Beata Nowakowska, 24.10.2016

Zasady i metody klasycznej i molekularnej

diagnostyki cytogenetycznej

Cytogenetyka

Klasyczne badanie cytogenetyczne - opiera

się na analizie chromosomów w stadium

metafazy

Dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów. Koncentruje się zarówno na kształcie jak i liczbie chromosomów oraz na

ich dziedziczeniu.

cytogenetyka molekularna - umożliwia badanie

materiału genetycznego w stadium interfazy

Rola i znaczenie badań cytogenetycznych

pre- i postnatalnego rozpoznania chorób i

zespołów uwarunkowanych aberracjami

chromosomowymi

identyfikacji rodzin ryzyka genetycznego

Badanie cytogenetyczne stanowi podstawę:

poznawania etiologii i patomechanizmu chorób

genetycznych

Od chromosomu do nukleotydu Cytogenetyka Sekwencjonowanie

CGH NGS

SNP + CNV (?)

CNV

Rozdzielczość metod cytogenetyki molekularnej

Sekwencjonowanie DNA- 1pz

FISH - 40-250 kpz

Klasyczne metody oceny kariotypu >4

Mpz

HR-CGH >3 Mpz Mikromacierze CGH – 1 Mpz – 20 pz

MLPA - 40-60 pz

Metody cytogenetyki klasycznej - hodowla limfocytów krwi obwodowej

Limfocyty – Tylko limfocyty ulegają pobudzeniu przez czynnik wzrostu

Limfocyty T

odpowiedzialne za odpowiedź odpornościową komórkową

U osoby zdrowej stanowią ~70% populacji wszystkich limfocytów

Limfocyty B

odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu i wytwarzanie przeciwciał

Analiza prążkowa chromosomów

Każdy chromosom ma specyficzny dla siebie obraz (wzór) prążkowy, czyli układ poprzecznych prążków, różniących się wielkością i intensywnością zabarwienia.

W haploidalnym zestawie chromosomów metafazowych można wyróżnić około 400 prążków.

Chromosomy z wcześniejszych stadiów podziału chromosomowego, prometafazowe lub profazowe, wykazują, zależnie od stopnia kondensacji, 500-1250 prążków.

Wielkość najmniejszej aberracji która może być w nim rozpoznana odpowiada 7-10 Mpz, przy 400 prążkach i zwiększa się do 2-5 Mpz przy 850 prążkach.

6p21.3 region 2 prążek 1 subprążek 2

Każda para chromosomów musi być przeanalizowana •co najmniej dwukrotnie (każdy region prążkowy) •przy zalecanej rozdzielczości na podstawie wzorców z ISCN

46,XX

Kariotyp prawidłowy męski, rozdzielczość 450 prążków

Kariotyp prawidłowy męski, rozdzielczość 750 prążków

47,XY,+21

Trisomia 21 (zespół Downa), 47,XY,+21

47,XY,+21

47,XXY

47,XXX

47,XY,+mar

46,X,del(X)(q21)

del(X) X

46,X,del(X)(q21)

46,X,t(X;3)(p21.1;12.1)

3 der(3) der(X) X

t(X;3)(p21.1;12.1)

45,XY,der(13;14)(q10;q10)

46,XY,add(7)(q36)

Translokacja Robertsonowska zrównoważona, 46,XY,der(13;14)(p11,p11)

Translokacja Robertsonowska niezrównoważona, trisomia 13 (zespół Patau)

46,XY,der(13;14)(q10;q10),+13

Translokacja wzajemna zrównoważona, 46,XX,t(4;7)(p15.2;q11.2)

Delecja w obrębie długiego ramienia chromosomu 18 pary, 46,XY,del(18)(q21.3)

Metody cytogenetyki molekularnej

Technika FISH umożliwia identyfikację specyficznych

sekwencji DNA w chromosomach metafazowych, jądrach interfazowych

lub skrawkach tkanek znajdujących się w preparatach cytologicznych.

RODZAJE SOND MOLEKULARNYCH

1. Sondy

malujące

2. Sondy specyficzne

do unikalnych

sekwencji DNA

3. Sondy specyficzne do

powtarzalnych sekwencji DNA

subtelomer

centromer

subtelomer

Zespół

Wolfa-

Hirschhorna

Sondy specyficzne do unikalnych sekwencji DNA

Translokacja (4;7)

Sondy subtelomerowe

Sondy malujące

chromosom 12

p-arm probes fluoresce green

q-arm probes fluoresce red

1 2 3 4 5 6 7 8

9 10 11 12 13 14 15 16

18 19 20 21 22 X/Y 17

Subtelomere Region-specific Probes

Sondy

subtelomerowe

Chromosomy 3 pary -

prawidłowe

Chromosomy 6 pary -

prawidłowe

Translokacja (4;7)

Multicolor - FISH

Rapid FISH

Prawidłowa liczba sygnałów

13 - sygnały zielone

21 - sygnały czerwone

Nieprawidłowa liczba sygnałów

3 sygnały zielone

– trisomia 13 pary

36

Metoda MLPA

Zalety

• Możliwość analizy ~45 loci w jednym badaniu

• Możliwość badania do 96 próbek równocześnie

• Wynik badania po 24 godz.

• Prostota, mały koszt

Zastosowanie

Diagnostyka:

• zespołów mikrodelecji/mikroduplikacji

• aberracji subtelomerowych

• aneuploidii w badaniach prenatalnych

MRC Holland http://www.mrc-holland.com

Starter Y do reakcji PCR

Sekwencja komplementarna do badanego regionu DNA

Starter X do reakcji PCR

Unikalnej długości sekwencje DNA

Sekwencja komplementarna do badanego regionu DNA

X 5’

5’ 3’ Badany region DNA A

Y

Badany region DNA B

X

5’

5’ 3’

Y

5’ 3’ 5’ 3’

X Y

5’ 3’

X Y

5’ 3’

Ligacja i amplifikacja

Ilościowa analiza powstałych tak produktów PCR umożliwia odzwierciedlenie liczby kopii analizowanych loci. (d) Rozróżnienie poszczególnych sond odbywa się na drodze rozdziału elektroforetycznego w sekwenatorze, dzięki temu, że każda z sond jest innej długości

Pojedyncza sonda zawiera dwa różne oligonukleotydy (20-43 nukleotydy), których miejsca wiązania w genomie znajdują się koło siebie. Sondy swoiste dla przylegających do siebie fragmentów DNA analizowanego regionu połączone są z krótkimi, unikalnymi sekwencjami DNA o różnej długości (19-370 nukleotydów), oflankowanymi sekwencjami komplementernymi do uniwersalnych starterów.

Schouten, J.P. et al. Nucl. Acid Res. 30, e57. More info on www.mrc-holland.com

Hybrydyzacja

38

Delecja 22q11.2 39

Duplikacja 4p 40

Metoda porównawczej hybrydyzacji genomowej

Pozycja na chromosomie

Genomowe DNA

pacjenta

Genomowe DNA

referencyjne

Cot-1 DNA

addycja delecja

Chromosom

markerowy

Sondy centromerowe 8/9

Sondy centromerowe 13/21

Chromosom

mar

Sonda malX

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) do mikromacierzy:

Genomowe DNA

pacjenta

Genomowe DNA

referencyjne Cot-1 DNA

Pozycja na chromosomie

1

Wzglę

dna

fluore

scencja

addycja delecja Profil intensywności

fluorescencji

Wartości progowe

Cy5 Cy3 Test Sample Reference Sample

Hybridization for 16 hrs

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) do mikromacierzy:

Schemat analizy DNA genomowego techniką mikromacierzy CGH:

DNA referencyjne DNA testowane

Mieszanina sond

Hybrydyzacja do mikromacierzy

Fragment sekwencji DNA umieszczony na mikromacierzy

Wizualizacja wyniku

Duplikacja fragmentu

DNA

Względna fluorescencja

Wstępne przetwarzanie

danych

Fragmenty DNA umieszczone na

szkiełku podstawowym

wg. Chari i wsp. 2006

Mikromacierze DNA:

CGH: SNP:

identyfikacja zmiany liczby kopii fragmentów DNA (CNV)

identyfikacja zmiany liczby kopii fragmentów DNA (CNV)

identyfikacja disomii jednorodzicielskiej (UPD)

identyfikacja utraty heterozygotyczności (LOH)

identyfikacja mutacji punktowych

Rodzaje i zastosowanie CGH do mikromacierzy Mikromacierz skonstruowana dla określonego

regionu chromosomu -region 1p36 - Yu W i wsp.,2003, -region 15q –Locke i wsp.,2004, -region 18q – Veltman JA i wsp., 2004, -region 17p – Shaw CJ i wsp.,2004

Mikromacierz kliniczna, zawiera sondy specyficzne dla regionów krytycznych zespołów genetycznych oraz regiony subtelomerowe (Cheung SW i wsp.,2005, Shaffer L i wsp., 1999)

Mikromacierz sporządzona dla całego genomu (Li Ji wsp.,2003, Cai WW i wsp.,2002 )

Charakterystyka mikromacierzy stosowanych w badaniach

diagnostycznych

Mikromacierze selektywne vs. całogenomowe:

1. Targeted BAC Array 2. Whole Genome BAC Array 1MB 3. Whole Genome BAC Tiling Array 4. Oligo Targeted Array 5. Oligo Whole Genome Tiling Array

CNV- Copy Number Variations

Zmiany liczby kopii

fragmentów DNA łagodne CNVs oraz

patogenne CNVs

indel (insertion or deletion)

CNV (copy number variants) – zmiana liczby kopii sekwencji DNA

Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Sebat J, Lakshmi B, Troge J, Alexander J, Young J, Lundin P, Månér S, Massa H, Walker M, Chi M, Navin N, Lucito R, Healy J, Hicks J, Ye K, Reiner A, Gilliam TC, Trask B, Patterson N, Zetterberg A, Wigler M. Science. 2004 Jul 23;305(5683):525-8. Detection of large-scale variation in the human genome. Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C. Nat Genet. 2004 Sep;36(9):949-51.

CNV: 290 fenotypowo prawidłowych osób pochodzących z

różnych grup etnicznych

1668 CNVs (średnio 11 CNVs na osobę)

średnia wielkość 340 - 465 kpz (100 kpz- 10 Mpz)

łącznie CNVs stanowiły 360 Mpz

co stanowi 12% ludzkiego genomu (obecnie w internetowej bazie zmiany łagodne pokrywają 29% genomu)

Uważa się, że CNVs są odpowiedzialne za

- ewoluję

- zmienność osobniczą ( np. HIV - Gonzalez et al. 2005 , choroby autoimmunologiczne - Yang et al. 2007)

- odpowiedź na leki (np. onkologia - Ouahchi et al. 2006)

- podatność na powstawanie chorób

Oddziaływanie CNVs na fenotyp:

Zmiana ekspresji genu

Modyfikację dawki produktu danego genu

Zaburzenie funkcji elementów regulatorowych

„Odsłonięcie” alleli recesywnych

Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany

Bazy danych wariantów polimorficznych:

- Toronto Database of Genomic Variants http://projects.tcag.can/variation

Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem:

- DECIPHER

http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/

Region bogaty w geny

Wielkość zmiany

Delecja czy duplikacja

Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badania

Interpretacja wyników badań metodą aCGH

Interpretacja wyników badań metodą aCGH

Rodzicielskie pochodzenie CNV Mniejsze prawdopodobieństwo

patogenności (>99% dziedziczonych CNV to CNV łagodne) ale w interpretacji wyniku trzeba

uwzględnić: - Ocenę fenotypu rodzica, nosiciela CNV (zróżnicowanie

ekspresji, niepełna penetracja, mozaikowość – odziedziczone CNV np.1q21.1; 1q41q42; 3q29; 15q11.2; 15q13.2q13.3; 16p11.2; 16p13.11; 22q11.2 mogą być patogenne

- Czynniki epigenetyczne (CNV zawiera piętnowany locus, np. del UBE3A od matki skutkuje chorobą u dziecka)

- Możliwość ujawnienia się mutacji recesywnej gdy dotyczy drugiego allelu genu znajdującego się w obrębie CNV odziedziczonego od rodzica

Niepełna penetracja

McCarroll S.A. Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, Review Issue 2

Niepełna penetracja

Możliwość ujawnienia się mutacji recesywnej

Interpretacja wyników badań metodą aCGH Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany

Bazy danych wariantów polimorficznych:

- Toronto Database of Genomic Variants http://projects.tcag.can/variation

Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem:

- DECIPHER

http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/

Region bogaty w geny

Wielkość zmiany

Delecja czy duplikacja

Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badanie

A JHG 82, 181-187 2008

Interpretacja wyników badań metodą aCGH Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany

Bazy danych wariantów polimorficznych:

- Toronto Database of Genomic Variants http://projects.tcag.can/variation

Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem:

- DECIPHER

http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/

Region bogaty w geny

Wielkość zmiany

Delecja czy duplikacja

Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badanie

10,7Mb delecja interstycjalna bez

efektu fenotypowego

5q14.3q15

MEF2C

d

a

c

b

Patient 2

Patient 1

PH critical region 5.8 Mb

TMEM161B FLJ11292 LYSMD3

GPR98

CETN3

AL050132

86,200,000-95,500,000

86 96

Position MB

91 87 88 89 90 93 92 94 95

RASA1

CCNH

LOC153364

POLR3G

ARRDC3 FLJ42709

NR2F1

FAM172A

POU5F2

AK130941

KIAA0825

C5orf36

CR590796

ANKRD32

MCTP1

CR614705

SPATA9

RHOBTB3

KIAA0878

FAM81B

TTC37

UNQ630

ARSK

GPR150

RFESD

GLRX

ELL2

Patient 3

Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 1

Deletion: Engels et al.(2009) Patient 1

Deletion: Engels et al.(2009) Patient 2

Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 2

Deletion: Le Meur et al.(2009) Patient 1

Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 3

Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 4

Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 5

Duplication: Le Meur et al. (2009) Patient 6

Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 3

Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 2

Deletion: Engels et al.(2009) Patient 3

Nowakowska i wsp., Am J Med. Genet Part B, 2010

Średnia wielkość CNV

Wg. Buysse i wsp., Eur J Med. Genet., 2009

• Platformy stosowane do badań diagnostycznych w przypadkach

NI/ASD/WWR o nieznanej etiologii powinny być całogenomowe i

mieć rozdzielczość ≥ 400 kpz

Rekomendacje ISCA – The International Standard Cytogenomic Array

Consortium Opracowany na podstawie 35 badań w grupie 21 478 pacjentów z NI

/opóźnieniem rozwoju psychoruchowego/ chorobą ze spektrum zaburzeń

autystycznych (ASD) / wrodzonymi wadami rozwojowymi o nieznanej etiologii

Rekomenduje

Podstawa: Stosując rozdzielczość ~400 kpz wykrywamy wszystkie

znane i powtarzające się zmiany warunkujące choroby genomowe i

większość unikalnych, patogennych niezrównoważeń genomu oraz

niewielką liczbę łagodnych CNV

• Kariotyp konwencjonalny powinien być wykonywany w

przypadkach wywiadu rodzinnego obciążonego zrównoważoną

rearanżacją chromosomową lub licznymi poronieniami oraz w

przypadkach znanych zespołów aneuploidii (tris.21, 13, zespół

Turnera i Klinfeltera)

Noworodki z wielowadziem i/lub cechami dysmorfii ~ 14 - 28%

Niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju 9 – 13%

psychoruchowego (3 – 5% met. GTG)

CNV stwierdzane metodą aCGH w różnych grupach klinicznych

Szacuje się, że aż 15% chorób genetycznych uwarunkowana jest

submikroskopowym niezrównoważeniem genomu

Mikromacierze są ok. 3 krotnie skuteczniejsze w diagnostyce

niezrównoważenia genomu niż badania metodami

konwencjonalnymi

Wapner et al. June, 2014

Przydatność diagnostyczna metody aCGH w badaniach prenatalnych:

Internetowe bazy danych: Wapner et al. June, 2014 74

Lepsze poznanie i zrozumienie fenotypowej zmienności w znanych zespołach genetycznych

Wyjaśnianie genetycznej etiologii znanych zespołów (poprzez identyfikację genów odpowiedzialnych za patologię np. CHD7 w zespole CHARGE)

Diagnostykę rzadkich zespołów genetycznych

Odkrywanie nowych zespołów mikrodelecji/mikroduplikacji

Poznawanie znaczenia klinicznego mozaikowości (w 8 – 10% mozaikowość nie wykrywana badaniami konwencjonalnymi)

Wzbogacanie wiedzy o polimorfizmie genetycznym (częstość i rozmieszczenie w genomie CNV, 4000 loci), jego aspektach klinicznych np. znaczenia dla predyspozycji do chorób wieloczynnikowych (autyzm, Alzheimer, nowotwory)

Przydatność kliniczna badań na mikromacierzach

Badania na mikromacierzach umożliwiają:

Interpretation of array comparative genome hybridization data: a major challenge. Gijsbers AC, Schoumans J, Ruivenkamp CA. Cytogenet Genome Res. 2011;135(3-4):222-7

Porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy

(aCGH)

Zalety Ograniczenia

• Duża rozdzielczość • Nie wykrywa

zrównoważonych

rearanżacji i poliploidii

(~0.3% osób z NI ma

aberrację zrównoważoną)

• Precyzyjne mapowanie

miejsc złamań

• Wykrywanie duplikacji • Duża liczba wykrywanych

polimorfizmów

• Wykrywanie mozaikowatości

(10% BAC, 30% oligonukleotydowe)

• Problemy z interpretacją

wyników badań

Metoda

Rozdzielczość

Zalety

Ograniczenia

Problem Skutki

GTG 4 – 10 Mpz • Identyfikacja aberracji zrównoważonych

• Mała rozdzielczość • Subiektywizm oceny

•nie identyfikowane mikroaberracje • wysokie ryzyko błędu

FISH

40 - 250 kpz •Wysoka rozdzielczość •Łatwość wykonania •Cena

•ograniczona liczba analizowanych loci •konieczność znajomości regionu patologii

•Wieloetapowa identyfikacja aberracji

MLPA 40 - 60 pz

HR-CGH >3 Mpz •Analiza całego genomu •Identyfikacja dodatkowego materiału

•Mała rozdzielczość •Nie identyfikowane aberracje zrównoważone

•nie identyfikowane mikroaberracje •Nie identyfikowane translokacje zrównoważone

aCGH 1 Mpz do 10 - 20 kpz

•Duża rozdzielczość •Wykrywanie mozaikowości

•Nie identyfikowane aberracje zrównoważone •Wykrywanie polimorfizmów

•Nie identyfikowane translokacje zrównoważone •Trudności w interpretacji

1997 r.

79