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Vitamin C enters mitochondria via facilitative glucose transpor ter 1 (Glut1) and confers mitochondrial protection against oxidative injury La Vitamina C Entra en la Mitocondria via transportador facilitador 1 de glucosa (Glut1) y confiere protección mitocondrial contra el daño oxidativo

Sagun KC,*,† Juan M. Cárcamo,‡,1 and David W. Golde*,‡,§ *Department of Pharmacology, Weill Medical College, Cornell University, New York, New York, USA; and †Program in Molecular Pharmacology and Chemis try, ‡Department of Clinical Laboratories, and §Department of Medicine, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York, USA

ABSTRACT Reactive oxygen species (ROS)-induced mitochondrial abnormalities may have important consequences in the pathogenesis of degenerative diseases and cancer. Vitamin C is an important antioxidant known to quench ROS, but its mitochondrial transport and functions are poorly understood. We found that the oxidized form of vitamin C, dehydroascorbic acid (DHA), enters mitochondria via facilitative glucose transporter 1 (Glut1) and accumulates mitochondrially as ascorbic acid (mtAA). The stereo-selective mitochondrial uptake of D-glucose, with its ability to inhibit mitochondrial DHA uptake, indicated the presence of mitochondrial Glut. Computational analysis of N-termini of human Glut isoforms indicated that Glut1 had the highest probability of mitochondrial localization, which was experimentally verified via mitochondrial expression of Glut1-EGFP. In vitro mitochondrial import of Glut1, immunoblot analysis of mitochondrial proteins, and cellular immunolocalization studies indicated that Glut1 localizes to mitochondria. Loading mitochondria with AA quenched mitochondrial ROS and inhibited oxidative mitochondrial DNA damage. mtAA inhibited oxidative stress resulting from rotenone-induced disruption of the mitochondrial respiratory chain and prevented mitochondrial membrane depolarization in response to a protonophore, CCCP. Our results show that analogous to the cellular uptake, vitamin C enters mitochondria in its oxidized form via Glut1 and protects mitochondria from oxidative injury. Since mitochondria contribute significantly to intracellular ROS, protection of the mitochondrial genome and membrane may have pharmacological implications against a variety of ROS-mediated disorders.—KC, S. Cárcamo, J. M., Golde, D. W. Vitamin C enters mitochondria via facilitative glucose transporter 1 (Glut1) and confers mitochondrial protection against oxidative injury. FASEB J. 19, 1657–1667 (2005)

Key Words: ROS • oxidative stress • DNA damage • antioxidants • cellular redox

Mitochondria are centrally involved in the oxidative synthesis of ATP and play a critical role in regulating apoptosis, redox homeostasis, and maintaining cellular transmembrane potential (1). The human mitochondrion contains 2 to 10 molecules of double-stranded, closed circular DNA (mtDNA). The 16.6 kb self-replicating mitochondrial genome encodes 13 proteins, 2 rRNAs, and 22 tRNAs. Proteins encoded by mtDNA are associated exclusively with oxidative phosphorylation and the electron transport chain (ETC), and the remaining mitochondrial proteins are encoded by nuclear DNA (2). Nuclear-encoded proteins enter mitochondria through specialized import pathways (3) using an N-terminal targeting sequence that comprises four or five positively charged amino acid residues aligned isofacially in an amphipathic α-helix (4, 5). Eukaryotic mitochondria have two morphologically distinct membranes. The outer membrane contains nonselective proton pumps, or porins, whereas the inner membrane contains proteins involved in the selective transport of solutes, nucleotides, water, and ions into the mitochondrial matrix. The precise number of transport proteins localized in the mitochondrial inner membrane remains unknown. Reactive oxygen species (ROS) are generated continuously by intracellular oxidative events and mitochondria contribute significantly to the production of intracellular ROS (6). ROS can modify the biological activity of enzymes, modulate intracellular signaling events, and damage biological macromolecules (7). The mtDNA has been shown to be extremely susceptible to the mutagenic

ABSTRACTO Anormalidades mitocondriales inducidas por especies reactivas al oxígeno (ROS), pueden tener conse-cuencias significativas en la patogénesis de enfermedades degenerativas y cáncer. La Vitamina C es un antioxidante importante conocida por apagar los ROS, pero sus funcio-nes mitocondriales y transporte son poco entendidas. Des-cubrimos que la forma oxidada de la Vitamina C, ácido dehidroascórbico (DHA), entra en la mitocondria a través del transportador facilitador de glucosa (Glut1) y se acu-mula mitocondrialmente como ácido ascórbico (mtAA). La absorción mitocondrial de glucosa-D realizada de ma-nera estéreo-selectiva, con su habilidad de inhibir la ab-sorción mitocondrial de DHA, indicó la presencia de Glut mitocondrial. El análisis computado de terminaciones-N de las isoformas humanas Glut indicó que Glut1 tuvo la pro-babilidad más alta de ubicación mitocondrial, lo cual fue verificado experimentalmente a través de la expresión mi-tocondrial de Glut1-EGFP. La importación in vitro de Glut1, análisis inmunoblot de proteínas mitocondriales y estudios de inmunoubicación celular indicaron que Glut1 se ubica hacia la mitocondria. El cargar la mitocondria con ROS mitocondrial apagado por AA y daño inhibido del ADN mitocondrial oxidativo. mtAA estrés oxidativo, inhibido re-sultado de una interrupción de rotenona inducida de la cadena respiratoria mitocondrial, previno la despolariza-ción de la membrana mitocondrial en respuesta a proto-noforo, FCCP. Nuestros resultados muestran que análogos a la absorción celular, la vitamina C entra la mitocondria, en su estado oxidado, via GLut 1 y protege la mitocondria de lesiones de oxidación. Dado que la mitocondria contri-buye grandemente a la ROS intracelular, la protección del genoma mitocondrial puede tener implicaciones farma-cológicas contra una variedad de desórdenes mediados por ROS.

Palabras clave: ROS • estrés oxidativo • daño al ADN •an-tioxidantes • redox celular

Ciertamente la mitocondria está involucrada de manera principal en la síntesis del ATP oxidado y juega un rol crítico en la regulación de apoptosis, redox homeostático, y el mantenimiento del potencial de la membrana célula (1). El mitocondrio humano contiene de 2 a 10 moléculas de ADN circular cerrado de doble cadena (mtADN). Los 16,6 kg de genoma mitocondrial auto replicado codifican 13 proteínas, 2 rRNAs, y 22 tRNAs. Las proteínas codificadas por mtADN están asociadas exclusivamente con fosfori-lación oxidativa y la cadena de transporte de electrones (ETC), y las proteínas mitocondriales restantes están codi-ficadas por el ADN nuclear (2). Las proteínas codificadas nuclearmente ingresan a la mitocondria a través de rutas especializadas de importación usando un Terminal-N en-focándose a una secuencia que abarca cuatro o cinco residuos amino-ácidos cargados positivamente alineados isofacialmente en un α-hélice anfipático (4,5). Mitocondria eucariota tiene dos membranas morfológicamente dis-tintas. La membrana exterior contiene bombas de proto-nes no selectivas, o porinas, donde la membrana interior contiene proteínas involucradas en el transporte selectivo de iones, solutos, nucleótidos y agua, hacia la matriz mi-tocondrial. El número preciso de proteínas transportado-ras ubicadas en la membrana interior mitocondrial es aún desconocido. Las especies reactivas al oxígeno (ROS) son continuamen-te generadas por eventos oxidativos intracelulares y mito-condria, contribuyen significativamente a la producción de ROS intracelular (6). Las ROS pueden modificar la acti-

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effects of ROS (8). To protect itself from the damaging effects of ROS, mitochondria possess elaborate defense mechanisms including ROS-eliminating enzymes (9–12), thiols (13), and water and lipidsoluble antioxidants (14). Vitamin C is a potent antioxidant known to protect tissues from oxidative injury (15, 16). Loading cells with vitamin C reduces oxidative cell death (17, 18), inhibits FAS-induced apoptosis (19), and confers genomic protection (20) through the quenching of intracellular ROS. Vitamin C is a cofactor to enzymes involved in the synthesis of collagen (21) and carnitine (22), and is postulated to be involved in the mitochondrial reduction of α-tocopherol (23) and ferricytochrome c (24). In specialized cells, vitamin C is directly transported as ascorbic acid (AA) via sodium-dependent vitamin C transporters (SVCT) (25, 26). However, most cells transport vitamin C in its oxidized form, dehydroascorbic acid (DHA), via facilitative glucose transporters (Glut), including Glut1 (27). Once inside cells, DHA is reduced and accumulated as ascorbic acid (AA) (28). Glut1 is ubiquitously expressed in cells and up-regulated by malignant transformation (29). Recently, Glut1 was discovered to serve as a receptor for human T cell leukemia virus 1 (HTLV-1) (30). In vivo studies show that mammalian mitochondria contain AA at concentrations that can be increased with dietary vitamin C supplementation (31–33). Mitochondria and mitoplasts isolated from rat liver transport vitamin C (34) and purified plant mitochondria were shown to uptake DHA and glucose (35). However, the precise mechanism of vitamin C uptake by mammalian mitochondria is not known. Here we report that vitamin C enters mitochondria via Glut1 in its oxidized form, DHA, which is reduced and accumulated as mitochondrial AA (mtAA). Our data indicate that by quenching ROS, mtAA protects the mitochondrial genome and membrane from oxidative damages.

MATERIALS AND METHODSCell cultureHuman kidney (293T) and murine fibroblast (NIH/3T3) cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle media containing high glucose (DME-HG) and minimum Eagle media (MEM), respectively, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), and 1% each of penicillin/streptomycin, lglutamine, and sodium pyruvate. Human myeloid leukemia (HL-60) and hepatocarcinoma (HepG2) cells were grown in Iscove’s modified Dulbecco’s media (IMDM) and MEM, respectively, supplemented with 10% FBS, and 1% each of penicillin/streptomycin and l-glutamine.

Isolation of mitochondria and purification mitochondrial DNA (mtDNA)Cells were harvested, pelleted, and mechanically homogenized in 10 pellet volumes of homogenization buffer (HB) (0.25 M sucrose, 10 mM HEPES, 0.3 mM EDTA, pH 7.5). The lysate was centrifuged twice at 700 g to pellet the cell debris and generate a cytoplasmic fraction. Mitochondria were pelleted by centrifuging the cytoplasmic fraction at 12,000 g for 15 min. Pellets were pooled and resuspended in two volumes of sucrose TE buffer (20% sucrose, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5). Aliquots of 5.5 mL of this mitochondria-enriched fraction were layered between sucrose cushion A (1.0 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) and sucrose cushion B (1.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 6 mM EDTA, pH 7.5) and centrifuged for 30 min at 25,000 rpm using a 55.2 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). The mitochondrial layer above cushion B (5 mL) was extracted, combined with five volumes of HB, and centrifuged for 20 min at 15,000 rpm to pellet mitochondria. Pooled mitochondrial pellets were resuspended in appropriate buffers for further studies, or dissolved in guanidine HCl buffer (0.8 M guanidine-HCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 200 µg/mL proteinase K) for isolation of mtDNA. The mtDNA was isolated and purified using a plasmid isolation kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA).

Measurement of AA accumulationAA levels were measured electrochemically using HPLC (Beckman-Coulter) linked to Coul-Array (ESA Inc., Chelmsford, MA, USA). Cells were incubated for 30 min at room temperature in incubation buffer (IB) (15 mM HEPES, 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 , 0.8 mM MgCl2 , pH

vidad biológica de las enzimas, pueden modular eventos intracelulares específicos, y dañar macromoléculas bio-lógicas (7). El ADNmt ha mostrado ser extremadamente susceptible a efectos mutágenos de ROS. Para protegerse de efectos dañinos del ROS, la mitocondria posee meca-nismos elaborados de defensa entre ellos enzimas de eli-minación de ROS, tioles, y antioxidantes solubles en agua y lípidos. La vitamina C es un antioxidante conocido muy potente para proteger a los tejidos de lesiones de oxidativas (15,16). El cargar las células con vitamina C reduce la muerte de células oxidadas (17,18), inhibe la aptosis inducida por FAS (19), y confiere protección al genoma (20) al extinguis las ROS intracelulares. La vitamina C es un co-factor para las enzimas involucrados en la síntesis de colágeno (21) y car-nitina (22) y es postulada a estar involucrada en la reduc-ción mitocondrial de tocoferol-α (23) y ferricitocromo. En células especializadas, la vitamina C es transportada direc-tamente como ácido ascórbico (AA) a través de los trans-portadores de Vitamina C dependientes de sodio (SVCT) (25, 26). Sin embargo, la mayoría de células transportan la vitamina C en su forma oxidada, ácido dehidroascórbi-co (DHA), a través de los transportadores facilitadores de glucosa (Glut), incluyendo el Glut1 (27). Una vez dentro de las células, el DHA es reducido y acumulado como ácido ascórbico (AA) (28). El Glut1 es manifestado en todas par-tes de las células y es regulado por transformación maligna (29). Recientemente, se descubrió que el Glut1sirve como receptor de virus de la leucemia humana de células T tipo 1 (HTLV-1) (30). Estudios en vivo muestran que la mitocon-dria de mamífero contiene AA en niveles que pueden ser incrementados por el consumo de vitamina C a través de suplementos dietarios (31-33). Mitocondria y mitoplasto ais-lados de hígado de rata transportan vitamina C (34) y mi-tocondria purificada de planta han demostrado absorber DHA y glucosa. Sin embargo, los mecanismos precisos de la absorción de vitamina C por mitocondria de mamífero son desconocidos. Aquí reportamos que la vitamina C en-tra en la mitocondria vía Glut1 en su forma oxidada, DHA, la cual es reducida y acumulada como AA mitocondrial (mtAA). Nuestros datos indican que al extinguir las ROS, la mtAA protege el genoma mitocondrial y la membrana de daños oxidativos.

MATERIALES Y METODOS Cultivo Celular Riñón humano (293T) y células de fibroblastos murinos (NIH/3T3) fueron desarrolladas en medio Águila modifica-do de Dulbecco con un contenido alto de glucosa (DME-HG) y mínimo medio Águila (MEM), respectivamente, su-plementados con 10% de suero bovino fetal (FBS), y un 1% de penicilina/estreptomicina en cada uno, L-glutamina, y sodio piruvato. Leucemia mieloide (HL-60) y células de car-cinoma hepatocelular humano (HepG2) fueron desarrolla-das en un Medio Iscove Modificado de Dulbecco (IMDM) y en MEM, respectivamente, suplementado con un 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina y L-glutamina, cada uno.

Aislamiento de la mitocondria y purificación del ADN mito-condrial (mtDNA) Las células fueron recolectadas, comprimidas, y mecá-nicamente homogeneizadas en 10 volúmenes de com-presión de agente homogenización (HB) (0,25 M sucrosa, 10mM HEPES, 0,3 mM EDTA, pH 7,5). El lisato fue puesto en la centrifuga dos veces a 700 g para comprimir la derbis de la célula y generar una fracción citoplasmica. La mitocon-dria fue comprimida centrifugando la fracción citoplasmi-ca a 12.000g durante 15 minutos. Los comprimidos fueron puestos en un fondo en común y suspendidos nuevamente en dos volúmenes de solución de sucrosa TE (20% sucrose, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5). Ejemplares de 5,5 mL de esta fracción enriquecida de mitocondria fueron pues-tos en capas entre el colchón de sucrosa A (1.0 M sucrosa, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5) y el colchón de sucrosa tipo B (1.5 M sucrosa, 10 mM Tris-HCl, 6 mM EDTA, pH 7.5) y fueron centrifugadas durante 30 minutos a una velocidad de 25.000 rpm usando un rotor Ti ultracentrífuga 55,2 (Bec-kman Coulter, Fullerton, CA, USA). La capa mitocondrial sobre el colchón B (5 mL) fue extraída, combinada con cinco volúmenes de HB, y centrifugada por 20 minutos a una velocidad de 15.000 rpm hasta hacerse comprimidos

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7.4) supplemented with DHA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to achieve a defined concentration of intracellular AA. Control uptakes of AA (Sigma-Aldrich) were conducted in the presence of 1 mM DTT. Cells were washed in cold PBS, harvested and counted using a hemocytometer, lysed in ice-cold 60% HPLC-grade methanol (J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA), repelleted, and the supernatant was filtered through a cellulose-acetate filter (Sigma-Aldrich). To determine compartmentalization of intracellularly accumulated AA in mitochondria, mitochondria from control and AAloaded cells were purified, lysed, and the mitochondrially accumulated AA (mtAA) quantified with HPLC-ECD. To measure in vitro uptake of vitamin C in mitochondria, mitochondria were purified as described above and incubated for 30 min in IB containing specified concentrations of DHA. After DHA treatment, mitochondria were washed, lysed, filtered, and the levels of mtAA were measured electrochemically using HPLC-ECD (19). Intracellular and mitochondrial concentrations of AA were calculated using published values for cell volume (20), and mitochondrial volume (34), respectively. For competition assays, purified mitochondria were preincubated for 10 min with d- or l-glucose (0.1, 1.0 mM), followed by a 30 min uptake of 0.5 mM DHA (28). After DHA uptake, mitochondria were washed, lysed, and mtAA content was quantified by electrochemical detection, as described previously.

Mitochondrial uptake of 14C-labeled D- or L-glucosePurified mitochondria were incubated for 30 min at room temperature in IB containing specified concentrations of 14C-labeled d- or l-glucose (50 µCi/mol) (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA). Mitochondria were pelleted, washed with PBS, and lysed with lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 0.2% SDS, pH 7.4). Mitochondrial incorporation of 14C-labeled glucose was determined using scintillation spectroscopy (Beckman-Coulter).

Mitochondrial targeting of Glut1A DNA fragment coding the first 19 amino acids of Glut1 was ligated into an EGFP vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to generate chimeric pGlut1-EGFP using the following primers: Glut1-forward: 5’-CCG GAA TTC AGC GCT GCC ATG GAG CCC AGC AGC AAG AAG CTG ACG GGT CGC CTC ATG CTG GCT GTG GGA TCC ATC-3’ and Glut1-reverse: 5’-GAT GGA TCC CAC AGC CAG CAT GAG GCG ACC CGT CAG CTT CTT GCT GCT GGG CTC CAT GGC AGC GCT GAA TTC CGG-3’. pEGFP and pCMV/Myc/Mito/EGFP (CoxVIII-EGFP) were used as negative and positive controls, respectively. Cells (293T) were transiently transfected with the appropriate plasmid vectors using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 48 h, cells were harvested and incubated for 1 h with 100 nM Mitotracker Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), washed twice with PBS, and mounted onto microscope slides. Cellular localization of proteins was detected by fluorescence microscopy using Retiga 1300 digital camera (Qimaging Inc., Burnaby, B.C., Canada). Images were analyzed with Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Inc., San Jose, CA, USA) and assembled in Canvas 9.0 (Deneba Inc., Miami, FL, USA).

ImmunoblottingProteins in fractionated cellular extracts were resolved by SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and transferred to nitrocellulose membranes. Glut1 polyclonal antibody (Charles River Labs, Wilmington, MA, USA) was used to detect Glut1. The mitochondrial fraction was tested with anti-Mcl1 antibody (Upstate Biotech, Waltham, MA, USA). As controls, antibodies against Lamp1 and Grp78 proteins (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) were used to detect lysosome and endoplasmic reticulum proteins, respectively. HRP-conjugated donkey secondary antibodies were used and proteins were visualized by enhanced chemiluminescence detection system (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

Immunolocalization of Glut1 in cellsCells (NIH/3T3) cultured in 8-well chambers (Nunc Nalgene, Naperville, IL, USA) were fixed with 4% para-formaldehyde for 10 min, washed, and treated with 50% acetone for 30 s. Cells were blocked at room temperature in PBS supplemented with 5% BSA and 0.3% Triton-X, followed by an overnight incubation with Glut1 antibody

de mitocondria. Comprimidos mitocondriales de fondo en común fueron suspendidos agentes apropiados para ma-yores estudios, o disueltas en solución de guanadina HCl (0.8 M guanidina-HCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 200 µg/mL proteinasa K) para aislamiento de mtDNA. La mtDNA fue aislada y purificada usando un kit de aislamiento plás-mido (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA).

Medición de acumulación de AA Los niveles AA fueron medidos electroquímicamente utili-zando HPLC (Beckman-Coulter) conectado a Coul-Array (ESA Inc., Chelmsford, MA, USA). Las células fueron incuba-das por 30 minutos a temperatura ambiental en un tapón incubador (IB) (15 mM HEPES, 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 , 0.8 mM MgCl2 , pH 7.4) complementado con DHA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) para alcanzar la concentración intracelular de AA definida. La absorción de AA en el experimento control (Sigma-Aldrich) fue con-ducida en la presencia de 1mM DTT. Las células fueron lavadas en PBS frio, recolectadas y contadas utilizando un hemocitómetro, luego lisadas en metanol congelado a 60% HPLC (J.T. Baker, Philipsburg, NJ, USA), comprimidas nuevamente y el sobrante fue filtrado a través de un filtro de acetato de celulosa (Sigma-Aldrich). Para determinar la compartimentación de la AA (mtAA) intracelular acu-mulada mitocondrialmente, mitocondria del experimento control y células cargadas de AA fueron purificadas, lisa-das y el AA (mtAA) acumulado mitocondrialmente fue cuantificado con HPLC-ECD. Para medir la absorción in vitro de la vitamina C en la mi-tocondria, se purificó mitocondria, como descrito anterior-mente en este informe, y la misma fue incubada por 30 mi-nutos en IB que contenía concentraciones específicas de DHA. Luego del tratamiento DHA, mitocondria fueron lava-das, pasadas por el proceso de lisis, filtradas, y los niveles de mtAA fueron medidos electro-químicamente utilizando HPLC-ECD. Concentraciones intracelulares y mitocondria-les de AA fueron calculadas utilizando valores publicados del volumen celular, y de volumen mitocondrial, respecti-vamente. Para análisis de competencias, mitocondria puri-ficada fue pre-incubada por 10 minutos con D- o glucosa-L (0.1, 1.0 mM) seguido por una absorción de 0,5 mM DHA de 30 minutos. Luego de la absorción DHA, la mitocondria fue lavada, lisada y el contenido de mtAA fue cuantifica-do a través de detección electro-química como descrito previamente.

Absorción mitocondrial de glucosas 14C-, D-, o L- Mitocondria purificada fue incubada durante 30 minutos a una temperatura de ambiente en IB que contenía con-centraciones específicas de glucosas C-, D-, o L- (50 µCi/mol) (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA). La mitocondria fue puesta en comprimidos, lavada con PBS, y pasada por el proceso de lisis celular con un tapón de lisis (50 mM Tris-HCl, 0.2% SDS, pH 7.4). La incorporación de glucosa etiqueta-da C- fue determinada usando espectroscopia centellar (Beckman-Coulter).

Búsqueda Mitocondrial de Glut1Una codificación de un fragmento de ADN de los prime-ros 19 amino ácidos de Glut1 fue ligado a un vector EGFP (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) para generar pGlut1-EGFP quimérico utilizando los siguientes cebadores: Glut1-fron-tal: 5’-CCG GAA TTC AGC GCT GCC ATG GAG CCC AGC AGC AAG AAG CTG ACG GGT CGC CTC ATG CTG GCT GTG GGA TCC ATC-3’ y Glut1-reverso: 5’-GAT GGA TCC CAC AGC CAG CAT GAG GCG ACC CGT CAG CTT CTT GCT GCT GGG CTC CAT GGC AGC GCT GAA TTC CGG-3’. pEGFP y pCMV/Myc/Mito/EGFP (CoxVIII-EGFP) fueron uti-lizados como controles negativos y positivos, respectiva-mente. Células (293T) fueron transitoriamente transfecta-das con los vectores apropiados usando Lipofectamina de Invitrogen. Luego de 48 horas, las células fueron recolecta-das e incubadas por una hora con 100 nM Mitotracker Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), lavadas dos horas con PBS, y montadas a los portaobjetos para microscopio usando una cámara digital Retiga 1300 (Qimaging Inc., Burnaby, B.C., Canada). Las imágenes fueron analizadas con Photoshop Adobe 7,0 (Adobe Inc., San Jose, CA, USA) y ensambladas en Canvas 9,0 (Deneba Inc., Miami, FL, USA).

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(1:200). Cells were washed twice with PBS and incubated for 6 h at 4°C with 1:2000 dilution of FITC-conjugated goat-anti-rabbit secondary antibody (Sigma-Aldrich). Alternatively, rhodamine-conjugated goat-anti-rabbit secondary antibody (Molecular Probes) was used in cells transfected with CoxVIII-EGFP. Intracellular colocalization of mitochondria, as detected by the mitochondrially targeted CoxVIII-EGFP or Mitotracker Red, with Glut1 was visualized with a Leica TCS SP2 confocal microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

In vitro mitochondrial import of Glut1Glut1 was transcribed and translated in vitro using the TNT rabbit reticulocyte lysate system supplemented with canine microsomal membranes (Promega, Madison, WI, USA). In vitro synthesized CoxVIII-EGFP and EGFP were used as positive and negative controls, respectively. Mitochondrial pellets purified from 293T cells were resuspended in import buffer (250 mM sorbitol, 10 mM ATP, 2 mM MgSO4, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, supplemented with 0.2% BSA) and incubated with the in vitro synthesized proteins in the TNT reaction mixture (3:1 ratio v/v) for 30 min at room temperature. Mitochondrial pellets were washed twice with import buffer to remove nonspecifically bound proteins and lysed with 0.2% SDS buffer (50 mM Tris, 0.2% SDS, pH 7.4). A negative control import assay was performed in the absence of mitochondria. Equal amounts of mitochondrial lysates were resolved using SDS-PAGE and probed with antibodies against Glut1. For analysis of mitochondrial import of control proteins (CoxVIII-EGFP or EGFP), the mitochondrial lysate retrieved after the translocation reaction was spotted on a nitrocellulose membrane and the imported GFP-tagged proteins were visualized by fluorescence microscopy. The relative mitochondrial localization of control proteins is indicated by their fluorescence intensities, as quantified by NIH Image.

Mitochondrial production of ROSMitochondrial ROS was quantified by measuring superoxide (–•O2), hydrogen peroxide (H2O2), and hydroxyl radical (•OH) generated by purified mitochondria using these fluoremetric probes (Molecular Probes): dihydroethidium for –•O2 formation, Amplex Red for H2O2 generation, and dihydrorhodamine 123 for •OH formation (36). All measurements were made with Fluoroskan Ascent FL fluorometer (ThermoElectron Corp., Waltham, MA, USA). To test the effect of AA on mitochondrial ROS, equal amounts of purified mitochondria were preloaded with a defined concentration of mtAA, washed, and incubated for 30 min in the presence or absence of 10 µM 2,3-dimethoxy-1-naphthoquinone (DMNQ) as an oxidative stressor (37) (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA). Alternatively, to analyze the role of vitamin C against oxidative stress resulting from the disruption of the mitochondrial respiratory chain (ETC), cells or mitochondrial suspensions were loaded with or without vitamin C and treated for 1 h with 1 µM of the complex I inhibitor, rotenone (38). Cells or purified mitochondria were pelleted, washed, layered equally onto 96-well plates (Corning Inc., Corning, NY, USA), and incubated for 30 min at 37°C with the appropriate fluoremetric probes. Background fluorescence of the cellular/mitochondrial suspension and the reduced probe were subtracted from the measured fluorescence. Measurements are expressed as a percentage of controls.

Mitochondrial DNA damagePurified mitochondria were preloaded with a defined concentration of mtAA, washed, and treated for 60 min with either H2O2 (Fisher Scientific) or a combination of 0.1 mM Cu2+ and H2O2. Mitochondrial DNA was treated with nuclease P1 and alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich) using previously described methods (20). Equal amounts of digested samples were eluted through a modified C-18 column (Phenomenex) using HPLC mobile phase buffer (0.1 M lithium acetate, 10% methanol, pH 5.0) at a flow rate of 1.0 mL/min. The 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG) content in mtDNA was measured using peak areas derived from standard 8-oxo-dG samples (ESA) and expressed as µg 8-oxodG/ mg of total mtDNA. Alternatively, the levels of apurinic/ apyrimidic (AP) sites in isolated mtDNA were quantified colorimetrically using an AP-site quantification kit (Dojindo Inc., Gaithersburg, MD, USA). For

Análisis InmunoblotLas proteínas en extractos fraccionados de célula fue-ron resueltas por SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y transferidas a membranas de nitrocelulosa. El anticuerpo policlonal Glut1 (Charles River Labs, Wilmington, MA, USA), la fracción mitocondrial fue probada con anticuerpo anti-Mel1 (Upstate Biotech, Waltham, MA, USA). Como con-troles, anticuerpos en contra de Lamp1 y proteínas Grp78 (Biosciences, San Jose, CA, USA) fueron usados para de-tectar lisosoma y proteínas del retículo endoplásmico, res-pectivamente. Anticuerpos secundarios HPR-conjugados de burro fueron usados y proteínas fueron visualizadas por una detección mejorada de un sistema de quimoluminis-cencia (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

Immunolocalización de Glut1 en células Células (NIH/3T3) cultivadas en recamaras de 8 platos (Nunc Nalgene, Naperville, IL, USA) fueron arregladas con un 4% paraformadehido durante 10 minutos, lavadas, y tratadas con 50% de acetona por 30 s. Las células fueron bloqueadas a temperatura ambiental en PBS complemen-tados con 5% BSA y 0,3% Triton-X, seguidos por una incuba-ción de una noche con anticuerpo Glut1 (1:200). Células fueron lavadas dos veces con PBS e incubadas por 6h a una temperatura de 4 °C con una dilución 1:2000 de an-ticuerpos secundarios FITC-conjugados cabra-anti-conejo (Sigma-Aldrich). De manera alternativa, cabra-anti-conejo anticuerpo secundario con rodamina fue usado en células transfectadas con CoxVIII-EGFP. Colocalisación intracelu-lar de mitocondria, como detectado mitocondrialmente, tuvo como CoxVIII-EGFP o Mitotracker Red, con Glut1 fue visualizado con microscopio confocal Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

Importación mitocondrial in vitro de Glut1Glut1 fue trasladado y transcrito in vitro usando el siste-ma TNT retículo lisado de conejo complementado con membranas microsomales caninas (Promega, Madison, WI, USA). CoxVIII-EGFP y EGFP sintetizados in vitro fueron utilizados como controles positivos y negativos, respecti-vamente. Bolitas purificadas de mitocondria desde células 293T fueron suspendidas nuevamente en el tapón de im-portación (250 mM sorbitol, 10 mM ATP, 2 mM MgSO4, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, complementado con 0.2% BSA) e incubadas con proteínas sintetizadas in vitro en la mezcla TNT reactiva (3:1 ratio v/v) durante 30 minutos en tempe-ratura ambiente. Comprimidos mitocondriales fueron la-vados dos veces con un agente de importación para re-mover proteínas ligadas no especificas y lisados con 0,2% SDS (50 mM Tris, 0.2% SDS, pH 7.4). Un análisis de control de importación negativo fue realizado en ausencia de la mitocondria. Cantidades iguales de lisatos mitocondriales fueron hechas solución química usando SDS-PAGE y exa-minadas con anticuerpos contrarios al Glut1. Para análisis de importación mitocondrial de proteínas de control (Cox-VIII-EGFP o EGFP), los lisatos mitocondriales retirados luego de la reacción de trans ubicación fueron identificados en una membrana nitro celulosa y las proteínas importadas etiquetadas por GFP fueron identificadas por microsco-pio floreciente. La ubicación mitocondrial relativa de las proteínas de control es indicada por sus intensidades flore-cientes, como ha sido cuantificado por la imagen NIH.

Producción Mitocondrial de ROS El ROS mitocondrial fue cuantificado al medir superóxido (–•O2), peróxido de hidrogeno (H2O2), e hidroxilo radical (•OH) generado por mitocondria purificada en uso de son-das fluorométricas (Sondas Moleculares): dihydroethidium para formación de –•O2, Amplex Rojo por generación H2O2, y di-hidrorodamina 123 por formación •OH (36). To-das las medidas fueron calculadas con Fluoroskan Ascent FL fluorometro (ThermoElectron Corp., Waltham, MA, USA). Para probar el efecto AA en el ROS mitocondrial, canti-dades iguales de mitocondria purificada fueron cargadas previamente, con una concentración definida de mtAA, lavadas, e incubadas por 30 minutos en la presencia o au-sencia de 10 µM 2,3-dimetoxido-1-naftoquinona (DMNQ) como un estresante oxidativo (37) (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA). De manera alternativa, para poder analizar el rol de la Vitamina C en contra del estrés oxidati-vo resultante de la interrupción de la cadena mitocondrial respiratoria (ETC), células o suspensiones mitocondriales

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analysis of H2O2-induced mtDNA fragmentation, purified mitochondria were incubated with 1.0 mM H2O2 for 1 h and 1 µg of the isolated mtDNA was resolved using a 1% agarose gel. The resolved mtDNA was stained with SYBR Green I (Molecular Probes).

Loss of mitochondrial membrane potential (ΔΨm)Human myeloid HL-60 cells were preloaded with or without AA, washed, and incubated in the dark for 30 min in media containing 100 nM 3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC(6) (3); Molecular Probes). A 10 min pretreatment with carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) in 0–50 µM concentrations (Sigma Aldrich) was used to disrupt mitochondrial membrane potential. A threshold level of ΔΨm, derived from the mitochondrial retention of DIOC(6) (3) in control population of live cells, was used to analyze the loss of ΔΨm in response to CCCP, as determined by flow cytometry (BD Immunocytometry).

Statistical tests and analysisAll statistical tests were performed with Graphpad Prism 4.0 (Graphpad Inc., San Diego, CA, USA). All values are denoted as means ± sd unless otherwise noted.

RESULTSDHA is transported into mitochondria and accumulates as AACells (293T) accumulate ascorbic acid (AA) intracellularly through the uptake of DHA, the oxidized form of vitamin C (Fig. 1A). We observed a dose-dependent increase in intracellular AA in response to extracellularly administered DHA. However, incubation with extracellular AA did not elevate intracellular AA levels after 30 min of incubation. Mitochondria isolated from cells loaded with AA via DHA treatment also showed a concentration-dependent increase in mitochondrially accumulated AA (mtAA) with respect to the extracellularly administered DHA (Fig. 1B). These results indicate that cellular uptake of DHA results in cytosolic and mitochondrial accumulation of AA in 293T cells. It was previously reported that purified rat mitochondria take up DHA but not AA (33, 34). Therefore, to determine the mechanism of DHA transport in mitochondria, we first performed in vitro DHA uptake studies with purified mitochondria. Incubating purifiedmitochondria with 0.1 or 0.5 mM DHA for 30 min led to 5- and 10-fold increases in mtAA levels comparedwith control, respectively (Fig. 1C) (Dunnett’s multiple comparison test, P<0.01). A mitochondrial concentration of 2.0±0.5 mM AA was achieved with 0.5 mM DHA (Fig. 1C) whereas treatment with 0.5 mM AA did not appreciably increase levels of mtAA (data not shown). Our results show that DHA is the form of vitamin C transported in purified human mitochondria, in agreement with previous reports on DHA uptake in rat (33) and plant (35) mitochondria.

Mitochondrial uptake of DHA involves a facilitative glucose transporterSince vitamin C is universally transported in cells via plasma membrane facilitative glucose transporters (Glut), we reasoned that mitochondrial uptake of DHA also occurs through a facilitative glucose transporter. Since Gluts are stereo-selective in their transport properties, we investigated the competitive effect of dglucose on the mitochondrial uptake of DHA. Preincubation of purified mitochondria with 1.0 mM d-glucose before treatment with 0.5 mM DHA led to a significant reduction in mtAA accumulation (Dunnett’s multiple comparison test, P<0.01) (Fig. 1D). However, preincubation with the same concentration of the nontransportable l-glucose had no effect, suggesting that the transport of DHA into mitochondria involves a facilitative glucose transporter. Furthermore, we found that purified mitochondria preferably uptake d-glucose, but not l-glucose (Student’s t test, P<0.05) (Fig. 1E). These studies with purified mitochondria indicate the involvement of a functional Glut in the mitochondrial uptake of vitamin C.

Glut1 localizes to the mitochondrial membraneLocalization of cellular proteins in mitochondria is partially dependent on the N-terminal sequence of the targeted proteins. We therefore analyzed the probability of mitochondrial localization of glucose transporters on the basis of their N-terminal sequences using prediction programs available through the Expert Protein Analysis System (EXPASY)

fueron cargadas de vitamina C o sin Vitamina C y tratadas por 1 hora con 1 µM del complejo inhibidor I, rotenona (38). Las células o mitocondria purificada fueron comprimidas, lavadas y esparcidas de manera igual en superficies de 96 platos (Corning Inc., Corning, NY, USA), luego fueron incu-badas por 30 minutos a 37°C con las sondas fluorométricas apropiadas. El trasfondo fluorescente de la suspensión de la mitocondria celular y de la sonda reducida fue restado de la medida fluorescente. Las medidas son expresadas como un porcentaje de los controles.

Daño en el ADN mitocondrialMitocondria purificada fue cargada previamente con una concentración especifica de mtAA, lavadas, y tratadas por 60 minutos con uno de dos: H2O2 (Fisher Scientific) o una combinación de 0.1 mM Cu2+ y H2O2. ADN mitocondrial fue tratado con nucleasa P1 y fosfatase alcalina (Sigma-Al-drich) utilizando métodos puntualizados previamente (20). Cantidades iguales de muestras digeridas fueron disueltas a través de una columna modificada de C-18 (Phenome-nex) utilizando tapón en fase móvil HPLC (0.1 M acetato de litio, 10% metanol, pH 5.0) a una tasa de flujo de1.0 mL/min. El contenido de 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxiguanosin (8-oxo-dG) en mtADN fue cuantificado utilizando áreas pico derivadas de muestras estándares de 8-oxo-dG (ESA) y expresadas como µg 8-oxodG/mg del total de mtADN. De manera alternativa, los niveles de lugares de apurínico/apirimidínico (AP) en mtDNA aislado fueron cuantificados colorimétricamente usando un kit de cuantificación AP en sitio (Dojindo Inc., Gaithersburg, MD, USA). Para analizar la fragmentación de mtADN inducida por H2O2, se incubó mitocondria purificada con 1.0 mM H2O2 durante 1 h y 1 µg de la mtADN aislada fue determinada usando un 1% de gel de agarosa. El mtADN determinado fue manchado con Verde I SYBR (Molecular Probes).

Pérdida del potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm)Células HL-60 de mieloide humano fueron previamente cargadas con o en ausencia de AA, lavadas, e incubadas en la oscuridad por 30 minutos en medio conteniendo 100 nM 3,3’-dihexyloxacarbocyanine yoduro (DiOC(6) (3); Son-das Moleculares). Se utilizó un tratamiento previo de 10 mi-nutos con carbolino de cianuro m-chlorophenylhydrazone (CCCP) en concentraciones 0–50 µM (Sigma Aldrich) para disturbar el potencial de la membrana mitocondrial. Se uti-lizó un nivel de umbral de ΔΨm, derivado de la retención mitocondrial de DIOC(6) (3) en la población de células control, para analizar la pérdida de ΔΨm como reacción a CCCP, así como fue determinado por la citometría de flujo (BD Immunocytometry).

Pruebas Estadísticas y AnálisisTodas las pruebas estadísticas se realizaron con un Prisma Graphpad 4.0 (Graphpad Inc., San Diego, CA, USA). Todos los valores fueron denotados como medios ±sd a excep-ción de aquellos que notifican lo contrario.

RESULTADOSDHA es transportado dentro de la mitocondria y se acumu-la como AACélulas (293T) acumulan acido ascórbico (AA) de manera intracelular al absorber el DHA, la forma oxidada de la Vi-tamina C (Fig. 1A). Se observó un incremento dependiente de la dosis en AA intracelular como respuesta a DHA admi-nistrado externamente. Sin embargo, incubación con AA extracelular no evaluó los niveles intracelulares de AA lue-go de 30 minutos de incubación. La mitocondria aislada de células cargadas con AA a través de tratamiento DHA también mostraron un incremento atado a la concentra-ción en AA acumulada mitocondrialmente con relación a la que fue administrada extra celularmente DHA (Fig. 1B). Estos resultados muestran que la absorción del DHA resulta en acumulación citosólica y mitocondrial de AA en células 293T. Previamente se reportó que mitocondria de rata purificada absorbe DHA, aunque no absorbe AA (33, 34). Así que, para determinar el mecanismo de transporte de DHA en la mitocondria, primero realizamos estudios de absorción in vitro de DHA utilizando mitocondria purifica-da. Incubar mitocondria purificada con 0.1 o 0.5 mM DHA durante 30 minutos incrementos de led a 5- y 10-veces en los niveles mtAA comparados al experimento control, res-

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server. The first 60 amino acids of human glucose transporter isoforms were analyzed for mitochondrial localization using TargetP(39), Mitoprot (40), and Predotar (41). The output scores obtained from individual programs indicate probability of mitochondrial localization. We used Nterminal sequence (60 amino acids) of human cytochrome oxidase subunit VIII (CoxVIII) and myeloid cell leukemia 1 (Mcl1) as positive controls. Computational analysis of N-terminal sequences of human Glut isoforms revealed that Glut1 has the highest probability of mitochondrial localization (Fig. 2A). The mitochondrial localization probability for Glut1 was consistently higher in all prediction assays than any other isoform of glucose transporters analyzed. For example, based on TargetP analysis, the mitochondrial localization probability of myeloid cell leukemia 1 (Mcl1) protein (0.161), a Bcl2 homologue known to localize to the mitochondrial membrane (42), was similar to the output score of Glut1 (0.169). We have highlighted several positively charged amino-acid residues in the N terminus of Glut1 that may be involved in mitochondrial targeting. Based on these analyses, our theoretical prediction is that Glut1 localizes to mitochondria in human cells.

Figure 1. Mitochondrial transport of vitamin C involves a facilitative glucose transporter. A) Intracellular and B) mitochondrial accumulation of ascorbic acid (AA) in 293T cells incubated with extracellular DHA (●) or AA (○). AA levels were measured electrochemically with HPLC-ECD. C) Mitochondrial ascorbic acid levels in purified mitochondria incubated for 30 min with DHA. Asterisks indicate statistical significance (Dunnett’s multiple comparison test, P<0.01). D) Stereo-selective inhibition of 0.5 mM DHA uptake by d-glucose (■) or l-glucose (□) in purified mitochondria. Asterisk indicates statistical significance (Dunnett’s multiple comparison test, P<0.01). E) Stereo-selective uptake of labeled d-glucose (■) or l-glucose (□) in purified mitochondria. *Statistical significance (Student’s t test, n=3, P<0.05).

To experimentally test for the role of N-terminal Glut1 in mitochondrial targeting, we created a chimeric vector (pGlut1-EGFP) encoding the first 19 amino acids of Glut1 fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP). Cells (293T) transiently transfected with pGlut1-EGFP revealed differential pattern of expression compared with the cells transfected with pEGFP. EGFP was ubiquitously expressed in both the cytoplasm and the nuclei of transfected 293T cells, whereas Glut1-EGFP was expressed in distinct cytosolic areas. Cells stained with Mitotracker Red revealed a strong colocalization of Glut1-EGFP with mitochondria whereas EGFP did not colocalize with mitochondria (Fig. 2B). The expression pattern of Glut1-EGFP was similar to CoxVIII-EGFP, a mitochondrially targeted chimeric protein. These results indicate that the N terminus of Glut1 functions as a mitochondrial targeting sequence.

To physically confirm that Glut1 localizes to mitochondria, we analyzed for the presence of Glut1 in purified mitochondrial extracts via immunoblotting. Glut1 was detected as a 54 kDa protein in mitochondrial (Mito), plasma membrane (PM), and endoplasmic reticulum (ER) fractions (Fig. 2C). The mitochondrial extract was positive for Mcl1 but negative for Grp78 (ER protein) and Lamp1 (lysosomal protein), indicating the purity of the mitochondrial

pectivamente (Fig. 1C) (Prueba de Múltiples comparacio-nes de Dunnett, P<0.01). Se alcanzó una concentración mitocondrial de 2.0±0.5 mM AA con 0.5 mM DHA (Fig. 1C) donde el que fue tratado con 0.5 mM AA no incrementó los niveles de mtAA en niveles significativos (data no publi-cada). Nuestros resultados muestran que DHA es una de las manifestaciones y formas de la vitamina C que es trans-portada en mitocondria humana, así como demostrado en reportes previos sobre la absorción de DHA en mitocon-dria de ratas (33) y plantas (35).

La absorción de DHA involucra un facilitador transportador de glucosa Dado que la vitamina C es transportada de manera uni-versal a las células vía transportadores de glucosa facili-tadores de membrana plasmática (Glut), razonamos que la absorción mitocondrial de DHA ocurre también a tra-vés del facilitador transportador de glucosa. Dado que los Gluts son estéreo-selectivos en sus propiedades de trans-porte, investigamos el efecto competitivo de dglucosa en la absorción mitocondrial del DHA. Incubación previa de mitocondria con un 1.0 mM d-glucose previo al tratamien-to con 0.5 mM DHA canaliza a una reducción significativa de la acumulación de mtAA (Prueba de comparaciones múltiples de Dunnett P<0.01) (Fig. 1D). Sin embargo, la pre-incubación bajo la misma concentración de l-glucosa no-transportable no tuvo efecto alguno, sugiriendo así que el transporte de DHA hacia la mitocondria implica al facilita-dor transportador de glucosa. Aun mas, hemos encontra-do que mitocondria purificada absorbe preferiblemente la glucosa D, pero no la glucosa L (Prueba t por estudiante, P<0.05) (Fig. 1E). Estos estudios con mitocondria purificada indican el involucramiento del Glut funcional en la absor-ción mitocondrial de vitamina C.

Figura 1. El transporte mitocondrial de vitamin C involucra un transportador facilitador de glucosa. Acumulación de ácido ascórbico (AA) en células 293T incubadas con DHA extracelular (●) o AA (○) A) Intracelular y B) mitocondrial. Los niveles de AA fueron medidos electroquímicamente con HPLC-ECD. C) Niveles de ácido ascórbico mitocondrial en mitocondria purificada incubada por 30 min con DHA. Los asteriscos indican significancia estadística (Prueba de comparación múltiple de Dunnett, P<0.01). D) Inhibición estereo-selectiva de absorción de 0.5 mM DHA por d-glucosa (■) o l-glucosa (□) en mitocondria purificada. El asterisco indica significancia estadística (Prueba de comparación múltiple de Dunnett, P<0.01). E) Absorción estereo-selectiva d-glucosa (■) o l-glucose (□) en mitocondria purificada. *Ssignificancia estadística (Prueva de Estudiante, n=3, P<0.05).

Glut1 se localiza hacia la membrana mitocondrialLa localización de proteínas celulares en la mitocondria es parcialmente dependiente de la secuencia N-terminal de las proteínas objetivo. Por lo cual nosotros analizamos la probabilidad de la localización mitocondrial de transpor-tadores de glucosa en base a sus secuencias terminales-N utilizando programas de predicción disponibles a través del servidor (EXPASY) Sistema Experto de Análisis de Proteí-na. Los primeros 60 amino ácidos de isoformas de transpor-tadores de glucosa humana fueron analizados por la loca-lización mitocondrial utilizando TargetP (39), Mitoprot (40) y Predotar (41). Las cifras resultantes obtenidas de progra-mas individuales indican la probabilidad de localización mitocondrial. Utilizamos la secuencia Nterminal (60 ami-no ácidos) de subunidad VIII citocroma oxidasa humana (CoxVIII) y de célula mieloide de leucemia 1 (Mcl1) como controles positivos. Análisis computarizado de secuencias de terminal-N de isoformas Glut humanas revelaron que Glut1 tiene la probabilidad más alta de localización mi-tocondrial (Fig. 2A). La probabilidad de localización mito-condrial para Glut1 fue consistentemente mayor en todos los análisis de predicción que cualquier otra isoforma de transportadores de glucosa analizados. Por ejemplo, ba-sado en el análisis TargetP, la probabilidad de localización mitocondrial de la proteína (0.161) de la célula mieloide de leucemia 1 (Mcl1), un Bc12 análogo conocido por lo-calizarse hacia la membrana mitocondrial (42), fue similar al resultado numérico de Glut1 (0.169). Hemos resaltado algunos residuos de amino ácidos con carga positiva, en los terminales N, de Glut1 que pueden estar involucrados en la ubicación mitocondriales. Basado en estos análisis, nuestra predicción teórica es que Glut1 se localiza a la mi-tocondria en células humanas. Para probar experimentalmente el rol de terminal-N Glut1 en objetivos mitocondriales, a través de experimentos,

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fractions. These results indicate physical presence of Glut1 in the mitochondrial fractions. Immunodetection of Glut1 in NIH/3T3 cells with confocal microscopy revealed strong overlapping of Glut1 with mitochondria, as detected by Mitotracker Red (Fig. 2D). Immunodetection of Glut1 overlapped with mitochondrial expression of CoxVIII-EGFP (Fig. 2E). Taken together, these results indicate that Glut1 localizes to mitochondria in mammalian cells. To examine the translocation of Glut1 into mammalian mitochondria, we performed a mitochondrial import assay of in vitro translated Glut1, CoxVIII-EGFP or EGFP. In vitro synthesized proteins were incubated with purified mitochondria for 1 h and the mitochondrial import of full-length Glut1 was assessed with immunodetection. The presence of a denser band in Glut1- supplemented mitochondrial fraction indicates that Glut1 was imported into mitochondria (Fig. 2F ). Endogenous mitochondrial Glut1 in equal amounts was observed in CoxVIII-EGFP and EGFP-supplemented mitochondrial fractions but absent in the control reaction, which was not supplemented with purified mitochondria. Analysis of mitochondrial import of CoxVIIIEGFP or EGFP by fluorescence detection indicated that CoxVIII-EGFP translocated to mitochondria whereas EGFP did not. These results indicate that Glut1 is capable of mitochondrial import in human cells.

Figure 2. Glucose transporter 1 (Glut1) localizes to mitochondria in human cells. A) Prediction of mitochondrial localization of human facilitative glucose transporter isoforms using TargetP, Mitoprot, and Predotar. Multiple sequence alignment of the N-termini of glucose transporters with the positively charged amino acids (boldface) and the consensus amino acids (highlighted). The N-termini of two mitochondrial proteins, Mcl1 and cytochrome oxidase subunit VIII (CoxVIII), are included as reference. The probability of mitochondrial localization correlates with the output scores of individual programs. B) Intracellular localization of transiently expressed EGFP, Glut1-EGFP, and CoxVIII-EGFP in 293T cells, as measured by GFP fluorescence (upper panel). Cytosolic localization of mitochondria is shown with Mitotracker Red (lower panel). C) Cellular (Total), mitochondrial (Mito), plasma membrane (PM), and endoplasmic reticulum (ER) proteins were analyzed by immunoblotting using specific antibodies against Glut1, Mcl1, Lamp1 (lysosomespecific protein), and Grp78 (ER-specific protein). D) Immunolocalization of Glut1 in NIH/3T3 cells was analyzed by confocal microscopy using Mitotracker Red to visualize mitochondria. Control cells were incubated with FITCconjugated secondary antibody alone. E) Immunolocalization studies performed on CoxVIIIEGFP transfected NIH/3T3 cells using CoxVIIIEGFP as a mitochondrial marker. Control cells were incubated with rhodamine-conjugated secondary antibody alone. F) Mitochondria purified from 293T cells were incubated with in vitro synthesized Glut1, CoxVIII-EGFP, and EGFP and mitochondrial import of Glut1 was assessed by Glut1 immunoblotting. A null import assay performed in absence of mitochondria is indicated as control. Fluorescence intensities of GFP-tagged control proteins (CoxVIII-EGFP and EGFP), as quantified by NIH Image, were used to assess mitochondrial import.

creamos un vector quimérico (pGlut1-EGFP) codificando los primeros 19 amino ácidos de Glut1 fusionados para au-mentar proteína floreciente verde (EGFP). Células (293T) transfectadas transitoriamente con pGlut1-EGFP mostraron un patrón de expresión diferenciado en comparación a las células transfectadas con pEGFP. El EGFP fue expresado en todos los lugares tanto en el citoplasma como en el nu-cleo de células transfectadas 293T, en donde Glut1-EGFP se expresó en áreas citosólicas diferentes. Células que fue-ron marcadas con Mitotracker Red mostraron una fuerte colocalización de Glut1-EGFP con mitocondria, mientras que EGFP no colocalizó con mitocondria (Fig. 2B). El patrón de expresión de Glut1-EGFP fue similar a CoxVIII-EGFP, una proteína quimérica dirigida a la mitocondria. Estos resulta-dos indican que los terminales-N del Glut1 funciona como una secuencia dirigida a la mitocondria. Para comprobar físicamente que el Glut1 se localiza en mi-tocondria analizamos la existencia de la presencia de Glut1 en extractos mitocondriales purificados vía inmunotransfe-rencia. Glut2 fue detectado como la proteína 54kDa en mitocondria (Mito), membrana plasma (PM), y fracciones de retículo endoplásmico (ER) (Fig. 2C). El extracto mito-condrial fue positivo para Mcl1 pero negativo para Grp78 (proteína ER) y Lamp1 (proteína limosomal), indicando así la pureza de las fracciones mitocondriales. Estos resultados indican la presencia física de Glut1 en fracciones mitocon-driales. Inmuno detección de Glut1 en células NIH/3T3 con microscopia confocal reveló fuerte sobrepuesto en capas de Glut1 con mitocondria, detectado por Mitotracker Red (Fig. 2D). Immunodetección de Glut1 sobrepuesto con ex-presión mitocondrial de CoxVIII-EGFP (Fig. 2E). En conjunto, estos resultados indican que Glut1 localiza a mitocondria en células mamíferas. Para examinar la translocación de Glut1 en mitocondria mamífera, realizamos un análisis de importación mito-condrial de Glut1 traducido in vitro, CoxVIII-EGFP o EGFP. Proteínas sintetizadas in vitro fueron incubadas con mito-condria purificada durante 1 hora y la importación mito-condrial de Glut1 de longitud completa fue analizada con inmunodetección. La presencia de una banda más densa en la fracción mitocondrial de Glut1 indica que el Glut1 fue importado hacia la mitocondria (Fig. 2F ). Se pudo observar Glut1 mitocondrial endógeno en partes iguales en CoxVIII-EGFP y EGFP fracciones complementadas mi-tocondrialmente, pero ausentes en la reacción control, la cual no fue complementada con mitocondria purificada. Análisis de la importación mitocondrial de CoxVIIIEGFP o EGFP por detección fluorescente indicó que CoxVIII-EGFP se translocó hacia la mitocondria mientras que EGFP no lo hizo. Estos resultados indican que Glut1 es capaz de impor-tación mitocondrial a las células humanas.

Figura 2. El transportador 1 de glucosa (Glut1) se localiza hacia la mitocondria en células humanas. A) Predicción de la localización mitocondrial de las isoformas del transportador de glucosa facilitativa humana usando TargetP, Mitoprot y Predotar. Alineación de múltiple secuencia del terminal-N de los transportadores de glucosa con los amino ácidos positivamente cagados (negritas) y el consenso de amino ácidos (resaltado) Multiple sequence alignment of the N-termini of glucose transporters with the positively charged amino acids (boldface) and the consensus amino acids (highlighted). El terminal-N de dos proteinas mitocondriales, Mcl1 y citocromo oxidasa subunidad VIII (CoxVIII), estan incluidas como referencia. La probabilidad de la localización mitocondrial se corelaciona con los datos de salida de los programas individuales. B) La localización intracelular del EGFP temporalmente expresado, Glut1-EGFP y CoxVIII-EGFP en células 293T, como se miden por fluoroluminicencia GFP (panel superior). La localización citosólica de la mitocondria se demuestra con Mitotracker Rojo (panel inferior). C) Proteinas celular (Total), mitocondrial (Mito), membrana de plasma (PM) y retículo endoplasmática (ER) fueron analisadas por inmunoblot usando anticuerpos específicos contra el Glut1, Mcl1, Lamp1 (proteina lisosomaespecífica) y Grp78 (proteina ER-especifica). D) La inmunolocalización del Glut1 en células NIH/3T3 cells fue analizada con microscopio confocal usando Mitotracker Rojo para visualizar la mitocondria. Células control fueron incubadas con solo anticuerpo secundario FITCconjugado. E) Estudios de inmunolocalización seguidos en células NIH/3T3 transfectadas en CoxVIIIEGFP usando CoxVIIIEGFP como marcador mitocondrial. Células control fueron incubadas con solo anticuerpo secundario rodamina-conjugada. F) Mitocondria purificada de células 293T fue incubada con Glut1 sitetizado in vitro, CoxVIII-EGFP y EGFP, e importe mitocondrial de Glut1 fue evaluado por inmunoblot Glut1. Un ensayo nulo de importe realizado en ausencia de mitocondria se indica como control. Intensidades fluorescentes de proteinas de control etiquetadas GFP (CoxVIII-EGFP y EGFP), quantificadas por Imagen NIH, se usaron para evualuar el importe mitocondrial.

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Mitochondrial AA quenches ROS generated by purified mitochondriaOxidative events in mitochondria produce ROS that can damage the mitochondrial membrane and mtDNA. To study the effect of mtAA on mitochondrial ROS, purified mitochondria were loaded with or without AA, and the levels of ROS were detected upon treatment with the oxidative stressor, DMNQ. We analyzed levels of superoxide (•O2), hydroxyl radical (•OH), and hydrogen peroxide (H2O2) in control and oxidatively stressed purified mitochondria. Levels of –•O2 were significantly increased by treating mitochondria with the superoxide generator DMNQ, which was inhibited by preloading mitochondria with 2.0 mM AA (Fig. 3A). A significant reduction in •OH levels was achieved by preloading mitochondria with AA (Fig. 3B). Mitochondrial AA also significantly reduced levels of H2O2 in oxidatively stressed purified mitochondria (Fig. 3C). Overall, we found that levels of mitochondrial ROS were attenuated when purified mitochondria were preloaded with AA (Student’s t test, n=8, P<0.05). These data indicate that mtAA inhibits mitochondrial ROS production during both normal and oxidative conditions. Intracellular oxidative stress and energetic decline resulting from defective or disrupted mitochondrial ETC is considered to be the cause of aging and age-related degenerative diseases (8). Hence, we tested the effect of vitamin C against oxidative stress resulting from rotenone-mediated disruption of the mitochondrial ETC (38). We found that rotenone-induced generation of H2O2 in purified mitochondria, as measured by Amplex red assay, was significantly quenched by loading mitochondria with 2.0 mM AA (Student’s t test, n=8, P<0.05) (Fig. 3D).

Figure 3. Mitochondrial AA (mtAA) quenches ROS in control, oxidatively stressed, and ETC-disrupted purified mitochondria. Fluoremetric measurement of A) superoxide (–•O2), B) hydroxyl radical (•OH), and C) hydrogen peroxide (H2O2) in purified mitochondria preloaded with or without 2.0 mM AA and treated with buffer or 10 µM DMNQ. D) Measurement of H2O2 liberated by control and AA-loaded mitochondria treated with or without 1 µM rotenone. *Statistical significance (Student’s t test, n=8, P<0.05).

mtAA protects mitochondrial genome and membrane from oxidative damageROS-induced oxidation of mitochondrial DNA (mtDNA) results in a wide variety of adductive and structural DNA damages (8). We reasoned that by quenching mitochondrial ROS, mtAA could protect the mtDNA against oxidative damages. The protective effect of AA was assessed by treating control or AAloaded mitochondria with an oxidative stressor and measuring levels of 8-oxo-dG in the mtDNA. We found that compared with controls, purified mitochondria treated with 0.1 mM H2O2 had

AA Mitocondrial extingue el ROS generado por mitocon-dria purificadaEventos oxidativos en la mitocondria producen ROS que puede dañar la membrana mitocondrial y mtADN. Para estudiar el efecto de mtAA en ROS mitocondrial, se cargo mitocondria purificada de AA o sin AA, y los niveles de ROS fueron detectados una vez que se realizó el tratamiento con el estresante oxidativo, DMNQ. Analizamos niveles de superóxido (–•O2), hidroxilo radical (•OH), e hidrogeno de peróxido (H2O2) en mitocondria controlada o mitocondria purificada oxidativamente estresada. Los niveles de –•O2 aumentaron significativamente al tratar la mitocondria con el generador superoxidativo DMNQ, el cual fue inhi-bido al cargar mitocondria previamente con 2.0 mM AA (Fig. 3A). Se alcanzó una reducción significativa en niveles de •OH al cargar de manera previa la mitocondria con AA (Fig. 3B). AA mitocondrial también reduce niveles de H2O2 significativamente en mitocondria purificada oxidativa-mente estresada (Fig. 3C). En general, encontramos que los niveles mitocondriales ROS fueron atenuándose cuan-do mitocondria purificada fue cargada de manera previa con AA (Prueba de Estudiante t, n8, P<0.05). Esta informa-ción indica que mtAA inhibe la producción de ROS mito-condrial tanto en condiciones normales como oxidativas. Estrés intracelular oxidativo y una baja en energética resul-tante de ETC mitocondrial interrumpido o defectuoso son considerados como la causa de envejecimiento y enfer-medades degenerativas relacionadas a la edad (8). Por lo tanto, probamos la vitamina C con un examen resultante de estrés oxidativo de interrupción mediado por rotenona en ETC mitocondrial (38). Descubrimos que la generación de H202 inducida por rotenona en mitocondria purificada, como cuantificado por el análisis rojo Amplex, fue apaga-do significativamente al cargar la mitocondria con 2.0 mM AA (Prueba t de estudiante, n8, P<0.05) (Fig. 3D).

Figura 3. AA mitocondrial (mtAA) extingue ROS de mitocondria purificada control, oxidativamente estresada y ETC-perturbada. Mediciones fluoremétricas de A) superoxido (–•O2), B) radical hidroxyl (•OH) y C) peróxido de hidrógeno (H2O2) en mitocondria purificada precargada con o sin 2.0 mM AA y tratada con agente o 10 µM DMNQ. D) La medida del H2O2 liberado por el control y mitocondria cargada con AA tratada con o sin 1 µM rotenona. *Significancia estadística (Prueba de estudiante, n=8, P<0.05).

mtAA protege el genoma y membrana mitocondrial del daño oxidativo Oxidación inducida por ROS de AND mitocondrial resulta en una variedad amplia de daños al ADN aducido y es-tructural (8). Razonamos que al apagar el ROS, mtAA pro-tege al mtADN de daños oxidativos. El efecto protector de AA fue evaluado al tratar el control o mitocondria carga-da de AA con un estresante oxidativo y al medir los niveles de 8-oxo-dG en mtADN. Encontramos que, en compara-ción a los experimentos control, la mitocondria purificada tratada con 0.1 mM H2O2 tuvo un nivel significativamente más alto de 8-oxo-dG mitocondrial, un biomarcador de daño oxidativo de ADN (Fig. 4A). Sin embargo, cargar pre-viamente a la mitocondria con 2.0 mM AA redujo de ma-nera significativa los niveles de 8-oxo-dG en las muestras oxidativamente estresadas (Fig. 4A) (Prueba t de estudian-te, n3, P<0.05). Con el conocimiento de que los metales de transición pueden facilitar la producción de ROS y por lo tanto exsacerbar los efectos dañinos de los ROS en el ADN (20), probamos los efectos del mtAA contra el daño oxi-dativo del mtADN inducido por Cu2+/ H2O2 . Encontramos que en prescencia de 0.1 mM Cu2+, los niveles de 8-oxo-dG en el mtADN incrementaron con concentraciones au-mentadas de H2O2, mientras que el cargar la mitocondria con vitamina C redujo los niveles de 8-oxo-dG en todas las concentraciones del estresante oxidativo (Fig. 4B). Como un biomarcador adicional de daño de AND, medimos los niveles de sitios apurínico/apirimídico (AP) en mtADN aisla-do del control y la mitocondria oxidativamente estresada. Tratar la mitocondria purificada con 0.1 mM Cu2+ y 0.5 mM H2O2 incremento los sitios de AP mitocondrial el doble, lo cual fue reducido significativamente en mitocondria car-gada previamente con 2.0 mM AA (Prueba de estudiante t, n5, P<0.05) (Fig. 4C). Nuestros resultados muestran que la mtAA protege mtADN en contra de aumento de lugares 8-oxo-dG y AP inducido por ROS.El estrés oxidativo en la mitocondria puede también llevar a rupturas de ADN de cadena doble, resultando así en cor-

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significantly higher levels of mitochondrial 8-oxo-dG, a biomarker of oxidative DNA damage (Fig. 4A). However, preloading mitochondria with 2.0 mM AA significantly reduced 8-oxo-dG levels in oxidatively stressed samples (Fig. 4A) (Student’s t test, n=3, P<0.05). With the knowledge that transition metals can facilitate the production of ROS and hence exacerbate the damaging effects of ROS on DNA (20), we tested the effect of mtAA against Cu2+/H2O2-induced oxidative mtDNA damage. We found that in the presence of 0.1 mM Cu2+, 8-oxo-dG levels in the mtDNA increased with increasing concentrations of H2O2, while preloading mitochondria with vitamin C reduced 8-oxo-dG levels at all concentrations of the oxidative stressor (Fig. 4B). As an additional biomarker of oxidative DNA damage, we measured levels of apurinic/apyrimidic (AP) sites in mtDNA isolated from control and oxidatively stressed mitochondria. Treatment of purified mitochondria with 0.1 mM Cu2+ and 0.5 mM H2O2 increased mitochondrial AP sites twofold, which was significantly reduced in mitochondria preloaded with 2.0 mM AA (Student’s t test, n=5, P<0.05) (Fig. 4C). Our results show that mtAA protects mtDNA against ROS-induced elevation of 8-oxo-dG and AP sites. Oxidative stress in mitochondria can also lead to DNA double-strand breaks, resulting in shearing of mtDNA. Therefore, we examined whether mtAA could protect against ROS-mediated fragmentation of mtDNA using gel electrophoresis (43). Purified mitochondria loaded with or without AA were treated with 1.0 mM H2O2. We found that H2O2 treatment increased shearing of mtDNA, which was significantly reduced by preloading mitochondria with 2.0 mM mtAA (Fig. 4D). To analyze the protective effect of vitamin C against intracellular oxidative stress stemming from the disruption of the mitochondrial ETC, we performed fluoremetric measurements of ROS in control and vitamin C preloaded HL-60 cells treated with or without 1 µM rotenone. We found that cells preloaded with 23 mM intracellular AA, achieved after a 30 min incubation with 0.5 mM DHA (44), were significantly protected from rotenone-induced intracellular oxidative stress (Student’s t test, n=8, P<0.05) (Fig. 4E). Our results point to the protective role of vitamin C in preventing oxidative disorders stemming from a defective or disrupted mitochondrial ETC.

Figure 4. Mitochondrial AA (mtAA) protects mitocondrial DNA (mtDNA) and membrane from oxidative damage. A) Mitochondria purified from 293T cells were loaded with or without AA, treated with 0.1 mM H2O2 , and 8-oxo-dG levels in mtDNA were measured with HPLC-ECD. *Statistical significance (Student’s t test, n=3, P<0.05). B) Levels of 8-oxo-dG in the mtDNA of mitochondria preloaded with (●) or without (○) AA and incubated with 0.1 mM Cu2+ and specified concentrations of H2O2. C) Levels of apurinic/apyrimidic (AP) sites in mtDNA of control and AA preloaded mitochondria after treatment with 0.1 mM each of Cu2+ and H2O2. AP sites were quantified by a colorimetric assay. *Statistical significance (Student’s t test, n=5, P<0.05). D) Mitochondrial DNA fragmentation in control and AA preloaded purified mitochondria treated with 1.0 mM H2O2 was analyzed by gel electrophoresis. E) Fluoremetric measurement of ROS in control and AA preloaded HL-60 cells treated with or without 1 µM rotenone. Statistical significance was assessed with a Student’s t test (n=8, P<0.05). F) CCCP-induced disruption of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in control (■) or AA preloaded (□) HL-60 cells, as measured by FACS analysis. The percentage of cells with disrupted ΔΨm was measured by mitochondrial retention of the fluorochrome DIOC(6) (3). Statistical significance was assessed with a Student’s t test (n=3, P<0.05).

Vitamin C inhibits protonophore-induced loss of membrane potential (ΔΨm)Since apoptotic and necrotic pathways can frequently be triggered in response to mitochondrial membrane damage, the stability of the mitochondrial membrane is essential for the survival of the cell (45). To study the effect of AA on mitochondrial membrane stability, we analyzed the loss of ΔΨm in HL-60 cells in response to a protonophore, CCCP. Treatment with CCCP resulted in a dose-dependent increase in the percentage of cells with disrupted ΔΨm, which was significantly inhibited by loading cells with 23 mM AA (Student’s t test, n=3, P<0.05) (Fig. 4F). Taken together, these results suggest a protective role of vitamin C in preventing mitochondrial membrane depolarization in response to uncouplers such as CCCP.

Generality of vitamin C-mediated genomic protectionTo study the generality of vitamin C-mediated protection

tes de mtADN. Por lo tanto, examinamos si es que el mtAA puede proteger en contra de fragmentación del mtADN mediado por ROS utilizando gel de electroforesis (43). Mito-condria purificada cargada con o sin AA fue tratada con 1.0 mM H2O2. Descubrimos que el tratamiento de H2O2 in-crementó la rajadura de mtDNA, lo cual fue significativa-mente reducido por la carga previa de la mitocondria con 2.0 mM mtAA (Fig. 4D).Para analizar el efecto protector de la vitamina C en con-tra de estrés oxidativo intracelular proveniente de la inte-rrupción del ETC mitocondrial, realizamos medidas fluoro-métricas de ROS en experimento control y de células HL-60 previamente cargadas con o sin 1 µM rotenona. Descu-brimos que células cargadas previamente con 23 mM in-tracelular AA, después de 30 minutos de incubación, con 0.5 mM DHA (44), fueron protegidas significativamente de estrés oxidativo intracelular inducido por rotenona (Prue-ba t de estudiante, n8, P<0.05) (Fig. 4E). Nuestros resultados apuntan al rol protector de la Vitamina C en la prevención de desordenes oxidativos provenientes de ETC mitocon-drial defectuoso o interrumpido.

Figura 4. AA mitocondrial (mtAA) protege el ADN mitocondrial (mtADN) y la membrana de daño oxidativo. A) Mitocondria purificada de células 293T fue cargada con o sin AA, tratada con 0.1 mM H2O2 y niveles 8-oxo-dG en mtADN se midieron con HPLC-ECD. *Significancia estadística (Prueba de estudiante, n=3, P<0.05). B) Niveles de 8-oxo-dG en el mtADN de mitocondria pre cargada con (●) o sin (○) AA e incubada con 0.1 mM Cu2+ y concentraciones especificadas de H2O2. C) Niveles de sitios apurínico/apirimídico (AP) en mtADN de control y mitocondria pre cargada con AA después del tratamiento con 0.1 mM cada una Cu2+ y H2O2. Los sitios AP fueron cuantificados por evaluación colorimétrica. *Significancia estadística (Prueba de estudiante, n=5, P<0.05). D) fragmentación de ADN mitocondrial en control y mitocondria purificada pre cargada con AA tratada con 1.0 mM H2O2 fue analizada con gel electroforesis. E) Mediciones fluoremétricas de ROS en control y células HL-60 pre cargadas con AA tratadas con o sin 1 µM rotenona. Significancia estadística fue evaluada con una prueba de Estudiante (n=8, P<0.05). F) Perturbación inducida por CCCP en el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) en control (■) o células HL-60 pre cargadas con AA (□) medidas con análisis FACS. El porcentaje de células con ΔΨm perturbado fue medido por retención mitocondrial del fluorocromo DIOC(6) (3). Significancia estadística fue evaluada con una prueba de Estudiante (n=3, P<0.05).

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of mtDNA against oxidative damage, we measured 8-oxo-dG levels in mitochondria isolated from HepG2 and HL-60 cell-lines. Consistent with our observations with mitochondria isolated from 293T cells, mitochondria purified from HepG2 and HL-60 cells transport DHA, which is accumulated mitochondrially as AA (Fig. 5A, B). Similarly, loading mitochondria with AA via DHA treatment conferred protection against H2O2- induced 8-oxo-dG formation (Fig. 5C, D). HepG2 mitochondria preloaded with 0.8 mM AA showed a 60% reduction in 8-oxo-dG levels when treated with 0.1 mM H2O2. Likewise, HL-60 mitochondria preloaded with 1.5 mM AA showed a 70% reduction in 8-oxo-dG levels (Student’s t test, n=3, P<0.05). These results collectively point to a protective role of mtAA in preventing ROS-induced mtDNA damage in mammalian mitochondria.

Figure 5. Generality of mitochondrial uptake of vitamin C and its role in genomic protection. Mitochondria purified from A) HepG2 and B) HL-60 cells were incubated with specified concentrations of DHA for 30 min and the accumulation of AA was measured by HPLC-ECD. Purified mitochondria loaded with or without AA were then oxidatively stressed with H2O2/Cu2+ and the levels of 8-oxo-dG in mtDNA isolated from C) HepG2 and D) HL-60 mitochondria were measured via electrochemical detection. Asterisks indicate statistical significance (Student’s t test, n=3, P<0.05).

DISCUSSIONGlut1 localizes to the mitochondrial membrane in mammalian cellsAlthough it is well documented that mammalian mitochondria contain vitamin C, the precise mechanism of its transport into mitochondria is poorly understood. We have previously shown that vitamin C is universally transported into cells in its oxidized form, DHA, through facilitative glucose transporters (27). Using theoretical, functional, and physical studies, we have discovered that a parallel mechanism exists for the mitochondrial transport of vitamin C. We show that facilitative glucose transporter 1 (Glut1) localizes to mitochondria in mammalian cells and participates in the mitochondrial transport of vitamin C. Our theoretical analysis and experimental studies of chimeric Glut1-EGFP localization indicate a role of N-terminal Glut1 in mitochondrial targeting. Analogous studies indicate that the N-terminal sequence of the plastidic glucose transporter (pGlcT) may be involved in the translocation of the protein to the chloroplasts inner membrane (46). It was also recently shown that plant mitochondria transport glucose and DHA in a facilitative manner (35), which we postulate to be mediated by a functional mitochondrial glucose transporter. Our studies collectively point to the localization of Glut1 to mitochondria of mammalian cells.

Glut1 confers mitochondrial uptake of vitamin COur results on the uptake of vitamin C in mitochondria isolated from human cells agree with previous findings using purified mammalian (32, 33) and plant (35) mitochondria. We postulate that the localization of Glut1 to mitochondria confers uncompeted transport of DHA into mitochondria since glucose in the cytosolic milieu

La Vitamina C inhibe la pérdida del potencial de la mem-brana (ΔΨm) inducida por protonoforoDado que las vías de apoptosis y necrótica pueden, fre-cuentemente, ser accionadas en respuesta al daño a la membrana mitocondrial, la estabilidad de la membrana mitocondrial es esencial para la supervivencia de la célula (45). Para estudiar el efecto de AA en la estabilidad de la membrana mitocondrial, analizamos la perdida de _m en células HL-60 como respuesta al protonoforo, CCCP. El tratamiento con CCCP resultó en un incremento en el por-centaje de células con _m interrumpido, dependientes de dosis, lo cual fue inhibido significativamente al cargar las células con 23 mM AA (Prueba t de Estudiante, n3, P_0.05) (Fig. 4F). Al tomarlos en conjunto, estos resultados sugieren el rol protector de la vitamina C en la prevención frente a la despolarización de la membrana mitocondrial en res-puesta a destructores como CCCP.

Generalidad de protección genómica mediada por la Vitamina CPara estudiar la generalidad de la protección de mtADN mediada por la Vitamina C en contra de daño oxidativo, medimos los niveles de 8-oxo-dG en la mitocondria aisla-da desde HepG2 y HL-60 líneas celulares. De manera con-sistente con nuestras observaciones con la mitocondria aislada de las células 293T, mitocondria purificada desde HepG2 y HL-60 células transportan DHA, lo cual es acu-mulado mitocondrialmente como AA (Fig. 5A, B). Similar-mente, cargar la mitocondria con AA vía tratamiento DHA asignó protección en contra de H2O2 inducido y forma-ción de 8-oxo-dG (Fig. 5C, D). Mitocondria HepG2 cargó previamente con 0.8 mM AA mostró un 60% de reducción en los niveles de 8-oxo-dG cuando fueron tratados con 0.1 mM H2O2. De la misma manera, mitocondria HL-60 carga-da previamente con 1.5 mM AA mostró una reducción de 70% en los niveles 8-oxo-dG (Prueba de Estudiante t test, n 3, P<0.05). De manera colectiva, estos resultados apuntan al rol protector de mtAA al prevenir daño de mtADN indu-cido por ROS in la mitocondria mamífera.

Figura 5. Generalidad de absorción mitocondrial de vitamina C y su rol en la protección genomica. Mitocondria purificada de células A) HepG2 y B) HL-60 fueron incubadas con concentraciones específicadas de DHA por 30 min y la acumulación de AA fue medida por HPLC-ECD. Mitocondria purificada cargada con o sin AA fue estresada oxidativamente con H2O2/Cu2+ y los niveles de 8-oxo-dG en mtADN aislados de mitocondria C) HepG2 y D) HL-60 fueron medidos via detección electroquímica. Los asteríscos indican significancia estadística (Prueba de estudiante, n=3, P<0.05).

DISCUSIÓNGlut1 localiza la membrana mitocondrial en células ma-míferasA pesar de que existe amplia documentación sobre el contenido de Vitamina C en la mitocondria mamífera, el mecanismo exacto de cómo es transportada dentro de la mitocondria no es entendido. Hemos demostrado hasta este punto que la vitamina C es transportada de manera universal dentro de las células en su estado oxidado, DHA, a través de los transportadores facilitadores de glucosa (27). Usando estudios teóricos, funcionales y físicos, hemos descubierto un mecanismo paralelo existente para trans-portación mitocondrial de la vitamina C. Demostramos que el transportador facilitador de glucose (Glut1) loca-liza a la mitocondria en células mamíferas y participa en el transporte mitocondrial de Vitamina C. Nuestro análisis teórico y estudios experimentales de localización Glut1-EGFP quimérico indican un rol de Glut1 terminal-N en la ubicación mitocondrial. Estudios análogos indican que la secuencia de terminal-N de el transportador de glucosa plastidica (pGlcT) puede estar involucrado en la transloca-ción de la proteína hacia la membrana interior de cloro-plastos (46). También fue demostrado recientemente que mitocondria de plantas transporta glucosa y DHA en una manera facilitadora (35), lo cual postulamos es mediado por un transportador de glucosa mitocondrial funcional. De manera colectiva, nuestros estudios se enfocan hacia la localización de Glut1 a la mitocondria en células mamí-feras.

Glut1 confiere absorción mitocondrial de Vitamina CNuestros resultados sobre la absorción de la Vitamina C en la mitocondria aislada de las células humanas coinciden

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exists almost entirely in the nontransportable form, glucose-6-phosphate (47). Due to the apparent lack of a glycolytic pathway in mitochondria, we speculate that Glut1 on the mitochondrial membrane likely exists for the transport of DHA. Once inside mitochondria, using potential reductive mechanisms (48–50), DHA is reduced and mitochondrially accumulated as AA (mtAA). During oxidative stress, mtAA is oxidized to DHA (14), which we postulate to be recycled in either the mitochondrial compartment or the cytosol, and thus confer differential compartmentalization of vitamin C during normal and oxidative conditions (17). Our proposed mechanism of uptake, reduction, and recycling of vitamin C by the mitochondrion appears to be a recapitulation of the metabolism of vitamin C in the cytosolic compartment (Fig. 6).

Figure 6. Schematic illustration of vitamin C uptake and recycling in the cell. Vitamin C in its oxidized form, DHA, is transported into mitochondria via facilitative glucose transporter 1 and reduced to mitochondrial AA. Mitochondrial AA quenches ROS, protects the mitochondrial genome, and inhibits mitochondrial membrane depolarization. The mechanisms involved in the uptake, trapping, and recycling of vitamin C in mitochondria appear to recapitulate the metabolism of AA in the cytosolic compartment.

Vitamin C protects mitochondrial genome from oxidative injuryROS generated metabolically and during oxidative stress can react with nucleic acids to generate a variety of cytotoxic and mutagenic DNA adducts (7). For example, hydroxyl radical (•OH), which is generated continuously by the mitochondrial respiratory chain, is a major contributor of oxidative mtDNA damage (51). Oxidation of guanosine yields potentially mutagenic 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG), which results in GC3TA transversions in 50% of the replicating DNA (52, 53). Mitochondrial ROS can also increase levels of apurinic/apyrimidic (AP) sites (54), followed by mtDNA double-strand breaks (55). Although mitochondria possess DNA repair pathways for combating oxidative damage (56–58), lack of protective histones and proximity to ROS make the mtDNA particularly susceptible to oxidative injury (8). Our studies of vitamin C-mediated quenching of mitochondrial ROS during normal and oxidative conditions correlate with the protective effect of vitamin C in inhibiting oxidative insults on the mtDNA. Furthermore, since levels of mitochondrial AA can be augmented with dietary vitamin C supplementation, our data suggest the pharmacological relevance of vitamin C in the protection of the mitochondrial genome against oxidative injury.

Vitamin C prevents mitochondrial membrane depolarizationIntegrity of the mitochondrial membrane plays a key role in diverse cellular processes such as growth, differentiation, apoptosis, and necrosis (45, 59). Loss of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and cytochrome c release are important events during apoptosis, both of which are inhibited by vitamin C (60). Protonophores such as CCCP disrupt ΔΨm (61), increase mitochondrial respiration (62), and induce membrane permeability transition (MPT) (63, 64). Our studies indicate that vitamin C inhibits CCCPinduced disruption of ΔΨm, which we postulate to be mediated through the quenching of ROS. Since CCCPinduced increase in mitochondrial respiration is inhibited by respiratory substrates (62), vitamin C may also be eliciting a similar effect. Alternatively, protection of mitochondrial

con hallazgos previos usando mitocondria purificada de plantas (35) y mamíferos (32, 33). Postulamos que la loca-lización de Glut1 en la mitocondria confiere un transporte sin competencia de DHA hacia la mitocondria dado que la glucosa en el entorno citosólico existe casi completa-mente en una forma no transportable, glucosa-6-fosfato (47). Dada la aparente escasez de una vía glicolítica en la mitocondria, especulamos que Glut1 existe en la mem-brana mitocondrial, muy probablemente, para transportar DHA. Una vez dentro de la mitocondria, usando mecanis-mos potenciales de reducción (48–50), DHA es reducido y acumulado de manera mitocondrial como AA (mtAA). Durante estrés oxidativo, mtAA es oxidado a ser DHA (14), lo cual postulamos es reciclado en el compartimiento mi-tocondrial o en el citosol, y por lo tanto confiere comparti-mentación diferenciada de la vitamina C en condiciones normales y oxidativas (17). Nuestro mecanismo propuesto para absorción, reducción y reciclaje de Vitamina C por el mitocondrio parece ser una recapitulación del metabolis-mo de la Vitamina C en el compartimiento citosólico (Fig. 6).

Figure 6. Schematic illustration of vitamin C uptake and recycling in the cell. Vitamin C in its oxidized form, DHA, is transported into mitochondria via facilitative glucose transporter 1 and reduced to mitochondrial AA. Mitochondrial AA quenches ROS, protects the mitochondrial genome, and inhibits mitochondrial membrane depolarization. The mechanisms involved in the uptake, trapping, and recycling of vitamin C in mitochondria appear to recapitulate the metabolism of AA in the cytosolic compartment.

La Vitamina C protege el genoma mitocondrial de lesiones oxidativasROS generado metabólicamente y durante estrés oxidati-vo puede reaccionar con ácidos nucléicos para generar una variedad de compuestos citotóxicos y mutagénicos de ADN (7). Por ejemplo, radical hidroxil (•OH), el cual es generado continuamente por una cadena mitocondrial respiratoria, es un contribuyente mayor de daño oxidativo mtDNA (51). La oxidación de guanosina conduce poten-cialmente 8-oxo-7,8-dihydro-2’ deoxyguanosine (8-oxo-dG) mutagenicos, lo cual resulta en transversiones GC3TA en un 50% del ADN replicado (52, 53). El ROS mitocondrial puede incrementar, tambien, niveles de sitios apurínicos/apirimí-dicos (AP) (54), seguido de rupturas de cadena doble de mtDNA (55). A pesar de que la mitocondria posee vías de reparo de ADN para combatir daño oxidativo (56–58), la falta de histones protectores y proximidad al ROS pueden convertir, de manera particular, a la mtADN susceptible a daño por lesiones oxidativas (8). Nuestros estudios del uso de vitamina C para apagar el ROS mitocondrial durante condiciones normales y oxidativas correlacionan con el efecto protector de la Vitamina C en inhibir daños oxida-tivos en el mtADN. Aún más, dado que los niveles de AA mitocondrial pueden ser aumentados con un suplemento diario de vitamina C, nuestros datos sugieren la relevancia farmacológica de la vitamina C en la protección del ge-noma mitocondrial en contra de lesiones oxidativas.

La Vitamina C previene la despolarización de la membra-na mitocondrialLa integridad de la membrana mitocondrial juega un rol clave en procesos celulares diversos como crecimiento, diferenciación, apoptosis y necrosis (45, 59). La pérdida del potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) y de la liberación del citocromo c son eventos importantes du-rante la apoptosis, ambos son inhibidos por la vitamina C (60). Protonofores tales como CCCP afectan al ΔΨm (61), incrementan la respiración mitocondrial, e inducen la tran-sición permeable de la membrana (MPT) (63, 64). Nuestros estudios indican que la Vitamina C inhibe la perturbación inducida por CCCP del ΔΨm, los cuales postulamos que son mediados a través de la extinción del ROS. Dado que el incremento de la respiración mitocondrial inducido por CCCP es inhibido por substratos respiratorios (62), la vitami-na C puede también provocar un efecto similar. De mane-ra alternativa, la protección de la membrana mitocondrial por la Vitamina C puede involucrar la desactivación del MPT, el cual es traído por el cambio redox de los tioles vici-nales del complejo de poros PT (65).

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membrane by vitamin C may involve inactivation of MPT, which is brought about by the redox switching of the vicinal thiols of the PT pore complex (65).

Mitochondrial AA and its projected role in cellular redox homeostasisRedox homeostasis is an intricate balance between oxidative and reductive events in the cell and vitamin C plays an important role in the modulation of the cellular redox state (66). Since most pro-oxidants are liberated by mitochondria during oxidative metabolism (6), quenching of mitochondrial ROS might favorably shift the cellular redox state. Oxidative imbalance is an important contributor to aging and degenerative diseases (67), and our studies suggest a role of mtAA against a variety of ROS-mediated mitochondrial disorders.

We thank G. Stratis for his technical assistance and the Sloan-Kettering Molecular Cytology Core Facility for confocal imaging. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (CA 30388), the New York State Department of Health, and the Lebensfeld Foundation. Our mentor David W. Golde, who was the motivating inspiration behind this work, passed away on August 9, 2004.

AA Mitocondrial y su rol proyectado en la homeostasis ce-lular redoxLa homeostasis Redox es un balance detallado entre even-tos oxidativos y reductivos en la célula y la Vitamina C que juega un rol importante en la modulación del estado celu-lar redox (66). Dado que la mayoría de pro-oxidantes son liberados por la mitocondria durante el metabolismo oxi-dativo (6), extinguir el ROS mitocondrial puede, de manera favorable, cambiar el estado celular redox. El desbalance oxidativo es también un contribuyente importante de las enfermedades por la edad y degenerativas (67), y nues-tros estudios sugieren un rol de mtAA contra una variedad de desordenes mitocondriales mediados por ROS.

Agradecemos a G. Stratis por su asistencia técnica y a la Facilidad de Sloan-Kettering Molecular Cytology Core Facility por sus imá-genes confocales. Este trabajo fue apoyado por préstamos de los Institutos de Salud de California (CA 30388), el Ministerio de Salud de New York, y la Fundación Lebensfeld. Nuestro mentor, David W. Golde, quien fue la inspiración para este trabajo, falleció el 9 de Agosto del 2004.