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VIROLOGIA

ManualdeapoioàsSessõesLaboratoriais

Fevereiro,2018

CarlosSinogas

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ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA...........................................................................................................................................................3 Riscoquímico................................................................................................................................................................................................3 Riscoradiológico..........................................................................................................................................................................................3 Riscobiológico..............................................................................................................................................................................................3 Regras..............................................................................................................................................................................................................3 Planeamento..................................................................................................................................................................................................4 Procedimentosgerais.................................................................................................................................................................................4

REGISTOSERELATÓRIOS.............................................................................................................................................................................5 TécnicaslaboratoriaisbásicasemMicrobiologia/Virologia.............................................................................................................6 Meiosdecultura...........................................................................................................................................................................................6 Esterilização..................................................................................................................................................................................................7 TubosdeculturaePlacasdePetri.........................................................................................................................................................7 Instrumentosparatransferênciadeculturas....................................................................................................................................7 Câmarasdecultura.....................................................................................................................................................................................8 Frigorífico.......................................................................................................................................................................................................8

Métodosdeesterilização................................................................................................................................................................................9 Esterilizaçãopelocalor..............................................................................................................................................................................9 Esterilizaçãoporgases...........................................................................................................................................................................10 Radiações.....................................................................................................................................................................................................10 Filtraçãoestéril..........................................................................................................................................................................................10 Desinfetanteseantissépticos...............................................................................................................................................................11

BACTERIÓFAGOS...........................................................................................................................................................................................12 PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS...............................................................................................................................................................13 PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES............................................................................................................................................13 CALIBRAÇÃODEPIPETAS.....................................................................................................................................................................18 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO........................................................................................................................................21 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2..................................................................................................................................23 PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO...........................................................................................................26 ISOLAMENTODEPLACAVIRAL..........................................................................................................................................................29 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS................................................................31 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE............................................................................34 CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO.....................................................................................................36 CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO-PROCESSOSIMPLIFICADO.............................................39 REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV).........................................................................................................................................42 ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(trabalhofinalautónomo)........................................................................44

APÊNDICE–Meiosdecultura(fórmulas).............................................................................................................................................47

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PROCEDIMENTOSDESEGURANÇAOtrabalholaboratorialemVirologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,oriscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesquesecolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadotampráticasapropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.

Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenasalgumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradotadas.

Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipodiferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoserobservadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.

Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdassituaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.

RISCOQUÍMICOOsprodutosquímicosempreguesnosensaiosbiológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentesriscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendoentãoseradotadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,etc.

AspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderiscoconhecidoparaaSaúdeHumana.

RISCORADIOLÓGICODetodososriscosassociadoscomostrabalhosdevirologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éaradioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemservistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãodeprodutosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Àsexigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminaçãodosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.

Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.

RISCOBIOLÓGICOTodasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfeciosas,emparticularasquesãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfeciososnãoexiste.Asoutrasespéciesdeanimaisnãomamíferos,potencialmenteusadasnostrabalhoslaboratoriais,nãorepresentamqualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratórios.

Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfeçõesocorrememgolpesabertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasouporinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodiretocomamostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidoseconvenientementeimpermeabilizados.

Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofaráusodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigemhumana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentesinfeciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocaso,ésempreaconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfeciososparaooperadoreadotaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".

AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,ondemicrorganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodassuperfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.

REGRASParaalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidadeparaalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnãoestabelecidas.Importa,porisso,prevenir.

Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:

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BataOusodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereemlaboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusadaapenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,abataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfeciososparaoexteriordolaboratório.

MãosÀentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizarpotenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvaspoderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.

ComerebeberÉexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecuçãodeexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquirirohábitodemanterasmãoslongedaboca.

BancadadetrabalhoOlocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantesdeiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosdesessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentesinfeciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.

LivrosecadernosSóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comooprotocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.

MateriaisTodooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostonolocalindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostrasdeorigembiológicaouinfeciosadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.

AcidentesQualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtromaterialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserdeimediatodesinfetadoscomoapoiodoresponsável.

PLANEAMENTONãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.

PROCEDIMENTOSGERAISTodososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoeaformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspetivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.

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REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraçãodorelatóriofinalouparaaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosduranteaexecuçãodotrabalhoexperimentalfacilitarãoaaprendizagemeainterpretaçãodosresultadosobtidos,emespecialquandoestessãoinesperados.

Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjetivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresuscetíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintesseções:

Título Identificadordoconteúdodorelatório

Resumo Pequenotextodequeconstemosobjetivosalmejadoseasconclusõesobtidas

Objetivo Razãodeserdotrabalhorealizado

Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada

Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho

Materialereagentes Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado

Protocoloexperimental

Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito

Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos

Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos

Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjetivo,decorrentedosresultadosobtidos

Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas

Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdasseçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo

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TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMMICROBIOLOGIA/VIROLOGIAOsmicrorganismossãoubíquos.Podemencontrar-senosolo,noar,naágua,nacomida,nosesgotosenassuperfíciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladoànossavolta,onossoambienteestárepletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismoénecessáriosepararestaspopulaçõesmistas,deformaamanipularnolaboratórioaschamadasculturaspuras,culturasdeumaúnicaestirpe.Nocasoparticulardosestudosemvirologia,emqueosvírusprecisamde"meiosdeculturavivos",énecessáriodispordeculturaspurasdascélulashospedeirasparaapropagaçãodeculturaspurasdeestirpesvirais.

Paraisolareestudarosvíruseosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentoslaboratoriaisbásicosedaaplicaçãodetécnicasespecíficasusandomateriaisparticulares.Naspráticasqueaplicaremosnodecursodestadisciplina,emqueestudaremosvírusinfeciososparabactérias(bacteriófagos),ter-se-áderecorreràstécnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacomutilizaçãodosequipamentosemateriaisespecíficosqueseindicam:

Equipamento Autoclaveedispositivosdefiltraçãoestéril

Ansaseagulhas.PipetasemicropipetasBanhosdeáguaeestufasFrigoríficoFluxolaminar(conveniente)

Materiais ÁguadestiladadequalidadeMeiosdecultura(bactérias)LíquidoSemissólidoSólidoTubosparaculturaPlacasdePetri

MEIOSDECULTURAUmadascaraterísticasexclusivasdosvírus,queosdiferenciamdosrestantesseresvivos,residenasuanecessidadedeinfetarcélulasvivasparasepropagarem.Osubstratoparaocrescimentodosvírusé,assim,umacélulahospedeira.Osmeiosdeculturanecessáriosaotrabalhoemvirologiarespeitamàscélulasinfetadaspelosvírusemestudo.

Asobrevivênciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrienteseconvenientescondiçõesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenasnecessitamdesubstânciasolúveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaçãoenzimáticadeoutrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluçãocontendoestesnutrientesédesignadacomomeiodecultura.Emgeral,osmeiosdeculturasãolíquidos,semissólidosousólidos.Ummeiolíquidosemagentesolidificanteédesignadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,originaummeiosólidoousemissólido.Oagaréumextratodealgasmarinhas,umcarbo-hidratocomplexoquecontemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarémuitoadequadocomoagentesolidificanteporqueseliquefazacercade100ºCesolidificaa40ºC.Devidoaestaspropriedades,osmicrorganismos,emespecialospatogénicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37ºCsemreceiosdeliquefaçãodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraçãodeagardaordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraçãoinferiora1%resultanummeiosemissólido.

Agrandevantagemeutilidadedosmeiossólidosesemissólidosemestudosdevirologiaresidemnofatodeascélulashospedeiraspoderemserimobilizadas,mantendoasuaviabilidade,edeaspartículasviraisveremreduzidaasuacapacidadededifusãonomeio.Talcomoparaoisolamentodecolóniasdebactériasnasuperfíciedoagar,tambémnosmeiossólidosesemissólidossepodemisolarindividualmenteasestirpesviraisempresença.

Paraalémdasnecessidadesnutritivas,váriosoutrosfatoresambientaisprecisamdesercontroladosparaosucessodaculturadosmicrorganismosedesuportedasinfeçõesvirais,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapressãoosmótica.

Umoutroaspetorelevantedas"culturasdevírus"relaciona-secomasquantidadesrelativasdevírusecélulashospedeirasnoiníciodainfeçãoedacapacidadedoshospedeirosparasuportarapropagaçãoviral.Istoimplica,comfrequência,dispordecélulasemfasedecrescimentoexponencialparaqueainfeçãoviralpossaocorrercomsucesso.

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ESTERILIZAÇÃOAesterilizaçãoéumdospontos-chaveparaosucessodotrabalhoemvirologia.Paratrabalharemcondiçõesdeesterilidadeéfundamentalousodematerialestérileaaplicaçãodetécnicasadequadas.Aesterilizaçãoéprocessopeloqualsãoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistécnicasparaaesterilizaçãoderotinaemlaboratóriosãoasseguintes:

Calor Calorseco(arquente)

160ºCa180ºCdurante1/2horaa3horasMaterialdevidroemvazioCalorhúmido(vapor)Circulaçãodevapora100ºC.Esterilizaçãointermitente(soluçõestermolábeis)Autoclave.Vaporsobpressão,temperaturasacimados100ºC(meiosdecultura,soluçõestermo-

estáveis)Filtração Membranasfiltrantescomporosde0,05µma0.8µm

RemoçãodemicrorganismosdesoluçõestermolábeisporfiltraçãoProdutosquímicos

ÓxidodeetilenoMaterialdeplásticoBeta-propiolactonaTecidosvivos,materiaisbiológicos

TUBOSDECULTURAEPLACASDEPETRITubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplásticoconstituemosprincipaissuportesparaodesenvolvimentodasculturasdemicrorganismosquesuportamapropagaçãodosbacteriófagosautilizar.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooudeagaréusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameiosólido.Umambienteestérilépreservadonostubosdeculturaporváriostiposdetampas.Historicamenteéorolhãodealgodãohidrófobo,desenvolvidoporSchroederevonDuschnoséculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratóriosusamtampasemformademanga,emmetalouplásticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofatodenãoexigiremtantotrabalhonasuapreparaçãoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubosduranteamanipulação.

AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfícieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.Sãocompostasporumabasecircularinferior,ondeécolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoeligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetrideváriasdimensõesparadiferentesexigênciaslaboratoriais.Narotinasãousadasplacasdecercade10cmdediâmetro.Omeionutritivoestéril,contendoagar,numvolumede15a20mLévertidonasplacasquandoaindaquenteapósfusãodoagaredeixadoarrefeceratemperaturainferiora40ºC.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassãoincubadasemposiçãoinvertidaparaevitarqueasgotasdecondensação,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,caiamsobreasuperfíciedoagar.

Aimobilizaçãodasbactériaseadificuldadededifusãodaspartículasviraisnosmeiossólidosassociadosàpequenaespessuradosuportepermiteidentificareisolarbacteriófagosindividuais,comoseveránodecursodotrabalhoexperimental.

INSTRUMENTOSPARATRANSFERÊNCIADECULTURASExisteanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasdearmazenamentoemanutençãoparaculturasdeanálise,paraoisolamentodefagosouparaasuaexpansãoemmassa.Éoprocessodesubculturaquetemdenecessariamenteserefetuadocomtécnicaestérilparaevitarpotenciaiscontaminaçõesdassubculturas.

Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprópriosparaamanipulação,sãoinstrumentosmuitoduráveisdefácilutilização.Sãofacilmenteesterilizáveisnomomentodasuautilizaçãoporincineraçãoàchama,numaposiçãoquaseverticalatéometalficaraorubro.Importarádepoisdeixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismosambientaisviáveiséinferior.Depoisdearrefecidos,paranãoinativarosmicrorganismosatransferir,podemserusadaspara"picar"umaculturasólidaoulíquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeveráserdeimediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.

Aspipetassãooutrosdosinstrumentosdetransferênciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Sãocalibradasepermitematransferênciadequantidadesdeculturaslíquidaspreestabelecidas.Sãodevidroouplástico,comumaextremidadeafiladaeoutraparaaaspiraçãoeexpulsãodolíquidoquecontenham.Podemseresterilizadasporcalor

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secoouhúmido,conformeotipodematerialdequesãoconstituídas.Apesardetradicionalmentesereminstrumentospara"pipetaràboca"éproibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliaresmecânicosdisponíveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidadelargadapipeta.

AspipetasPasteur,tubosdevidronãograduadoscomumadasextremidadesafiladassãotambémdeusomuitofrequenteemestudosdevirologia,tambémpelasuafacilidadedeesterilizaçãoextemporânea.

CÂMARASDECULTURADascondiçõesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevanteséasuatemperaturaótimadecrescimento.Asestufassãousadasparaamanutençãodatemperaturaótimadosmicrorganismosemcrescimentoduranteoperíododecultura.Sãocâmarasemqueatemperaturaambienteinteriorécontroladaportermóstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamemgeralumsistemadecirculaçãodearaquecidoe,paraevitaradesidrataçãodosmeiosemincubação,deverãocontertambémumafontedevapordeágua(umrecipientecomáguanoseuinterior,quandonãovenhampreparadasparaoefeitodeorigem).

Osbanhosdeágua(banho-maria)comáguaatemperaturacontroladaportermóstatoconstituemoutrodosinstrumentosfrequentementeempreguesparaacriaçãodascondiçõesdetemperaturaótimadecrescimentodosmicrorganismos.Oíntimocontatodaáguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemosmicrorganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrápidaeeficaztransferênciadocalor.Alémdisso,osbanhoscomagitaçãofacilitamtambémoarejamentodasculturas,degrandeimportânciaparaocrescimentodosmicrorganismosaeróbios.Adesvantagemdobanhodeáguaresidenofatodesópoderserusadoparaasculturasemmeiolíquido,aocontráriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolíquidocomoemmeiosólido.

Osvírusporquesópodemcresceremcélulasqueestejamemcrescimentorequerem,naturalmente,omesmotipodecâmarasdeculturausadasparaosrespetivoshospedeiros.

FRIGORÍFICOOfrigoríficoéoutradaspeçasfundamentaisemlaboratóriodevirologia.Oambientedebaixatemperaturaquedisponibilizaédamaiorrelevânciaparaamanutençãoearmazenamentodasculturascelularesemfasedenãocrescimentoentreosperíodosdesubcultura,paraamanutençãodassuspensõesviraiseparaaconservaçãodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes.Tambémassoluçõesecompostostermolábeistêmperíodosdeconservaçãomaisalargadosquandoarmazenadosabaixastemperaturas.

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MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃOEsterilizaçãoéumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremàsuperfícieounointeriordeummaterial,podendoseralcançadopelaexposiçãodomaterialaagentesletaisfísicosouquímicosou,nocasodoslíquidos,pelaseparaçãomecânicadosorganismosatravésdefiltrações.Existemmuitasformasdeesterilizarmateriaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomodadisponibilidadedemeiosdetrabalho.

Anoçãodeesterilidade(estéril=infecundo)encontra-sefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia(ausênciadesepsis=putrefação)eadedesinfeção(livrardainfeção).Estessignificadosliteraiscorrespondem,defato,àsnoçõestécnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimo-nosaesterilizaçãoquandosepretendeimpedirapropagaçãodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambientedesprovidodemicrorganismoseadesinfeçãoquandoseaplicamtécnicasdestinadasaeliminarmicrorganismospotencialmentepatogénicosparaooperador.Aformadeeliminaçãodainfecciosidadeviraldependedascaraterísticasdovírusemcausa.

Destasnoções,aadquirirnoexercíciodaexperimentaçãoquesedesenvolveránadisciplina,importaconsideraremparticularastécnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaçãodemicrorganismosviáveis:aesterilização.

ESTERILIZAÇÃOPELOCALORA.CalorHúmidoOaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaéaautoclave.Asautoclavestrabalhamàsemelhançadepanelasdepressãodomésticas.Asautoclavesdelaboratóriooperamnormalmentesobumapressãode1,02Baraumatemperaturade121ºC.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem15-30minutos,sendoavariaçãodotempodeesterilizaçãodevidaàrelaçãosuperfície/volumedosmateriaisaseremesterilizados.

Aspetosdaesterilizaçãoporvapor-pressão

Temperatura

Osendósporosdasbactériassãoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiçãopodeserconseguidaseforaplicadovaporsobrepressão.Umatemperaturade121ºCofereceumaboamargemdesegurançaseformantidaduranteumespaçodetempoapropriado.

Humidade

Acoagulaçãodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehámedidaqueestaéremovidaatemperaturanecessáriaparahavercoagulaçãoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecidoficarámais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposiçãoparaaesterilização,quenasituaçãoextremadeesterilizaçãoemcalorsecoseráde170ºCduranteumahora.Emconclusão,vaporexcessivamentequenteperdealgumadasuaeficáciacomoagenteletalparaalémdepoderserlesivoparaosmateriaisaseremtratados.

Pressão

Apressão,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisónãoexercequalquerefeitonaesterilização,sendoútilparaelevaratemperaturadovaporacimados100°C.

Tempo

Otempoénecessárioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaseremesterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaçãosãoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosnãosãotodosmortosdeumavez.Avelocidadedemorteéumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidadedetempodeexposiçãoaoagenteletal,umaproporçãoqueéconstanteparaumadadapopulação.Normalmentedemora11a12minutosa121°C(calorhúmido)paramatarosendósporosdasbactériastermofílicas,osagentesmaisresistentesnasmanipulaçõesdodia-a-dia.

Purga

Oarrelativamentefrionacâmaradeesterilizaçãoémuitomaispesadoqueovaporàtemperaturadeesterilização.Senãoforpermitidaasaídadoarcria-seumaestratificaçãonaautoclavequeconduzaumafaltadeuniformizaçãodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsãolentosamisturarem-se,asdiferençasdetemperaturaentrecamadaspodemsermuitograndes,porissoanecessidadedesesubstituirtodooarporvapor(purga).

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Natureza do carregamento

Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilização,sendopreferívelesterilizarpequenosvolumesdecadavez,porexemploépreferívelesterilizar5balõesdelitrodecadavezdoqueesterilizarapenasumbalãocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodãooupapel.Sefornecessáriousartampasroscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasaídadeareentradadevapor,evitando-seassimorebentamentodefrascosnaautoclave.

B.Calorseco

Ocalorsecoéusadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaissólidostermoestáveisealgunscomponentesdemeiosoualimentosqueficariamimprópriosseexpostosaovapor.Trata-setambémdeumdosmétodosdeesterilizaçãomaisusadosedemuitofácilaplicação.Oequipamentoindispensáveléapenasumaestufadealtatemperatura(160–200ºC).Paraalémdeterdesertidaemcontaaresistênciatérmicadosmateriaisaesterilizarporestatécnica,aoutraprecauçãoaconsiderarprende-secomaminimizaçãodapossibilidadedecontaminaressesmateriaisdepoisdaesterilização.

ESTERILIZAÇÃOPORGASESOrecenteincrementodousodematerialdeplásticodeutilizaçãoúnica("disposable")comoseringas,caixasdePetri,tubosdecultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaçãoqueusagasestóxicosparaaeliminaçãodosmicrorganismosdemateriaistermo-sensíveis.Aaplicaçãodestatécnicarequerautilizaçãodeequipamentosprópriosqueforcemacirculaçãodogástóxicoatravésdetodasassuperfíciesdosmateriais,oqueatornadedifícilutilizaçãoemlaboratóriosdetiponãoindustrial.

Oóxidodeetilenoéogásusadocommaiorfrequêncianestetipodeesterilizações.Estegás,aocontráriodemuitosprodutosquímicostóxicos,époucocorrosivoenãoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendofacilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperíodosdeexposiçãoparaseobteraesterilização(váriashoras),areatividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposdeplásticoseanecessidadedeequipamentosprópriosedisponibilidadedogás,comosereferiu.

RADIAÇÕESAlgunsprocessoscomerciaisusamasradiaçõesparaaesterilizaçãoafriodecertosmateriaiscomoprodutosfarmacêuticos,porexemplo.Airradiaçãoéousoderadiaçõesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgamaproduzidosapartirdecobalto-60oucésio-139ederaioscatódicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresdeeletrões.

Airradiaçãocomluzultravioletanãoéumaformamuitosatisfatóriadeesterilizaçãodadaasuafracacapacidadedepenetraçãonosmateriaiseprodutosaesterilizar.É,contudo,deutilizaçãofrequentenadiminuiçãodoníveldecontaminaçãodeespaçosconfinados,comosalasestéreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteúteistambémparaareduçãodainfecciosidadeviraldevidoàsalteraçõesinduzidasnomaterialgenéticodaspartículasviraisexpostas.

FILTRAÇÃOESTÉRILOprincipalmétodoparaaesterilizaçãodelíquidosquecontenhamcomponentestermo-sensíveistaiscomovitaminas,proteínasséricaseantibióticos,porexemplo,éafiltração.Tradicionalmenteosmicrobiologistasesterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomáceasefibrasdeasbesto,previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstituídosporfiltrosdeacetatodeceluloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraçõescomelevadosgrausdeprecisão.Existematualmentedisponíveisnomercadofiltrosesterilizantesdeváriosporosecapacidadesfiltrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessíveissãofiltrosdeporosde0,45µmou0,2µmdediâmetro,queretêmosmicrorganismospresentesnassoluções.

Paraesterilizarumasoluçãoporfiltração,nãohámaisquepassaressasoluçãoatravésdeumdestesfiltrospelaaplicaçãodeumapressãopositivanolíquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefaçãodoarnocontentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatécnicarequerarecolhadofiltradoemcondiçõesdeassepsiaparaimpediracontaminaçãodolíquidoesterilizado.

Virologia2017/18 11

Salvorarasexceções,afiltraçãoestérilnãoretémaspartículasvirais.Nãopodendoserconsideradocomométodode"esterilizaçãodevírus".Afiltraçãoestérilémesmoumatécnicafrequentementeusadaemvirologiaparaapurificaçãodesuspensõesviraispelaeliminaçãodebactériaspotencialmentecontaminantes.

DESINFETANTESEANTISSÉPTICOSMúltiplosreagentesquímicossãodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaçãodemicrorganismos.Osprodutosusadosna"limpeza"deutensíliosdiversos,frequentementedemasiadotóxicosparaserusadosdiretamentenoHomem,sãochamadosdedesinfetantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmoobjetivodeeliminareventuaismicrorganismos,sãoantissépticos.

Particularmenteeficazemuitoútilnolaboratório,paraeliminaçãodevírusemicrorganismoséasoluçãodehipocloritodesódio(lixívia)comquesetratamosmateriaisdelaboratórioapósexposiçãoaagentesinfeciosos.

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BACTERIÓFAGOSOsvírusdiferemdasbactériasporseremmuitomaispequenos,deconstituiçãonãocelulareparasitasintracelulares.Adicionalmentenãosãocapazesdecresceremmeiosdeculturanãovivos.Apesardissoépossívelestudá-losnolaboratório,detetandoasuapresençapelosefeitosqueprovocamnascélulasqueinfetam.

Existemvíruscomespecificidadeparadiversostiposdecélulas,tantoeucarióticascomoprocarióticas.Aestritadependênciadecélulashospedeirasdeve-seàsuaincapacidadeparasintetizarasenzimasnecessáriasaosmecanismosdasuapropagação.Aopenetraremnascélulassãocapazesdeusarasenzimasdohospedeiroemseupróprioproveito.

Oestudodevírusqueparasitamcélulasvegetaisouanimaisexigerecursosespecíficosparaculturadetecidos,sendoestastécnicasemgeraldemasiadodemoradasparaexecuçãoemaulaspráticasdonívelqueaquisepretendemdesenvolver.Paraalémdissoeapesardaespecificidadeparacertoshospedeirosautilizaçãodevírusdeeucariotasexigecuidadosdecontençãobiológicabastanteapertados.

Osvírusqueparasitamasbactérias,osbacteriófagosousimplesmentefagossãodemaisfácilmanipulação,exigemaaplicaçãodetécnicasgeraisdemicrobiologia,menosdemoradasporviadasrápidastaxasdecrescimentodasbactériasusadas.Ocuidadoparaoconfinamentobiológicodasexperiênciastambémnãoprecisadesertãoapertadocomoparaousodevíruseucarióticos.

Quandoumfagoinfectaumabactériarecetivaumadeduascoisasacontecerá:aliseoualisogeniadabactéria.QuandoocorrealiseometabolismodabactériaéreorientadoparaasíntesedoDNAgenómicodovírusedasproteínasparaproduziraspartículasfágicasmaduras.Usadoomaterialcelulardisponível,acélularebentaelibertaosviriõesmaduros,capazesdereinfectarnovasbactériasqueencontrem.

Osbacteriófagosqueprovocamalisedabactériasãochamadosdevirulentosoulíticos.Quandoainfeçãonãoconduzàmortedabactéria,estabelece-seentreestaeovírusumrelacionamentodesignadoporlisogeniaeofagoédenominadodetemperadooulisogénico.NestescasosoDNAdofagoéintegradonocromossomadabactériaeestacrescenormalmente.Ocasionalmenteumadestasbactériasentraemciclolíticoelibertaviriõescapazesdeinfetaroutrascélulas.

Aevidênciavisualdalisedeumabactériaéconseguidapelaculturadabactériaemmeiosólido,emcamadauniformeeinfeçãodealgumascélulascomobacteriófago.Acamadadebactérias,naturalmenteopaca,apresentacírculosclaroscorrespondentesaoslocaisemqueumfagoinfetouedestruiuapopulaçãodecélulasvizinhas.Sãoasplacasvirais.Noscasosdefagoslisogénicos,comosóalgumasdasbactériasentramemciclolítico,estasplacassãotranslúcidas.

Virologia2017/18 13

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS

PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)enasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.

Materialereagentes¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos¾ Espectrofotómetro

Procedimento(porgrupo)

Diluiçõesdecimais

1. Marquemicrotubosde1a102. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Solvente(mL) 0 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,5Corante(mL) 1,5 0,15 0 0 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesma

cuvete.Amostra:brancodecontrolo).

Diluiçõescentesimal

1. Marquetubosdeensaiode1a62. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais

concentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)

Diluiçõesdetrêsemtrês

6. Marquetubosdeensaiode1a10)

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7. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Solvente (mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1,5 Corante (mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Solução precedente (mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 Diluição (10x)

8. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.9. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos10. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais

concentrada,namesmacuvete)

Diluiçãoúnica(TPC)

¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLdecada

umadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:a. Diluiçãode5x102b. Diluiçãode5x10-2

Preparaçãodesoluções(TPC)

¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:

a. NaOH0,1Nb. SO4H20,1Nc. NaCl0,1Md. NaCl100mMe. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6)g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2)

Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.

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RegistodeobservaçõeseResultados

PIPETAGENSEDILUIÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Diluiçõesdecimais

Tubo Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações

1

2

3

4

5

6

Diluiçõescentesimais


1

2

3

4

5

6

Diluiçõesdetrêsemtrês


1

2

3

4

5

6

Diluiçõesúnicas

Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações

5x102

5x10-2

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Gráficos

Notas:

Virologia2017/18 17

SOLUÇÕES


NaOH0,1N(100mL)

Componentes Peso/volume

SO4H20,1N(100mL)


NaCl0,1M(100mL)


NaCl100mM(100mL)


Glicerol10%(100mL)


Glucose10%(100mL)


Etanol70%(100mL)


Notas:

Virologia2017/18 18

CALIBRAÇÃODEPIPETAS

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Autilizaçãofrequentedaspipetasdisponíveisnolaboratórioporestudantessemexperiêncialevaautilizaçõesincorretasdonderesultaquealgunsdosvolumesindicadosnosvisoresnãocoincidamcomasquantidadesmedidas.Nestecontextoéimportanteconheceraformadecalibraraspipetasausar.

Materialereagentes¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos,coposdeboémia¾ Balançadeprecisão

Procedimento(porgrupo)

Ajustedevolume(5µL)

1. Utilizeumapipetade20µL2. Ajusteoindicadordevolumeaos5µL3. Pipete,nabalança,paratubocalibrado5µL4. Observeopesoindicado5. Sesuperioraos5mg,reduzaovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.6. Seinferioraos5mg,aumenteovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.7. Quandoaquantidadedeáguadestiladapesadaforde5mg,anoteaindicaçãodevolumeque,napipeta,

correspondeaos5µL.


1. Utilizeumapipetade200µL2. Repitaospassosdoprocedimentoanterior(de1.a7.)paraamassade50mg(correspondentea50µL)


1. Utilizeumapipetade1000µL2. Repitaospassosdoprocedimentoinicial(de1.a7.)paraamassade500mg(correspondentea500µL)

Calibraçãodepipeta(200µL)

1. Meça,nabalança,umvolumede10µLparacopotarado.Anoteopeso2. Repitamaisduasvezesestadeterminação3. Repitaospontos1e2paraosvolumesde20µL;50µL;100µL;150µLe200µL4. Façamédiasdecadaconjuntodetrêspesagenshomólogas5. Desenheográficodecalibraçãodapipeta,fazendocorresponderosvolumesindicadosnovisorcomospesos

avaliados.

NB

Osprocedimentosparaoutrosvolumesououtraspipetassãoidênticos.

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CALIBRAÇÃODEPIPETAS


Calibraçãodepipeta20µL

Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações

1µL

2µL

5µL

10µL

15µL

20µL

Calibraçãodepipeta200µL


10µL

20µL

50µL

100µL

150µL

200µL

Calibraçãodepipeta1000 µL


50µL

100µL

200µL

500µL

750µL

1000µL

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Calibraçãodepipeta

Notas:

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CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO

Introdução

Comosesabe,asbactériasmultiplicam-seporprocessosdefissãobinária.Umabactériaemcrescimentometabolizaosnutrientesdisponíveisnomeio,aumentaoseutamanhoedivide-seemduas.Otempoparaumabactériasereplicareformardoisindivíduoséotempodegeração,caraterísticodaestirpenascondiçõesdeculturaaplicadas.

Umvírusparasepropagarprecisadeinfectarumhospedeirometabolicamenteativoparapoderutilizarosseusmecanismosdereplicaçãodogenomaedesíntesedasproteínasviraisconstitutivasdosviriões.

Particularmentenosbacteriófagoslíticos,oseuestudoimpõeautilizaçãodebactériashospedeirasemfasedecrescimento.Importa,porisso,conheceroperfildascurvasdecrescimentodestasbactériasparadeterminaromomentoemqueainfeçãocomovírusdeveráserdesencadeada.

Nestetrabalhodeterminar-se-áexperimentalmenteacurvadecrescimentodeumabactériaE.coliautilizarnodesenvolvimentodostrabalhossubsequentes.

Materialereagentesespecíficos¾ CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(culturadediaanterior)¾ Sorofisiológicoestéril¾ PlacasdePetricomagarnutritivo¾ Tubosdeensaio,contendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)¾ Tubosdecentrífugaesterilizados(cercade10mL)¾ PipetasPasteuresterilizadas¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas¾ Espectrofotómetrodovisível(600nm)

Procedimento(porgrupo)1. AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida2. Inocular100mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde

DO600nm=0.053. Incubara37ºCembanhooucâmaracomagitação(cercade120rpm)4. Homogeneizarasuspensão5. Tomaramostrade4mL.AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário)6. Tomar2X0.1mLdesuspensão7. Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo8. Diluiraoutraamostra1:10eespalhar0.1mLnasuperfíciedeoutraplacadeagarnutritivo9. Incubarasplacasemestufaa37ºCduranteumanoite10. Repetirpassos5a10,dehoraahoraatéàsoitohorasdeincubação11. Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas12. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação13. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão14. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação15. RelacionarasDO600nmdeterminadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas

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CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO


Tempo(horas) DO600nm/mL Bactérias/mL Observações

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Notas:

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CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2

Introdução

Dadoqueasduashorasdasessãolaboratorialformalnãosãosuficientesparaarealizaçãointegraldacurvadecrescimentobacteriano,propõe-searealizaçãodestetrabalhoparailustraraformadeestabelecerumacurvadecrescimentoetomarosdadosnecessáriosàprossecuçãodetrabalhosfuturos.

Materialereagentesespecíficos

(idênticoaanterior)

Procedimento(porgrupo)1. AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida(culturarecente“overnight”)2. Inocular20mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde

DO600nm=0.053. Homogeneizarasuspensão4. Tomaramostrade2mL.Separar

a. AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário).Registarvalor5. Tomar2X0.2mLdesuspensão

a. Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivob. Diluiraoutraamostra1:10(adicionar1,8mLSF)eespalhar0.2mLnasuperfíciedeoutraplacadeagar

nutritivo6. Incubara37ºCemestufacomagitação(cercade120rpm)7. Repetirpassos3a5demeiaemmeiahora.8. Continuaraincubaçãodetodasasplacasinoculadasemestufacomagitaçãoa37ºCduranteumanoite

9. Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas10. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação11. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão12. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação13. RelacionarasDO600nmregistadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas14. Calcularaabsorçãoespecíficadaculturabacteriana.

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CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2


Tempo(minutos) DO600nm/mL Bactérias/mL Observações

0

30

60

90

Notas:

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Gráficos

Notas:

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PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO

Introdução

Todososvírussãoparasitasintracelularesobrigatóriosesãoincapazesdesepropagaremmeiosnutritivoscomoacontececomgrandenúmerodebactériaseoutrascélulas.Cadatipodevírusrequerumhospedeiroadequadoparasereplicar.Hávírusqueconsegueminfectardiferentestiposdehospedeiroseoutrosdemaiorespecificidadeparaumtipoparticulardecélulas.

Porqueosvírusnãopossuemasatividadesenzimáticasnecessáriasàsdiferentesfasesdosseusciclosdereplicação,estãodependentesdaatividademetabólicadohospedeiroparasepropagarem.Acélulainfectadadeveencontrar-seemcrescimentoativocomainerenteproduçãodeenergiaemacromoléculasutilizáveispelovírusaquandodainfeção,paraqueestapossaserprodutiva.

Nocasodosbacteriófagos(="comedoresdebactérias"),oshospedeirosnosquaissepodemmultiplicarsãobactérias.Énecessárioqueabactériaseencontreemcrescimentoexponencialparaaefetividadedainfeção.Seocrescimentobacterianonãoéóptimonaalturadainfeção,areplicaçãoviralpoderánãoocorrerousermuitoreduzida.


¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo

(faseexponencial)¾ Sorofisiológicoestéril¾ PlacasdePetricomagarnutritivo¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagar

nutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC

¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)¾ Tubosdecentrífugaesterilizados(12mL)¾ PipetasPasteuresterilizadas¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas

esterilizadas

Procedimento

NB

Cadagrupoexecutaoensaiocomduasdiluiçõesdevírus1. Identificaromaterialautilizarnotrabalho:

a. 2X7Tuboseppendorf(de1a7)b. 7PlacasdePetricomagarnutritivo(de1a7)eidentificar:nomedogrupo,dataeexperiência

2. Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófagoaamplificar,umaamostranãodiluídaeumcontrolonegativo,conformeaoesquema:

Tubo# 1 2 3 4 5 6 7Amostrainicial 200µL 100µL - - - - -Diluiçãoanterior - - 100µL 100µL 100µL 100µL Sorofisiológico - 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µLDiluiçãofinal 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 0

Virologia2017/18 27

3. Emmicrotuboesterilizadomisturar:a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencialb. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago

4. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos5. Adicionaroconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºC6. Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo7. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)8. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)9. Repetirpassos3a8paracadadiluição.10. Observarasplacaseregistarasobservações11. Escolheraprimeiraculturaquecontenhaasplacasdovírusconfluentes12. ComauxíliodeumapipetaPasteurdobradaremoveracamadadeagarsemissólidoparatubodecentrífuga13. Adicionar5mLdesorofisiológicoehomogeneizarporaspiraçãocompipeta14. Repartirasuspensãopormicrotubos15. Centrifugar5minutos.

a. Repetircentrifugaçãoseosobrenadantenãoestiverlímpido16. Tomarosobrenadanteeconservaremfrigoríficoa4ºC

a. Senecessárioprocederafiltraçãoestéril-0,22nmou0.45nmNBEstaamostraseráafontedevírusparaostrabalhossubsequentes.Cadagruporesponsabiliza-sepeloseumaterial.

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PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO


Placa Amostra Observação

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

Notas:

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ISOLAMENTODEPLACAVIRAL

Introdução

Nostrabalhosdevirologia,emparticularquandosemanipulamagentesresultantesderecolhasdoambiente,nãoégarantidoqueestejapresenteapenasumaespécieviral.Éfrequentenestetipodetrabalhosobservar-seaformaçãodeplacasviraisdecaraterísticasdiferentes(dimensão,transparência,p.ex.)correspondendoaestirpesviraisdetipodiferente.

Nestetrabalhopreparar-se-áumasuspensãouniformedevírus,isolandoumtipodosrestantes.


¾ PlacadePetricomplacasviraisisoladas¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo

(faseexponencial)¾ Sorofisiológicoestéril¾ CaixasdePetricomagarnutritivo

¾ PipetasPasteuresterilizadas¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas

esterilizadas

Procedimento1. DeumacaixadePetricomplacasviraisselecionarumabemisoladaemarcarposiçãonacaixa.2. CompipetaPasteuraspirarum“plug”deagarcontendoaplacaviralselecionada3. Transferiro“plug”deagarparadentrode500µLdeSFemmicrotubo4. Homogeneizarcommicropipetaaspirandoeexpirandoo“plug”5. Identificaremarcar5X2microtubosecincoplacasdeagarcontendomeionutritivo6. Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófago,conformeaoesquema:

Tubo# 1 2 3 4 5Amostrainicial 200µL 100µL - - -Diluiçãoanterior - - 100µL 100µL Sorofisiológico - 900µL 900µL 900µL 900µLDiluiçãofinal 100 10-1 10-2 10-3 0

7. Nooutroconjuntodemicrotubosesterilizadosmisturar:

a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencialb. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago

8. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos9. Transferiratotalidadedoconteúdodecadatuboparaasuperfíciedoagardarespetivacaixa10. Comespalhador(pipetaPasteurduasvezesdobrada)espalharuniformeecompletamenteatéàabsorção

completa.11. Repetirparatodasasdiluições12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)13. ObservarasplacasdePetrieregistarasobservações

a. Ocontrolovalidaoensaio(ausênciadeplacasvirais)b. ObservarcaixadePetricomplacasviraisisoladaseregistarpresençaounãodeplacasdetipos

diferentes

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ISOLAMENTODEPLACAVIRAL


Placa Amostra Observação(existênciadeplacasviraisdetiposdiferentes)

#1

#2

#3

#4

#5

Notas:

Virologia2017/18 31

TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS

Introdução

Diversastécnicasemvirologiarequeremoconhecimentopreliminardaconcentraçãoviraldassuspensõesausar.Importaconheceronúmerodeunidadesinfeciosasporunidadedevolumedasuspensão.

Emcadaciclodeumainfeçãocombacteriófagolítico,cadabactériainfectadaproduzváriaspartículasviraisqueselibertamparaomeioexteriornasequênciadamortedohospedeiro.Cadaumadestaspartículasviraisterácapacidadeparainfectarumanovabactériaaqueseligue.

Quandoainfeçãoocorreemmeiosemissólido,aspartículasviraisqueselibertamapenaspodeminfectarasbactériasvizinhasdevidoàsuadifusãoretardadapelomeiogelificado.Porcadabactériainicialmenteinfectadaobservar-se-á,apósculturaadequada,umespaçonaculturaconfluentedebactérias,correspondenteaoslocaisemqueasbactériasforamdestruídaspelosvírus(placadelise).

Aconcentraçãodevírusnasuspensãooriginal,determinadapelonúmerodeunidadesformadorasdeplacas(pfu,plaque-formingunits),podesercalculadausandoaseguintefórmula:

Concentraçãoviral=Númerototaldeplacasvirais

VolumeusadoXFatordediluição

Materialereagentesespecíficos¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior)¾ Sorofisiológicoestéril¾ PlacasdePetricomagarnutritivo¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas

Virologia2017/18 32

Procedimento1. Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a9,prepararasseguintesdiluiçõesdecimaisdofago:

Tubo# 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Amostrainicial 100µL - - - - - - - -

Diluiçãoanterior - 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL -

Sorofisiológico 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL

Diluiçãofinal 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Controlo

2. Emmicrotuboesterilizadomisturar:

a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencialb. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófagoc. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos

3. Adicionaratotalidadedoconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºCa. Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivob. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)c. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)

4. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasviraisemtrêsplacasdePetriconsecutivascomplacas

viraiscontáveisa. Registarasobservaçõeseosresultados.

5. Calcularotítulodasuspensãoinicialempfu/mLparacadadiluiçãoavaliada

a. Estabelecerotítulodasuspensãoviralinicialpormédiadosvaloresencontrados

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TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS


Placa Amostra NúmerodeplacascontadasTítulodasuspensão

inicial Observações

#X

#X+1

#X+2

Média

Notas:

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TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE

Introdução

Inoculandodiversasculturaslíquidasdebactériashospedeirascomdiluiçõescrescentesdasuspensãoviralemestudo,atinge-seumpontoapartirdoqualnãomaisépossíveldetectarpartículasvirais.Determinandoadiluiçãodasuspensãoqueaindacontempelomenosumapartículaviralépossívelcalcularaconcentraçãodasuspensãoinicial.

Materialereagentesespecíficos¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior)¾ Sorofisiológicoestéril¾ Tubosdeculturacontendo5mLdeagarnutritivolíquido¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas

Procedimento1. Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a12,prepararasseguintesdiluiçõesdecimais:Tubo# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Amostrainicial(µL) 150 100 - - - - - - - - - -Diluiçãoanterior(µL) - - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900Diluiçãofinal 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 controlo2. Emmicrotuboesterilizadomisturar:

a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencialb. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófagoc. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos

3. Marcaradequadamenteostubosdeensaiocontendo5mLdemeiodeculturalíquidoa. Inocularcadatubocomatotalidadedecadasuspensãobacterianainfectada.b. Misturarnovortex.c. Incubarembanho-mariacomagitação(ouemincubadoracomagitação)a37ºCdurante24horas

(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)4. Observaraturvaçãodasculturas

a. Registarasobservações5. Calcularotítulodasuspensãoinicial

a. Compararcriticamentecomotítulocalculadopelatécnicadeformaçãodeplacas

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TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE


Tubo Amostra Turvação(+/-) Observações

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

#9

#10

#11

#12

Títulodasuspensãoviralinicial:

Notas:

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CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO

Introdução

Oaspetotípicodeumacurvadecrescimentodebactériasmostraumcrescimentoconstantedonúmerodeindivíduosnafaseexponencial,quedecorreduranteumdeterminadoperíododetempocorrespondenteageraçõessucessivasdeindivíduos.Poresgotamentodosnutrientesnomeiooupelodesenvolvimentodeoutrascondiçõesadversas(pH,acumulaçãodeprodutostóxicos,etc.),ocrescimentobacterianoéinibido.

Areplicaçãodeumvíruslíticonabactériadesenvolve-senumúnicopassoconducenteàmortedohospedeiroelibertaçãodosfagosparaomeioenvolvente.Estefenómenoqueocorrenumaúnicacélulainfetadapodeserdemonstradonumapopulaçãodemicrorganismossetodososindivíduosforeminfetadosaomesmotempo.

Amultiplicidadedeinfeção–MOI(multiplicityofinfection)éumconceitoquerelacionaonúmerodepartículasviraisinfeciosasusadasparainfetarumdeterminadonúmerodecélulashospedeiras.UmaMOIde1.0correspondeaumasituaçãodeumapartículaviralinfeciosaporcélula.

Nestetrabalhodetermina-seoperfildecrescimentodeumbacteriófagolítico.

Materialereagentesespecíficos¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior¾ CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(diaanterior)¾ Sorofisiológicoestéril¾ PlacasdePetricomagarnutritivo¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC¾ Tubosdecentrífuga(10mLmínimo),Microtuboseppendorf,Micropipetas(200e1000)epontasesterilizadas

Procedimento(culturadevírus)1. Inocularfrascoerlenmeyerscontendo50mLdemeionutritivocom2mLdeculturabacterianarecente.2. Incubara37ºC,sobagitação,atécrescimentoexponencial(Oprocessodemoraentre3a5horasatéqueacultura

comeceaduplicarasuadensidade–crescimentoexponencial).3. AvaliaraDOdasuspensãobacteriana4. Avaliaraquantidadedebactériasexistentesem10mldesuspensão5. Tomar10mLdeculturaparacadaumdedoistubosdecentrífugaestéreis(Tubos1e2)6. AdicionarsuspensãoviralsuficienteparaatingirumaMOIde5a10notubo17. AdicionarigualvolumedemeiodeculturaLBaotubo28. Incubar37ºCdurante5minutos9. Centrifugar1500rpmX5minutos.Decantarossobrenadantesparatubosestéreis10. Preservarsobrenadantedetubo1econservara4ºC11. Conservarosedimentobacterianosecoa4ºCparaaaulaseguinte12. Ressuspenderosedimentodecadatubocom20mLdemeiodeculturapré-aquecido.13. TransferirasuspensãodecadatuboparafrascosErlenmeyer14. Incubara37ºCsobagitação15. Tomarassepticamenteasamostrasseguintesaotempo0(zero):

a. Daculturabacterianainoculadacomvírus(tubo1):i. Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura.ii. Amostrade0,5mLdesuspensão.Conservara4ºC

b. Daculturabacteriananãoinoculadacomvírus(tubo2):i. Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura.

16. Repetirpasso15decada15minutosatéaofimdaaula

Virologia2017/18 37

Procedimento(revelação)1. Materialbiológiconecessárioconservadoa4ºC:

a. Sobrenadantedaculturainicialdosvírusb. Umaamostradesuspensãobacterianadetempo0(zero)c. Umaamostradesuspensãobacterianadecadatemporecolhido

2. Faceàquantidadedevírusebactériasinicialmenteutilizadoscalcularasdiluiçõesafazerparacadacaso3. Procederàdiluiçãodecadaamostraaestudardeacordocomoseguinteesquemaeemfunçãodadiluição

máximanecessária:

Tubo# 1 2 2 2 2 ... NSorofisiológico 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µLSobrenadante(sessãoanterior) 100µL - - - - - -Diluiçãoanterior - 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL -

4. Selecionardecadaamostraastrêsdiluiçõesparainocularnasbactérias5. Emeppendorfsesterilizados:

a. 300µLdesuspensãobacterianarecenteb. 100µLdadiluiçãodasuspensãoviralemestudoc. Homogeneizar

6. Repetirpasso5paratodasasamostrasatestar7. Incubarostubosa37ºCdurante5minutos8. Pipetaratotalidadedoconteúdodecadaeppendorfparatubodeensaiocontendoagarsemissólidoliquefeitoe

aquecidoa50ºC9. Rolarotuboentreasmãosparahomogeneizar10. Verterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivopreviamentemarcada11. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)13. Repetirprocedimentosde8a12paratodasasamostrasselecionadas.14. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasvirais15. Registarasobservaçõeseosresultados16. CalcularamédiadonúmerodepartículasviraispormLdecadasobrenadanteinicial17. Prepararacurvadecrescimentodobacteriófago.18. Determinaroperíododeexplosão(burstsize)

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CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO


Sobrenadante

Amostra

(Diluições)Tempodeinfeção

Contagensdeplacasvirais

PlacadePetriX-1 PlacadePetriX PlacadePetriX+1

Inicial

(____________)

-

1

(____________)

0

2

(____________)

3

(____________)

4

(____________)

5

(____________)

6

(____________)

Notas:

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CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO-PROCESSOSIMPLIFICADO

Materialereagentesespecíficos(IDÊNTICOSAOSDATÉCNICAANTERIOR)

Procedimento(culturadevírus)1. AvaliaraDOdeculturadeE.colidediaanterior2. Calcularonúmerodebactériaspresentesem5mLdecultura3. Medir5mldeculturabacterianaparacadaumdedoistubosFalconde20mL(tubos1e2)4. Adicionaraotubo1suspensãoviralatéumaMOIde5a105. Adicionaraotubo2meiodeculturaemvolumeigualaodasuspensãoviralacrescentadaaotubo16. Incubara37.ºCdurante10min7. Centrifugara1500rpmX5min8. Decantarsobrenadantesereservarparaavaliaçãoposterior9. Suspenderosprecipitadosbacterianosdecadatubocom50mLdemeiodeculturapré-aquecidoa37.ºC10. Transferirparaerlenmeyers11. Incubara37.Ccom.Agitação12. De30em30minutos:

a. Tomaramostrade1mLdecadacultura.b. AvaliarDO.Registar.c. Tomaramostrade200a500µLdotubo1.Conservara4ºC.

13. Continuararecolhadeamostrasatéàobservaçãodecrescimentoevidentenotubo2eparagemdecrescimentonotubo1.

Virologia2017/18 40

Procedimento(revelaçãodostítulosvirais)1. Materialbiológiconecessárioconservadoa4ºC:

a. Sobrenadantedaculturainicialdosvírus(passo8.doprocedimentoanterior)b. Amostrasdesuspensãodaculturainfetadaacadatemporecolhido

2. Faceàquantidadedevírusebactériasinicialmenteutilizadoscalcularasdiluiçõesafazerparacadacaso3. Procederàdiluiçãodecadaamostraaestudardeacordocomoseguinteesquemaeemfunçãodadiluição

máximanecessária:

Tubo# 1 2 2 2 2 ... NSorofisiológico 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µLSobrenadante(sessãoanterior) 100µL - - - - - -Diluiçãoanterior - 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL -

4. Selecionardecadaamostraastrêsdiluiçõescorrespondentesaaproximadamente10,100e1000placasvirais,

parainocularnasbactérias5. Emeppendorfsesterilizados:

a. 300µLdesuspensãobacterianarecenteb. 100µLdadiluiçãodasuspensãoviralemestudoc. Homogeneizar

6. Repetirparatodasasamostrasatestar7. Incubarostubosa37ºCdurante5minutos8. Pipetaratotalidadedoconteúdodecadaeppendorfparatubodeensaiocontendoagarsemissólidoliquefeitoe

aquecidoa50ºC.Homogeneizar9. Verterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivopreviamentemarcada10. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)11. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)12. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasvirais13. Registarasobservaçõeseosresultados14. CalcularamédiadonúmerodepartículasviraispormLdecadasobrenadanteinicial15. Prepararacurvadecrescimentodobacteriófago.16. Determinaroperíododeexplosão(burstsize)

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CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICOProcessoSimplificado


Sobrenadante

Amostra

(Diluições)Tempodeinfeção

Contagensdeplacasvirais

PlacadePetriX-1 PlacadePetriX PlacadePetriX+1

Inicial

(____________)

-

1

(____________)

0

2

(____________)

3

(____________)

4

(____________)

5

(____________)

6

(____________)

Notas:

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REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)

Introdução

OTMV(TobaccoMosaicVírus)éumvírussimpleshelicoidal,degenomaaRNAdecadeiasimplesqueinfectaasplantasdotabacoedotomateiroalémdeoutrostiposdeplantas.Foioprimeirovírusaseridentificado,purificadoecristalizadoeédosvírusmaisestudados.Ainfeçãoviralcausalesõeslocalizadasnasfolhas,dando-lhesumaspectoheterogéneo(mosaico),podendotambémcausarinfeçãosistémicasetransmitidoàplantainteira.Devidoàexistênciadeumaparedecelularrígida(celulósica)nascélulasvegetais,ainfeçãosópodeestabelecer-sequandoocorreroturanessaparede,napresençadovírusinfecioso.

Nestetrabalhopretende-sepesquisarapresençadeTMVemprodutoscomerciaisdetabacoporabrasãodasfolhasdaplanta.

Materialereagentesespecíficos¾ Vasoscomplantasdotabacoemcrescimento(1porgrupo)¾ Produtosdetabacocomerciais(cigarros,charutos,tabacodecachimbo),dediferentesfabricantes.¾ Almofarizepistão¾ Sorofisiológico¾ Areiafina¾ Algodãoesterilizado(bolas)

Procedimento

1. Identificarovasodecadagrupo2. Pendurarumapequenaetiquetaemcadaumdedoisramosdaplanta,marcadascomcontroloeteste3. “Pisar”umaporçãodetabaco(umcigarrodesfeito)noalmofarizcomumapequenaporçãodesorofisiológico4. Aspergirsorofisiológiconumadasfolhasdoramomarcadocomocontrolo.5. Espelharumapequenaporçãodeareiamuitofinasobreafolhamolhada6. Embeberumaboladealgodãocomsorofisiológico7. Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão8. Repetirospassos4.e5.numafolhadoramomarcadocomoteste9. Embeberumaboladealgodãocomomaceradodetabacopreparado10. Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão11. Cuidardamanutençãodaplanta12. Observarsemanalmenteasfolhasutilizadasnoensaio13. Registarasobservaçõesefetuadas

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REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)


Observações

Data Folhacontrolo Folhateste

Conclusão:

Notas:

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ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(TRABALHOFINALAUTÓNOMO)

Introdução

Comoparasitasintracelularesobrigatórios,osvírusencontrar-se-ãonosmesmosecossistemasnaturaisondesedesenvolvemosseushospedeiros.

Oscoliformessãobactériasqueseencontramemgrandesquantidadesnotratointestinaldosmamíferos,peloqueédeesperarencontrarbacteriófagosdeE.colinamatériafecalnãotratadaoueminsectosqueapovoem.

ÉobjetivodestaexperiênciademonstrarapresençadefagoslíticosdeE.coli,emdejetosdemamíferosecapacitarosestudantesparaarealizaçãodeumtrabalhoautónomoemVirologia.


¾ Matériafecal,maceradodemoscas,etc.¾ MeiodeculturaTYG(1%triptona;0.5%

extratodelevedura;0,2%glucose)¾ CulturarecentedeE.coli(JF335)emmeio

TYG(diaanterior)¾ CulturarecentedeE.coli(JF417)emmeio

TYG(diaanterior)¾ Banho-mariaa50ºCea42ºC

¾ Estufadeincubaçãoa37ºC¾ Sorofisiológicoestéril¾ PlacasdePetricomagaremTYG¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivo

semi-sólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)¾ Microtuboseppendorfesterilizados¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas

esterilizadas

Procedimentosugerido

Enriquecimento

1. Tomar“umanoz”dematériafecal,50mLdefluidorecolhidodoesgotonãotratado(doméstico,deexploraçãopecuáriaououtro)ouumadúziademoscasdomésticas.1

2. Homogeneizaremaceraromaterialsólidoem25mLdesorofisiológico.Tomaramostradecercade25mLdemateriallíquidooupastoso

3. Centrifugar5000rpmX10minutos.Recuperarsobrenadante.4. Repetircentrifugaçãoatésobrenadantelímpido.5. A20mLdesuspensãolímpidaadicionar:

a. 2,5mLdeLB10Xconcentradob. 2,5mLdeculturadeE.colirecente

6. Incubara37ºCdurante24horas(guardarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte,senecessário)

Clarificação

1. Centrifugar20mLdesuspensãoa5000rpmX10minutos.Recuperarosobrenadante2. Repetiracentrifugaçãoatéàclarificaçãodosobrenadante3. Esterilizarsobrenadante,porfiltração(usarseringaefiltrode0,22nm)atécolmataçãodofiltro4. Homogeneizartodasasamostras5. Conservara4ºC

1 Tratar o material recolhido do esgoto como potencialmente infecioso para o homem. Usar luvas e evitar o contato direto.

Virologia2017/18 45

Amplificaçãodevírus

Prepararumasuspensãoviraldealtotítulo

Isolamentodevírus

Seàobservaçãoforevidenteaexistênciadediferentestiposdeplacasvirais(opacidadeedimensões),selecionarapenasumtipoeamplificar

Titulação

Titularassuspensõesobtidas,tentandoreportaraosníveisdecontaminaçãodomaterialbiológicoinicialmenteutilizado.

Curvadecrescimentodovírus

Estabeleceracurvadecrescimentodovírusisolado.

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ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM


Enriquecimento

Clarificação

Titulação/Isolamento

Amplificação

Titulaçõesespecíficas

Curvadecrescimento

Notas:

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APÊNDICE–MEIOSDECULTURA(FÓRMULAS)

MeiodeculturaLB(stock)

LB10X:

Bacto-triptona 100g

Extratodelevedura 50g

NaCl 100g

H2Odestiladaaté 1000mL

pH7,5.

Autoclavar.Conservarestérila4°C.

MeioLBlíquido

MeioLB10X 100mL

Águadestiladaestéril 900mL

Conservarestérila4ºC.

AgarLBsemi-sólido

MeioLBlíquido 1000mL

Agar 7,5g

Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC.

AgarLBnutritivo

MeioLBlíquido 1000mL

Agar 7,5g

Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC.

CarlosSinogas

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