PHẦN I.TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐẾ

Khi sử dụng Đất để trồng trọt thì cây trồng hút dinh dưỡng của Đất để

sinh trưởng và phát triển làm cho Đất mất đi một lượng lớn dinh dưỡng. Nếu

không được bù trả thì Đất sẽ nhanh chóng bị suy thoái. Vì vậy việc bổ sung, bù

trả dịnh dưỡng cho Đất là rất quan trọng. Đặc biệt với nước ta - một nước nông

nghiệp thì việc này càng quan trọng hơn. Hàng năm, chúng ta phải bỏ ra hàng

triệu USD để mua phân bón.Tuy nhiên bón phân hóa học lại có những mặt trái

của nó tác động tiêu cực đến đất và chất lượng nông sản :

- Làm đất nhiễm bẩn nitrat : Do phân đạm sản sinh ra NO3-. Theo thống kê,

cây trồng chỉ hấp thụ được 50% lượng phân đạm bón vào đất, lượng còn lại đi

vào trong đất và nước.

- Nhiễm bẩn kim loại nặng : Phân bón hóa học sản xuất được sản xuất từ

nguyên liệu chính là các khoáng : apatit, photphorit, pyrite….Các khoáng này

đều có môt tỉ lệ nhất định các kim loại nặng : Hg, Cd, Pd, As, Mn, Cr…làm đất

bị nhiễm bẩn kim loại nặng dần dần sẽ bị thoái hóa , giảm sức sản xuất của đất,

giảm chất lượng nông sản, ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

- Làm đất chua, mất kết cấu : Bón phân hóa học quá nhiều sẽ làm tăng độ

chua của đất,

- Tăng chi phí sản xuất trong nông nghiệp

Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích canh tác 10,126 triệu ha với

sản phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nên

lượng tàn dư thực vật ( rơm rạ, vỏ hành tỏi, lõi ngô, rau củ …) phát sinh hàng

năm là rất lớn . Phần lớn thường được bà con nông dân đốt, đun nấu hoặc vứt

bừa bãi trên các đường giao thông nội đồng.Việc này không những lãng phí

nguồn tài nguyên này mà còn gây ô nhiễm không khí, cản trở giao thông, gây

ách tắc dòng chảy, gây các bệnh hô hấp. Chỉ một lượng nhỏ tàn dư này để lại

1

cho Đất nhưng phân giải chậm nên lượng dinh dưỡng từ nó cung cấp cho Đất là

rất ít. Bên cạnh đó những tàn dư này thường có hàm lượng Xenlulo cao, phân

hủy chậm trong môi trường, nên nếu để lại trên đồng ruộng sẽ gây ô nhiễm môi

trường, nơi cư trú cho các ổ dịch bệnh.

Từ những lí do trên việc tìm ra phương pháp xử lí các phế phụ phẩm

này mà không gây ô nhiễm môi trường, bù trả được hữu cơ cho Đất là một yêu

cầu bức thiết. Phương pháp sử dụng các vi sinh vật làm chế phẩm để xử lí các

phế thải đồng ruộng đã đáp ứng được những vấn đề đặt ra đó. Là một biện pháp

tương đối dễ áp dụng đối với người nông dân, cho hiệu quả cao, giảm thiểu môi

trường, bù trả được hữu cơ cho Đất. Nước ta lại được thiên nhiên ưu đãi cho hệ

động thực vật, vi sinh vật phát triển rất phong phú. Vì vậy phương pháp sử dụng

chế phẩm vi sinh vật để xử lí phế thải đồng ruộng lại càng có điều kiện để áp

dụng và phát huy.

Trong các loại vi sinh vật thì xạ khuẩn có những ưu điểm như : ít độc, có

thể sản sinh ra chất ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh khác, dễ tiến

hành theo kiểu lên men rắn theo kiểu ủ đống. Tuy nhiên xạ khuẩn lại ít được

nghiên cứu nhất.

Chính những lí do trên tôi quyết định nghiên cứu đề tài sau: “Nghiên cứu

và tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải xenluloza đê làm giống sản

xuất chế phẩm xử lí phế phụ phẩm nông nghiệp”

Đề tài tập trung nghiên cứu và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng

phân hủy xenlulo để làm giống sản xuất chế phẩm xử lí tàn dư thực vật.Việc

nghiên cứu này là cần thiết ,có ý nghĩa thực tiễn nằm giảm thiểu ô nhiễm môi

trường, bù đắp dinh dưỡng cho đất.

2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY XENLULOZA

2.1.1.Cấu trúc phân tử và khả năng bền vững của xenluloza

Xenluloza là thành phần chính của tế bào thực vật chiếm khoảng 20%

trong một số loài cỏ, 45% trên gỗ và trên 90% trên sợi bong. Xenluloza kết hợp

với hemixenlulo và lignin tạo nên độ cứng cho thành tế bào. Xenluloza là

polysacarit mạch thẳng gồm 1.400 đến 12.000 gốc β- D glucopyranoza liên kết

với nhau bằng liên kết β- 1,4 glucozit tạo thành dạng chuỗi, có công thức cấu tạo

là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n. Trong phân tử xenluloza các gốc β- D gluco

thường có cấu hình dạng ghế và quay một góc 1800 với nhau, do đó các nhóm

huydroxit (-OH) đều nằm trên đườngthẳng xích đạo. Nhờ phân tích Ronghen,

người ta đã biết rằng xenluloza có cấu tạo sợi. Các sợi liên kết với nhau bằng

các liên kết hydro và các liên kết Vandderrvan tạo thành các bó nhỏ gọi là micro

fibrin có cấu trúc không đồng nhất và tạo nên cấu trúc mixen của xenlulo. Các

sợi micro fibrin có chiều rộng từ 100- 300A0 và có chiều dài từ 40- 100A0.

( Conovalov- 1972).

Cấu trúc mixen của xenluloza bao gồm hai vùng chính : Vùng kết tinh có

cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi đậm đặc và chặt chẽ như tinh thể và chiếm

khoảng ¾ cấu trúc xenluloza. Do có mạng lưới liên kết hydrogen dày đặc ngăn

cản sự hấp thụ nước và trương lên nên vùng kết tinh rất khó bị tác dụng ngay cả

với enzyme xenluloza( enzyme xenluloza chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi). Vùng

vô định hình có cấu trúc kém chặt chẽ hơn vùng kết tinh nên dễ bị tác động hơn.

Vùng này có thể hấp thụ nước và trương lên tạo điều kiện thuận lợi giúp enzyme

xenluloza tấn công dễ dàng.

Trong tự nhiên, xenluloza là một trong những hợp chất khá bền vững,

chúng không tan trong nước mà chỉ bị trương lên do hấp thụ nước (phần vô định

hình). Xenluloza là một chất tương đối phức tạp chỉ bị thủy phân khi đun nóng

3

với axit hoặc kiềm ở nồng độ cao, bị thủy phân ở nhiệt độ 40- 500C bởi enzyme

xenluloza và bị thủy phân ở điều kiện bình thường nhờ phức hệ xenluloza của

VSV (1)

Hàng năm thảm thực vật trên trái đất tổng hợp được một khối lượng lớn

hydrocacbon (5triệu tấn ). Trong đó tinh bột là thức ăn cho con người và động

vật. Phần còn lại chủ yếu là xenluloza, lignin và hemixenluloza thì con người và

động vật không sử dụng được, vì thế các phế thải chứa xenluloza đã bị ứ đọng

và gây ô nhiễm môi trường.Chính vì vậy, việc thủy phân xenluloza thành

glucoza là một vấn đề có ý nghĩa rất quan trọng. Có hai phương pháp chính để

thực hiện mục đích này. Phương pháp hóa học đòi hỏi kinh phí lớn, hiệu quả

kinh tế không cao. Còn phương pháp sinh học dễ dàng thực hiện dễ dàng thực

hiện nhờ VSV. Theo phương pháp này xenluloza và các nguyên liệu khác phải

được thủy phân thành các đường hòa tan rồi được dùng làm cơ chất nuôi cấy

VSV để thu nhận sinh khối giàu protein hoặc lên men tạo thành các dung môi,

chất dẻo, etanol. ( Michael,vtv,1979, Bellany, 1974 [2]

CH2OH

O

O

HOH

H

OHH

H

Cấu trúc của xenluloza.

4

2.1.2. Cơ sở khoa học của quá trình phân hủy xenluloza

2.1.2.1.Sinh tổng hợp xenluloza của vi sinh vật

Phân giải xenluloza tự nhiên là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tham

gia phối hợp của phức hệ enzyme xenluloza. Sự điều hòa sinh tổng hợp

xenluloza được thực hiện nhờ cơ chế cảm ứng, kìm hãm xenluloza tự nhiên và

các dẫn xuất của chúng là những tác nhân cảm ứng đặc hiệu với các thành phần

trong phức hệ xenluloza ( Reese, 1950) [3]. Qúa trình tổng hợp xenluloza chịu

sự điều khiển của bộ máy di truyền và các quá trình sinh hóa do các chất cảm

ứng sự kiềm chế của các chất trao đổi và các sản phẩm cuối cùng. Nhiều tác giả

khẳng định xenluloza là enzyme cảm ứng và chất cảm ứng tốt nhất là xenuloza

và lactoza. Nhưng một số tác giả lại đưa ra bằng chứng rằng xenluloza hay chất

cảm ứng nêu trên. Tuy nhiên, thực tế VSV tổng hợp xenluloza mạnh nhất trên

môi trường có hàm lượng xenlulo cao nhất hay chất cảm ứng thích hợp. Vì vậy,

có thể coi sự tổng hợp xenluloza là có tính cảm ứng không chặt chẽ vì xenlulo là

cơ chất không hòa tan, phân tử lớn, bản thân không thể thâm nhập vào tế bào để

gây ra các phản ứng sinh hóa. Theo Whitaker, xenluloza không phải là chất cảm

ứng trực tiếp mà khi ở ngoài môi trường chúng bị thủy phân bởi một lượng nhỏ

thành xenlobioza, chất này có thể thấm qua màng tế bào vào trong và được coi

là chất cảm ứng sinh lý, nhưng nếu nồng độ xenlobioza cao sẽ thực sự kìm hãm

tổng hợp xenluloza. Vì vậy để thu được nguồn enzym cao người ta thường sử

dụng cơ chất không thể thủy phân như : bã mía, rơm rạ, giấy loại. Hoặc có thể

nuôi cấy kết hợp với VSV đồng hóa tốt xenlobioza.[4]

Sự kìm hãm tổng hợp xenlulaza xảy ra rất mạnh mẽ trong môi

trường có chứa hydrat cacbon dễ tiêu, đặc biệt là gluco. Khi trong môi trường

còn hydrat cacbon dễ tiêu, quá trình sinh tổng hợp xenlulaza chưa bắt đầu. Thậm

chí khi tế bào đang tổng hợp xenlulaza người ta bổ sung gluco thì cường độ tổng

hợp xenluaza bị giảm ngay. [5]

5

Nhiều sản phẩm của chu trình Kerbs( axit nitric,succinic…) là chất ức chế

quá trình sinh tổng hợp xenlulaza. Nguồn nitơ hữu cơ tác động rõ rệt tới quá

trình tổng hợp xenlulaza, khi nuôi Thermoactinomyces trên môi trường có avicel

nếu bổ sung nước chiết nấm men hay pepton thì khả năng sinh C1, C2 sẽ tăng lên

[6]

2.1.2.2. Cơ chế phân giải xenluloza.

Qúa trình phân giải xenluloza của VSV được thực hiện bởi các phức hệ

enzyme xenluloza. Phức hệ này gồm 3 enzym chủ yếu sau đây:

- Endoglucanaza hay CMC aza (edo – 1,4 – β – D glucan – 4 glucanohydrolaza

EC 3.2.1.4) có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong phân tử xenluloza làm

giảm nhanh chiều dài chuỗi, làm tăng chậm các nhóm khử, thủy phân liên kết β

– 1,4 glucozit một cách tùy tiện và giải phóng xenluodextrin, xenlobioza và

gluco. Enzym này phân giải mạnh mẽ các xenluloza hòa tan nhất là dạng

xenluloza vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh.

- Exoglucanaza (exo - 1,4 – β – D glucan – xenlobiohydrolaza, EC

3.2.1.91) có khả năng tấn công chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng

xenlobioza và gluco. Enzym này không phân giải xenuloza kết tinh cũng như

các xenuloza hòa tan, tác dụng yếu lên CMC nhưng hoạt động mạnh lên

xenluloza vô định hình

- β - 1,4 glucozidaza hay xenlobiaza( EC 3.2.1.21) có khả năng thủy

phân xenobioza hay xenlo – oligosacazit ( xenlodextrin) hòa tan trong nước giải

phóng glucoza. Enzym này có hoạt tính cực đại trên xenlobioza và hoạt động

giảm dần theo chiều dài của chuỗi xenlodextrin. Chức năng của β - 1,4

glucozidaza chỉ là điều chỉnh sự tích lũy chất cảm ứng của enzyme xenlulaza [7]

Về động học phản ứng của các enzyme này, Reese và các cộng sự lần đầu đưa

ra cơ chế phân giải vào năm 1950.

6

Theo các tác giả này thì enzym C1 tương ứng với endo-

glucanaza là “ tiền nhân tố thủy phân” hay enzyme không đặc biệt làm biến

dạng xenluloza tự nhiên thành các chuỗi xenluloza hoạt động có mạch ngắn hơn,

sau đó enzym Cx tương ứng với exo – glucanaza tiếp tục phân cắt, giải phóng

các đường hòa tan và cuối cùng taọ thành gluco dưới dụng của xenlobioza [8]

Năm 1988, Kliosov và các cộng sự lại cho rằng quá trình

chuyển hóa xenluloza có thể xảy ra do nhiều phức hệ enzyme xeulaza, sơ đồ sau

thể hiện những bước chính của quá trình thủy phân xenluoza:

Với E1 : Endoglucanaza E3 : Xenlobioza

E2 : Xenlobiohydrolaza E4 : Exoglucozidaza

Con đường (4) E4 là enzyme xúc tác, nhưng trong trường hợp còn có cả

E1 hayE2 có khi cả hai enzyme này cùng xúc tác với E4

Con đường (5) ngoài E1còn có cả E2cùng xúc ác.

Các thành phần trên đi theo con đường nào phụ thuộc vào cấu trúc phân

tử cơ chất và mức độ polime hóa, điều kiện thủy phân, thành phần phức hợp

xenlulaza và các yếu tố khác [9]

Hai sơ đồ trên được nhiều người tán thành, nhưng một cơ chế đầy đủ và

giả thích thật thỏa đáng sự thủy phân xenluloza thì chưa có tác giả nào đưa ra

được.

Xenlulo ban đầu

E1(1)

Xenlubigosaccorit

E2(2)

Xenlobioza

E3

(3)Gluco

E4

(4)

E5(5)

7

2.1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenluloza.

Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải xenuloza rất đa

dạng và phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn. Để phân giải xenluloza tự

nhiên đòi hỏi sự tham gia phối hợp của phức hệ enzym xenlulaza. Xenulaza là

một phức hệ enzym rất phức tạp. Các vi sinh vật thường không có khả năng tạo

ra được tỷ lệ enzyme một cách cân đối. Có loài tạo được nhiều enzym này có

loài tạo được nhiều loại enzym khác. Vì thế trong quá trình phân giải xenluloza

cần có sự hiệp đồng để tạo ra phức hệ enzym xenlulaza hoàn chỉnh.

+ Nấm sợi

Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết ra ngoài môi trường một lương

lớn đầy đủ các thành phân enzym có trong phức hệ xenlulaza. Nên khả năng

phân giải xenluloza của nấm là rất mạnh. Những loài nấm có khả năng phân giải

xenluloza mạnh như: Trichoderma với đại diện là Trichoderma reesei,

Trichoderma viride, tiếp theo là Aspergillus niger,Fusarium solani, Penicillim

pinophinum, Sporotrichum pulverulentum

Mỗi loài nấm khác nhau có khả năng phân giải mạnh loại xenluloza

khác nhau. Mandels và các cộng sự nhận thấy rõ ảnh hưởng của nguồn cacbon

đối với nấm T. viride. Nguồn cacbon thích hợp cho tổng hợp xenlulaza ở

Aspergillus fumigatus ưa ấm và ưa nhiệt là giấy lọc hay rơm nghiền. Ở A.tereus

là giấy lọc còn ở T.viride là hỗn hợp cám và củ cải đường. Bổ sung các chất dễ

đồng hóa như gluco xenlobioza vào môi trường nuôi cấy chứa xenluloza có thể

làm pH của môi trường giảm đi nhanh chóng và do đó hoạt tính xenlulaza của

các chủng nấm Tricoderma giảm theo

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự tạo

thành xenlulaza của nấm. Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp xenlulaza ở

nhiều loại nấm như Fusarium, Aspergillus, Tricoderma… còn muối axit amôn

thường ức chế việc tạo thành xenlulaza ở A.terreus, T. lignorum, T. koningi và

nhiều loại nấm khác. Nguồn nitơ hữu cơ cũng có ảnh hưởng không giống nhau

8

tới việc sinh xenlulaza ở các nấm, peptone gây kích thích sự tạo thành xenlulaza

ở Penicillium oxalicum, T. reesei, Helminnihosporium cylop, nhưng lại ức chế

việc tạo thành xenlulaza ở Myrothecium, Aspergillus, Chaetominum

Jeris và các cộng sự thường gặp các nấm phân giải xenluloza trong

các đống ủ như: Alternaria, Aspergillus, Chaetominum, Copprinus, Fomes,

Fusarium, Myrotheccium, Penicillium, Polypones, Rhizoctonia, Rhizapus,

Tricoderma,Verticilli …[10]

+ Vi khuẩn : đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn. Năm 1785 lần

đầu tiên L.Popov đã phát hiện ra rằng các vi khuẩn kỵ khí tham gia vào quá trình

lên men xenlulo. Thế kỷ 19 các nhà khoa học đã phân lập được một số VSV kỵ

khí có khả năng phân giải xenlulo từ phân và dạ cỏ của động vật nhai lại. Năm

1902 V.L.Omelianski đã thuần khiết và mô tả giống vi khuẩn phân giải xenlulo

và nêu lên hai kiểu lên men xenlulo đó là: Lên men hydro do loài Bacillus

cellulose hydrogenicus và lên men mêtan Bacillus cellulosaemetanicus. Chúng

đều là những VK ưa ấm với nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 300 – 350C. Sau

đó, ngoài những nhóm VK kỵ khí, người ta phân lập được các nhóm VK hiếu

khí ưa ấm, ưa nhiệt có khả năng phân giải xenlulo. Bên cạnh đó, khả năng phân

giải xenlulo và hemixenlulo của các nhóm VK tăng lên trong môi trường có độ

ẩm cao.

Vi khuẩn cũng có khả năng phân giải xenlulo nhưng cường độ không mạnh bằng

nấm sợi do lượng enzim tiết ra môi trường ít hơn và các thành phần không đầy

đủ bằng. Do vậy để phân giải xenlulo tự nhiên, các loài vi khuẩn khác nhau phải

“phối hợp” với nhau để cùng phân giải trong mối quan hệ hỗ sinh. Các vi khuẩn

hiếu khí có khả năng phân giải xenlulo khá mạnh như Cellulomonas, Vibrio,

Archomobacter. Một số niêm vi khuẩn có khả năng này thì đáng chú ý là

Cytophara, Sporocytophara, Soragium… Niêm vi khuẩn nhận được năng lượng

khi ôxi hóa các sản phẩm của sự phân giải xenlulo thành CO2 và H2O.

9

Xạ khuẩn: bên cạnh nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn cũng có khả năng

phân giải xenlulo khá cao, đáng chú ý là Streptomyces, Actinomyces, Nocardia,

Mycromonospora.

XK phân giải xenlulo được phân lập từ các mẫu đất, mùn rác, mẫu bùn,

những nơi có chứa xenlulo. Người ta thường sử dụng XK đặc biệt là

Streptomyces trong việc phân hủy rác sinh hoạt. Những XK này thường thuộc

nhóm ưa nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt độ 450 – 500C, rất thích hợp với

quá trình ủ rác thải. [11]

2.2. XẠ KHUẨN

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn G (+), đặc biệt khác với vi sinh vật nhân

sơ là có tỉ lệ G+ X cao (70%), trong đó ở vi khuẩn là 25-45 %. Chúng có khuẩn

lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng

sợi phân nhánh như nấm (myces). Xạ khuẩn phân bố rộng rãi và có vai trò quan

trọng trong tự nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa hợp

chất trong đất, trong nước. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu,

thành phần đât, mức độ canh tác và thảm thực vật.Theo Waksman thig trong 1

gam đất có khoảng 29.000- 2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số vi

sinh vật(…).Đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt sâu

đến 40cm thường gặp một số lượng lớn XK. Trong 1 gam đất canh tác có thể

phân lập được 5 triệu hoặc hơn mầm XK.Đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm

thấp, nghèo dinh dưỡng, mật độ phân bố XK thấp hơn, thường dao động trong

khoảng 10.000- 100.000. Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng

hình thành chất kháng sinh, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng

sinh chất kháng sinh.

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng. Để sử dụng nguồn cacbon, chúng thường

sử dụng đường, tinh bột, rượu, axit hữu cơ, polysaccarit, lipti, axit amin, protein

và nhiều hợp chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ vô cơ thường là : pepton, protein,

10

cao ngô, cao nấm men,… Khả năng đồng hóa các chất ở các loài XK khác nhau

à khác nhau.Phần lớn chúng la VSV ưa khí và ưa ẩm.

XK được coi là nhóm VK đặc biệt vì chúng có một số điểm chung với VK về

cấu tạo :

- Kích thước của XK rất nhỏ và tương tự với kích thước của VK

- Nhân của XK cùng loại với nhân của VK nghĩa là chưa có nhân phân hóa rõ

ràng.

- Màng của XK không chứa xenluloza hay kitin.

- Sự phân chia tế bào của XK theo iểu amioz

- XK không có giới tính.

Tuy nhiên cấu trúc dạng sợi ( khuẩn ty) và các cơ quan sinh sản vô tính cua XK

làm cho XK có nhiều điểm khác với VK. XK có hình thái giống nấm ở chỗ có

cấu tạo sợi, phát triển bằng phân nhánh thành những sợi nhỏ, dài gọi là khuẩn

ty(hypha), mỗi khuẩn ty do một tế bào hình thành, tập hợp của các khuẩn ty này

gọi là hệ khuẩn ty. Về phân loại XK thuộc Procaryota còn nấm thuộc Eucaryota.

2.2.1. Đặc điểm hình thái và kích thước

Hình dạng kích thước của khuẩn ty XK:

XK có hệ khuẩn ty phát triển tốt, khuẩn ty hông có vách ngăn và không tự

đứt đoạn, bắt màu Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha bào,

không có lông và giáp mô, đa hình thái như hình chùy, hình phân nhánh hay

dạng sợi dài gọi là khuẩn ty hay phân nhánh thành chùm thành bó

thể( mycelium). Đường kính của khuẩn ty từ 0,2- 2,5μm, kích thước và khối

lượng khuẩn ty thường không ổn định,chúng phụ thuộc vào từng loại và từng

điều kiện nuôi cấy. Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường

lớn hơn so với các khuẩn ty già và các khuẩn ty không mang bào tử. Khi già XK

thay đổi hình dạng rõ rệt chúng trở nên giòn dễ gãy thành từng đoạn nhỏ có kích

thước khác nhau [12]

11

2.2.2. Khuẩn lạc của xạ khuẩn

Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trươn ướt như ở VK và ở nấm men mà

thường rắn chắc thô ráp dạng vôi dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo không

trong suốt, do đó bềm mặt của khuẩn lạc có thể nhẵn có mấu lồi, có nếp nhăn

hoặc sần sùi như vỏ cam sành. Kích thước của khuẩn lạc thay đổi tùy loại XK và

điều kiện nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5- 2mm. Khuẩn lạc của

XK có nhiều màu sắc khác nhau như : đỏ, da cam, vang, lam, hồng, nâu, tím…

Màu sắc của XK cũng là một tiêu chí quan trọng để xác định tên các loài XK

2.2.3. Cấu tạo tế bào [13]

Cấu tạo tế bào XK khá phức tạp bao gồm:

- Vách tế bào XK:

Cấu tạo tương đối dày và khá vững chắc đó là nguyên nhân làm cho khuẩn lạc

của XK rắn chắc hơn khuẩn lạc của vi khuẩn. Vách tế bào XK cấu tạo bởi 3 lớp

◦ Lớp ngoài dày 60- 120Ao khi khuẩn ty già có thể dày tới 150- 200Ao.

◦ Lớp giữa chắc hơn dày 50 Ao

◦ Lớp trong dày 50 Ao

Vách tế bào XK có cấu tạo hoa học là protein, lipit, mucopolysaccarit, ngoài ra

còn chứa các hợp chất photpho, axit teitioic, nhiều men và các loại men này

tham gia cào qua trình trao đổi chất của tế bào.

Vách tế bào XK có nhiều chức năng như:

◦ Cho phép các chất kháng sinh, axit amin, men, nhiều hợp chất khác kể cả hợp

chất hóa học có kích thước lớn như dextran, protein chui qua một cách dễ dàng

◦ Cho phép các chất dinh dưỡng từ môi trường ngoài thẩm thấu có chọn lọc qua

màng

Bên ngoài màng còn có thể có vỏ nhày( capsule), lớp vỏ này cấu tạo từ

polysaccarit và thường rất mỏng, ở một số XK lớp vỏ nhày được hình thành từ

quá trình hình thành bào tử

- Màng nguyên sinh chất của XK:

12

Bên trong vách tế bào là một lớp màng moingr bao phủ trực tiếp nguyên sinh

chất gọi là màng nguyên sinh chất. Màng này dày khoảng 7,5- 10,0 nm, chức

năng chủ yếu của màng nguyên sinh chất là điều hòa hấp thu các chất dinh

dưỡng vào tế bào và tham gia vào quá trình hình thành bào tử.

- Nguyên sinh chất và nhân của XK:

Cũng tương tự như nguyên sinh chất và nhân của VK, do đó người ta cho rằng

XK cùng loài với VK. Trong nguyên sinh chất của XK có chia:

◦ Mezoxom : Thường có dạng hình ống, chức năng của mezoxom là tăng diện

tích tiếp xúc của màng nguyên sinh chất, do đó làm tăng hoạt tính của enzym,

tăng chuyển điện tử.

◦ Các vật thể ẩn nhập gồm có các hạt polyphosphate hình cầu, bắt màu thuốc

nhuộm Soudan III, các hạt polysaccarit bắt màu dung dịch lugol.

2.2.4. Bào tử và sự hình thành bào tử ( Khả năng sinh sản) [14]

- Bào tử xạ khuẩn:

Bào tử được hình thành trên KTKS, sợi bào tử có thể có nhiều loại hình dạng

khác nhau như: thẳng, lượn song,xoắn, mọc vòng, một số XK có sinh nang bào

tử bên trong chứa bào tử nang. Bào tử của XK được hình thành theo ba phương

pháp sau:

◦ Phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của thành khuânt ty tạo ra thành

của bào tử.

◦ Phát triển trong thành: Thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên

sinh chất và thành khuẩn ty

◦ Phát triển bào tử nội sinh thật: Thành khuẩn ty không tham gia vào quá trình

hình thành bào tử

Bào tử trần (conidiospora ) của XK có thể hình tròn, hình bầu dục, hình que,

hình trụ…, Hình dạng và kích thước của bào tử có vai trò quan trong trong công

việc định tên XK

- Sự hình thành bào tử: Sự hình thành bào tử xảy ra theo hai cách:

13

◦ Sự liên kết đoạn( fragmentation)

Các hạt cromatin(chất tạo thành thể nhân) trong nguyên sinh chất được

phân bố đồng đều khắp cuống sinh bào tử, cái nọ cách cái kia theo một khoảng

cách nhất định, sau đó nguyên sinh chất và các chất ưa kiềm co lai bao bọc xung

quanh những hạt cromatin tạo thành một khối gọi là tiền bào tử. Bào tử hình

thành kiểu này thường có hình cầu hoặc được giải phóng ra ngoài khi cuống sinh

bào tử tan đi.

◦ Sự cắt khúc( Segentation)

Cuống sinh bào tử hình thành các vách ngăn ngang. Trước khi hình thành

vách ngăn các chất nhân cũng được phân chia và tạo thành các hạt cromatin

phân bố đều thành một hang dọc trên cuống sinh bào tử. Nguyên sinh chất và

các chất ưa kiềm tập trung xung quanh hạt cromatin tạo thành tiền bào tử. Nhờ

việc hình thành các vách ngăn ngang mà các tiền bào tử lại biến thành bào tử

thực sự. Bào tử thực sự được hình thành theo kiểu này thường có hinh que hay

hình viên trụ. Trên mỗi cuống sinh bào tử có 30-100 bào tử, đôi khi lên tới 200

bào tử. Kích thước bào tử ( 0,7- 0,9)×( 0,7- 1,9) μ. Bề mặt bào tử có thể trơn,

nhẵn cũng có thể xù xì hoặc có gai nhỏ.

2.2.5. Phân loại xạ khuẩn[15]

Ngày nay nhờ sự phát triển cao của sinh học phân tử, hóa sinh hoc lý sinh

học mà những kiến thức phân loại XK đã có nhiều thay đổi cơ bản. Do số lượng

các loại XK mới được mô tả ngày càng nhiều, để việc phân loại nhanh và chính

xác về di truyền phân tử, người ta sử dụng Phương pháp phân loại số, nghiên

cứu chủng loại phát sinh. Xong người ta vẫn chủ yếu dựa vào đặc điểm hình

thái, nuôi cấy, các đặc điểm sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân

tử.

- Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy:

Dựa vào đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy, XK được chia thành 4 nhóm

chính:

14

Nhóm 1: XK mang bào tử rõ rệt. Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào

tử và phân bố thành hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất.

Nhóm 2: XK có bào tử nang. Đặc trưng của nhóm này là hệ sợi phân chia theo

các hướng vuông góc với nhau tạo ra cấu trúc tương tự mang bào tử

Nhóm 3: XK dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt sợi

Nhóm 4: XK dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình chữ V,

T hoặc dạng cầu thong thường không có sợi

Về cuống sinh bào tử trước đây người ta vẫn dựa theo cách chia của Pridham và

cộng sự gồm 3 nhóm: RF - cho những cuống sinh bào tử thằng và lượn sóng,

RA – cho những cuống sinh bào tử xoắn thô sơ và ngắn, S – cho những cuống

sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Tuy nhiên do những năm gần đây việc

nghiên cứu trên những môi trường khác nhau đã làm cho nhiều tác giả có

khuynh hướng chia nhỏ các nhóm trên

- Đặc điểm hóa phân loại( chemotaxonomy): Hóa phân loại chủ yếu dựa vào

các đặc điểm sau:

◦ Typ thành tế bào chủ yếu dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần

peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.

◦ Typ Peptidoglucan( PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của

mạch tetrapeptit của PG, cầu nối peptit và các lien kết giữu các mắt xích của PG.

Nă 1974 Steiner đã chia các PG thành hai nhóm cơ bản là A,B.

◦ Menaquinon : XK giống VK Gram duong ở chỗ tổng hợp menaquinon và

dimetylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon. Phần lớn các chi của XK có

thành phần menaquinon xác định

◦ Phospholipit: Năm 1997, Lechevalier đã sử dụng đặc điểm của phospholipit

để phân XK có 5 tup phospholipit: (PI,,PII, PIII, PIV, PV) có thành phần dặc

trưng và có ý nghĩa cho phân loại XK

- Đặc điểm sinh lí- sinh hóa:

15

Khi phân loại XK đến loài người ta sử dụng các đặc điểm sinh lí, sinh hóa khác

như khả năng đồng hóa các nguồn Cacbon và Nitơ, nhu cầu các chất sinh

trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Các chỉ tiêu

khác cũng được xác định như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối

và các yếu tố môi trường khác, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và

phát triển khác nhau, tính đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh và các sản

phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK.

2.3. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT

TRIỂN VÀ SINH TỔNG HỢP ENZYM CỦA VSV. [16]

2.3.1. Ảnh hưởng của pH

Ph của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng và phát triển

của nhiều VSV. Các ion H+ và OH- là hai loại ion hoạt động lớn nhất trong tất cả

các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng mạnh

mẽ. Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và việc duy trì pH cần thiết

trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng. Các giá trị pH( cực tiểu,

cực đại, tối thích) cần cho sinh trưởng và sinh sản của VSV ứng với các giá trị

pH cần cho hoạt động của men. Giới hạn pH hoạt động đối với VSV ở trong

khoảng 4- 10. Đa số VK sinh trưởng tốt nhất ở pH trung tính ( =7). pH không

những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến các quá trình

trao đổi chất của VSV.

2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của VSV. VK có thể sinh trưởng

trong một biên độ rộng về nhiệt độ. Giới hạn nhiệt độ cực tiểu và nhiệt độ cực

đại là vùng nhiệt sinh trưởng của VSV. Giới hạn này khác nhau ở các loài VSV.

Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt mà có thể chia VSV thành ba nhóm trên cơ sở

phạm vi vùng sinh trưởng tốt nhất. Bọn ưa lạnh sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ <

20oC thường gặp trong nước biển, các hố sâu, dưới suối lạnh. Bọn ưa ấm sinh

16

trưởng tốt nhất ở 20oC – 40oC chiếm đa số các VK, XK, Nấm. Bọn ưa nhiệt sinh

trưởng tốt nhất ở 55oC. Một số không thể sinh trưởng được ở nhiệt độ < 30o C.

2.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối

Natri và Clo là các nguyên tố mà nhiều sinh vậ đòi hỏi với số lượng lớn không

nhỏ. Nhưng cho đến nay người ta vẫn còn biết rất ít về vai trò sinh lí của chúng.

Đa số VSV sinh trưởng tốt trong môi trường chứa ít hơn 2% muối, nồng độ cao

hơn có thể hại cho tế bào. Nhưng cũng có 1 số ít VSV lại sinh trưởng tốt nhất

trong môi trường chứa tới 30% muối.

2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

Cacbon là nguồn dinh dưỡng quan trong cho VSV. Hầu hết các loài VSV sử

dụng nguồn cacbon đưa từ ngoài đưa vào. Mỗi loại có khả năng sử dụng nguồn

cacbon tối thích khác nhau cho sinh trưởng. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp

thụ các nguồn thức ăn cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: Thứ nhất là đặc điểm

sinh lí của từng loại VSV. Thứ hai là thành phần hóa học và tính chất sinh lí của

nguồn thức ăn này.

2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Nguồn nitơ cung cấp cho VSV nguyên liệu để hình thành nhóm amin(-

NH3) và imin(- NH-) trong phân tử aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng và các

hợp chất hóa học khác có mặt trong nguyên sinh chất.Vì vậy nitơ rất quan trọng

đối với sự sinh trưởng, phá triển, sih enzym của VSV.

17

2.3. THỰC TRẠNG VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÍ CHẤT THẢI HỮU

CƠ( có cần thiết phải làm phần này ko hả cô?)

2.4. CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP Ở VIỆT

NAM

( em muon làm thên phần:”Tình hình phát sinh phế phụ phẩn trong

nông nghiêp” nhưng e ko tìm được tài liệu, số liệu cụ thê cô a.vậy có

cần lam fan nay ko ha cô?)

Phế phụ phẩm nông nghiệp có khối lượng tương đối lớn, tuy nhiên thường

không được trả lại cho đất. Vì vậy, canh tác lâu năm đất mất dinh dưỡng và có

nguy cơ thoái hóa cao. Các biện pháp xử lí hiên nay chủ yếu là:

2.4.1. Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Trước đây chăn nuôi ở quy mô hộ gia đình rất phổ biến thì phế thải trong

trồng trọt phần lớn được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm. Đây là

biện pháp tận dụng triệt để sản phẩm phụ trong trồng trọt để tạo ra năng suất thứ

cấp, góp phần thu nhập cho nông dân. Tuy nhiên, việc tận dụng triệt để này là

một trong những nguyên nhân gây thiếu dinh dưỡng cho đất trồng.

Hiện nay chăn nuôi nhỏ có xu hướng giảm nhanh nên tàn dư được bỏ lại

trên đồng ruộng khá nhiều. Việc xử lý loại tàn dư này lại được tiến hành theo

các cách khác nhau.

2.4.2. Biện pháp đốt

Đây là biện pháp khá phổ biến ở nước ta. Tàn dư thực vật được thu gom, phơi

khô và đốt ngay trên đồng ruộng hoặc làm nguyên liệu để đun nấu. Ngày nay,

khi nền kinh tế phát triển thì nguyên liệu đun nấu cũng được cải thiện, đồng thời

chăn nuôi giảm nên tàn dư bị đốt trên đồng ruộng, trên các đường giao thông

ngày càng tăng. Đây là biện pháp gây ra nhiều vấn đề về môi trường như khói,

bụi. Đặc biệt nó thường tập trung vào mùa thu hoạch nên việc đốt tàn dư thực

vật đại trà trên diện rộng còn gây ra khó khăn cho đi lại ở nông thôn. Mặt khác

18

khi đốt tàn dư trên đồng ruộng tạo ra sự phá hủy khu hệ vi sinh vật đất khi nhiệt

độ mặt đất tăng cao. Sản phẩm sau khi đốt là tro được trả lại cho đất nhưng quá

trình đốt đã làm mất lượng lớn chất hữu cơ. Vì thế biện pháp này ít có ý nghĩa

trong cải tạo đất.

2.4.3. Biện pháp vùi lấp

Biện pháp này được sử dụng đối với loại tàn dư là rau màu dễ bị phân hủy. Khi

thu hoạch rau màu, các loại gốc, rễ, thân, lá… không sử dụng được vào các mục

đích khác, người ta để lại trên đồng ruộng và cày bừa để vùi lấp. Cùng với cỏ,

loại phế phẩm này sau một thời gian bị vùi lấp sẽ tự phân hủy và trở thành phân

bón cho các loại cây trồng vụ sau.

Tuy nhiên, biện pháp này có nhược điểm là không tiêu diệt được các loại sâu

bệnh hại cây trồng. Nếu cây trồng vụ sau có nhiều đặc tính sinh học giống cây

trồng vụ trước (có chung loại sâu bệnh hại) thì biện pháp này đã tạo ra ổ dịch

bệnh hại cây trồng vụ sau phát triển.

Ở các khu vực đồng ruộng trũng, gốc rạ cũng được xử lý theo phương pháp này

vào vụ mùa. Tuy nhiên, nếu do thời tiết ít mưa gốc rạ không bị hoai mục đáng

kể sẽ gây khó khăn cho việc cấy lúa vào vụ tiếp theo. Mặt khác cây lúa rễ bị trôi

nổi và chết khi gốc rạ bị phân hủy và nổi lên trên bề mặt ruộng.

2.4.4. Biện pháp ủ làm phân bón

Phế phẩm đồng ruộng và cỏ dại được thu gom tạo thành đống ủ ở góc ruộng, sau

đó được trát một lớp bùn khá dày hoặc phủ một lớp linon phía ngoài. Sau một

thời gian đống ủ được phân hủy nhờ vi sinh vật tự nhiên mà chủ yếu là vi sinh

vật kị khí. Khi bị hoai mục được sử dụng làm phân bón lót cho cây trồng.

Đây là biện pháp có hiệu quả tốt trong việc cải tạo đất. Đặc biệt khi việc ủ phế

thải được bổ sung hoặc ủ chung với phân chuồng, vôi bột…sẽ làm tăng độ xốp

và hàm lượng chất dinh dưỡng cho đất và cây trồng. Biện pháp này là cơ sở cho

các biện pháp sinh học xử lý chất thải hữu cơ nhờ sự hoạt động của khu hệ vi

sinh vật trong các đống ủ.

19

Tuy nhiên, phương pháp này rất lâu vì có thể khu hệ vi sinh vật có sẵn

trong đống ủ cần một thời gian nhất định để nhân nhanh sinh khối. Do đó, nếu

chúng ta phân lập các chủng vi sinh vật có trong đống ủ, sau đó tuyển chọn đánh

giá đặc tính sinh học và nhân sinh khối rồi bổ sung vào đống ủ, sẽ làm giảm thời

gian ủ và làm tăng hàm lượng dinh dưỡng của đống ủ.

2.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ VIỆC SỬ DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ

CHẤT THẢI HỮU CƠ

2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới

2.5.1.1. Lịch sử quá trình ủ chất hữu cơ

Từ lâu con người đã nhận thức được lợi ích của vi sinh và đã sử dụng

chúng để ủ lá cây, phân gia súc mang lại lợi lợi ích kinh tế thiết thực. Nhưng

việc sản xuất và sử dụng phân ủ chỉ theo những kinh nghiệm dân gian chưa có

những nghiên cứu về các quá trình diễn ra trong đống ủ. Vào những năm đầu

của thế kỷ 20, nhiều nhà sinh học đã bắt đầu nghiên cứu tìm ra những yếu tố tác

động vào quá trình ủ, rút ngắn thời gian và nâng cao chất lượng đống ủ.

Hutchingson và Richards (1921) là những người đầu tiên nghiên cứu quá

trình ủ phân. Sau đó Horward đã đưa ra “phương pháp hữu cơ”, tức là trộn xác

hữu cơ với phân gia súc với tỷ lệ 3:1 và đảo trộn thường xuyên. Ông đã phát

triển phương pháp ủ trên những nguyên liệu khác nhau theo từng lớp và lần thứ

hai đảo lại, tạo điều kiện hiếu khí. Đây là phương pháp Indore, phương pháp

mang tên nơi mà Howard làm việc. [17]

Từ năm 1926- 1941, Waksman và các cộng sự nghiên cứu sự phân hủy

hiếu khí bã thực vật, động vật và đã kết luận nhiệt độ, các nhóm vi sinh vật có

ảnh hưởng đến sự phân hủy chất thải hữu cơ [18].

Ở Mỹ, vào những năm 1942, Rodale J.I đã kết hợp các nghiên cứu của

Howard với những nghiên cứu của mình và đã đưa ra phương pháp hữu cơ trong

trồng trọt, làm vườn và đã được hoan nghênh ủng hộ [19].

20

Golaas và các cộng tác viên (1950 – 1952) đã nghiên cứu nguyên tắc cơ

bản của phân ủ hỗn hợp rác thải và bùn cống, kết quả cho thấy các tác nhân môi

trường như nhiệt độ, độ thoáng khí, kích thước cơ chất, tần số đảo trộn, đặc biệt

tỷ lệ C/N của nguyên liệu thô liên quan đến hiệu quả của việc ủ phân hữu cơ.

Đến năm 1980, Haug đã đưa ra kết luận về việc làm phân ủ như sau: ủ

chất thải là quá trình phân giải sinh học các chất hữu cơ dẫn tới sự ổn định khối

ủ trong tồn trữ và sử dụng như một dạng phân hữu cơ[20]

2.5.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình ủ chất hữu cơ và các

phương pháp làm phân ủ

Quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ xảy ra do những nhóm

vi sinh vật dị dưỡng như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh,

trong đó vai trò của hệ vi sinh vật phân giải xenlulo, lignin là quan trọng nhất.

Việc phân hủy chất hữu cơ nhờ sự hoạt động của cả hai hệ VSV hiếu và kị khí.

Theo R.S. Mathur, có hai phương pháp hay được sử dụng để sản xuất

phân ủ là: phương pháp Indore (ủ hiếu khí) và phương pháp Bangalore (nửa hiếu

khí).

+ Phương pháp Indore (Indore method)

Người đầu tiên đưa ra nguyên lý phân giải chất hữu cơ bằng vi sinh vật

trong điều kiện hiếu khí thành công là Albert Howard ở Ấn Độ. Phương pháp

này dựa trên nguyên tắc là đảm bảo oxy cung cấp cho hoạt động của vi sinh vật

trong đống ủ, bằng cách hàng tuần phải đảo trộn hoặc dùng hệ thống thổi khí,

đồng thời làm giảm nhiệt độ của đống ủ. Một yêu cầu nữa là độ ẩm phải thích

hợp, kích thước đống ủ không quá lớn.

Nguyên liệu để ủ là hỗn hợp phế thải nông nghiệp, phân chuồng, lá cây… Mỗi

đống sâu 1m, rộng 1,5 - 2 m, đống ủ gồm nhiều lớp nguyên liệu, mỗi lớp nguyên

liệu dày 10 - 15 cm, thêm vào 4,5 kg phân, 3,5 kg nước tiểu và 4,5 kg phân ủ

được 15 ngày. Đống ủ được tưới đủ ẩm và được đảo trộn 3 lần trong suốt thời

21

gian ủ. Lần thứ nhất là sau 15 ngày ủ, lần thứ hai cách lần thứ nhất 15 ngày, lần

thứ ba cách lần thứ hai một tháng.

Trên nguyên lý của phương pháp Indore, phương pháp ủ đống ra đời (Heap

method). Mỗi đống ủ theo phương pháp này có kích thước 7 fít chiều rộng, 5 fít

chiều cao, 7 fít chiều dài hoặc rộng hơn. Trong đống ủ, mỗi lớp phế thải có

nguồn gốc cacbon (lá, cỏ, rơm rạ, càch cây, lá cây ngô, cây bông…) dày 8 inch,

4 inch nguyên liệu giầu nitơ (phân chuồng, bùn, than bùn).

Phương pháp này có ưu điểm là hoạt động của vi sinh vật xảy ra nhanh, chất

mùn tổng hợp nhiều, thời gian hoàn thành đống ủ ngắn (3- 4 tháng). Tuy nhiên

do trao đổi khí thường xuyên nên một lượng lớn nitơ cùng với nước bị thất thoát

ra ngoài (nitơ bị mất 31,4 %) [21].

+ Phương pháp Bangalore (Bangalore method)

Phương pháp này chia thành hai giai đoạn:

- Giai đoạn ủ hiếu khí: 8 – 10 ngày để nhiệt độ tăng cao nhằm tiêu diệt các vi

sinh vật gây bệnh và cỏ dại.

- Giai đoạn ủ kị khí: sau thời gian ủ hiếu khí, dùng bùn đắp chặn bên ngoài đống

ủ để không khí không lọt vào được. Trong giai đoạn này, hoạt động của vi sinh

vật diễn ra trong điều kiện kị khí.

Phương pháp này đòi hỏi khoảng thời gian dài để hoàn thành đống ủ, thường từ

6-8 tháng. Ưu điểm của phương pháp này là giữ được độ ẩm và không hao tổn

nitơ.

So với phương pháp Indore, phương pháp này kém hiệu quả kinh tế hơn,

do thời gian ủ lâu hơn và mức độ phân huỷ chậm hơn [22].

Trên nền tảng của hai phương pháp trên Gaur A.C đã đưa ra phương pháp ủ

phân nhanh (Rapid composting).

+ Phương pháp ủ phân nhanh

Trung bình 6- 8 tháng quá trình ủ phân kết thúc, ta biết thời gian ủ ảnh

hưởng đến hiệu quả quay vòng của các chất thải hữu cơ. Quá trình ủ làm giảm

22

lượng cacbon hữu cơ thông qua hình thành CO2 và sinh khối vi sinh vật, dẫn đến

tỷ lệ C/N giảm tỷ lệ C/N xuống 15/1 hoặc 10/1.

Trong phương pháp ủ nhanh, các nguyên liệu nghèo nitơ như rơm rạ, lá khô,

mùn cưa, lõi ngô, cỏ khô được trộn thêm với các nguyên liệu giàu nitơ như phân

chuồng, bèo hoa dâu, cây điền thanh …Tuy nhiên, chất lượng phân được cải

thiện vì hàm lượng nitơ, hàm lượng phốt pho và chất mùn, trung bình đống ủ

chứa 0,5- 1,0% N, 0,6% P2O5; 0,5% K2O. Trong các nghiên cứu Gaur và các

cộng sự cho thấy các vi sinh vật phân giải xenluloza đã làm tăng hàm lượng phốt

pho trong phân hữu cơ cùng với việc giảm giá thành công nghệ [10].

Như vậy trong phương pháp này vi sinh vật đã được quan tâm nghiên cứu so với

hai phương pháp trên. Ta cũng khẳng định rằng sự có mặt của vi sinh vật phân

giải xenlulo là một trong các yếu tố quan trọng để rút ngắn thời gian phân hủy

các hợp chất hữu cơ.

2.5.2.3.Các nghiên cứu và áp dụng vi sinh vật vào xử lí chất thải hữu cơ

Năm 1946, Hugater đã phân lập được loài xạ khuẩn có tên là Micromonospora

có khả năng thủy phân xenlulo cao [14 cua chi thanh].

Veigia và các cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh

Lacoruva (Tây Ba Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenlulo và

sinh trưởng tốt trong môi trường có chứa 3,5% NaCl [14 cua chi thanh].

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật

kỵ khí có khả năng phân giải xenlulo. Những năm đầu của thế kỷ XX người ta

phân lập được các loài vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này. Trong các vi

khuẩn hiếu khí phân giải xenlulo thì niêm vi khuẩn là quan trọng nhất.

Jeris và cộng sự thấy trong đống ủ có các loài vi khuẩn phân giải xenlulo sau:

Acteromobater, Clostridium, Cellulomonas, Cytophara, Cellvibrio, Bacillus,

Pseudomonas, Sorangium, Sporocytophara,…Và các loài nấm phân giải xenlulo

như: Alternaria, Aspergillus, Chactomium, Fomes, Fusarium, Myrothecium,

Nennicillium, Polyponus, Rhizoctonia, Rhozopus,…[23].

23

Năm 1979 Gaur đã sử dụng các chủng nấm ưa ấm vào các đống ủ (rơm, lá khô),

hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong tháng đầu tiên của quá trình

ủ. Aspergillus sp làm tỷ lệ C/N giảm 45% xuống 20,6%, Penicillium sp làm

giảm xuống còn 19,6% [24].

Ở Cu Ba người ta nghiên cứu thành công trong phạm vi thí nghiệm sử

dụng một số loài vi khuẩn có khả năng phân giải xenlulo thuộc giống

Cellulomonas để chế biến thành chế phẩm có sinh khối vi khuẩn giàu protein và

giàu vitamin (H.G.Osmanetal năm 1972, 1974) [25].

Ở Nhật, người ta dùng vi sinh vật phân giải chất thải chăn nuôi, thu về

sinh khối có hàm lượng protêin cao và khí mêtan (CH4) [26].

Ở Pháp, người ta sản xuất nước uống sạch từ nước bị ô nhiễm, trong đó sử

dụng khu hệ vi sinh vật trong nước thải để xử lý các chất hữu cơ [27].

2.5.2.4. Các nghiên cứu ở trong nước

Khí hậu nhiệt đới ẩm là điều kiện tự nhiên thuận lợi cho khu hệ vi sinh vật

phát triển, do vậy mà ở nước ta chúng rất phong phú và đa dạng. Việc nghiên

cứu các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao áp dụng cho phân giải các hợp chất

hữu cơ là rất cần thiết.

Những nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật ở Việt Nam đã được bắt đầu

từ những năm 60 của thế kỉ XX, nhưng mãi đến những năm 80 mới được đưa

vào chương trình cấp nhà nước với tiêu đề “Công nghệ sinh học phục vụ nông

nghiệp” giai đoạn 1985 – 1990.Cho đến nay đã có những nghiên cứu và ứng

dụng thành công trong việc xử lý rác thải, phế thải hữu cơ. Trong đó, các đề tài

cấp Nhà nước KHCN- 02-04, cấp Bộ B99 - 32- 46, B2001- 32- 09 và các nghiên

cứu khác về xử lý phế thải hữu cơ như: lá, bã mía, vỏ thải cà phê, rác thải nông

nghiệp thành phân bón hữu cơ sinh học.

Phạm Văn Ty và các cộng sự đã phân lập được hàng trăm chủng vi sinh

vật có khả năng phân giải xenlulo, lignin, hemixenlulo. Tác giả đã xây dựng

24

được quy trình sản xuất chế phẩm phân giải chất hữu cơ đạt huy chương vàng

hội chợ triển lãm kinh tế kỹ thuật toàn quốc năm 1987. Kết quả thử nghiệm xử lí

bằng chế phẩm đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45 – 60 ngày thay vì 6 tháng

đến 1 năm, thậm chí 2 năm với điều kiện tự nhiên. [28]

Năm 1994, Nguyễn Đình Quyến và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn

được 2 chủng Tricoderma có khả năng phân giải xenlulo từ các mẫu gỗ bị mốc

xanh và Bacillus.sp sinh bào tử, đem nuôi cấy 2 chủng trên cùng một môi trường

có chứa xenlulo cho thấy số khuẩn lạc của Bacillus.sp cao hơn rõ rệt so với nuôi

cấy đơn chủng và số lượng enzim phân hủy ngoại bào (amylaza, xenlulaza,

poligalacturonaza) cao hơn so với nuôi cấy riêng rẽ. [29]

Đề tài cấp nhà nước KHCN 02 – 06A, giai đoạn 1996 – 1998 “Nghiên

cứu và áp dụng công nghệ sinh học trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh từ

nguồn phế thải hữu cơ rắn”, đã phân lập từ mẫu đất và mẫu rác ở một số tỉnh

phía Bắc tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn X50 thuộc loài Streptomyces

gougero và chủng X20 Streptomyces macrosporrus, 2 chủng vi khuẩn là V40

thuộc loài Cellulomna.sp và V31 thuộc loài Corynebacoerium.sp và 2 chủng

nấm N11 thuộc loài A.japonicus và N3 thuộc loài A.unilateralis. Các chủng

giống này có khả năng phân hủy chuyển hóa các hợp chất hữu cơ khó phân giải

như xenlulo, hemixenlulo, có khả năng sinh tổng hợp các enzim ngoại bào như

amylaza, proteiaza, pectilaza,…Khi nghiên cứu các tác động của vi sinh vật vào

quá trình phân hủy rác, các tác giả nhận thấy khi chúng tác động đồng thời theo

tỷ lệ phối trộn giữa XK, VK, nấm là 1:1:1 sẽ cho hiệu quả cao hơn khi chúng có

tác động riêng rẽ. [30]

Đề tài cấp nhà nước KC 02 – 04 Lê Văn Nhương và cộng sự đã phân lập

và tuyển chọn được 2 chủng XK là S59 và S116 có hoạt tính phân giải tinh bột,

xenlulo và CMC cao. Khi thử nghiệm mức độ chuyển hóa của các xạ khuẩn trên

môi trường có bổ sung 5g rơm rạ hoặc vỏ lạc đã xử lí kiềm và nhận thấy chúng

làm giảm cơ chất rơm 37,78%, thể tích giảm 47,05% và trọng lượng vỏ lạc giảm

25

25,15%, thể tích giảm 32,6% so với đối chứng. Khi nuôi trên môi trường rơm,

vỏ lạc thông qua xử lí kiềm thì hàm lượng xenlulo giảm 43,03% (rơm) và giảm

39,73% (vỏ lạc) đối với chủng S59. Đối với chủng S116 thì giảm 40,7% (rơm),

giảm 37,34% (vỏ lạc) so với đối chứng. [31

Năm 1999, đề tài cấp Bộ B99 – 32 – 46 của tác giả Nguyễn Xuân Thành

và các cộng sự đã nghiên cứu thành công đề tài: “Xử lí rác thải sinh hoạt và phế

thải bùn mía bằng vi sinh vật và tái chế phế thải thành phân hữu cơ bón cho cây

trồng”. Kết quả cho thấy khi xử lí chế phẩm vi sinh vật vào đống ủ phế thải có

tác dụng làm tăng vi khuẩn tổng số hảo khí, vi khuẩn phân giải xenlulo, nấm

tổng số so với đối chứng. Hàm lượng chất dinh dưỡng dễ tiêu và độ xốp tăng so

với đống ủ không được xử lí. Phân hữu cơ được tái chế từ phế thải đạt TCVN

123B – 1996, chất lượng phân sau 4 tháng vẫn đạt TCVN. Khi thử nghiệm trên

cây đậu tương cho kết quả: Phân hữu cơ vi sinh tái chế từ phế thải, rác thải hữu

cơ có tác dụng làm tăng chiều cao cây, trọng lượng, tăng cường độ N phân tử và

tăng năng suất hạt đậu tương từ 15 – 25% so với đối chứng. [32]

Cũng trong năm 1999, khi nghiên cứu đề tài: “Sử dụng vi sinh vật có hoạt

tính phân giải xenlulo cao, để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt

và nông nghiệp”. Tác giả cho thấy khi xử lí bằng các vi sinh vật hoạt tính phân

giải xenlulo cao vào đống ủ rác thải có tác dụng rút ngắn thời gian ủ xuống còn

77,6% so với đối chứng. Hàm lượng mùn tạo thành của bể có bổ sung chế phẩm

vi sinh vật cao hơn 28,8%, các chất dinh dưỡng dễ tiêu cho cao hơn 10% so với

bể đối chứng. [33]

Năm 2000, tác giả Lê Văn Nhương và cộng sự đã nghiên cứu thành công đề tài:

“Công nghệ xử lí một số phế thải nông sản chủ yếu (lá mía, vỏ thải cà phê, rác

thải nông nghiệp) thành phân bón hữu cơ sinh học”. Kết quả nghiên cứu đã phân

lập và tuyển chọn được 7 chủng VK, 6 chủng XK và 11 chủng nấm sợi có hiệu

lực xenlulaza cao và xác định được rằng khi các loại vi sinh vật này phối trộn

với nhau theo tỉ lệ thích hợp sẽ cho hiệu suất phân giải cao nhất. Đồng thời khi

26

ứng dụng các loại chế phẩm này vào các đống ủ mía, vỏ cà phê, rác thải sinh

hoạt người ta thấy thời gian phân hủy được rút ngắn xuống, thành phẩm sau khi

ủ có hàm lượng chất dinh dưỡng dễ tiêu đối với cây trồng cao hơn so với đống ủ

đối chứng. [34]

Năm 2004, tác giả Nguyễn Xuân Thành và các cộng sự đã nghiên cứu thành

công đề tài khoa học cấp Bộ B2004 – 32 – 66 : “Xây dựng quy trình sản xuất

chế phẩm vi sinh vật xử lí tàn dư thực vật trên đồng ruộng thành phân hữu cơ tại

chỗ bón cho cây trồng”. Quy trình sản xuất chế phẩm được ứng dụng để sản

xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí tàn dư thực vật trên đồng ruộng đạt TCVN

(TCVN/TC 134B – 1996). Chế phẩm được thử nghiệm đem lại hiệu quả cao, rút

ngắn thời gian xử lí so với đối chứng xuống còn 45 – 60 ngày, có hàm lượng

mùn, hàm lượng dinh dưỡng tăng…có thể làm phân bón hữu cơ tại chỗ cho

nhiều loại cây trồng, giảm bớt chi phí đầu vào cho sản xuất nông nghiệp. [35]

27

PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Phế thải nông nghiệp: rơm rạ; hoa quả; hành tỏi.

- Các chủng nấm có khả năng phân  giải Xenluloza.

3.1.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

+ Hóa chất:

KH2PO4 CaCl2

MgSO4.7H2O NaCl

FeCl3 NaNO3

K2HPO4 Cao thịt

Rose Bengal Cồn

Thạch ` Nước cất

MnSO4 CaCO3

Pepton FeSO4.7H2O

KI I2

H2SO4 Tinh bột tan

KNO3 CMC (Cacbonxy methyl cenlulo)

+ Dụng cụ thí nghiệm:

▪ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, que gạt, que cấy, đèn cồn, kính

hiển vi, ống đong, bình nón, nhiệt kế, chậu vại…

▪ Nồi hấp vô trùng (Auto clave), tủ định ôn, tủ sấy, cân kỹ thuật, máy lắc,

tủ lạnh

+ Công thức môi trường

- Môi trường ISP – 4 (g/l):Tinh bột tan -10g, K2HPO4 -

1g,MgSO4.7H2O - 1g, (NH4)2SO4 -   2g , CaCO3  - 2g, NaCl – 1, thạch – 18, nước

-1 lit, dung dịch khoáng – 1ml

28

Dung dịch khoáng có thành phần( g/100ml nước): FeSO4.7H2O – 0,1.,MnCl2-

0,1, ZnCl2.4H2O - 0,1 ,ZnSO4 – 0,1.

- Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan -20g, K2HPO4 – 0,5,

MgSO4.7H2O – 0,5, NaCl –0,5, (NH4)2SO4 - 2, KNO3 – 0,5, FeSO4 – 0.01.

- Môi trường Gause II (g/l): Nước chiết thịt – 30ml, pepton -5, ,

NaCl – 5, Glucoza – 10, thạch – 18, nước -1 lit

- Môi trường A-4H (g/l) : glucoza- 15, bột đậu tương – 15, NaCl –

5, , CaCO3  - 1g, , thạch – 20, nước -1 lit

- Môi trường A- 4(g/l) : glucoza- 10, , bột đậu tương – 10, NaCl –

5, , CaCO3  - 1g, , thạch – 20, nước -1 lit

- Môi trường A – 12(g/l): Tinh bột tan -10g, rỉ đường – 10, bột đậu

tương – 10, KH2PO4 – 2, CaCO3  - 2g, NaCl – 5, nước -1lit,

- Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải xenluloza(g/l): (NH4)2SO4-

1.4; KH2PO4- 0.5; K2HPO4- 0.5; MgSO4- 0.4;NaCl- 0.5; MnSO4- vết; FeSO4-

vết; thạch- 20; giấy- 2; nước- 1lit.

- Môi trường dung dịch lugol (g/l): I2- 1; KI- 2; Nước cất- 300ml

- Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải amylaza(g/l ): tinh bột

tan – 1, thạch – 15

- Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải proteaza(g/l):Gelatin - ,

thạch - 12 3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng thí nghiêm vi sinh vật- khoa Tài nguyên và Môi trường- Trường Đại học

Nông Nghiệp Hà Nội.

3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

       - Xác định số lượng xạ khuẩn tổng số (XKTS), nấm tổng số NTS, vi

khuẩn tổng số VKTS , xác định tỉ lệ xạ khuẩn có trong từng mẫu.

       - Xác định tỉ lệ xạ khuẩn có trong từng mẫu.

29

       - Phân nhóm xạ khuẩn theo quan sát màu sắc xạ khuẩn

       Từ  kết quả của bước trên ta tiến hành phân loại xạ  khuẩn theo màu sắc

của các khuẩn lạc xạ khuẩn.

3.3.2.Đánh giá khả năng phân giải của các chủng xạ khuẩn đã phân lập

được

      Khả  năng phân giả xenluloza, tinh bột, protein của các chủng được đánh

giá bằng kích  thước vòng phân giải (không màu) trên môi trường chuyên tính

có đục lỗ.

3.3.3. Đánh giá các hoạt tính khác.

      - Lựa chọn môi trường nuôi cấy, lên men

      - Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sinh trưởng,phát triển và sinh enzym

của xạ khuẩn

      - Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng,phát triển và sinh enzym của

xạ khuẩn

     - Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng,phát triển và sinh enzym của

xạ khuẩn

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng,phát triển và sinh enzym của xạ

khuẩn

- Đánh giá khả năng ức chế một số VSV gây bệnh khác

3.3.4. Thử nghiệm khả năng xử lí phế phụ phẩm đồng ruộng quy mô chậu vại.

- Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nhau.

- Thử nghiệm khả năng xử lí phế phụ phẩm đồng ruộng quy mô chậu vại.

3.3.5. Thử  nghiệm hiệu quả của chế  phẩm ở quy mô đồng ruộng

- Sản xuất chế phẩm theo qui trình của trường Đại học nông nghiệp

Hà Nội

Thử nghiệm trên đống ủ và theo dõi các chỉ tiêu : Nhiệt độ, pH, N%, OC%,

P2O5% , K2O

30

3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1. Phương pháp lấy mẫu.

      Phế  thải đồng ruộng được chọn: rơm rạ,hành tỏi,rau quả. Trước lúc lấy mẫu

dụng cụ cần được thanh trùng bằng cồn.

3.4.2. Phân lập, tuyển chọn và xác định tổng số  vi sinh vật( Nấm tổng số,xạ 

khuẩn tổng số,vi khuẩn tống số) từ các mẫu nghiên cứu

      - Xạ khuẩn tổng số:Tiến hành phân lập trong mẫu  đưa về trên môi trường

Gause ở các nồng độ 10-5,10-6,10-7.. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.Đem nuôi ở nhiệt

độ 28oC. Sau một thời gian nhất định, khi các chủng vi sinh vật mọc rõ đem cấy

truyền và làm thuần khiết theo phương pháp ria 3 pha. Sau khi được làm thuần

khiết được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống.

Số  xạ khuẩn có trong 1 gam mẫu được tính theo công thức:

                                   S = 10.N.T

      Trong đó :  S : là số xạ khuẩn có trong 1 g mẫu

                     T là hệ số pha loãng bằng nghịch đảo của nồng độ pha loãng.

                    N : là số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa Petri

      Làm tương tự với nấm dùng môi trường Martin.Vi khuẩn dùng môi trường

vi khuẩn.

3.4.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn bằng quan sát hình thái xạ khuẩn

      Xác định hình thái và kích thước khuẩn lạc theo phương pháp quan sát và đo

trực tiếp.Xạ khuẩn được nuôi trên môi truong ISP4 có cắm lam kính nghiêng

trên bề mặt môi trường.Sau khi XK được lấy ra và  quan sát dưới kinh hiển vi để

xác định dạnh và  cuống sinh bào tử:S –thẳng,RE-lượn song,RA-hình móc câu

hay xoắn và xoắn hoàn toàn.

3.4.4. Đánh giá đặc tính sinh học của các chủng xạ khuẩn.

3.4.4.1. Xác  định khả năng phân giải xenluloza

Xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng giống nấm theo phương

pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch (Wiliam, 1983).

31

Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo(g/l): (NH4)2SO4-

1.4; KH2PO4- 0.5; K2HPO4- 0.5; MgSO4- 0.4;NaCl- 0.5; MnSO4- vết; FeSO4-

vết; thạch- 20; giấy- 2; nước- 1lit.

Môi trường dung dịch lugol (g/l): I2- 1; KI- 2; Nước cất- 300ml

+ Cách tiến hành: Bột giấy đem đun nhừ, đong xem được bao nhiêu ml, cho các

chất còn lại vào, bổ sung thêm nước để được 1lit, đun sôi, đem hấp khử trùng.

Môi trường sau khử trùng được đổ ra ra đĩa petri. Mỗi đĩa thạch dày khoảng

0.2cm. Đợi nguội rồi dùng khoan lỗ thạch đường kính 1cm. Đem nhỏ dịch nuôi

cấy (khoảng 0.1mm) vào các lỗ khoan, rồi đặt vào tủ lạnh trong 6- 12h; rồi đặt

vào tủ định ôn ở 370C trong 24h.

Nhuộm màu các đĩa thạch trên bằng dung dịch lugol:

Vòng phân giải xenlulo có màu vàng chanh và được tính theo công thức:

D = (R – r) x 2

Trong đó: D: Kích thước vòng phân giải (mm).

R: Bán kính vòng phân giải.

r: Bán kính vòng tròn que cấy.

3.4.4.2. Xác  định khả năng phân giải tinh bột.

Xác định hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng xạ khuẩn theo phương pháp

khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch (Wiliam, 1983).

Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải tinh bột(g/l):tinh bột tan- 1; thạch-

12; nước- 1lit.

+ Cách tiến hành: Môi trường sau khử trùng được đổ ra ra đĩa petri. Mỗi đĩa

thạch dày khoảng 0.2cm. Đợi nguội rồi dùng khoan lỗ thạch đường kính 1cm.

Đem nhỏ dịch nuôi cấy (khoảng 0.1mm) vào các lỗ khoan, rồi đặt vào tủ lạnh

trong 6- 12h; rồi đặt vào tủ định ôn ở 370C trong 24h.

Nhuộm màu các đĩa thạch trên bằng dung dịch lugol:

Vòng phân giải xenlulo có màu vàng chanh và được tính theo công thức:

D = (R – r) x 2

32

Trong đó: D: Kích thước vòng phân giải (mm).

R: Bán kính vòng phân giải.

r: Bán kính vòng tròn que cấy.

3.4.4.2. Xác  định khả năng phân giải protein.

Xác định hoạt tính phân giải protein của các chủng xạ khuẩn theo phương pháp

khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch (Wiliam, 1983).

Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải protein (g/l):gelatin- 3; thạch- 15;

nước- 1lit.

+ Cách tiến hành: Môi trường sau khử trùng được đổ ra ra đĩa petri. Mỗi đĩa

thạch dày khoảng 0.2cm. Đợi nguội rồi dùng khoan lỗ thạch đường kính 1cm.

Đem nhỏ dịch nuôi cấy (khoảng 0.1mm) vào các lỗ khoan, rồi đặt vào tủ lạnh

trong 6- 12h; rồi đặt vào tủ định ôn ở 370C trong 24h.

Nhuộm màu các đĩa thạch trên bằng dung dịch lugol:

Vòng phân giải xenlulo có màu vàng chanh và được tính theo công thức:

D = (R – r) x 2

Trong đó: D: Kích thước vòng phân giải (mm).

R: Bán kính vòng phân giải.

r: Bán kính vòng tròn que cấy.

3.4.5. Phương pháp xác định sinh khối

Cân giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi (ở

105C/2giờ). Lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc, đem sấy khô giấy lọc đến trọng

lượng không đổi. Cân lại giấy lọc. Trọng lượng khô của tế bào được xác định

bằng công thức:

P (g) = P2 – P1

Trong đó: P: Trọng lượng khô của sinh khối.

P1: Trọng lượng khô của giấy lọc.

P2: Tổng trọng lượng khô của giấy lọc và sinh khối.

33

3.4.6. Lựa chọn môi trường nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28- 300C trên

các môi trường cơ bản là: A-4, A-4H, A-12, Gause 1, Gause 2, ISP-4 . Sau 5

ngày nuôi đem xác định:

- pH sau nuôi cấy

- Sinh khối bằng cân trọng lượng khô

- Hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

Từ đó so sánh kết quả thu được để lựa chọn ra môi trường nuôi cấy thích hợp

nhất.

3.4.7. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sinh trưởng, phát triển và sinh

enzym của  các chủng nấm.

Bổ sung nguồn cacbon(%) :Đối chứng(không có nguồn C), tinh bột tan 1 và 2;

Xenlulo- 0,2, Glucoza- 1, Saccaroza- 1; rỉ đường- 1;lactoza- 1 trong công thức

môi trường cơ bản để nuôi cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được.

- Mỗi môi trường làm 100ml chia đều vào các bình  tam giác mỗi bình 50ml.

Sau khi khử trùng ướt ở 1at trong vòng 30 phút. Ta tiến hành cấy các chủng xạ

khuẩn đã tuyển chọn vào các bình với số lượng sinh khối bằng nhau rồi đem

nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28- 300C cho chúng phát triển. Sau 5

ngày nuôi đem xác định:

- pH sau nuôi cấy

- Sinh khối bằng cân trọng lượng khô

- Hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

3.4.7. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng, phát triển và sinh enzym

của nấm.

Bổ sung nguồn nitơ(%) : Đối chứng ( không nitơ), Cao nấm men- 1; bột đậu

tương 1 và 2; peptone- 1, NH4Cl- 0.1; (NH4)2SO4- 0.2; KNO3- 0.1 trong công

thức môi trường cơ bản để nuôi cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn được.

34

Mỗi môi trường làm 100ml chia đều vào các bình  tam giác mỗi bình 50ml. Sau

khi khử trùng ướt ở 1at trong vòng 30 phút. Ta tiến hành cấy các chủng xạ

khuẩn đã tuyển chọn vào các bình với số lượng sinh khối bằng nhau rồi đem

nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28- 300C cho chúng phát triển. Sau 5

ngày nuôi đem xác định:

- pH sau nuôi cấy

- Sinh khối bằng cân trọng lượng khô

- Hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

3.4.8. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng, phát triển và sinh enzym của các

chủng xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28- 300C trên

môi trường cơ bản là ISP-4 : đã chỉnh pH theo các pH 5, 6, 7, 8, 9 bằng dung

dịch đệm Sorensen 1. Sau 5 ngày nuôi đem xác định:

- pH sau nuôi cấy

- Sinh khối bằng cân trọng lượng khô

- Hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

Từ đó so sánh kết quả thu được để lựa chọn ra pH nuôi cấy thích hợp nhất.

- Cách tiến hành:

Pha dung dịch đệm Sorensen 1:

+ Cân chính xác 9,078 g KH2PO4 1/15 M.

+ Cân chính xác 11,876 g Na2HPO4. 2H2O hòa vào 1 lít nước cất được dung

dịch Na2HPO4 1/25 M.

Sau đó pha 2 dung dịch này theo tỷ lệ như sau: (đối với 1000ml môi trường).

35

pHTỷ lệ trong dung dịch (ml)

Na2HPO4 KH2PO4

5,0 5 95

6,0 30 70

7,0 80 20

8,0 99 1

9,0 100 0

3.4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng, phát triển và sinh enzym

của các chủng nấm.  

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút trên môi trường cơ bản

là: ISP-4 ở các ngưỡng nhiệt độ 200C, 300C, 400C, 500C, 600C. Sau 5 ngày nuôi

đem xác định:

- pH sau nuôi cấy

- Sinh khối bằng cân trọng lượng khô

- Hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.

Từ đó so sánh kết quả thu được để lựa chọn ra nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất.

3.4.10. Khả năng ức chế một số VSV gây bệnh

- Các VSV gây bệnh như : E.coli, vi khuẩn héo thối

- Tiến hành :

+ Chuẩn bị đĩa Petri có môi trường,

+ Pha loãng các vi sinh vật vào nước vô trùng rồi nhỏ 0,1ml dịch này vào đĩa

Petri. Dùng que trang trang đều dịch này len toàn bộ bề mặt

+ Dùng dụng cụ khoan 1 lỗ ở giữa bề mặt môi trường trong đĩa petri

+Nhỏ khoảng 0,1ml dịch thể các xạ khuẩn vào lỗ

36

+Theo dõi khả năng mọc của các VSV gây bệnh, nếu xung quanh phần khoan lỗ

các VSV gây bệnh không phát triển, hoặc phát triển yếu chứng tỏ các xạ khuẩn

lựa chọn có khả năng ức chế VSV gây bệnh và ngược lại nếu các VSV phát triển

bình thường thì các xạ khuẩn đã lực chọn không có khả năng ức chế các VSV

gây bệnh

3.4.11. Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn

Tiến hành nuôi cấy riêng lẻ và nuôi cấy chung các xạ khuẩn tuyển chọn được

( môi trường dịch thể, chât mang) rồi so sánh số lượng từng loại XK khi nuôi

riêng lẻ và kết hợp với các mốc thời gian ( 0 ngày, 30 ngày, 60 ngày,…)

3.4.12. Thử nghiệm khả năng xử lí phế phụ phẩm đồng ruộng quy mô chậu vại.

Dùng 3 công thức :

Công thức đối chứng (CT1) : Không bổ sung chế phẩm

Công thức ( CT2): Bổ sung chế phẩm các chủng xạ khuẩn đã chọn được

Công thức ( CT3): Bổ sung chế phẩm các chủng xạ khuẩn đã chọn được với các

chủng vi khuẩn của bộ môn

Công thức (CT4): .Bổ sung chế phẩm các chủng xạ khuẩn đã chọn được vớicác

chủng nấm của bộ môn

Công thức ( CT5): Bổ sung chế phẩm của các chủng xạ khuẩn đã chọn được với

các VSV của bộ môn.

Theo dõi và phân tích các chỉ tiêu : OM, OC(%), pH , K2O(%), P2O5 (%), N%,

nhiệt độ

3.4.13. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử  lí phế thải đồng ruộng.

      Sử  dụng các vi sinh vật của bộ môn kết hợp với các chủng xạ khuẩn đã

tuyển chọn được theo phương pháp lên men dịch thể và lên men xốp tại phòng

thí nghiệm.

     - Lựa chọn môi trường lên men thích hợp.

- Sản xuất chế phẩm vi sinh vật

37

3.4.14. Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên quy mô đống ủ

- Bố trí 2 công thức : Công thức đối chứng : Không bổ sung chế phẩm

Công thức 1: Bổ sung chế phẩm xạ khuẩn

- Theo dõi và phân tích các chỉ tiêu : OM, OC(%), pH, K2O(%), P2O5 (%), N

%, nhiệt độ

3.4.15. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu OM, OC(%), pH , K2O(%), P2O5

(%), N%, nhiệt độ

Mỗi mẫu lấy 3 lần, sau đáo tiến hành phân tích các chỉ tiêu theo phương pháp

dưới đây và tính ra số liệu trung bình

- pH : đo bằng máy

- N% : phương pháp Kjeldhal, công phá bằng H2sSO4 và hỗn hợp xúc tác

- OC(%) : phương pháp Walkey – Black

- K2O(%) : Phương pháp quang kế ngọn lửa, công phá mẫu bằng hốn hợp

axit H2SO4, HClO4

- P2O5 (%) : Phương pháp so màu,công phá băng hỗn hợp H2SO4, HClO4

38

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Kết quả phân lập các chủng giống vi sinh vật

4.1. 1. Sự phân bố VSV trong các mẫu phế thải

Từ các mẫu phế phụ phẩm đồng ruộng chúng tôi tiến hành phân lập các chủng

VSV trên các môi trường khác nhau((môi trường cho VSV phân giải xenlulo,

môi trường nấm tổng số, môi trường vi khuẩn tổng số, môi trường xạ khuẩn

tổng số. Kết quả đã phân lập và thuần khiết được 52 chủng VSV gồm có: 27

chủng nấm (N), 12 chủng xạ khuẩn (XK), 13 chủng vi khuẩn (VK).

- 27 chủng nấm được đánh số ký hiệu từ N1 – N27.

- 12 chủng xạ khuẩn được đánh số ký hiệu từ XK1 – XK12.

- 13 chủng vi khuẩn được đánh số ký hiệu từ VK1 – VK13

Kết quả sự phân bố VSV trong các mẫu phế phụ phẩm thể hiện trong bảng dưới đây:

Mẫu Nơi lấy mẫu

XKTS

(106

CFU/g)

NTS

(10 106

CFU/g)

VKTSHK

(106

CFU/g)

VKTSYK

(106

CFU/g)

Số chủng

phân lập

Rơm

rạ 1

Trường đại học

NN Hà Nội

1.2 3.1 1.5 1.5 11(6N, 3XK,

2VK

Hoa

quả

Trường đại học

NN Hà Nội

2.2 4.0 2.9 1.1 14(8N, 2XK,

4VK)

Hàn

h tỏi

Nam Sách- Hải

Dương

1,5 2.3 1.3 1.2 13(7N,3XK,

3VK)

Rơm

rạ 2

Trường đại học

NN Hà Nội

2.1 3.1 2.0 1.0 14(6N, 4XK,

4VK)

Số lượng xạ khuẩn trong các mẫu là: Mẫu rơm rạ : 3/11 = 27,3%

Mẫu hoa quả: 14,2% Mẫu hành tỏi: 23% Mẫu rơm rạ : 28.6%

4.2. Tuyển chọn XK có hoạt tính xenluloza

39

Để phân giải được các hợp chất hữu cơ cao phân tử thành các chất đơn giản thì

VSV phải tiết ra các loại enzim đặc hiệu.Chủng nào tiết ra nhiều enzym thì

chủng đó có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ tốt và ngược lại chủng nào

tiết ít enzym thì sẽ phân giả các hợp chất hữu cơ kém. Vì vậy, đánh giá hoạt tính

enzim của các chủng vi sinh vật là công việc không thể thiếu. Qua đó, ta có thể

tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải chất hữu cơ tốt. Từ

12 chủng xạ khuẩn đã phân lập được chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng

phân giải xenlulo, CMC theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch

(William, 1983). Theo phương pháp này thì chủng nào có kích thước vòng phân giải lớn sẽ

có hoạt tính enzim mạnh và ngược lại chủng nào tạo vòng phân giải nhỏ thì hoạt tính enzim

yếu. Kết quả được thể hiện qua bảng :

ST

T

Chủng

VSV

Kích thước vòng

phân giải CMC

(mm)

Kích thước vòng

phân giải xenlulo

(mm)

Kích thước vòng

phân giải tinh

bột (mm)

1 XK1 6,7 16 20

2 XK2 7,2 16 . 0

3 XK3 7,9 18. 21,3

4 XK4 7,1 17. 0

5 XK5 6,7 19 0

6 XK6 8,8 26 0

7 XK7 9,1 17,6 40

8 XK8 6,6 16,6 11

9 XK9 8,6 13,6 0

10 XK10 11,3 23 24,3

11 XK11 9,5 10,5 40

12 XK12 7,8 15 28,3

Từ bảng ta thấy: một chủng VSV có hoạt tính phân giải CMC cao chưa chắc đã

có hoạt tính phân giải xenlulo cao. Điều này hoàn toàn đúng vì theo Klisov và

40

các cộng sự, CMC aza chỉ là một trong bốn loại enzym để phân hủy xenlulo. Do

đó chúng ta phải lựa chọn các chủng có khả năng phân giải xenlulo cao chứ

không phải có khả năng phân giải CMC cao. Hai chủng có hoạt tính phân giải

xenlulo và CMC mạnh nhất là XK10(23mm) và XK7(17.6mm). Ngoài ra hai

chủng này vừa có khả năng phân giải tinh bột cao. Hai chủng này được cấy

chuyền vào các ống nghiệm chứa môi trường Gause1, ISP4 nuôi ở tủ định ôn,

sau 6-7 ngày các chủng XK phát triển tốt được bảo quản trong tủ lạnh để giữ

giống để tiếp tục nghiên cứu.

4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng

4.3.1. Đặc điểm hình thái

Chủng XK-10: Streptomyces sp.

- Điều kiện nuôi cấy:

+ Môi trường: YS (Yeast extract-soluble starch)

+ pH 7

+ Nhiệt độ: 30oC

+ Điều kiện sống: Hiếu khí.

41

- Hình thái:

- Khuẩn lạc chủng XK-10 Cuống sinh bào tử chủng XK10

+ Khuẩn lạc: Sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường YS, khuẩn lạc tròn,

nhỏ, lồi. Khuẩn ty khí sinh có màu trắng. Khi ra bào tử khuẩn lạc có màu xám,

không tiết sắc tố vào môi trường.

+ Hình dạng cuống sinh bào tử: Cuống sinh bào tử có dạng lượn sóng (RF-

Rectiflexibiles).

Chủng XK-10 có thể được xếp vào chi Streptomyces khi so sánh với khoá phân

loại Streptomyces của Bergey [4] .

42

Chủng XK7:

4.3.2. Đặc điểm nuôi cấy

Môi

trường

Chủng Sinh

trưởng

Màu

KTKS

Màu KT

cơ chất

Màu sắc tố

hòa tan

Gause1 XK7

XK10

Gause2 XK7 +++ Không

XK10 ++ Tráng nâu Không

ISP4 XK7 +++ Trắng hơi

ngà vàng

Nâu

xám(xám

đậm)

Không

XK10 ++ Trắng Xám xi

măng

Không

IS XK7 ++

XK10 ++ Trắng xám Không

4.3.3. Giải trình tự ADNr16S :

4.4. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển, sinh enzym của

các chủng

4.4.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Môi trường đóng vai trò quan trọng hàng đầu đối với sự sinh trưởng và phát

triển, sinh enzyme của VSV nói chung và XK nói riêng. Một môi trường lên men tốt

phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh trưởng tốt vừa sinh lượng

enzyme lớn. Ở đây chúng tôi chọn 5 loại môi trương lên men cơ sở là: A-4, A-4H, A-

12, Gause 1, Gause 2, ISP4. Qúa trình lên men được tiến hành trong bình nón dung

tích 250ml chứa 50ml môi trường. Nuôi lắc 220 vòng ở nhiệt độ nhiệt độ phòng. Sau

120h lên men, xác định hoạt tính enzyme của các chủng. Kết quả thể hiện ở bảng sau:

- Chủng XK7: Trên 6 loại môi trường lên men, chủng XK7 có hoạt tính enzyme

ở 4 môi trường là ISP4, Gause1, Gause 2, A-4. Song chỉ trên môi trường ISP-4 chủng

này mới sinh trưởng tốt và cho hoạt tính enzym lớn nhất( Xenluloza là 30.6 mm,

43

Amylaza là 25mm, Proteaza là 29mm.Sinh khối đạt tới 7.593 g/l). Khi nuôi cấy

ở môi trường A-12 cho sinh khối rất lớn(13.314 g/l) nhưng lại không cho hoạt

tính xenluloza, amylaza, proteaza.Trên cơ sở này chúng tôi sử dụng môi trường

ISP4 cho những nghiên cứu tiếp theo.

- Chủng XK10: Từ kết quả bảng dưới ta thấy chủng XK10 đều cho hoạt tính

enzyme từ mức trung bình trở lên (D-d > 8mm). Ở 2 môi trường ISP4, Gause1 đều

thuận lợi cho sự sinh trưởng của XK10. Thể hiện ở chỗ: Sinh khối ở hai môi trường

này tương đối lớn: Gause1 là 8.954 g/l, ISP4 là 8.229 g/l. Ở môi trường Gause 1 cho

lượng sinh khối lớn hơn ở môi trường ISP4. Nhưng ở môi trường Gause1 hoạt tính

xenluloza, amylaza, proteaza lại kém hơn hẳn so với môi trường ISP4. Một môi trường

lên men tốt phải là môi trường thuận lợi cho cả sự sinh trưởng, phát triển và sinh

enzym. Vì vậy chúng tôi lựa chọn môi trường ISP4 làm môi trường lên men cho

những nghiên cứu tiếp theo.

Chủng Môi

trường

pH sau

nuôi

Sinh

khối (g/l)

Hoạt tính enzym (D-d,mm)

Xenlulaza Amylaza Proteaza

XX-7 ISP-4 5,85 7.593 20,6 15 19

A-4H 5,08 4.789 0 0 0

A-12 6,00 13.314 0 0 0

Gause 1 5,04 6.143 15,3 9,3 15,3

Gause 2 4,76 2.767 19,7 17,3 16.7

A-4 5,60 1.584 11 6 11,7

XX10 ISP-4 5.0 8.229 18 14.6 17.3

A-4H 8.65 5.011 8.6 2 4.3

A-12 5.98 1.085 9.3 7.3 10.3

Gause 1 7.95 8.954 17 10 15

Gause 2 8.09 0.516 11 4.6 9.3

A-4 7.26 5.972 13 6.6 10.3

44

4.4.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ

Trong quá trình ủ để xử lí phế phụ phẩm nông nghiệp, nhiệt độ, p H của đống ủ

thay đổi rõ rệt. Như vậy, một chủng được xem là có khả năng phân giải xenluloza cao

thì ngoài hoạt tính enzyme cao còn phải thích hợp với nhiều ngưỡng nhiệt độ, pH khác

nhau.Vì vậy việc đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đên sinh trưởng, phát triển, sinh

enzym của 2 chủng XK cũng rất quan trọng.

Hai chủng XK7, XK10 được lên men lắc 220 vòng/ phút trên môi trường ISP4

ở các mức nhiệt độ và pH ban đầu khác nhau.Sau 120 giờ lấy ra xác định sinh khối và

hoạt tính amylaza, xenluloza, proteaza. Kết quả trình bày ở bảng sau:

Một điều dễ dàng nhận thấy là: có sự thay đổi lớn pH của môi trường trước và

sau nuôi cấy. Có thể giải thích là tùy từng p H nhau đã tác động khác nhau đến sự sinh

trưởng, sinh enzym của các XK. Lượng enzym sinh ra khác nhau ở các mức pH khác

nhau sẽ làm cho môi trường thay đổi pH

Cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng sinh enzym trong dải pH từ 5 đến 9.

Tuy nhiên kết quả ở bảng cho thấy pH 7 là thích hợp nhất với sinh trưởng. Tại mức p

H này sinh khối thu được của hai chủng XK là rất lớn XK7 (6.090 g/l), XK10 là

(4.808 g/l). Còn khả năng sinh tổng họp enzym thì đối với XK7 thì p H 9 là

ngưỡng p H thích hợp nhất. Đường kính vòng phân giải xeluuloza, amylaza,

proteaza lần lượt là 23, 16, 19(mm). Còn với XK10 thì ngưỡng p H 6 là thích

họp cho sinh tổnh hợp enzym nhất. Đường kính vòng phân giải xeluuloza,

amylaza, proteaza lần lượt là 15, 10, 24.

45

Bảng : Ảnh hưởng của của pH ban đầu đến sinh trưởng và tổng họp enzym của

XK7, XK10

Các chỉ tiêu Chủngp H ban đầu (0C)

5 6 7 8 9

pH sau nuôi XX7 3.2 3.95 6.16 3.15 7.4

XX10 5.1 0.42 0.79 2.87 5.7

Sinh khối (g/l) XX7 3.08 2.582 6.090 3.148 2.266

XX10 2.754 4.552 4.808 2.848 2.97

Hoạt tính Xenlulaza

(D-d,mm)

XX7 14 15 13 13 23

XX10 12 15 15 0 14

Hoạt tínhAmylaza(D-

d,mm)

XX7 10 14 8 6 16

XX10 7 10 0 0 7

Hoạt tính Proteaza(D-

d,mm)

XX7 18 18 20 10 19

XX10 13 24 8 7 18

Sau đó các chủng này tiếp tục được nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

đến sinh trưởng và sinh tổng họp enzym. Bởi vì nhiệt độ lên men cũng là một trong

các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tổng hợp enzym. Chúng tôi tiến hành lên

men ở các ngưỡng nhiệt độ là 20, 30, 40, 50, 600C. Kết quả thể hiện bảng sau:

Kết quả cho thấy 2 chủng đều sinh trưởng và cho hoạt tính ở các ngưỡng nhiệt

độ trên. Bắt đầu từ nhiệt độ trên 500 c thì hoạt tính enzym của 2 chủng này yếu hẳn.

Như vậy các kết quả cho thấy nhiệt độ sinh trưởng tối thích của 2 chủng là 20 – 40 0 C

phù hợp với nhiệt độ tối thích của đa số xạ khuẩn.

46

Các chỉ tiêu ChủngNhiệt độ ban đầu (0C)

20 30 40 50 60

pH sau nuôi XX7 5.48 6.9 5.42 8.1 7.9

XX10 5.73 7.0 6.08 8.5 7.7

Sinh khối (g/l) XX7 1,804 1.828 1.92 3.756

XX10 1.944 2.936 1.244 1.954

Hoạt tính

Xenlulaza(D-

d,mm)

XX7 20 18 15 10 5

XX10 22 16 16 10 3

Hoạt

tínhAmylaza(D-

d,mm)

XX7 15 10 10 11 5

XX10 18 11 11 5 4

Hoạt tính

Proteaza(D-

d,mm)

XX7 16 15 12 10 7

XX10 20 15 15 8 5

4.4.3. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon, nguồn Nitơ

Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

Cacbon là nguồn dinh dưỡng quan trong cho VSV. Hầu hết các loài VSV sử

dụng nguồn cacbon đưa từ ngoài đưa vào. Mỗi loại có khả năng sử dụng nguồn

cacbon tối thích khác nhau cho sinh trưởng. Chúng tôi đã sử dụng 7 nguồn

Cacbon khác nhau và một công thức đối chứng( không bổ sung nguồn Cacbon

vào môi trường ISP4) để xác đinh mức độ ảnh hưởng của nguồn Cacbon lên

sinh trưởng và sinh enzym của 2 chủng XK7, XK10. Kết quả được thể hiện ở

bảng sau:

47

Bảng : Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sinh trưởng và phát trỉên và

sinh enzym của các chủng XK

chỉ tiêu

Ký

hiệu

chủng

Nguồn Cacbon

D/

Chung

Tinh

bột

tan

(1%)

Tinh

bột

tan

(2%)

Glucoza

(1%)

Lactoza

(1%)

Saccaroza

(1%)

Rỉ

đường

10ml/l

CMC

(1%)

pH sau

nuôi

XX7 7.15 8.31 7.75 7.24 6.96 8.21 7.6 8.01

XX10 7.14 7.8 8.41 7.24 8.13 8.24 7.65 8.30

Sinh khối

(g/l)

XX7 1.068 7.5 3.2 0.76 0.388 0.064 0.622 5.268

XX10 1.482 8.964 13.98 4.588 0.404 0.48 0.78 7.712

Hoạt tính

Xenlulaza

(D-d,mm)

XX7 12 12 10 0 12 11 12 9

XX10 11 2419

18 12 22 16 12

Hoạt tính

Amylaza

(D-d,mm)

XX7 10 12. 6 7 11 7 6 7

XX10 0 12 18 25 18 12 36 4.

Hoạt tính

Proteaza

(D-d,mm)

XX7 12 16 16 12 10 12 11 12

XX10 25 13 16 14 12 12 0 9

Kết quả ở bảng trên cho thấy hai chủng XK, XK10 đều có khả năng sử

dụng nhiều nguồn Cacbon khác nhau. Tuy nhiên, tinh bột tan và CMC là thích

hợp hơn cả cho cả hai chủng XK7, XK10. Riêng đường glucoza chỉ thích hợp

cho sinh trưởng, phát triển cho chủng XK10 nhưng lại không thích hợp với

chủng XK7. Điều đặc biệt ở đây là: nguồn Cacbon nào cho lượng sinh khối cao

nhất thì cũng cho hoạt tính enzym cao. Cụ thể: Ở môi trường có tinh bột 1%,

tinh bột 2% , CMC 1% cho sinh khối lớn hơn cả thì ở những môi trường này

cũng cho hoạt tính cao hơn so với nhũng môi trường chứa nguồn Cacbon khác.

48

Glucoza thích hợp với chủng XK10, không thích hợp với chủng XK7 nên hoạt

tính xenluloza, amylaza, proteaza của chủng XK10 ở môi trường này cao, của

XK7 lại thấp.

Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Chúng tôi sử dụng 7 nguồn ni tơ khác nhau và một công thức đối

chứng( Không bổ sung nguồn Nitơ) để xác định sử ảnh hưởng của các nguồn ni

tơ lên sự sinh trưởng và phát triển, sinh enzym của 2 chủng xạ khuẩn. Kết quả

thể hiện ở bảng sauBảng : Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng và phát trỉên và sinh enzym của các

chủng XK

Các chỉ tiêu Chủng

Nguồn Nitơ

Đối

chứng

Đậu

tương

(1%)

Đậu

tương

(2%)

Cao

nấm

men

(1%)

Pepton

(1%)

NH4Cl

(0,1%)

(NH4)2

SO4

(0,2%)

KNO3

(0,1%)

pH sau nuôiXX7 6.5 7.8 7.5 6.8 6.4 5.8 5.7 6.7

XX10 4.8 5.1 5.1 5.0 7.8 5.3 4.7 7.9

Sinh khối

(g/l)

XX7 2.505 11.244 10.746 7.93 7.74 3.794 2.344 4.762

XX10 3.670 6.698 7.308 4.828 4.464 2.602 2.536 2.976

Hoạt tính

Xenlulaza(D-

d,mm)

XX7 13.5 28 14 12 8 13 11 12

XX10 16 24 15 29 20 15 30 18

Hoạt

tínhAmylaza(

D-d,mm)

XX7 6 10 10 8.3 0 5 4.6 8.3

XX10 5.6 18 10 8 13.6 6 13 5

Hoạt tính

Proteaza(D-

d,mm)

XX7 12 11.6 8 13 8.6 10.3 11.5 14

XX10 12 13 12.5 13.5 19.6 14.5 12.5 27.5

49

Kết quả ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng, phát triển, sinh enzym trình bày

ở bảng trên đã khẳng định ưu thế của bột đậu tương lên khả năng sinh trưởng,

sinh enzym của XK7, XK10. Điều này có thể do trong bột đậu tương ngoài

40% là protein còn có chứa thêm một số chất khác cần thiết cho quá trình sinh

tổng hợp enzym. Đối với chủng XK7 lượng bột đậu tương thích hợp là 1%, còn

đối với XK10 là 2%. Sau bột đậu tương là cao nấm men, peptone là nguồn nitơ

thích hợp cho sinh trưởng, sinh tổng hợp của 2 chủng XK này.

4.4.4. Khả năng kháng kháng sinh.

Các chủng được nuôi cấy ở môi trường ISP4 có bổ sung Steptomycin

nồng độ 300, 500, 800,1000 mg/l môi trường. Sau 120 giờ xác định sinh khối,

hoạt tính xenluloza,amylaza, proteaza. Kết quả thể hiện ở bảng sau: Cả hai

chủng đều có khả năng sinh trưởng và phát triển ở các mức kháng sinh đó.

Chứng tỏ hai chủng lựa chọn có khả năng kháng kháng sinh. Tuy nhiên hoạt tính

xenluloza, amylaza, proteaza của các chủng ở các mức kháng sinh này lại thấp.

Điều này cũng dễ hiểu, bởi vì chất kháng sinh đã ức chế sự sinh trưởng của các

XK, hạn chế quá trình sinh tổng họp enzym. Hoạt tính xenluloza, amylaza,

proteaza cũng giảm dần theo mức độ tăng nồng độ chất kháng sinh. Chủng XX7

cho nhiều sinh khối lớn hơn chủng XK10 ở các mức kháng sinh, tuy nhiên hoạt

tính enzym ở cùng một mức kháng sinh của XK10 lại cao hơn chủng XK7.

50

Bảng : Ảnh hưởng của các mức kháng sinh đến sinh trưởng và phát trỉên và

sinh enzym của các chủng XK

Chỉ tiêu ChủngMức kháng sinh (mg/l)

300 500 800 1000

pH sau nuôiXX7 1.9 2.4 1.9 7.4

XX10 2.0 2.2 7.7 6.7

Sinh khối (g/l)XX7 4.526 5.183 4.868 1.24

XX10 2.31 2.42 0.845 0.505

Hoạt tính Xenlulaza(D-d,mm)XX7 5 4 5 5

XX10 16 6 4 4

Hoạt tínhAmylaza(D-d,mm)XX7 8 6 6 6

XX10 14 7 5 0

Hoạt tính Proteaza(D-d,mm)XX7 8 6 5 3

XX10 15 7 8 3

51