vitassay qpcr · 2019-02-01 · 3 iu_005 ed01 nov16 uso previsto vitassay qpcr...
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1
Vitassay qPCR
Zika + Dengue + Chikungunya
EN ES
PCR en tiempo real para la detección cualitativa y diferenciación de los
virus Zika, Dengue y Chikungunya en muestras humanas
Real-time PCR kit for the qualitative detection and differentiation of Zika,
Dengue and Chikungunya virus in human samples
2 IU_005 Ed01 Nov16
3 IU_005 Ed01 Nov16
Uso previsto
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, permite la detección y diferenciación de
los virus del Zika, Dengue y chikungunya mediante RT-PCR a tiempo real en muestras
clínicas. Este producto está destinado para facilitar el diagnóstico diferencial de
infecciones producidas por el virus del Zika, Dengue y/o Chikungunya.
Referencias
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya 4x8 -well strip, low profile 7041005
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya 4x8-well strip, high profile 7042005
Materiales/Reactivos suministrados
Código Reactivo/Material Color Cantidad
7041S005/ 7042S005
Zika+Dengue+Chikungunya Virus strips low/high profile
- 4 tiras de 8 pocillos
7C005 Zika+Dengue+Chikungunya
Positive Control
rojo 1 vial
7001A PCR grade water blanco 1 vial x 1 mL
7002B Resuspension buffer verde 1 vial x 1 mL
7003N Negative control amarillo 1 vial x 1 mL
7004O Tapas ópticas - 4 tiras de 8 tapones
Condiciones de Transporte y conservación
El transporte y almacenaje de los kits puede realizarse de 2-40ºC hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
El control positivo resuspendido debe ser almacenado a -20ºC. Para evitar
ciclos de congelación y descongelación, se recomienda separar en alícuotas.
Conservar los reactivos en la oscuridad.
ES
4 IU_005 Ed01 Nov16
Material y equipamiento necesario pero no proporcionado
Kit de extracción de RNA
Equipo de PCR a tiempo real (ver Adjunto I)
Centrífuga para tubos de 1.5 mL
Vórtex
Micropipetas (1-20 µL, 20-200 µL)
Puntas con filtro
Guantes desechables sin polvo
Resumen
Los virus del Zika (ZKV), Dengue (DNV) y Chikungunya (CHIKV) son patógenos que se
transmiten a través de la picadura del mismo mosquito del genero Aedes.
El virus del Zika fue aislado en 1947 de un mono Rhesus en el bosque de Zika en
Uganda. Normalmente, las manifestaciones clínicas de ZIKV humano son similares a
otras derivadas de infecciones por arbovirus y que pueden ocurrir sin complicaciones
graves incluyendo enfermedad febril autolimitada, artralgia, mialgia, dolor de cabeza y
erupción maculopapular. Conjuntivitis, dolor ocular retroorbital, linfadenopatía así como
diarrea también se han reportado.
El virus Dengue provoca una enfermedad viral grave. Los síntomas iniciales pueden
variar desde fiebre asintomática hasta complicaciones como fiebre hemorrágica y
shock. Aunque los síntomas más comunes son fiebre aguda alta, dolor muscular y
articular, mialgias, erupción cutánea, episodios hemorrágicos y shock circulatorio.
El virus Chikungunya se aisló en primer lugar en Tanzania en 1953. Los virus
Chikungunya causan una artralgia severa, debilitante y a menudo crónica con altas
tasas de ataques, dando lugar a una morbilidad severa y grandes costes económicos
para las comunidades afectadas.
Estos tres virus presentan un cuadro clínico similar en las etapas iniciales de la
infección, aunque el tratamiento de cada una de ellas es diferente, es por eso que, una
detección precoz y diferenciación es crucial. La confirmación e identificación de estas
infecciones se basa principalmente en la detección de RNA viral en suero y orina
mediante retrotranscripción y posterior amplificación (RT-PCR). De hecho, la serología
no se aconseja debido a que esta técnica puede dar lugar a reacciones cruzadas entre
los anticuerpos de estos arboviruses.
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Principio del test
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya se basa en la amplificación a tiempo real
de un fragmento de una región conservada de la zona del gen envelope del virus Zika,
de la región 3´ no codificante del virus Dengue y del NSP1 del virus Chikungunya. El
RNA viral extraído se transcribe a cDNA utilizando un primer específico mediante un
paso de transcripción inversa seguido, de la reacción en cadena de la polimerasa. La
presencia de los virus se realiza mediante un aumento de la fluorescencia observada
durante la reacción, tras la hidrólisis de la sonda fluorescente.
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, se trata de un test listo para usar que
contiene en cada pocillo todos los reactivos necesarios en formato estabilizado para
llevar a cabo la PCR a tiempo real. Además un control interno permite la detección de
una posible reacción de inhibición. La amplificación de la secuencia diana es detectada
en el canal FAM (Dengue), Cy5 (Zika) y ROX (Chikungunya) mientras que el control
interno (CI) se detecta en el canal HEX, VIC o JOE (según el equipo utilizado).
Precauciones
Diseñado para uso profesional de diagnóstico in vitro.
No utilizar el kit después de la fecha de caducidad.
No mezclar reactivos de otros kits y/o diferentes lotes.
No utilizar si el kit tiene signos de haber sido abierto o manipulado.
Trabajar siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio. Use ropa protectora,
guantes desechables, gafas y mascarilla.
No comer, beber o fumar en los laboratorios.
Es importante seguir un flujo de trabajo en el laboratorio unidireccional: Área
de Extracción, Área de Amplificación y Detección. No retornar muestras,
equipos ni reactivos a un área anterior.
Las muestras y todo material en contacto con ellas se deben tratar como
potencialmente infecciosos y se deben gestionar según la legislación sobre
residuos sanitarios nacional. Tome las precauciones necesarias durante la
recogida, almacenamiento, tratamiento y eliminación de muestras.
Se recomienda la descontaminación periódica de los equipos usados
habitualmente, especialmente micropipetas, y de las superficies de trabajo.
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Procedimiento
Toma de muestra, preparación y extracción de RNA.
Realizar el pretratamiento y el aislamiento de los ácidos nucleicos utilizando un sistema
manual o automático compatible con ensayos de PCR en tiempo real. Seguir las
instrucciones de uso del fabricante. Los siguientes kits de extracción han sido
validados:
Maxwell® 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit (Promega).
QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAcube instrument (QIAGEN).
High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche).
Invisorb®
Spin Universal Kit (Stratec).
Preparación del control positivo
Reconstituir el Zika+Dengue+Chikungunya Positive Control (tubo rojo) liofilizado con
100 µL de PCR grade water suministrado (tubo blanco). Mezclar bien con ayuda del
vórtex. Después del primer uso, dispensar en alícuotas para evitar varios ciclos de
congelación-descongelación y almacenarlo a -20ºC.
El control positivo contiene una gran cantidad de copias molde y el riesgo de
contaminación es elevado. Por lo tanto, se recomienda abrir y manipular en un área del
laboratorio separada de los otros componentes.
Preparación de la reacción
Preparar el número de pocillos necesarios incluyendo muestras y controles (un
control positivo y uno negativo). Retirar el sello de aluminio que protege las
tiras.
Pipetear 15 µL de la solución de resuspensión (tubo verde) en cada pocillo.
Pipetear 5 µL de RNA extraído, Control Negativo (tubo amarillo) y Control
positivo (tubo rojo) en los pocillos correspondientes.
Cerrar los pocillos con los tapones suministrados. Centrifugar brevemente
(opcional).
Colocar las tiras en el equipo de PCR a tiempo real.
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Programación del termociclador.
Configurar el termociclador siguiendo las siguientes instrucciones:
Etapa Temperatura Tiempo Ciclos
Retrotranscripción 45ºC 15 min 1
Desnaturalización inicial 95ºC 2 min 1
Desnaturalización 95ºC 10 seg
45 Hibridación/Elongación
(Recogida de datos*)
60ºC 50 seg
Los datos de fluorescencia deben recogerse durante la etapa de hibridación (*) a través
de los canales FAM (Dengue), Cy5 (Zika) y ROX (Chikungunya) y los canales HEX,
JOE o VIC (Control Interno). En los termocicladores Applied Biosystems 7500 Fast,
Applied Biosystems StepOne™, y Stratagene Mx3005P™ comprobar que la opción del
control pasivo ROX esta desactivada (ver Adjunto II).
Análisis e interpretación de resultados
El análisis de las muestras se realiza con el software propio del equipo de PCR a
tiempo real de acuerdo con las instrucciones de uso del fabricante.
Antes de analizar el resultado de las muestras clínicas debe validarse el resultado de
los controles:
Control positivo El control positivo utilizado en cada serie, debe mostrar una curva de
amplificación en los canales de los virus de Zika (Cy5), Dengue(FAM) y Chikungunya
(ROX).
Control negativo El control negativo incluido en cada serie, debe mostrar la ausencia
de señal de FAM, ROX y Cy5.
El experimento es inválido si hay señal de amplificación en el control negativo o
ausencia de la señal en el control positivo. El ensayo se debe de repetir.
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Con la ayuda de la siguiente tabla, analizar los resultados:
Zika Virus
Dengue Virus
Chikungunya Virus
Control Interno
Control Negativo
Control Positivo
Interpretación
+ + +
+/- - +
Virus Zika, Dengue y Chikungunya
Positivos
- - -
+ - +
Virus Zika, Dengue y Chikungunya
Negativos
+ - - +/- - +
Virus Zika Positivo, Virus Dengue y Chikungunya
Negativos
+ + - +/- - +
Virus Zika y Dengue Positivos, Virus
Chikungunya Negativo
+ - + +/- - +
Virus Zika y Chikungunya
Positivos, Virus Dengue Negativo
- + - +/- - +
Virus Dengue Positivo, Virus Zika y
Chikungunya Negativos
- + + +/- - +
Virus Dengue y Chikungunya
Positivos, Virus Zika Negativo
- - + +/- - +
Virus Chikungunya Positivo, Virus Zika y
Dengue Negativos
+ + + + + + Inválido
- - - - - - Inválido
+ Positivo: Señal de amplificación
- Negativo: No hay señal de amplificación
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Si las muestras negativas para todos los virus no muestran un resultado positivo para el
control interno, se debe repetir el ensayo diluyendo la muestra original 1:10 o repetir la
extracción de los ácidos nucleicos debido a posibles problemas causados por
inhibidores de PCR.
Control de Calidad
Con el fin de confirmar el correcto funcionamiento de la técnica de diagnóstico
molecular, se incluye un Control Interno (CI) en cada reacción. Además un control
positivo y uno negativo se debe de incluir en cada ensayo para una correcta
interpretación de los resultados.
Características técnicas
Sensibilidad y especificidad clínica
Un total de 17 muestras de suero provenientes de pacientes con sospecha de infección
por el virus del Dengue fueron analizadas mediante Vitassay qPCR
Zika+Dengue+Chikungunya y RealStar® Dengue RT-PCR Kit (Altona Diagnostics). El
virus del Dengue fue detectado en 5 muestras mediante ambos tests correctamente.
Un total de 4 muestras clínicas de muestras procedentes de un panel de Zika de la
organización INSTAND del año 2016 se evaluaron mediante PCR a tiempo real
utilizando Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya. El virus Zika fue detectado
correctamente en las 3 muestras positivas mediante el test Vitassay qPCR
Zika+Dengue+Chikungunya.
Doce muestras del panel del virus del Dengue de QCMD 2014 y 10 muestras del panel
de Chikungunya de QCMD del 2015 fueron analizadas mediante Vitassay qPCR
Zika+Dengue+Chikungunya. Se obtuvo una concordancia del 100% para ambos
paneles comparando los resultados con el informe de QCMD.
Los resultados muestran una alta sensibilidad y especificidad para detectar los virus de
Zika, Dengue y Chikungunya utilizando Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya.
Sensibilidad analítica
La sensibilidad analítica fue determinada a partir de diluciones seriadas (1:10) del RNA
molde de los diferentes virus (107-10
1 copias/reacción). Este ensayo tiene un límite de
detección de ≥10 copias de RNA viral por reacción.
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Especificidad analítica
La especificidad analítica para la detección de virus Zika, Dengue y Chikungunya fue
confirmada probando un panel compuesto por los siguientes virus, no observándose
reacciones cruzadas entre ninguna de las especies:
Reactividad analítica
La reactividad de Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, para el virus Zika fue
confirmada por medio de la amplificación a tiempo real utilizando Zika cepa MR 766
como molde.
La reactividad de Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, para el virus Dengue fue
confirmada por medio de la amplificación a tiempo real utilizando Virus Dengue 1 cepa
Hawaii, Virus Dengue 2 cepa Nueva Guinea C, Virus Dengue 3 cepa H87 y Virus
Dengue 4 cepa H241 como moldes.
La reactividad de Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, para el virus
Chikungunya fue confirmada por medio de la amplificación a tiempo real utilizando
Virus Chikungunya cepa S27 Petersfield como molde.
Zika Dengue Chikungunya
Chikungunya S27 Petersfield Chikungunya S27 Petersfield Zika MR 766
Dengue 1 Hawaii Zika MR 766 Dengue 1 Hawaii
Dengue 2 New Guinea C St Louis Encephalitis 17D Dengue 2 New Guinea C
Dengue 3 virus H87 West Nile H160/99 Dengue 3 H87
Dengue 4 virus H241 West Nile Heja Dengue 4 H241
St Louis Encephalitis 17D West Nile Ug37 St Louis Encephalitis 17D
West Nile H160/99 Yellow Fever 17D West Nile H160/99
West Nile Heja West Nile Heja
West Nile Ug37 West Nile Ug37
Yellow Fever 17D Yellow Fever 17D
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Termocicladores compatibles
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya, ha sido probado en los siguientes equipos:
LightCycler 480II (Roche)
Cobas Z480 (Roche)
7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)
CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
AriaMx Real-Time PCR System (Agilent Technologies)
DTPrime Real Time Detection Thermal Cycler (DNA-Technology)
Rotor-Gene® (Qiagen)
SmartCycler® (Cepheid)
Para los equipos Rotor-Gene® Q y SmartCycler® el producto debe ser reconstituido y
trasvasado a los tubos específicos de cada uno de los equipos.
En el caso de utilizar el equipo Applied Biosystems 7500 Fast con tiras, se recomienda
colocar el soporte adecuado para los tubos (Ref. PN 4388506).
Limitaciones
Este test proporciona un diagnóstico preliminar de infección por virus Zika,
Dengue y/o Chikungunya. Todos los resultados obtenidos deben ser
interpretados por un especialista junto con la información clínica y los
hallazgos de laboratorio disponibles.
Este ensayo ha sido probado en muestras de suero y orina. El uso de otras
muestras no se ha establecido.
El correcto funcionamiento de la prueba depende de la calidad de la muestra;
el RNA deber ser extraído de forma adecuada de las muestras clínicas
humanas. Una forma inadecuada de recolección, almacenaje y/o transporte de
las muestras puede dar lugar a falsos negativos.
Se puede detectar un bajo número de copias del RNA molde diana por debajo
del límite de detección, pero los resultados pueden no ser reproducibles.
Existe la posibilidad de falsos positivos debido a la contaminación cruzada con
los diferentes virus, ya sea por muestras que contienen altas concentraciones
de RNA molde diana o por contaminación por arrastre a partir de productos de
PCR de reacciones anteriores.
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Adjunto I: Compatibilidad de los termocicladores a tiempo real más usuales
Los termocicladores más usuales se enumeran en la siguiente tabla separados por tipo de tubo. Si no encuentra su termociclador en la siguiente lista, póngase en contacto con
su proveedor:
Termocicladores con bloque de bajo pefil Termocicladores con bloque de alto perfil
Applied Biosystems
Applied Biosystems
7500 Fast Real-Time PCR System
7500 Real-Time PCR
7500 Fast Dx Real-Time PCR System QuantStudio™ 12K Flex 96-well
QuantStudio™ 12K Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 6 Flex 96-well
QuantStudio™ 6 Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 7 Flex 96-well
QuantStudio™ 7 Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System
ViiA™ 7 Real-Time PCR
ViiA™ 7 Fast Real-Time PCR System
Bio-Rad
Bio-Rad
CFX96 TouchTM
Deep Well Real-Time PCR
Detection
CFX96 TouchTM
Real-Time PCR Detection System
iCycler iQTM
Real-Time PCR
Roche
iCycler iQTM
5 Real-Time PCR
LightCycler ®480 Real-Time PCR System
Eppendorf
LightCycler ®96 Real-Time PCR System MastercyclerTM
ep realplex
Agilent Technologies Stratagene / Agilent Technologies
AriaMx Real-Time PCR System Mx3000P™ Real Time PCR System
DNA-Technology
Mx3005P™ Real Time PCR System
DTlite Real-Time PCR System Analytik Jena Biometra
DTprime Real-time Detection Thermal Cycler
TOptical
Qiagen qTOWER 2.0
Rotor-Gene®
Abbott
Cepheid
Abbott m2000 RealTime System
SmartCycler® BIONEER
Exicycler™ 96
DNA-Technology
DTlite Real-Time PCR System
DTprime Real-time
Qiagen
Rotor-Gene®
Cepheid
SmartCycler®
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Adjunto II: Canales de detección de los equipos a tiempo real
Los canales de fluorescencia de algunos de los termocicladores a tiempo real más
comunes se especifican en la siguiente tabla:
Termociclador Canal
Vitassay
Canal de Detección Observaciones
Bio-Rad CFX96 TM
FAM FAM
HEX HEX
ROX ROX
Cy5 Cy5
ABI 7500 Applied Biosystems
FAM FAM Opción del control
pasivo ROX desactivada
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
Roche Lightcycler®480II
FAM 465/510 Se requiere
compensación de color
HEX 533/580
ROX 533/610
Cy5 618/660
Smartcycler® Cepheid
FAM Channel 1
HEX Channel 2
ROX Channel 3
Cy5 Channel 4
Abbott m2000rt
FAM FAM
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
Mx3000PTM
Mx 3005P
TM
Stratagene
FAM FAM Opción del control
pasivo ROX desactivada
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
AriaMx Agilent
FAM FAM
HEX HEX
ROX ROX
Cy5 Cy5
Rotor-Gene®Q Qiagen
FAM Green
HEX Yellow
ROX Orange
Cy5 Red
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Intended use
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya allows the detection and differentiation of
Zika virus, Dengue virus and Chikungunya virus by real-time RT-PCR in clinical
samples. The product is intended for use in the diagnosis of Zika virus, Dengue virus
and/or Chikungunya virus infections alongside clinical data of the patient and other
laboratory tests outcomes.
References
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya 4x8 -well strip, low profile 7041005
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya 4x8-well strip, high profile 7042005
Materials/reagents provided
Código Reactivo/Material Color Cantidad
7041S005/ 7042S005
Zika+Dengue+Chikungunya Virus strips low/high profile
- 4x8-well strip
7C005 Zika+Dengue+Chikungunya
Positive Control
red 1 vial
7001A PCR grade water white 1 vial x 1 mL
7002B Resuspension Buffer green 1 vial x 1 mL
7003N Negative control yelow 1 vial x 1 mL
7004O Optical caps - 4x8 cap strip
Transport and storage
The reagents and the test can be shipped and stored at 2-40ºC until expiration
date stated in the label.
The resuspended positive control should be stored at -20ºC. In order to avoid
repeated freeze/thaw cycles, we recommend to separate in aliquots.
Keep all reagents of in the dark.
Additional equipment and material required
RNA extraction kit
Real-time PCR instrument (thermocycler) (Attached I)
Centrifuge for 1.5 mL tubes
Vortex
Micropipettes (1-20 µL, 20-200 µL)
Filter tips
Powder-free disposal gloves
EN
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Summary
Zika virus (ZIKV), Dengue (DENV) and Chikungunya virus (CHIKV) are transmitted by
the sting of the same Aedes genus mosquito.
Besides, Zika virus was isolated in 1947 from a rhesus monkey in the Zika forest in
Uganda. Typically, clinical manifestations of human ZIKV disease are similar to many
others derived of arbovirus infections that occur without serious complications and may
include a self-limiting febrile illness, arthralgia, myalgia, headache and maculopapular
rash. Conjunctivitis, retroorbital eye pain, lymphadenopathy and diarrhea have also
been reported.
Dengue is also an acute viral illness caused by RNA virus of the family Flaviviridae.
Presenting features may range from asymptomatic fever to dreaded complications such
as hemorrhagic fever and shock. Acute onset high fever, muscle and joint pain, myalgia,
cutaneous rash, hemorrhagic episodes, and circulatory shock are the commonly seen
symptoms.
Chikungunya virus was first isolated in Tanzania in 1953. Chikungunya virus causes
severe, debilitating, often chronic arthralgia with high attack rates, resulting in severe
morbidity and economic costs to affected communities.
These three arboviruses in the initial stages of the infection, cause similar clinical
presentations, although the disease management is different, for that, an early detection
and differentiation is crucial. Confirmation and identification of these infections is based
mostly on detection of viral RNA in serum and urine by using reverse transcription PCR
(RT-PCR). In fact, serology is not advised since this technique can cause cross
reactivity between the antibodies of these arbovirus.
Principle of the test
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya test is based on the real-time amplification
of specific conserved fragments of the envelope gene (Zika virus), of the 3´ Non coding
region (Dengue virus) and of the NSP1 gene (Chikungunya virus). The viral RNA
extracted is transcribed into cDNA using a specific primer by reverse transcription step
followed immediately in the same well by polymerase chain reaction. The presence of
the virus is detected by an increase in observed fluorescence during the reaction upon
hydrolysis of the fluorescent probe.
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya test is a ready-to-use test which contains in
each well all the necessary reagents for real-time PCR assay in a stabilized format. In
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addition, an internal control allows the detection of a possible reaction inhibition. The
amplification of the Zika virus RNA target sequence is detected through the Cy5
channel, Dengue virus RNA target in FAM channel, Chikungunya virus RNA target in
ROX channel whereas the internal control (IC) in HEX, VIC or JOE channel (depending
on the equipment used select the proper detection channel, see Annex 2).
Precautions
For in vitro diagnostic use.
Do not use after expiration date.
Do not mix components from different kits and/or lots.
Do not use if package is open or damaged.
Follow Good Laboratory Practices. Wear protective clothing, use disposal
gloves, goggles and mask.
Do not eat, drink or smoke in the laboratories.
The laboratory process must be one-directional, it should begin in the
Extraction Area and then move to the Amplification and Detection Areas. Do
not return samples, equipment and reagents to the area in which the previous
step was performed.
Specimens and reagents/materials that have been exposed to them must be
treated as potentially infectious. Take necessary precautions during the
collection, storage, treatment and disposal of samples.
Regular decontamination of commonly used equipment is recommended,
especially micropipettes and work surfaces.
Procedures
Specimen collection, processing and RNA extraction
For pre-treatment and nucleic acid isolation, it is recommended to use your optimized
manual or automatic system compatible with real-time PCR technology. The assay has
been validated with the following extraction kits:
Maxwell® 16 Viral Total Nucleic Acid Purification Kit (Promega).
QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAcube instrument (QIAGEN).
High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche).
Invisorb®
Spin Universal Kit (Stratec).
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Positive control preparation
Reconstitute the lyophilized Zika+Dengue+Chikungunya Positive Control (red tube)
in the 100 µL of PCR grade water (transparent tube) supplied. To ensure a complete
resuspension, vortex the tube thoroughly. After first use, dispense into aliquots in
order to avoid multiple freeze-thaw cycles, and store them at -20ºC.
This component contains high copies number template and is a very significant
contamination risk. Therefore, we recommend open and manipulate it in a separate
laboratory area away from the other components.
Reaction setup
Separate the number of required reactions including samples and controls.
Remember that one positive and one negative controls must be included in
each run. Peel off protective aluminium seal from the strips.
Pipette 15 µL of Resuspension buffer (green tube) into each well.
Pipette 5 µL of RNA sample, negative and positive controls into each well
Cover the wells with the caps provided. Spin down briefly (optional).
Place the strips in the Real-time PCR instrument.
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Programm your thermocycler.
Set your thermocycler following the conditions below:
Step Temperature Time Cycles
Reverse transcription 45ºC 15 min 1
Initial denaturation 95ºC 2 min 1
Denaturation 95ºC 10 sec
45 Annealing/Extension
(Data collection*)
60ºC 50 sec
Set the fluororescence data collection during the extension step (*) through the Cy5
(Zika virus), FAM (Dengue virus), ROX (Chikungunya) and HEX, JOE or VIC channels
(Internal Control (IC)). If you use the Applied Biosystems 7500 Fast or the Stratagene
Mx3005P™ check that passive reference option ROX is none. (Attached 2)
Analysis and interpretation of results
The analysis of the results is done by the software itself of the used real-time PCR
system following manufacturer´s instructions.
For a valid diagnostic test run, the following control conditions must be met:
Positive control
The positive controls used in each run, must show an amplification curve for Cy5 (Zika
virus), FAM (Dengue virus) and ROX (Chikungunya), which validates the reaction.
Negative control
The negative controls included in each run, must show the absence of signal in FAM,
ROX and Cy5 which validates the reaction.
The experiment seems to be fail if there is signal of amplification in negative control or
absence of signal in the positive well. The assay should be repeated.
20 IU_005 Ed01 Nov16
The result interpretation is summarized in the following table:
Zika Virus
Dengue Virus
Chikungunya Virus
Internal control
Negative control
Positive control
Interpretation
+ + +
+/- - +
Zika , Dengue and Chikungunya viruses
Positive
- - -
+ - +
Zika, Dengue and Chikungunya viruses
Negative
+ - - +/- - +
Zika Virus Positive, Dengue and
Chikungunya Viruses Negative
+ + - +/- - +
Zika and Dengue Viruses Positive, and Chikungunya Virus
Negative
+ - + +/- - +
Zika and Chikungunya Viruses Positive, and
Dengue Virus Negative
- + - +/- - +
Dengue Virus Positive, Zika and Chikungunya
Viruses Negative
- + + +/- - +
Dengue and Chikungunya Viruses Positive, Zika Virus
Negative
- - + +/- - +
Chikungunya Virus Positive, Zika and Dengue Viruses
Negative
+ + + + + + Experiment fail
- - - - - - Experiment fail
(+) Positive: Amplification signal (-) Negative: No amplification signal
21 IU_005 Ed01 Nov16
If the negative samples not show a positive result for the internal control, they should be
retested from the diluted original sample 1:10 or the nucleic acid extraction has to be
repeated due to possible problems caused by PCR inhibitors.
Quality Control
In order to confirm the appropriate performance of the molecular diagnostic technique,
an Internal Control (IC) is included in each reaction. Besides, a positive and a negative
control must be included in each assay to interpret the results correctly.
Performance evaluation
Clinical sensitivity and specificity
A total of 17 serum samples from Dengue symptomatic patients were tested by Real
Time PCR using Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya and RealStar® Dengue
RT-PCR Kit (Altona Diagnostics). Dengue virus was detected in 5 samples by Vitassay
qPCR Zika+Dengue+Chikungunya Real Time PCR.
A total of 4 clinical samples from INSTAND 2016 panel from Virus Genome Detection-
Zikaviruses EQA Programme, were tested by Real Time PCR using Vitassay qPCR
Zika+Dengue+Chikungunya. Zika virus was correctly detected in the 3 positive samples.
A total of 12 clinical samples from Dengue QCMD 2014 panel and 10 samples from
Chikungunya QCMD 2015 panel were tested by Vitassay qPCR
Zika+Dengue+Chikungunya. The results of Vitassay qPCR kit were concordant for all
the samples.
The results show a high sensitivity and specificity to detect Zika, Dengue and
Chikungunya viruses using Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya.
Analytical sensitivity
The analytical sensitivity was determined by analysis of 10-fold dilution series of Zika,
Dengue and Chikungunya virus templates ranging from 107 to 10
1 copies/rxn. This
assay has a detection limit of ≥10 viral RNA copies per reaction.
22 IU_005 Ed01 Nov16
Analytical specificity
The analytical specificity for Zika, Dengue and Chikungunya virus was tested within the
panel of following virus, where no cross-reactivity was seen between any of the species:
Zika Dengue Chikungunya
Chikungunya S27 Petersfield Chikungunya S27 Petersfield Zika MR 766
Dengue 1 Hawaii Zika MR 766 Dengue 1 Hawaii
Dengue 2 New Guinea C St Louis Encephalitis 17D Dengue 2 New Guinea C
Dengue 3 H87 West Nile H160/99 Dengue 3 H87
Dengue 4 H241 West Nile Heja Dengue 4 H241
St Louis Encephalitis 17D West Nile Ug37 St Louis Encephalitis 17D
West Nile H160/99 Yellow Fever 17D West Nile H160/99
West Nile Heja West Nile Heja
West Nile Ug37 West Nile Ug37
Yellow Fever 17D Yellow Fever 17D
Analytical reactivity
The reactivity of Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya Virus Real Time PCR for
Zika virus was confirmed by the real time amplification using Zika virus strain MR 766 as template. The reactivity of Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya Virus Real Time PCR for
Dengue virus was confirmed by the real time amplification using Dengue 1 virus strain Hawaii, Dengue 2 virus strain New Guinea C, Dengue 3 virus strain H87 and Dengue 4 virus strain H241 as template.
The reactivity of Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya Virus Real Time PCR for Chikungunya virus was confirmed by the real time amplification using Chikungunya virus S27 Petersfield as template.
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Compatibles real-time PCR equipment
Vitassay qPCR Zika+Dengue+Chikungunya has been validated on the following
equipments:
LightCycler 480II (Roche)
Cobas Z480 (Roche)
7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)
CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
AriaMx Real-Time PCR System (Agilent Technologies)
DTPrime Real Time Detection Thermal Cycler (DNA-Technology)
Rotor-Gene® (Qiagen)
SmartCycler® (Cepheid)
For Rotor-Gene® Q and SmartCycler® thermocyclers the product should be
reconstituted following the procedure and transferred into specific Rotor-Gene® Q
and/or SmartCycler tubes.
When using the Applied Biosystems 7500 Fast with strips it is recommend to place a
plate holder for the tubes (Ref. PN 4388506).
Limitations
This test provides a presumptive diagnosis of Zika virus, Dengue virus and
Chikungunya virus infection. All results must be interpreted together with other
clinical information and laboratory findings available to the physician.
This assay was tried with serum and urine samples. The use of other samples has
not been established.
The quality of the test depends on the quality of the sample; proper RNA from
clinical specimens must be extracted. Unsuitable collection, storage and/or
transport of specimens may give false negative results.
Extremely low levels of target below the limit of detection may be detected, but
results may not be reproducible.
There is a possibility of false positive results due to cross-contamination by Zika,
Dengue and/or Chikungunya virus, either samples containing high concentrations
of target RNA or contamination due to PCR products from previous reactions.
24 IU_005 Ed01 Nov16
Attached I: Compatibility of the most common real-time PCR equipment
The most common thermocyclers are listed in the following table separated by tube type. If you do not find your thermocycler in the list below, please contact with your
supplier.
Low profile Block Thermocyclers High profile Block Thermocyclers
Applied Biosystems
Applied Biosystems
7500 Fast Real-Time PCR System
7500 Real-Time PCR
7500 Fast Dx Real-Time PCR System QuantStudio™ 12K Flex 96-well
QuantStudio™ 12K Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 6 Flex 96-well
QuantStudio™ 6 Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 7 Flex 96-well
QuantStudio™ 7 Flex 96-well Fast
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System
ViiA™ 7 Real-Time PCR
ViiA™ 7 Fast Real-Time PCR System
Bio-Rad
Bio-Rad
CFX96 TouchTM
Deep Well Real-Time PCR
Detection
CFX96 TouchTM
Real-Time PCR Detection System
iCycler iQTM
Real-Time PCR
Roche
iCycler iQTM
5 Real-Time PCR
LightCycler ®480 Real-Time PCR System
Eppendorf
LightCycler ®96 Real-Time PCR System MastercyclerTM
ep realplex
Agilent Technologies Stratagene / Agilent Technologies
AriaMx Real-Time PCR System Mx3000P™ Real Time PCR System
DNA-Technology
Mx3005P™ Real Time PCR System
DTlite Real-Time PCR System Analytik Jena Biometra
DTprime Real-time Detection Thermal Cycler
TOptical
Qiagen qTOWER 2.0
Rotor-Gene®
Abbott
Cepheid
Abbott m2000 RealTime System
SmartCycler® BIONEER
Exicycler™ 96
DNA-Technology
DTlite Real-Time PCR System
DTprime Real-time
Qiagen
Rotor-Gene®
Cepheid
SmartCycler®
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Attached II: Detection channels of most common real time PCR equipment
The fluorescence detection channels of some of most common Real Time PCR
Thermocyclers are specified in the following table:
REAL-TIME PCR
THERMOCYCLER
Vitassay
CHANNEL
DETECTION CHANNEL OBSERVATIONS
Bio-Rad CFX96 TM
FAM FAM
HEX HEX
ROX ROX
Cy5 Cy5
ABI 7500 Applied Biosystems
FAM FAM
Passive reference option ROX is none
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
Roche Lightcycler®480II
FAM 465/510
Colour Compensation required
HEX 533/580
ROX 533/610
Cy5 618/660
Smartcycler® Cepheid
FAM Channel 1
HEX Channel 2
ROX Channel 3
Cy5 Channel 4
Abbott m2000rt
FAM FAM
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
Mx3000PTM
Mx 3005P
TM
Stratagene
FAM FAM
Passive reference option ROX is none
HEX VIC
ROX ROX
Cy5 Cy5
AriaMx Agilent
FAM FAM
HEX HEX
ROX ROX
Cy5 Cy5
Rotor-Gene®Q Qiagen
FAM Green
HEX Yellow
ROX Orange
Cy5 Red
26 IU_005 Ed01 Nov16
Bibliography/Bibliografía
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Yap State, Micronesia, 2007 Lanciotti RS, Kosoy OL, Laven JJ, Velez JO,
Lambert AJ, Johnson AJ, Stanfield SM, Duffy MR. Emerg Infect Dis. 2008
Aug;14(8):1232-9.
2. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-
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Virol J. 2013 Oct 22;10:311.
3. Dengue virus: A global human threat: Review of literature. Hasan S, Jamdar
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Jan-Feb 6(1):1-6.
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Dumoulin A, Marti H, Panning M, Hatz C, Hirsch HH. J Clin Microbiol 2008
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and serological diagnosis of Chikungunya virus infection. Jacobsen S, Patel P,
Schmidt-Chanasit J, Leparc-Goffart I, Teichmann A, Zeller H, Niedrig M. J Clin
Virol 2016 Mar;76:55-65.
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Trademarks
CFX™ and IQ5™ are registered trademarks of Bio-Rad Laboratories.
ABI®, QuantStudio™ and ViiA™ are registered trademarks of Thermo Fisher Scientific Inc.
LightCycler® is a registered trademark of Roche.
Mx3000P™ and Mx3005™ are registered trademarks of Agilent Technologies.
Mastercycler™ is a registered trademark of Eppendorf.
Rotor-Gene® Q is a registered trademark of Qiagen.
SmartCycler® is a registered trademark of Cepheid.
Symbols for IVD components and reagents/ Símbolos utilizados para
componentes y reactivos IVD
Producto para
diagnóstico in vitro
For in vitro diagnostic
use only
Almacenar en lugar seco
Keep dry
Consultar las
instrucciones de uso
Consult instructions for
use
Limitación de
temperatura
Temperature limitation
Fecha de caducidad
Use by
Fabricante
Manufacturer
Número de lote
Lot number
Contiene <n> test
Contains sufficient for
<n> test
DIL
Diluyente de muestra
Buffer
Sample diluent
Número de referencia
Catalogue number
28 IU_005 Ed01 Nov16