1

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………...3-7

ГЛАВА 1. ЭТИОПАТОГЕНЕЗ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………..…………………….…….….…..…....8-37

1.1 Этиологические факторы колоректального рака……...…….……...……...8-12

1.2 Молекулярно-генетические факторы патогенеза КРР………….........…..13-20

1.3 Роль процесса мутагенеза в развитии канцерогенеза………………….....21-23

1.4 Роль иммунной системы в патогенезе опухолевого роста………….……24-26

1.5 Патогенетические методы лечения колоректального рака………………27-37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………...38-52

2.1 Организация исследования…………………………………………….…...38-39

2.2 Группы обследуемых больных…………………………………..………...39-40

2.3 Методы диагностики……………………………………………..…………41-52

2.3.1 Анкетирование……………………………………………..…….…….41-42

2.3.2 Клиническое обследование больных …………………….……….……..42

2.3.3 Инструментальное обследование больных………………………….42-44

2.3.4 Иммунохимический анализ опухолевых маркеров……………...…44-45

2.3.5 Морфологические исследования ………………………..…….….....45-52

2.4 Статистическая обработка данных…………………………..………………..52

ГЛАВА 3. КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

БОЛЬНЫХ, ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ

КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА В ПЕРМСКОМ РЕГИОНЕ…………………..53-85

3.1. Заболеваемость колоректальным раком в Пермском регионе……….....53-55

3.2 Анамнестические данные обследованного контингента………..…...…..55-59

3.3 Результаты лабораторных методов исследования ………….…………....59-63

3.4 Результаты инструментальных исследований………………..…………..63-65

3.5 Сравнительная характеристика диагностической ценности

лабораторных и инструментальных методов исследования колоректального

2

рака…………………………..…………………………………………………..65-69

3.6 Локализация опухоли……………………………………….………..……..69-71

3.7 Лечение больных с неопластческим поражением толстой

кишки…………………………………………………………………………….71-75

3.8 Отдаленные результаты комбинированного лечения больных

колоректальным раком…………………………………………………………75-84

ГЛАВА 4. ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ

РАКОМ……………………………………………………………………........85-113

4.1 Патоморфологические характеристики опухолевых тканей…………….85-90

4.2 Изучение чувствительности к химиотерапевтическим препаратам

первичных культур клеток опухолевой и нормальной эпителиальной ткани

кишечника……………………………………………………………………….90-92

4.3 Характеристика первичных культур клеток…………………….………...92-94

4.4 Изучение количества клеток с хромосомными аберрациями, анеуплоидных,

пролиферирующих и колониеобразующих клеток в первичных

культурах………………………………………………...………………………94-96

4.5 Определение чувствительности к химиотерапевтическим препаратам

эпителиальных клеток кишечника больных колоректальным

раком .in vitro ………………………………………………………………….96-103

4.6 Ингибирование пролиферативной активности опухолевых клеток

исследуемыми препаратами………………………………………………....103-106

4.7 Оценка экспрессии генов репарации ошибочно спаренных оснований

системы больных колоректальным раком….……………………………....106-110

4.8. Сопоставление результатов цитогенетического тестирования опухолевых

клеток с данными клинических исследований.…………………………….111-113

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………...113-119

ВЫВОДЫ……………………………………………………………….……..…...120

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….….121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………....122-147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………….….147-148

ПРИЛОЖЕНИЕ…………………………………………………………….…149-150

3

ВВЕДЕНИЕ

Патогенетические особенности опухолевых заболеваний обусловлены

аккумуляцией мутаций в онко- и тумор-супрессорных генах, которые вызывают

нарушения цикла деления клетки. Часть опухолевых заболеваний инициируется

дерепрессией аутосомно-доминантных мутаций в генах систем репарации ДНК.

К заболеваниям с аутосомно-доминантным типом наследования относятся

опухоли колоректальной локализации [Sjöblom T., et al., 2006]. Дерепрессия

генов репарации ДНК вызывает хромосомную и микросателлитную

нестабильности в эпителиальных клетках кишечника. Ежегодно в мире

регистрируют примерно 600000 новых случаев колоректального рака (КРР)

[Cancer Research, 2005], около 300000 человек умирают от этого заболевания

[Cai G. et al., 2008]. Результаты международных (ICG-HNPCC) и

национальных (Швеция, Финляндия, Италия, Франция) программ скрининга

заболеваемости 1958-2005 гг. показали, что к этиологическим факторам,

инициирующим процесс канцерогенеза относятся особенности питания,

малоподвижный образ жизни, сопутствующая соматическая патология

(сахарный диабет, ожирение), вредные привычки (табакокурение и прием

алкоголя), воспалительные заболевания кишечника и дивертикулярная болезнь

толстой кишки [Вашкамадзе Л.А. и др., 1999; Моисеенко А.Б. и др., 2001;

Белоусова Е.А., 2002; Белоус Т.А, 2002; Коган Е.А., 2002; Секачева М.И., 2006].

Актуальными проблемами, требующих решения, в период перехода от

дескриптивного к аналитическому этапу исследований опухолевого процесса

являются низкая чувствительность методов диагностики заболевания,

неспецифичность онкомаркеров для оценки эффективности и прогноза лечения

больных. В динамической системе моделирования сопоставление профилей

экспрессии маркерных генов, влияние противоопухолевых препаратов на

4

выживаемость неопластических клеток с данными клинических исследований

является концептуальным подходом решения этих проблем.

Выше изложенное определило цель и задачи диссертационной работы.

Цель исследования – патогенетическое обоснование оптимизации

диагностики и схем комбинированного лечения колоректального рака.

Задачи исследования

1. Провести анализ заболеваемости, выяснить основные факторы риска

возникновения колоректального рака у жителей Пермского региона.

2. Оценить in vitro влияние химио - и иммунотерапевтических средств на

цитогенетические показатели культур клеток опухолевой эпителиальной

ткани.

3. Обосновать включение в схему лекарственной терапии колоректального

рака перспективные подходы оценки чувствительности к лекарственным

препаратам опухолевых клеток с учетом их фенотипической и

генотипической вариабельности.

4. Разработать схему диагностики колоректального рака на основе

современных данных о механизмах развития опухоли.

Научная новизна. Впервые на основании оценки цитологических и

гистологических характеристик опухолевых клеток определен патогенетически

обоснованный выбор метода лечения колоректального рака. Впервые

разработан и апробирован способ сравнительной оценки чувствительности

опухолевых клеток к различным химиотерапевтическим агентам, что позволяет

оптимизировать схемы химиотерапевтического лечения новообразований

ободочной и прямой кишки. С учетом патогенетических и молекулярных

механизмов развития неопластического поражения толстой кишки, дополнена

диагностическая схема ведения больных КРР, которая унифицирует

последовательность и объем скрининга.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая

значимость работы состоит в обосновании комбинированного лечения КРР.

Культуры опухолевых клеток позволяют определить индивидуальную

5

чувствительность больных к противоопухолевым и иммуномодулирующим

препаратам. Результаты работы расширяют представление о механизме и

направленности действия на опухоли лекарственных препаратов в условиях их

фармакодинамического взаимодействия с иммуномодулятором. На основании

проведенных клинико-экспериментальных исследований изучены

патогенетические механизмы развития неопластического поражения толстой

кишки.

Практическая значимость работы заключается в создании и апробации

схемы скрининга и первичной диагностики колоректального рака, которая

может быть внедрена в поликлиническом звене. Оптимизация схем

диагностики и комбинированного лечения колоректального рака позволяет

индивидуализировать лечение с учетом патогенетических механизмов развития

этой патологии, что будет способствовать изменению структуры первичной

заболеваемости КРР, повысит эффективность лечения, снизит уровни

нетрудоспособности, инвалидизации и смертности.

Внедрение в практику.

Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедрах

онкологии, с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, патофизиологии

ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», в научных исследованиях

лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН. Областной детской краевой больницы и отделении

химиотерапии Краевого онкологического диспансера г. Пермь.

Положения, выносимые на защиту:

1. Колоректальный рак является мультифакториальной патологией, в

этиологии которого ведущая роль принадлежит генетическим и средовым

факторам.

2. Комплекс генетических нарушений в клетках эпителия кишечника

больных является этиологическим фактором развития колоректального рака.

Хромосомная и геномная нестабильность, изменение пролиферативной

активности, хемиорезистентность опухолевых препаратов и экспрессия

6

тумор-ассоциированных генов учитываются на этапе ранней диагностики и

для повышения эффективности лечения заболевания.

3. Использование патогенетически обоснованных схем комбинированного

лечения, учитывающих индивидуальные фенотипические признаки

чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам,

способствует повышению эффективности лечения колоректального рака.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на

Межвузовской конференции аспирантов «Экология: проблемы и пути

решения», Пермь, 2001; III-V Международных конференциях «Экология и

научно-технический прогресс», Пермь, 2004 - 2006; XV и XVI Конференциях

«Актуальные проблемы патофизиологии» (в рамках Международных

конгрессов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической

медицины»), Санкт-Петербург, 2009, 2010.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 3 в

журналах, рекомендованных ВАК, получено удостоверение на

рационализаторское предложение № 2362 от 09.11.2004г. – «Способ получения

культур живых клеток из опухолевой и нетрансформированной ткани при

колоректальном раке».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает:

«Введение», главы «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований»,

2 главы, отражающие результаты собственных исследований, «Заключение»,

«Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы». Диссертация

изложена на 150 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27

таблицами, 25 рисунками. Библиографический указатель содержит 256

литературных источника, из них 73 отечественных и 183 зарубежных авторов.

Место проведения работы. Диссертация обобщает исследования

выполненные автором в 2001-2009 гг. Клинические исследования проведены на

кафедре онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии ГОУ ВПО

«ПГМА им. ак. Е.А Вагнера Росздрава», на базе хирургического и

радиологического отделений Краевого онкологического диспансера г. Пермь,

7

отделения общей хирургии Краевой клинической больницы г. Пермь,

отделения проктологии клиники Управления Делами Президента РФ г. Москва.

Цитологические исследования проводили в Институте экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН, гистологические исследования – в

патологоанатомическом отделении на базе Краевой детской клинической

больницы г. Перми.

8

ГЛАВА I. ЭТИОПАТОГЕНЕЗ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Негенетическими факторами риска возникновения КРР являются

особенности питания, малоподвижный образ жизни, вредные привычки

(курение и прием алкоголя), сопутствующая соматическая патология (сахарный

диабет, ожирение), воспалительные заболевания кишечника, дивертикулярная

болезнь толстой кишки, доброкачественные новообразования. К генетическим

факторам относятся наследственная предрасположенность и соматические

мутации, возникающие в результате непассивного процесса мутагенеза.

1.1Этиологические факторы колоректального рака

Известно, что прием пищи, богатой жиром, примерно в 2 раза

увеличивает секрецию желчных кислот и в 11 раз повышает их содержание в

толстой кишке, что является фактором риска развития колоректального рака

[Бронштейн А.С. и др., 2001; Bartsch H., 2004]. Кишечная микрофлора разлагает

холевую и хенодезоксихолевую желчные кислоты до вторичных желчных

кислот − литохолевой и дексихолевой. Повышенное содержание вторичных

желчных кислот отмечается в копрограмме 70% больных КРР [Bartsch H.,

2004]. При удалении желчного пузыря желчь, в состав которой входят

холестерин и желчные кислоты, постоянно поступает в двенадцатиперстную

кишку, что приводит к развитию воспалительных и диспластических

изменений эпителия толстой кишки, а также появлению неоплазий кишечника,

вероятность возникновения которых возрастает в 4 раза [Bartsch H., 2004].

Желчные кислоты являются питательным субстратом анаэробных бактерий. В

свою очередь продукты метаболизма желчных кислот анаэробной микрофлорой

могут стимулировать процесс канцерогенеза. Выявлено, что повышенное

содержание желчных кислот увеличивает образование эстрогенов, которые

являются предикторами возникновения рака толстой кишки и молочной железы

9

[Вашкамадзе Л.А. и др., 1999; Ивашкин В.Т., 1999; Логинов А.С. и др., 2000].

Желчные кислоты стимулируют пролиферацию железистого эпителия 1/3

крипт толстой кишки, что также может приводить к развитию опухолевой

трансформации [Вашкамадзе Л.А. и др., 1999; Ивашкин В.Т., 1999; Коган Е.А.,

2002].

В настоящее время установлено, что диета, богатая жиром и фосфатами,

способствует не только уменьшению содержания кальция, необходимого для

реакций нейтрализации свободных желчных кислот в толстой кишке, но и

возникновению аденокарцином [Пиманов С.И. и др., , 2001; Пророков В.В. и

др., 2004; Myerson R.J. et al., 1997; Bartsch H., 2004; Poynte J.N. et al., 2005].

Кроме того, в содержимом толстой кишки присутствует канцероген индол

[Белоус Т.А., 2002; Пророков В.В. и др., 2004; Jessup J.M. et al., 1997; Cheng

K.C. et al., 2004].

Факторами риска возникновения рака толстой кишки являются застой

содержимого кишечника из-за малоподвижного образа жизни, анатомические

особенности строения кишечника и такая органическая патология, как птоз

органов и спайки в брюшной полости. Из-за стаза кишечного содержимого

сначала происходит механическое повреждение, затем развиваются

пролиферативные и метапластические изменения кишечного эпителия в местах

физиологических сужений (печеночном и селезеночном изгибах, узкой

сигмовидной кишке с брыжейкой, среднеампулярном отделе прямой кишки).

Согласно результатам исследований Бронштейна А.С. (2001), сопутствующей

патологией в 38.5% случаев рака прямой кишки является хронический

геморрой, который возникает при расширении геморроидальных вен из-за

застоя крови в сосудах малого таза при малоподвижном образе жизни.

Рассматривают и роль инсулиноподобных факторов роста (ИПФР) в

повышении риска возникновения и развития КРР в организме больных

сахарным диабетом или ожирением [Моисеенко А.Б. и др., 2001]. Факторы

роста – это пептиды, стимулирующие или ингибирующие деление и

дифференцировку различных клеток. Известно, что основным свойством

10

раковой клетки является её способность к автономному росту, которое

определяется аутосекрецией ростовых факторов, взаимодействующих с

соответствующими рецепторами на поверхности мембраны той же клетки, в

результате чего осуществляется активное деление клетки [Гарькавцева Р.Ф. и

др., 2000]. Одним из основных факторов роста, отвечающим за синтез ДНК в

клетке, является инсулиноподобный фактор роста 1 (ИПФР-1). ИПФР-1 – это

фактор прогрессии, присутствие которого необходимо клеткам в G-1 фазе,

предшествующей синтезу ДНК, а также для вступления клетки в S-фазу синтеза

ДНК [Гарькавцева Р.Ф. и др., 2000]. Клеточные рецепторы и рецепторы ИПФР-

1 относят к семейству трансмембранных гликопротеинов с тирозинкиназной

активностью. Являясь важнейшим фактором регуляции метаболизма клеток

эпителия толстого кишечника и митогеном для клеток карциномы толстого

кишечника in vitro, инсулин вместе с ИПФР (в большей степени, чем только

ИПФР), формируют митогенную и метаболическую основу стадии промоции

опухолевого роста Показано, что гиперинсулинемия и инсулинрезистентность,

т.е. состояния, при которых активируются рецепторы ИПФР, предрасполагают

к развитию КРР [Poynte J.N. et al., 2005].

H. Bartsch (2004) установил, что недостаток фолиевой кислоты и

витамина В12 приводит к дефектам метилирования ДНК, вызывая нарушения

клеточной дифференцировки и дисплазию кишечного эпителия, при этом в 43%

случаев дисплазия ассоциирована с инвазивной карциномой. Установлено, что

дериват алкоголя ацетальдегид и токсические смолы табачного дыма

увеличивают риск развития КРР и аденом толстой кишки, разрушая фолиевую

кислоту в организме. Эти факторы, а также канцерогенные соединения,

например, бенз[a]пирен наряду с физическими факторами (радиационное

излучение) являются триггерами развития неоплазий толстой кишки [Poynte

J.N. et al., 2005].

Инициируют развитие неоплазий и воспалительные заболевания толстой

кишки. Выявлено, что язвенный колит (ЯК) сопряжен с повышенным риском

развития КРР [Логинов А.С., Парфенов А.И., 2000; Фарелл Р., Пепперкорн М.,

11

2003; Мартынюк В.В., 2004; Валиев А.А., 2005; Clevers H., 2004].

Относительный кумулятивный риск возникновения КРР при ЯК составляет 3.1-

5.7 [Фарелл Р. и др., 2003]. КРР формируется в случае продолжительности

заболевания ЯК в течение 7-8 лет и более [Пиманов С.И и др., 2001; Белоус

Т.А., 2002; Фарелл Р. и др., 2003; Мартынюк В.В., 2004]. Согласно материалам

мировой статистики КРР возникает в 2-3% случаев, если больной имеет 5-

летний анамнез ЯК. Продолжительность заболевания ЯК в течение 10, 15, 20 и

более 25 лет сопровождается повышением уровня заболевания КРР

соответственно до 7, 12, 23 и 42% [Фарелл Р. и др., 2005].

Многие исследователи предполагают, что ранний возраст начала

заболевания является существенным фактором развития КРР [Мартынюк В.В.,

2004]. Эта точка зрения обоснована в 20% случаев формирования КРР в

течение последующих 10 лет после диагностирования ЯК у пациентов моложе

15 лет [Белоус Т.А., 2002; Мартынюк В.В., 2004]. Доказано, что КРР возникает

при тотальном ЯК с первичным склерозирующим холангитом (ПСХ) в 9%, 31%

и 50% случаев, если продолжительность заболевания 10, 20 или 25 лет

соответственно [Мартынюк В.В., 2004].

При отсутствии диспластических изменений в слизистой оболочке

толстой кишки вероятность выявления рака составляет 2% [Bartsch H., 2004].

Хотя время, в течение которого дисплазия перерождается в карциному, и

частота такого перерождения неизвестны, но зафиксировано 29-54% случаев

прогрессирования дисплазии низкой степени в дисплазию высокой степени и

карциному [Bartsch H., 2004; Wingo P.A. et al., 1995; Ransonoff D. et al., 1999;

Vogel I. et al., 2000]. Диспластические изменения эпителия толстой кишки

предшествуют образованию доброкачественных новообразований ободочной и

прямой кишки, и последующему развитию КРР [Белоус Т.А., 2002].

Существует риск развития КРР при болезни Крона (БК), хотя его уровень

значительно ниже, чем при ЯК [Логинов А.С., Парфенов А.И., 2000; Бронштейн

А.С. и др., 2001; Пиманов С.И. и др., 2001]. Злокачественной трансформации

подвергаются участки язвенно-измененной толстой кишки. Реже малигнизацию

12

наблюдают в подвздошной кишке. Несмотря на одинаковую природу факторов

риска развития КРР при болезни Крона и ЯК, отличительными чертами

процесса являются его продолжительность и уровень язвенного поражения.

Диспластические изменения появляются реже и не обязательно в зонах

воспаления. Возможны очаги диспластической трансформации в отдалении от

язвенно-измененных участков слизистой оболочки толстой кишки [Логинов

А.С. и др., 2000; Пиманов С.И. и др., 2001].

Выявлено повышение заболеваемости КРР среди пациентов, страдающих

дивертикулярной болезнью толстой кишки [Кныш В.И., 1997; Бронштейн А.С.

и др., 2001]. Колоректальный рак на фоне дивертикулярной болезни толстой

кишки диагностируют чаще всего среди больных в возрасте 70-80 лет и

преимущественно у женщин [Volk E.E. et al., 2005]. Риск развития рака связан с

аденомами, которые малигнизируются и выявляются у каждого 4-го больного с

дивертикулезом толстой кишки [Кныш В.И., 2000; Бронштейн А.С. и др., 2003].

Злокачественная трансформация слизистой оболочки толстой кишки возникает

в дивертикулах, что иногда приводит к развитию таких редких для ободочной

кишки опухолей, как аденоакантомы и фиброцистомы [Кныш В.И., 2000;

Логинов А.С. и др., 2000; Бронштейн А.С. и др., 2004]. Доброкачественные

опухоли толстой кишки, развиваясь в железистом эпителии, являются самым

распространенным заболеванием, на фоне которого развивается КРР

[Капуллера Л.Л., 2006]. Примерно 5% железистых полипов малигнизированы.

Ворсинчатые полипы размером более 2 см малигнизируются чаще, чем

железисто-ворсинчатые аденомы с промежуточным уровнем риска

малигнизации. Одной из причин инициации канцерогенеза являются

молекулярно-генетические изменения, вызванные нарушением процессов

пролиферации и апоптоза (процесс запрограммированной гибели клетки)

эпителиальных клеток.

13

1.2 Молекулярно-генетические факторы патогенеза колоректального

рака

Процесс развития колоректального рака состоит из серии геномных

изменений, повреждений хромосом, микросателлитной нестабильности.

Секвенировние генома человека и сравнительный анализ геномов опухолевых

клеток показали, что источником инициации канцерогенеза являются тысячи

мутированных генов, комбинаций которых встречаются в разных

гистологических формах КРР. В таблице 1 представлены локусы, повреждения

которых вызывают развитие КРР и других неопластических заболеваний.

Таблица 1 Генетические маркеры колоректального рака

Хромосомная

локализация

Заболевание Гены, участки ДНК, функции белков,

механизмы

Литература

1 2 3 4

3p22 КРР, рак легкого TGFβRII, рецептор второго типа фактора

роста TGF-β

Gryfe R., 1997

5q21 КРР АРС, регулирует стабильность и

транскрипционную активность β-

катенина

Trainer A.H., 2009

8q23.1 КРР, рак желудка EIF3H (субъединицы фактора инициации

трансляции eLF3)

Roy B., 2010

8q23.3 КРР EIF3H (субъединицы фактора инициации

трансляции elF3)

Roy B., 2010

8q24.21 КРР, рак молочной

железы

Энхансер, гены POU5F1P1, HsG57825,

DQ515897

Ahmadiyeha N.,

2010

9p21 КРР Микросателлитаная ДНК.

Ингибирование Cdk4 (p16INK4a),

активация р53

Tokuoka M., 2009

1 2 3 4

10p14 КРР, глиома, рак

легкого, матки,

печени

Тумор супрессорный ген Tomlinson I.P.M.,

2008

11q23 КРР, рак легкого,

молочной железы,

матки

SMAD7, тумор-супрессорный ген Martin E.S., Tokuoka

M., 2003

14q22.2 КРР BMP4 Study C., 2004

15q КРР, рак молочной

железы

GREM1, SGNE1, FMN1 Jaeger E., 2008

16q22.1 КРР CDH1 Study C., 2004

18q21.1 КРР SMAD2, SMAD7, SMAD4 и DCC,

передача сигнала от активированных

рецепторов TGF-β к Smad4

Boulay J.-L., 2003

19q13.1 КРР RHPN2, RhO GTPаза Study C., 2004

20q12.3 КРР FGFR3, MMSET, регуляция циклинов D1,

D3

Study C., 2004

К-RAS КРР Тумор-супрессорный ген Gregory S.G., 2006

N-RAS КРР Тумор-супрессорный ген Tokuoka M., 2003

DCC КРР Циклин Tokuoka M., 2003

18q21 КРР DPC4, транскрипционный фактор,

опосредует действие TGF-β

Boulay J.-L., 2003

17р13 КРР р53, регуляция апоптоза Hickman M.J., 1999

2p-162 КРР MSH2, MMР-система Bronner C.E., 1994

p15-163 КРР MSH3, MMР-система Burgart L.J., 2005

2p-162 КРР MSH6, MMР-система Drammond J.T., 1996

14

Метилирование ДНК. Предпочтительное метилирование цитозина по 5’-

углероду в последовательности 5’-CpG-3’ ДНК клеток млекопитающих

обеспечивает контроль транскрипции генов, нормальное эмбирональное

развитие, геномный импритинг, инактивацию Х-хромосомы и ингибирование

канцерогенеза [Jones P.A. et al., 2002]. В геноме млекопитающих метилировано

80% всех 5’-CpG-3’ динуклеотидов. Приблизительно 40% генов в промоторных

районах содержат 5’-CpG-3’ богатые районы [Bailin S.B. et al., 2001].

Гипо- и гиперметилирование ДНК. Гипо- и гиперметилирование генома и

промоторов тумор-супрессорных генов происходит в раковых клетках.

Гиперметилирование сайтов 5’-CpG-3’ в промоторном районе вызывает

ингибирование экспрессии генов. Инактивируя различные тумор-супрессорные

гены, эпигенетические модификации генома влияют на цикл деления клетки,

ТР53 систему (ген р14ARF), WNT сигнальную систему (гены APC, E-cadherin),

репарацию ДНК (гены MGMT, MLH1, BRCA1), апоптоз (ген DAPK) и процесс

метастазирования (E-cadherin, TIMP3) [Jones P.A. et al., 2002]. Изменения

уровня метилирования сайтов 5’-CpG-3’ в разных районах генома клеток, как

правило, возникает в аденокарциномах. В опухолевых клетках

гиперметилирование чаще всего наблюдается в 5’-районе или промоторных

районах генов, которые, в основном, неметилированы в нормальных

соматических клетках [Jones P.A. et al., 2002]. Гиперметилирование ДНК

блокирует процесс транскрипции генов и происходит в районах генома,

кодирующих информацию о дифференциации клеток разных соматических

тканей. Глобальное гипометилирования ДНК возникает в клетках опухоли

молочной железы, рака Wilms и карциномы яичников [Narayan P. et al., 1998;

Qu R. et al., 1999; Jackson J.T. et al., 2004]. Не установлена приоритетная роль и

взаимосвязь гипо- или гиперметилирования генома в инициации канцерогенеза.

Выявлено, что деметилирование и de novo метилирование 5’-CpG-3’

p21.37 КРР MLH1, MMР-система Pendas-Franco N.,

2008

p22 КРР PMS2, MMР-система Mu D., 1997

BAX КРР апоптоз Oltvai Z.N., 2007

15

тандемных повторов ДНК в эмбриональных клетках человека выполняет

функцию эпигенетической репарации [Bird A., 2002], которая исправляет

физиологически некорректное метилирование 5’-CpG-3’ сайтов в промоторах

тумор-супрессорных генов. Таким образом, в глобальной сети репарации ДНК

механизм эпигенетической репарации исправляет ошибки метилирования

генома [Xi Y. et al., 2006]. Гиперметилирование и гипометилирование ДНК в

равной степени связаны с канцерогенезом и являются общим этапом в еще не

изученном процессе эпигенетического изменения метилирования ДНК.

Например, гиперметилирование генов CDH13, CDH1 чаще всего обнаруживают

в клетках рака легкого и молочной железы, простаты, прямой кишки,

щитовидной железы [Nishiyama et al., 2005]. PGR гиперметилируется при раке

молочной железы и эндометрия. Гиперметилирование IGSF4 описано при

опухоли шейки матки и поджелудочной железы.

Семейный аденоматозный полипоз. Мутация в гене АРС (adenomatous

polyposis coli gene) присутствует в геноме клеток больных и обуславливает

100% риск развития КРР в возрасте после 40 лет. Белок, кодируемый геном

АРС участвует в активации онкогенов С-MYC и CDKD1 (циклин-зависимая

киназа D1), экспрессия которых вызывает формирование опухолевого фенотипа

клеток. Развитие процесса канцерогенеза инициируется повреждением

хромосомного веретена в клетках с доминантной мутацией в гене АРС. В

результате нарушения процесса расхождения хромосом возникает хромосомная

нестабильность в виде трисомии. Иногда трисомия возникает в результате

дисфункции теломеры до инициации процесса геномной нестабильности.

Кроме того, повреждение гена CDC4 запускает механизм хромосомной

нестабильности клеток на стадии митоза. Мутации в гене CDC4, обнаруженные

в геноме клеток аденом, вызывают нарушение механизма перехода из фазы G1

в S фазу цикла деления клетки. Сочетания мутаций в генах АРС и CDC4

выявлены в геномах клеток приблизительно 10% больных КРР. Дополнительно,

белок Аpc участвует в WNT сигнальной системе, которая является частью

процесса канцерогенеза при развитии КРР. Конститутивная активация WNT

16

системы стимулирует как транскрипцию онкогена С-MYC, гена CCND1

(кодирует циклин D1), так и процесс пролиферации клеток [Ehrlich M. et al.,

2006]. Альтернативным механизмом инактивации гена АРС является

аномальное метилирование нуклеотидной последовательности генома.

Согласно двухударной гипотезе, в опухолевых клетках один аллель АРС

мутантный, а второй метилированный [Lind G. et al., 2004, 2010].

Метилирование микросателлитной последовательности в гене АРС обычно

обнаруживают в клетках опухоли в стадии В по Dukes. Кроме семейного

аденоматозного полипоза желудочно-кишечного тракта часть случаев

спорадического КРР вызваны инактивацией АРС гена.

Спорадический колоректальный рак. Заболевание развивается в случае

нарушения процесса репарации неправильно спаренных оснований (methyl-

directed mismatch repair, далее MMР-система) и адаптивной репарации (O6-

MGMT) [Halford S. et al., 2005]. Соматические мутации в генах MMR обнаружены

в 17000 случаев спорадического КРР и 10000 случаев опухоли эндометрия,

диагностируемых каждый год в США. Микросателлитную нестабильность ДНК

обнаружили в клетках 20% больных спорадическим КРР. Нарушение

эпигенетического механизма регуляции экспрессии генов, нуклеотидная

последовательность которых содержит тандемные повторы нуклеотидов 5’-

CpG-3’ [Lind G. et al., 2004] вызывает микросателлитную нестабильность.

Нарушение эпигенетического механизма в опухолевых клетках 15% больных

КРР вызывает появление в микросателлитной ДНК вставок или делеций, но не

вызывает изменение количества хромосом. Уровень метилирования и частота

мутаций разные в клетках первичных опухолей, принадлежащих к одному

гистологическому типу. Высокая частота метилирования гена характерна для

диплоидных, но не анеуплоидных опухолей. Уровень микросателлитной

нестабильности в клетках, мутантных по генам MLH1 или MSH2, выше в 100

раз, чем в клетках не дефектных по генам ММР системы [Greenhough A. et al.,

2007]. В клетках спорадического КРР дефицит белка Mlh1, вызванный

гиперметилированием промотора гена MLH1, кроме микросателлитной

17

нестабильности ДНК, вызывает анеплоидность клеток [Feinberg A.P. et al, 2003;

Bird A.P., 2006]. Нарушение процесса метилирования нуклеотидной

последовательности гена INK4A нарушает цикл деления клеток [Mu D. et al.,

2007], ингибирует репарацию ДНК и стимулирует рост неопластических

клеток, опосредованный ингибированием р53-зависимого роста клеток

[Schmiegel W. et al, 2002]. Иммуногистохимический анализ показал, что

нарушение синтеза белков P53 [Gai G. et al., 2008], Apc [Mellon I. et al., 1996],

Mlh1 [Pendas-Franco N. et al., 2008], Bax [Pavelic J. et al., 2007], pl4ARF [Mu D.

et al., 1997], p161NK4a [Worthley D.L. et al., 2007] характерно для

низкодифференцированной аденокарциномы. В клетках небольшой части

спорадических аденом, как правило, микросателлитная нестабильность и

инактивация экспрессии генов MMР системы не сопровождаются мутациями в

гене APC [Young J. et al., 2001].

Неполипозный колоректальный рак и синдром Линча. Наследуются по

аутосомно-доминантному типу [Маев И.В. и др., 2004]. Частота заболеваемости

раком толстой кишки составляет 3.5-6.7% от общего количества заболевания

синдромом Гарднера, или Пейтца-Егерса, или Турко, или семейного

множественного и семейного ювенильного полипоза [Ransonoff D. et al., 1999;

Sack J. et al., 2000]. На долю заболевания приходится примерно 10-15% всех

форм злокачественных опухолей ободочной и прямой кишки [Volk E.E. et al.,

1995; Winawer S.J. et al., 1997; Schmeler K.M. et al., 2003]. Синдром Линча

имеет 2 разновидности. Тип рака «а» возникает только в толстой кишке, а тип

«в» – одновременно могут возникнуть опухоли в эндометрии или желудке, или

в мозгу, или в молочной железе или мочеполовой системе. В 66% случаев

семейный рак возникает по типу «а». Возраст заболевших на 20-30 лет меньше,

чем больных спорадическим КРР. В 56% случаев раковые опухоли

обнаруживаются в проксимальной части толстого кишечника, а при

спорадическом раке в 39% случаев. Зафиксирована пятилетняя выживаемость

58% и 21% больных с новообразованиями «а» и «в» типами соответственно.

18

Заболевание имеет следующие критерии клинического определения

[Lynch H.T. et al., 1998, 2007]:

наличие в семье не менее 3-х родственников 1-й степени родства с

морфологически верифицированным диагнозом рака толстого или тонкого

кишечника, желудка, верхних отделов мочевыделительного тракта, эндометрия,

молочной железы, яичников;

последовательное поражение двух поколений;

выявление колоректального рака в возрасте моложе 50 лет, хотя бы у

одного члена семьи.

Среди членов семьи в возрасте до 70 лет кумулятивный риск развития

рака составляет 91% для мужчин и 69% для женщин [Bartsch H., 2004; Clevers

H., 2004]. Уровень риска заболевания раком толстой кишки среди мужчин в 2

раза выше, чем среди женщин (74% и 30% соответственно). Риск развития рака

эндометрия составляет 42% [Sack J. et al., 2000; Schmeler K.M. et al., 2003].

Фенотип неопластических клеток обусловлен мутациями в генах MSH2,

MLH1 и PMS2 [Fishel R. et al., 2003; Leach F.S. et al., 2004; Bronner C.E. et al,

2004]. Мутации в генах ММР системы вызывают микросателлитную

нестабильность ДНК. Приблизительно 70-85% случаев наследуемого

неполипозного КРР вызвано мутациями в генах MLH1 [Papadopoulos N. et al.,

1994] и MSH2 [Kleczkowska H.E. et al., 2001]. Более низкий риск возникновения

КРР наблюдается в случае мутаций в генах MSH6 и PMS2 [Kleczkowska H.E. et

al., 2001]. Мутации в гене MSH6 в геноме половых клеток регистрируются в

случае наследуемого КРР и рака матки. Обнаружены гомозиготные

рецессивные мутации MLH1 и MSH2 в геномах половых клеток больных КРР и

злокачественными заболеваниями органов кроветворения. Изучение степени

риска заболевания наследуемым КРР на уровне популяции дают завышенные

данные, так как в семьях с наследуемым КРР встречаются менее выраженные

или редко встречаемые фенотипы. В случае синдрома Линча в геномах клеток

кроме мутаций в генах MMР системы присутствуют и другие механизмы

активации канцерогенеза.

19

Наследственные полипозы толстого кишечника являются следствием

герминальных мутаций генов-супрессоров [Гарькавцева Р.Ф. и др., 2000;

Переводчикова Н.И., 2004]. Развитие неоплазии в 95% случаев обусловлено

инактивацией одного аллеля гена АРС в соматических клетках [Bartsch H.,

2004], причем, в 60% случаев возникает рак толстой кишки [Clevers H., 2004], а

в остальных развивается рак молочной железы и желудка [Chapelle A., 2005].

Мутации, располагающиеся между 169 и 1393 кодонами нуклеотидной

последовательности гена АРС [Pages F. et al., 2004], вызывают формирование

фенотипа, так называемого, “коврового” покрытия стенки кишки аденомами.

Синдромы Туркота и Гарднера не имеют различий по клинике изменений в

толстой кишке с вышеописанной картиной семейного аденоматозного

полипоза. Различия лишь в том, что при синдроме Туркота могут быть еще

опухоли мозга, а при синдроме Гарднера большее разнообразие других

новообразований помимо изменений в кишечнике (десмоиды, опухоли

щитовидной железы, надпочечников, печени, желчных протоков). К

наследственным гамартомным полипозам относят также синдром Пейтца-

Джегерса, ювенильный полипоз, множественный синдром гамартом,

нейрофиброматоз.

Некоторые авторы выделяют больных с множественными аденомами (от

10 до 100) в отдельную группу – рассеянный аденоматоз, который клинически

характеризуется более поздним развитием на фоне аденом рака толстой кишки

[Переводчикова Н.И., 2004; Ransonoff D. et al., 1999; Vogel I. et al., 2000; Bartsch

H., 2004; Chapelle A., 2005]. Выявлено, что рассеянная форма СА

ассоциирована с мутациями, располагающимися в 3-4 экзонах 5’-района гена

АРС [Vogel I. et al., 2000]. Рассеянную форму СА классифицируют как

подгруппу синдрома наследственного неполипозного колоректального рака

[Сheng K.C. et al., 2004; Chapelle A., 2005]. Риск развития злокачественных

опухолей в организме больных СА в 18 раз выше общепопуляционного уровня.

К таким первично-множественным злокачественным новообразованиям,

которые локализуются вне толстой кишки, относят рак щитовидной и молочной

20

железы. Профилактическое удаление пораженной аденоматозом толстой кишки

не предотвращает развития злокачественной опухоли в других органах и тканях

[Переводчикова Н.И., 2004].

Частота первично-множественных злокачественных новообразований

(ПМЗН) среди больных ННКРР составляет 17.9%, в которые входят 8.4% –

синхронные и 9.5% – метахронные новообразования [Sack J. et al., 2000;

Scmeler K.M. et al., 2003]. Риск формирования метахронного КРР увеличивается

в 16-19 раз по сравнению с первичным раком толстой кишки [Переводчикова

Н.И., 2004; Пророков В.В. и др., 2004]. Нередко одиночные и множественные

аденомы являются фоновым процессом для появления первично-

множественного рака толстой кишки после удаления первой опухоли из

организма больных ННКРР [Бронштейн А.С. и др., 2001; Коган Е.А., 2002;

Clevers H., 2004]. Риск развития рака толстой кишки повышается с возрастом

пациентов и увеличением количества аденом. Сходство между клиническими

характеристиками метахронного рака толстой кишки и особенностями ННКРР

позволило предположить Ю.М. Тимофееву и др., (2007), что в организме

молодых больных ННКРР проявляется в виде метахронного рака толстой

кишки.

Гиперпластические полипы хуже охарактеризованы, чем аденомы, но

относятся эпидемиологически к КРР. В норме эпителиальные клетки слизистой

мигрируют с поверхности эпителия. В гиперпластических полипах ограничена

миграция эпителиальных клеток, и зрелые клетки остаются в поверхностном

слое эпителия. Причина дефекта механизма миграции эпителиальных клеток

неизвестна. Риск КРР повышается в случае развития гиперпластических

полипов, в ДНК клеток которых присутствует или мутантный ген K-RAS, или

делеция в хромосоме 1р(13) [Gregory S.G. et al., 2006] или мутантный ген TGFβRII

фактора роста RII. В гиперпластичных полипах элонгация процесса

канцерогенеза сопровождается гиперметилированием микросателлитной ДНК

[Woodford-Richens K. L. et al., 2001].

21

1.3 Роль процесса мутагенеза в развитии канцерогенеза

Частота спонтанных мутаций в нормальных соматических клетках

чрезвычайно низка. Злокачественная трансформация происходит в условиях

сочетания ряда генетических изменений, которые характерны для клеток с

мутаторным фенотипом [Барсуков Ю.А., 2006]. Частота возникновения рака в

организме человека значительно выше теоретически ожидаемой, если исходить

из предположения о независимом и случайном возникновении мутаций в

опухолевой клетке. Для объяснения этого противоречия предложена модель,

согласно которой ранним событием канцерогенеза является изменение

нормальной клетки, ведущее к резкому повышению частоты мутаций [Loeb

L.A., 2001]. Формирование мутаторного фенотипа происходит при активации

онкогенов, кодирующих белки, которые участвуют в процессах деления и

дифференцировки клеток. Параллельно происходит инактивация генов-

супрессоров, ответственных за синтез белков, ингибирующих эти процессы и

участвующих в апоптозе. Формирование мутаторного фенотипа

сопровождается нарушением механизма, исправляющего ошибки синтеза или

повреждения ДНК. В норме ДНК-полимераза делает одну ошибку на 104-10

6

встроенных нуклеотидов. Некоторые мутации гена ДНК-полимеразы

повышают мутаторную активность фермента приблизительно в 100 раз.

Эксперименты показали, что экстракты, полученные из суспензий лейкозных

[Loeb L.A., 2006] и лимфомных [Kubota Y. et al., 2005] клеток, стимулируют

включение некомплементарных нуклеотидов при синтезе ДНК, в отличие от

экстрактов из нормальных лимфоцитов. Специфические мутации в

нуклеотидной последовательности гена, кодирующего ДНК-полимеразу,

нарушают корректный синтез ДНК в опухолевых клетках [Loeb L.A., 2006].

Ошибки репликации исправляет ММР система репарации ДНК. Мутации

в генах ММР системы являются причиной появления белков с мутатрной

активностью. Клетки с дефектом ММР системы характеризуются повышенной

22

частотой спонтанных мутаций, так как имеют гипермутаторный фенотип

[Miller J., 2008].

Мутации в генах, кодирующих ферменты репарации или репликации

ДНК, возникают на этапе инициации канцерогенеза [Baylin S.B. et al., 2001].

Продукты генов с мутаторной активностью генерируют вторичные мутации в

разных участках генома и микросателлитную нестабильность [Chapelle A.,

2005; Hellerbrand

C. et al., 2007]. Микросателлитную нестабильность, как

индикатор мутаторного фенотипа и диагностический признак дефекта ММР

системы, используют для идентификации опухолей и линий опухолевых клеток

RER+ и RER– типов (RER или replication errors, англ.) [De la Chapelle A. et al.,

2005]. Микросателлитная нестабильность является результатом нарушения

метаболизма ДНК и является причиной развития опухолей [Drammond J.T. et

al., 2006; Thibodeau S.N. et al., 2003].

В результате дефекта ММР системы происходит накопление мутаций в

генах критических для деления клеток, что является предпосылкой инициации

и элонгации канцерогенеза. Процесс канцерогенеза имеет, по крайней мере,

следующие этапы: гетерозиготные мутации генов ММР вызывают

формирование мутаторного фенотипа соматических клеток; инактивация

аллеля дикого типа способствует появлению мутаторного фенотипа клеток; в

гипермутаторных клетках мутации в онкогенах и генах-супрессорах опухолей

нарушают механизм контроля цикла деления клеток и стимулируют

дальнейшую прогрессию опухоли и ее клональную эволюцию [Wang E., 2010].

Опухолевые клетки часто обладают резистентностью к ДНК-

повреждающим агентам и не чувствительны к цитотоксическому действию

химических соединений. Резистентность клеток может быть специфична к

определенным типам повреждений ДНК, например, к алкилированию

азотистых оснований нитрозогуанидином. Свойством резистентных к

метилированию ДНК клеток является чувствительность к бифункциональным

алкилирующим соединениям, таким как циклофосфамид. Эта

дифференциальная чувствительность опухолей, дефектных по ММР системе,

23

по сравнению с клетками окружающей нормальной ткани предоставляет

реальную возможность эффективной химиотерапии опухолей. Клетки

некоторых опухолей приобретают в процессе химиотерапии неспецифическую

резистентность к лекарственным препаратам различных химических классов.

Повышенная экспрессия нескольких маркеров резистентности может быть

индуцирована хронической интоксикацией при воздействии таких факторов

внешней среды, как ксенобиотики, загрязняющие воздух, воду и т.п. [Volm M.,

1998]. Мутации в генах, контролирующих клеточный цикл и апоптоз, придают

опухолевой клетке резистентность не только к цитостатикам, но и к

рентгенотерапии, так как их терапевтическое действие основано на

повреждении ДНК и индукции апоптоза.

Гомеостаз ДНК включает множество механизмов, управляющих уровнем

мутаций в нормальной клетке. Когда он нарушен в соматической клетке

вследствие повышения частоты повреждений ДНК, либо нарушения репарации,

в геноме накапливаются мутации. Раннее событие в формировании

мутаторного фенотипа – мутация гена одного из ключевых ферментов

репликации или репарации ДНК, которая уменьшает точность или

эффективность этих процессов. С каждым последующим раундом репликации

число мутаций увеличивается, некоторые из них изменяют другие белки

репликации и репарации. Возникает каскад событий, увеличивающий число

мутаций, часть которых детерминирует трансформацию. Присутствие

множества мутаций в опухолевой клетке показывает, что на уровне клетки

трансформация необратима. Все типы неоплазий имеют характерные

клональные хромосомные аномалии [Heim S., 1996]. Сложная паутина

программы развития, общая и сайтспецифическая гипермутабельность

опухоли, канцерогениндуцированные хромосомные аномалии и чисто

стохастические события, случайно придающие селективное преимущество

клеткам, являются предпосылками чрезвычайной поливариантности

трансформации и генетической уникальности каждой опухоли.

24

1.4 Роль иммунной системы в патогенезе опухолевого роста

Современная концепция развитий клеточной неоплазии постулирует

существование трех этапов процесса − 1) инициация (дисплазия), 2) элонгация

(развитие опухоли и процесс метастазирования), 3) терминация (гибель

опухолевой клетки) [Кныш В.И., 2007]. При запуске процессов деления и

развития опухолевых клеток изменяется антигенный состав, в результате чего в

процесс вовлекается иммунная система [Черешнев В.А., Юшков Б.Г., 2001].

Известны такие группы опухолевых антигенов, различающихся по своему

происхождению, как вирус-специфические антигены EBV1, HTLV-I, HBV,

HCV, HSV, которые могут вызывать злокачественную трансформацию клеток;

специфические опухолевые антигены, синтезирующиеся преимущественно в

опухолевой ткани и редко экспрессирующиеся в неизмененных (нормальных)

тканях, за исключением герминогенных (MAGE-2, BAGE, GAGE, RAGE,

LAGE); неоантигены FLICE-3, CDK-4, появляющиеся в результате

соматических мутаций; клеточные белки, контролирующие пролиферацию

опухолевых клеток.

Иммунная система кишечника GALT (gut associated lymphoid tissue)

является автономным образованием и входит в состав лимфоидной ткани,

ассоциированной со слизистыми оболочками органов, находящимися в

контакте с внешней средой, включая респираторный и урогенитальный тракты.

Структурно-функциональная характеристика иммунной системы ЖКТ

представлена в таблица 2.

Таблица 2

Основные компоненты иммунной системы желудочно-кишечного тракта

Тип

лимфоидной

ткани

Компоненты Функции

М-клетки Транспорт антигенов из кишечной трубки

Организо-

ванная

лимфоидная

В-клетки Иммуноглобулин М (IgM) – поверхностно-

несущие клетки, но прекоммитированные к

синтезу IgA.

25

ткань –

пейеровы

бляшки

Т–клетки

(СD4, CD8)

Предшественники клеток памяти, переключа-ют

В-лимфоциты на синтез IgA. Предшествен-ники

Т-цитолитических,Т-супрессоров, обеспечивают

оральную толерантность.

Макрофаги и

дендритные

клетки

Антигенный процессинг и презентация,

продукция лимфокинов IL-1, IL-6 и фактора

TGF-β

Диффузно

расположен-

ные

В–клетки и

плазматичес-

кие клетки

Синтез IgA.

лимфоидные

структуры

Т–клетки

(СD4, CD8)

Хелперы/клетки памяти. Эффекторы цитоли-

тические, межэпителиальные лимфоциты.

(lamina

propria)

Макрофаги Неспецифическая защита (фагоцитоз, продукция

лимфокинов IL-1, IL-6 и фактора TGF-β).

Тучные

клетки

Защита хозяина от паразитов, аллергические

реакции.

Эпителиаль-

ные клетки

Секреторный

компонент

Функция рецептора и транспортного механизма

для IgA.

HLA II класса Презентация антигенов.

В GALT-системе имеется специализированная структура, получившая

название пейеровые бляшки. В пейеровых бляшках находится субпопуляция

лимфоцитов, синтезирующих преимущественно иммуноглобулин А (IgA), и

инициируется иммунный ответ на действие опухолевых антигенов. Эта

лимфоидная ткань содержит 50-60% всех лимфоцитов тела человека, диффузно

распределенных в lamina propria эпителия слизистой оболочки толстой кишки.

Кроме популяции лимфоцитов, ткань содержит плазматические клетки,

фагоциты. Агрегаты лимфоидной ткани или лимфоидные фолликулы в

пейеровых бляшках, аппендиксе и мезентеральных лимфатических узлах

являются основными компонентами иммунной системы желудочно-кишечного

тракта [Бурмистрова А.Л., 1997; Вашкамадзе Л.А. и др., 1999].

Е.Е. Самотыя с соавт. (2007) установили взаимосвязь HLA-антигенов с

функциональным состоянием иммунной системы и предрасположенностью

больных КРР к полинеоплазиям. В частности, антиген HLA-B5 является

генетическим маркером предрасположенности больных к первичным

множественным опухолям. В результате исследований О.Е. Молчановым (2007)

26

выявлено, что в организме онкологических больных нарушается функция

клеточного звена иммунной системы, а гуморальное звено функционирует

нормально. По мере прогрессирования опухолевого процесса снижается

экспрессия белков комплекса гистосовместимости класса I вплоть до полной их

потери, и тогда основную роль в реализации противоопухолевого потенциала

играют натуральные киллеры (СD16 – клетки), которые осуществляют

антигензависимый лизис клеток. Основную роль в реализации

противоопухолевого ответа иммунной системы играют тумориндуцированные

лимфоциты (TIL–лимфоциты), инфильтрирующие опухоль. При

прогрессировании заболевания число TIL–лимфоцитов резко снижается [Ceelen

W.P. et al., 2009]. Степень инфильтрации метастатических узлов TIL–

лимфоцитами значительно ниже, чем первичной опухоли, и в их составе не

присутствуют клеточные элементы иммунной системы [Ceelen W.P. et al.,

2009].

Факторы TGF-β и IL-10, выделяемые опухолью, вызывают резкое

усиление гуморального иммунного звена, что приводит к снижению реакции

гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) Т-клеток. Преобладание

гуморального компонента иммунной системы и TIL–лимфоцитов в

периферической крови онкологических больных вызывает повышение

концентрации противоопухолевых антител, которые не выполняют

протективную функцию, а «экранируют» опухолевые клетки от действия

факторов клеточного иммунитета. Функция TIL-лимфоцитов изменяется, и

вызывают рост опухоли [Яицкий Н.А. и др., 2002; Ceelen W.P. et al., 2009]. В

ряде случаев эти клетки секретируют сосудисто-эндотелиальный фактор роста

(VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и интерлейкин-8 (IL-8), которые

обладают ангиогенными свойствами и способствуют развитию опухоли [Ceelen

W.P. et al., 2009].

27

1.5 Патогенетические методы лечения колоректального рака

Современными доминирующими подходами лечения новообразований в

толстом кишечнике являются хирургическое, лекарственное и лучевое

воздействие, причем хирургический метод используют в лечения 72.3% КРР

[Бронштейн А.С. и др., 2001].

Хирургические методы лечения

Хирургическая операция на длительный срок излечивает больного с

начальной стадией заболевания [Воробьев Г.И. и др., 1998; Воробьев Г.И. и др.,

2005; Барсуков Ю.А. и др., 2006]. Хирургические методы лечения рака

ободочной кишки заключаются в следующем: правостороннюю

гемиколэктомию выполняют при раке правых отделов ободочной кишки

[Воробьев Г.И. и др., 1998]; сегментарную резекцию с перевязкой и

лигированием средней ободочнокишечной артерии и вены проводят при

локализации опухоли в средней трети поперечной ободочной кишки.

Противником такого объема хирургического вмешательства при раке средней

трети поперечной ободочной кишки является Л.И. Снешко (1998), который

предполагает, что при такой локализации опухоли не всегда можно заранее

определить направление тока лимфы. Не так часто, но встречается

ретроградное метастазирование с поражением лимфатических узлов,

расположенных вдоль правой ветви средней ободочно-кишечной артерии и

вдоль ветвей правой ободочно-кишечной артерии. Поскольку нельзя исключить

возможность такого атипичного метастазирования, необходимо выполнить

тщательную ревизию зон возможного метастазирования до принятия решения

об объеме оперативного вмешательства и адекватной лимфодиссекции [Ветшев

П.С. и др., 2005].

При опухолевом поражении левой половины ободочной кишки

оперативное вмешательство в объеме левосторонней гемиколэктомии или

сегментарной резекции сигмовидной кишки с формированием первичного

28

толстокишечного анастомоза показано при компенсированной и

субкомпенсированной формах обтурационной кишечной непроходимости.

Расширение показаний к формированию первичного анастомоза при

декомпенсированной форме кишечной непроходимости, а также при

опухолевом процессе, осложненном перифокальным воспалением и

внутриопухолевым воспалительным процессом, возможно (при отсутствии

некорригируемых метаболических нарушений) за счет расширения объема

оперативного вмешательства до тотальной или субтотальной гемиколэктомии с

формированием илео- или цекосигмоанастомоза, а также выполнение операции

Лахея. Подобные оперативные вмешательства отвечают всем требованиям

онкологического радикализма [Воробьев Г.И. и др., 1998; Billingham B.P.,

2004].

Отдаленные результаты хирургического лечения за последние 15 лет

существенно не изменились, 5-летняя выживаемость составляет 30-70 %

[Воробьев Г.И. и др., 1998; Вашкамадзе Л.А. и др., 1999; Моисеенко В.М. и др.,

2001; Барсуков Ю.А. и др., 2006]. При этом главными причинами смерти

являются диссеминация процесса и рецидивы опухоли, возникающие в течение

двух лет после операции. Практически половина всех, казалось бы,

своевременно оперированных больных, умирает в пятилетний период после

операции. В 20-40% случаев развиваются отдаленные метастазы, которые чаще

выявляют в печени [Переводчикова Н.И., 2001].

Неудовлетворенность результатами лечения распространенных форм

колоректального рака привела к появлению более активной тактики в хирургии

рака ободочной кишки с отдаленными метастазами. Основными являются

циторедуктивные операции, которые направлены на максимально возможное

уменьшение массы опухоли [Fong Y. et al., 1995; Guillem J.G. et al., 1997;

Glehen O. et al., 2004]. При этом предполагают удаление, не только первичной

опухоли ободочной кишки, но и вмешательство по поводу отдаленных

метастазов. Цель операций заключается в достижении оптимальной

циторедукции и в создании благоприятного фона для последующей

29

противоопухолевой лекарственной терапии, эффективность которой зависит от

массы опухоли, оставшейся в организме больного после оперативного

вмешательства [Яицкий Н.А. и др., 2002; Царьков П.В. и др., 2004; Scharg D.,

Weeks J., 1999; Billingham B.P., 2004].

Адъювантная химиотерапия

Новым направлением в лечение КРР является адъювантная химиотерапия

[Тюляндин С.А., 2001; Carmichael J. et al., 2000; Douillard J.U. et al., 2005]. Цель

адъювантной терапии КРР, включающей такие методы, как химиотерапия,

лучевая терапия и иммунотерапия, состоит в увеличении продолжительности

жизни и в снижении риска рецидивов опухолевого процесса [Douillard J.U. et

al., 2005]. Сформулированы пять принципов адъювантной терапии [Macdonald

J.S., 1999; Gerrit-Jan Liefers M.D. et al., 2003]:

воздействие на скрытые, не выявленные злокачественные клетки в

кровеносном и лимфатическом русле или интраперитонеально (расположенные

на брюшине), а также верифицированные микроскопические очаги, как возле

первичной опухоли, так и в отдаленных областях;

наибольшая эффективность терапии при минимальной степени ее

агрессивности и оптимальной цитокинетике;

применение средств и способов с подтвержденной эффективной

противоопухолевой активностью;

назначение максимально переносимых доз, которые определяют

цитотоксический эффект терапии;

продолжительность проведения терапии должна определяться

достижением эрадикации злокачественных клеток;

выбор оптимального соотношения риска и эффекта терапии, чтобы не

вызывать ухудшение качества жизни больных после оперативных

вмешательств.

Интенсификация работы по созданию препаратов противоопухолевого

действия в 90-х годах XX века обусловлена прогрессом исследований в

30

молекулярной биологии, которые позволили понять ряд закономерностей

канцерогенеза [Барсуков Ю.А. и др., 2006]. На рубеже XX и XXI веков созданы

первые противоопухолевые препараты, мишенями которых являются

рецепторы факторов роста опухоли, механизмы передачи ростового сигнала,

механизмы апоптоза и неоангиогенеза. Усовершенствование методов и правил

клинических испытаний на основе принципов доказательной медицины, и

организация международных мультицентровых рандомизированных

исследований не только ускорили получение объективной оценки

эффективности новых лекарственных средств и терапевтических режимов, но и

их практическое применение.

Последние 15 лет в практике используют новые, эффективные

противоопухолевые препараты как широкого, так и узкого спектров действия.

К препаратам широкого спектра действия относятся таксаны (паклитаксел и

доцетаксел), ингибиторы топоизомеразы-I (иринотекан и топотекан),

производные платины (карбоплатин и оксалиплатин), винкаалкалоиды

(винорельбин), антиметаболиты (гемцитабин, пеметрексид, капецитабин).

Препаратами узкого спектра действия являются флударабин, пентостатин,

кладрибин, араноза, фотемустин, темозоломид, и такие гормональные

препараты, как летрозол, анастрозол, экземестан, которые представляют третье

поколение ингибиторов ароматазы. Эти противоопухолевые препараты

ингибируют синтез или функции РНК, ДНК и клеточных белков, вызывая

гибель опухолевой клетки. Они составляют основу арсенала

противоопухолевых средств, используемых в современной клинической

химиотерапии, вместе с такими препаратами, не потерявшими своего значения,

как алкилирующие соединения, антрациклины, антифолаты, антагонисты

пиримидинов и пуринов, гормональные препараты (антиэстрогены,

антиандрогены, агонисты RH-LH). В клинической практике широко

используют препараты группы модификаторов биологических реакций такие,

как цитокины (интерфероны и интерлейкины), применяют неспецифические

иммуномодуляторы, а также бисфосфонаты. Последние не обладая

31

цитотоксической активностью, но ингибируют резорбцию костной ткани и

метастазы в костях.

Примерами молекулярно-нацеленных или «таргентных» препаратов,

являются моноклональные антитела (МКА) к рецепторам эпидермального

фактора роста (трастузумаб или герцептин – МКА к HER-2/neu и цетуксимаб

(эрбитукса) или эрбитукс – МКА к HER-1), малые молекулы-блокаторы

тирозинкиназ EGFR – гефитиниб (иресса) и эрлотиниб (тарцева), ингибиторы

тирозинкиназы – с-KIT, ABL-киназа. Иматиниб мезилат (гливек), как

ингибитор рецептора тромбоцитарного фактора роста, принципиально изменил

терапию миелолейкоза и гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST).

Бевацизумаб (авастин) является моноклональным антителом к рецептору

VEGF фактора роста сосудистого эндотелия, подавляет рост опухолей

колоректального рака, немелкоклеточного рака легкого. Полусинтетическое

производное камптотецина, получившее название иринотекан (кампто),

специфически ингибирует активность топоизомеразы-I [Wolmark N. et al., 1999;

Twelves C. et al., 2005]. Продуктом метаболизма иринотекана является

соединение, получившее название SN-38, противоопухолевая активность

которого значительно выше, чем активность иринотекана. Иринотекан и его

метаболит блокируют разрушение комплекса топоизомеразы-I с ДНК,

препятствуя элонгации процесса репликации ДНК. Бевацизумаб в комбинации

с иринотеканом и 5-фторурацилом применяют в терапевтическом лечении

больных с диссеминированным процессом.

Цетуксимаб является химерным моноклональным антителом. Препарат

использую в терапевтическом лечении больных раком толстой и прямой кишки

при резистентности опухолевых клеток к комбинациям химиопрепаратов с

иринотеканом или оксалиплатином. Противоопухолевые препараты в

комбинации с бевацизумабом или цетуксимабом повышают эффективность

лечения КРР и ингибируют развитие метастазов. Монотерапия цетуксимабом

или терапия цетуксимабом в комбинации с иринотеканом соответственно

имеют 11% или 23% терапевтической эффективности, а медианы времени без

32

прогрессирования составляет 1.5 и 4 мес. Комбинированный режим

применения цетуксимаба и бевацизумаба имеет 23% эффективности лечения и

медиану времени без прогрессирования заболевания до 6.9 мес [Переводчикова

Н.И., 2004]. Комбинация препаратов цетуксимаб, иринотекан и бевацизумаб

имеет 38% терапевтической эффективности и медиану времени 8.6 мес.

выживаемости без прогрессирования заболевания.

Производные фторпиримидинов, в первую очередь 5-фторурацил, в

течение длительного времени остававшийся основой противоопухолевой

химиотерапии КРР, не потеряли своего значения и в наши дни. Механизм

действия 5-ФУ обусловлен превращением препарата в тканях в активный

метаболит фторуридинмонофосфат, который является конкурентным

ингибитором фермента тимидилатсинтетазы, принимающего участие в синтезе

нуклеиновых кислот. Поступая в клетку, 5-ФУ нарушает синтез ДНК, вызывает

образование структурно несовершенной РНК, угнетает деление опухолевых

клеток [Wolmark N. et al., 2006]. Адъювантная химиотерапия 5-фторурацилом

(5-ФУ) и лейковорином (ЛВ) пациентов с операбельным раком ободочной

кишки III стадии снижает на 41% риск рецидивов рака в течение трех лет после

операции и повышает выживаемость больных на 33% [Andre T. et al., 2000;

Saini A. et al., 2000; Schoenfeld P. et al., 2004; Saltz L.B. et al., 2006]. Применение

препарата в течение 6 месяцев после операции с регионарным

метастазированием снижает относительный риск рецидива заболевания на 35%,

улучшает пятилетнюю выживаемость больных КРР на 11% [Mamounas E. et al.,

1999; Poplin E. et al., 2000]. Применение 5-ФУ в комбинации с α-интерфероном

или интерлейкином-2 оказывает иммуномодулирующее действие, так как в

присутствии иммунопрепаратов увеличивается синтез 5-

фтордезоксиуридинмонофосфата [Семенов Н.Н., 2005; Таразов П.Г., 2005].

Появились новые препараты класса фторпиримидинов, в частности,

селективно активируемый опухолью препарат капецитабин (кселода). После

метаболической активации в печени капецитабин превращается в 5-ФУ только

в клетках злокачественной опухоли под влиянием фермента

33

тимидинфосфорилазы, которая, участвует в регуляции пролиферации

опухолевых клеток, стимулирует ангиогенез (образование сосудов) в ткани

опухоли [Семенов Н.Н., 2005; Таразов П.Г., 2005].

Лечебные схемы, применения иринотекана в комплексе с производными

фторпиримидина, обладают противоопухолевой активностью в 50-60% случаев

заболевания КРР. Последовательное применение этих препаратов позволяет

увеличить медиану выживаемости больных метастатическим КРР до 20 мес.

При симптоматической терапии выживаемости больных составляет 8 мес., а

при использовании фторпроизводных пиримидина выживаемость больных

достигает 11.7 мес. [Mitchell E. et al., 1999; Wolmark N. et al., 1999; Hoff P.M. et

al., 2000; Twelves C. et al., 2005]. В рандомизированном исследовании

комбинация IFL (иринотекан, 5-ФУ, лейковорин) эффективна при лечении 35%

больных КРР [Семенов Н.Н., 2005]. Эта комбинация препаратов в сочетании с

бевацизумабом оказалась эффективной при лечении 45% больных КРР.

Медиана выживаемости больных КРР увеличивается от 15.6 до 20.3 месяцев, а

медиана без прогрессирования заболевания увеличивается от 6.2 до 10.6

месяцев. Адъювантная химиотерапия различными вариантами комбинации 5-

ФУ и лейковорина в течение 6 месяцев после операции по поводу рака

ободочной кишки с регионарными метастазами (Nх) снижает относительный

риск рецидива заболевания на 35%, улучшая абсолютную 5-летнюю

выживаемость на 11%.

Производное платины третьего поколения или оксалиплатин (элоксатин)

является противоопухолевым препаратом активным в терапии КРР.

Водорастворимое комплексное соединение оксалиплатин содержит атом

платины, который ковалентно связан с оксалатом и 1,2-диаминоциклогексаном.

Производные платины вызывают образование межнитевых сшивок в ДНК,

которые блокируют процессы рекомбинации, репликации и репарации ДНК,

вызывая гибель клетки в любой фазе цикла клеточного деления [Wolmark N. et

al., 1999; Twelves C. et al., 2005]. Комбинации оксалиплатина с производными

фторпиримидина (FOLFOX, FOLFIRI, XELOX) обладают 50-60%

34

терапевтическим противоопухолевым эффектом, а последовательное их

применение увеличивает медиану выживаемости больных метастатическим

КРР до 20 месяцев. Использование этих комбинаций химиопрепаратов в

симптоматической терапии увеличивает в 1.5 раза медиану выживаемости

больных метастатическим КРР, по сравнению с медианой выживаемости

больных получивших лечение только фторпроизводными пиримидина.

Международное рандомизированное исследование 2246 больных раком

ободочной кишки II-III стадий (MOSAIC) показало, что результаты

послеоперационной адъювантной химиотерапии в режиме FOLFOX4

превосходят результаты стандартной адъювантной химиотерапии 5-ФУ и

лейковорином [Twelves C. et al., 2007]. Доказательством эффективности

лечения является показатель 3-летней безрецидивной выживаемости и

снижение на 23% вероятного риска рецидива заболевания. Дополнительный

анализ показал, что преимущество FOLFOX4 достоверно для больных с III

стадией заболевания, 3-летняя безрецидивная выживаемость которых составила

72.2%, а показатель относительного риска равен 0.76 (ДИ – 0.62-0.92).

Ралтитрексед (томудекс) является прямым специфическим ингибитором

тимидилатсинтетазы [Семенов Н.Н., 2005; Таразов П.Г., 2005; Valentini V. et al.,

1999]. Противоопухолевая активность томудекса при метастазах

колоректального рака установлена в завершенных клинических исследованиях,

проведенных в США и европейских странах. Препарат проникает в опухолевую

клетку с помощью фолиполиглютаматсинтетазы, которая инициирует реакцию

полиглютамации [Valentini V. et al., 1999]. Затем препарат избирательно

блокирует тимидилатсинтетазу [Rougier P., 2001], вызывая инактивацию

фолатной транспортной системы мембраны опухолевой клетки.

Пролонгированная противоопухолевая активность препарата объясняется

действием таких его метаболитов, как полиглутаматные комплексы, которые

длительное время остаются в клетке [Valentini V. et al., 1999]. Применение

этого лекарственного средства эффективно в монотерапии и в комбинации с

другими препаратами противоопухолевыми препаратами [Twelves C. et al.,

35

2005]. Результаты исследований свидетельствую о том, что включение

бевацизумаба и цетуксимаба в состав лекарственных комбинаций с томудексом

повышает эффективность химиотерапии метастатического типа КРР.

В настоящее время признано, что при многих солидных опухолях

достижение длительного контроля над болезнью и сохранение

удовлетворительного качества жизни являются оправданной целью проведения

противоопухолевой терапии. Появление и внедрение в клиническую практику

препаратов таргентной группы позволили максимально приблизиться к

достижению этой цели. Большинство препаратов этой группы не обладают

цитотоксическим эффектом, характерным для «классических» цитостатиков,

однако, влияя на заранее определенные жизненно важные для опухоли

механизмы, приводит к торможению ее роста. Несмотря на трудности

достижения объективных противоопухолевых эффектов, таргентные препараты

сдерживают прогрессирование заболевания, а в комбинации с цитотоксической

терапией потенцируют их действие, не усугубляя токсичность

противоопухолевой химиотерапии. Благодаря отсутствию цитотоксичности

таргентных препаратов отсутствуют многие побочные эффекты, характерные

для химиотерапии, что позволяет использовать их длительно, контролируя

развитие опухолевого процесса.

Лучевая терапия рака

Целесообразность лучевой терапии КРР практически не обсуждалась в

специальной литературе последние 20 лет. В отдельных работах [Одарюк Т.С. и

др., 2004; Hoskins R.B. et al., 2005] описана предоперационная лучевая терапия

в качестве первого этапа лечения нерезектабельных опухолей ободочной

кишки. Большинство работ посвящено лучевой терапии рака прямой кишки и

дистальной трети сигмовидной кишки [Withers H.R. et al., 2000; Bosset J.F. et

al., 2006; Braendengen M. et al., 2008; Cellen W.P. et al., 2009].

С 2006 г. в РОНЦ имени Н.Н. Блохина лучевую терапию используют в

предоперационном периоде, в режимах среднего фракционирования до

36

суммарной общей дозы (СОД) 20 Гр, дробно-протяжным методом до СОД 36-

40 Гр. Послеоперационное облучение проводят до СОД 25 Гр. Лучевую

терапию осуществляют преимущественно на линейных ускорителях с энергией

фотонного излучения 6-18 МЭВ с использованием многопольного, как правило,

четырехпольного облучения.

С целью повышения эффективности лучевого воздействия на опухоль

применяют радиомодификатор чувствительности клеток опухоли, в качестве

которого используют локальную СВЧ-гипертермию, которую осуществляют на

аппаратах «Яхта-4» (для внутриполостного прогревания) и «Яхта-5» (для

наружного прогревания). Гипертермический эффект вызывает СВЧ-излучение с

длиной радиоволн 69 см и частотой электромагнитных колебаний 433 МГц.

Опухоль прогревают до температуры 42.5-43.00С в течение 60 минут.

Представленные схемы лечения увеличивают безрецидивную выживаемость на

45% [Давыдов М.И. и др., 2006].

* * *

В последние десятилетия хирургическое и лекарственное лечение (химио-

и иммунотерапия), существенно изменили представление о заболевании.

Перспективным является использование иммунотерапии (моноклональные

антитела) при КРР. Молекулярно-биологические исследования позволяют

определять новые мишени для терапии КРР препаратами, созданными на

основе моноклональных антител. Важным моментом лечения КРР является не

только уничтожение опухолевых клеток, но и предотвращение возможных

отдаленных последствий активации программы клеточной гибели.

Целесообразность использования таргентных препаратов определяется

наличием специфической мишени, т.е. соответствующих молекулярно-

генетических характеристик опухоли больного, однако, сам по себе этот фактор

еще не определяет эффективность терапии, и проблема правильного

позиционирования таргентной терапии в современной комбинированной

химиотерапии опухолевых заболеваний составляет предмет дальнейших

исследований. Патогенетически обоснованное применение таргентных

37

лекарственных средств становится важнейшим составным элементом

современной комбинированной химиотерапии опухолей.

В свете вышеизложенного особое значение приобретают критерии

выбора терапевтической тактики, оценки факторов, позволяющих предсказать

возможный ответ на применение конкретного препарата и его переносимость. С

этой точки зрения особенный интерес привлекают к себе исследования по

оценке маркеров, изучению особенностей метаболизма и генетической

характеристики опухоли, открывающие возможность индивидуализации

терапевтического режима для каждого больного.

38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Организация исследования

На первом этапе работы оценивали заболеваемость колоректальным

раком населения Пермского региона, для чего был проведен анализ архивных

данных годовых отчетов Краевого онкологического диспансера за 8 лет (1999 -

2006 гг.).

На втором этапы работы было проведено обследование 108 больных с

неопластическим поражением толстого кишечника в возрасте от 28 до 78 лет

(средний возраст 57.72±9.4 лет), проживающих в Пермском регионе и в г.

Москве. Мужчин было 56 (51.9%), женщин – 52 (48.1%).

При поступлении на стационарное лечение всем больным проводилось

анкетирование. Анкета была разработана нами на основании опросника

проктологического больного [Блинов Н.Н. и др., 1994]. Дополнительно в анкету

включили вопросы об уточнении наиболее важных, согласно литературным

данным, факторов риска развития КРР.

Клиническое обследование проводили согласно диагностической

программе, разработанной для больных бластомами ободочной и прямой

кишки, представленной в «Методических указаниях Министерства

здравоохранения Российской федерации № 2001\128 от 26.07.2001г,

разработанных в МНИОИ им. П.А. Герцена». Больным проводили

лабораторные (общий анализ крови, коагулограмма, биохимический анализ

крови, кал на скрытую кровь − проба Вебера), и инструментальные

исследования (ректороманоскопия, колоноскопия, ирригоскопия и

ирригография, трансабдоминальная и эндоректальная эхография),

иммунохимический анализ уровней опухолевых маркеров.

После установления клинического диагноза всем пациентам с

образованиями толстого кишечника выполнялись хирургические

вмешательства: при КРР − различные варианты резекций толстой кишки с

39

формированием плоской забрюшинной колостомы, при полипах −

эндоскопическая эксцизия.

Химиотерапевтическое лечение состояло из пяти курсов в режиме Мейо

(5-фторурацил – 425 мг/м2 и лейковорин – 20 мг/ м

2 в течение 5 дней, каждые 4-

5 недель).

Химиолучевое лечение заключалось в сочетании химиотерапии и

дистанционной мегавольтной γ-терапии прямой кишки и клетчатки малого таза

с использованием аппаратов «РОКУС-АМ» (Россия) и «АГАТ-РМ» (Россия) в

режиме классического фракционирования (разовая очаговая доза 2-2.5 Гр,

суммарная 40-50 Гр).

Больные КРР находились под наблюдением в течение 5 лет после

выписки из стационара. Больным, которые получали только хирургическое

лечение, комплексное обследование проводили 1 раз в 6 месяцев на

протяжении 5 лет. Курсы системной химиотерапии проводили в стационаре

первые полгода ежемесячно после операции. Комплексное клинико-

инструментальное обследование в стационаре проводили каждые 3 месяца в

течение 5 лет.

2.2 Группы обследуемых больных

Все больные были разделены на 2 группы.

1 группу составили больные КРР – 68 человек, которые в зависимости от

вида лечения разделены на 2 подгруппы:

1а – больные, получавшие только хирургическое лечение, − 30

человек;

1б − больные, получавшие комбинированное лечение, – 38 человек,

из них хирургическое и последующее химиотерапевтическое лечение − 34

человека, хирургическое и последующее химиолучевое – 4 человека.

40

2-ю группу составили больные доброкачественными новообразованиями

толстого кишечника – 40 человек (аденомы – 32, гиперпластические полипы –

8).

Больные первой группы (КРР) получили лечение в Областном

онкологическом диспансере и Краевой клинической больнице г. Перми в 2001-

2007 гг. В послеоперационном периоде пациентам проводили дистанционную

мегавольтную γ-терапию прямой кишки и клетчатки малого таза

(параректальная и лимфатические пути до уровня отхождения верхней

прямокишечной артерии от нижней брыжеечной). Послеоперационное

облучение выполняли на аппаратах «РОКУС-АМ» (Россия) и «АГАТ-РМ»

(Россия) в режиме классического фракционирования, разовая очаговая доза 2-

2.5 Гр, суммарная очаговая доза 40-50 Гр. Проведено 5 курсов химиотерапии в

режиме Мейо (5-фторурацил – 425 мг/м2 и лейковорин 20 мг/м

2 в течение 5-и

дней, каждые 4-5 недель).

Больные второй группы с доброкачественными новообразованиями

(аденоматозные полипы и ворсинчатые опухоли) проходили лечение в

Клинической больнице Управления Делами Президента Российской Федерации

(Москва) в течение 2007 г.

После выписки все пациенты находились под диспансерным

наблюдением, которое заключалось в ежемесячных осмотрах в первые полгода

после операции. Осмотры соответствовали срокам госпитализации с целью

проведения курсов системной химиотерапии. Каждые 3 месяца пациентов

обследовали в период с 6-го по 24-й месяц после операции. Комплексное

обследование проводили 1 раз в год в течение 5 лет после операции, в него

входили клинические, инструментальные и лабораторные исследования. При

оценке отдаленных результатов лечения учитывали следующие показатели:

выживаемость, средняя продолжительность жизни, число местных рецидивов и

отдаленных метастазов, длительность безрецидивного периода.

41

2.3 Методы диагностики

Диагностическая программа больных раком ободочной и прямой кишки

рассчитана на выявление локализации и степени распространения опухоли.

Работу выполняли согласно алгоритмам, представленным в «Методических

указаниях Министерства здравоохранения Российской федерации № 2001\128

от 26.07.2001 г., разработанных в МНИОИ им. П.А. Герцена». В задачи

диагностики входило выявление и определение выраженности осложнений

опухолевого процесса и наличие сопутствующих заболеваний.

Диагностическая программа включает:

определение клинической картины заболевания;

проведение лабораторных, иммунологических исследований;

проведение интраоперационных цитологических и морфологических

исследований;

исследования с помощью эндоскопических методов (колоноскопия,

гастроскопия);

проведение ультрасонографии, в том числе интраоперационной;

выполнение компьютерной томографии;

рентгенологические исследования: ирригоскопия, рентгенография

органов грудной клетки;

консультации терапевта и врачей других специальностей (при наличии

показаний).

2.3.1 Анкетирование

В работе использован анкетно-опросный метод. Преимущество

предложенной анкеты заключается в том, что ее применение помогает

систематизировать данные анамнеза в соответствии с критериями повышенного

риска заболевания, а также стандартизировать начальный этап лабораторно-

42

инструметального обследования больных. Основой анкеты является схема

опроса больных, предложенная Н.Н. Блиновым, А.Г. Весниным, Ю.Г.

Пучковым (1994), дополненная вопросами актуальными не только для

Пермского региона (прил. 1). Такие дополнения помогли более тщательно

собрать анамнез заболевания, позволили определить время и

последовательность возникновения жалоб, их длительность.

2.3.2 Клиническое обследование больных

Обследование состояло из общего осмотра пациента, оценки состояния

различных групп лимфатических узлов, перкуссии, пальпации, аускультации,

как грудной клетки, так и живота. Особое внимание обращали на присутствие

пальпируемого через переднюю брюшную стенку новообразования, его

локализацию, размеры и подвижность. Затем женщинам выполняли

бимануальное, а всем пациентам пальцевое ректальное исследование в колено-

локтевом положении на гинекологическом кресле и ректороманоскопию

аппаратом фирмы «Шторц» (Германия), которая заключалась в осмотре прямой

и дистальной трети сигмовидной кишки. Методом ректороманоскопии уточняли

высоту расположения опухоли, распространение по периметру кишки, забирали

материал для цитологического или гистологического исследования.

Оценка общего состояние пациентов и распространенность опухолевого

процесса. Лабораторные исследования крови и мочи выполнены в клинико-

биохимической лаборатории. Основная цель исследований заключалась в

оценке нарушений физиологических обменных процессов, состояние белкового

и водно-электролитного баланса до и после операции.

2.3.3 Инструментальное обследование больных

Колоноскопию толстой и подвздошной кишки, зоны анастомозов

проводили ротационным способом, разработанным В.П. Стрекаловским

43

[Бронштейн А.С. и др., 2001]. В работе использовали такие модели

колоноскопов «Olimpus», как CF-40L, XCF-230LY и CF-Q-160AL (Япония),

которые позволяют полностью осмотреть толстую и подвздошную кишки.

Исследование толстой кишки пациента готовили, учитывая его общее

состояние, степень сужения просвета кишки, выраженность нарушений

кишечной проходимости. Схемы подготовки больных включали прием

слабительных, лаваж препаратом фортранс, постановку очистительных клизм.

На этапе эндоскопического исследования выполнена множественная биопсия.

При помощи лапароскопического источника света и диафаноскопии

определяли локализацию опухоли в прямой кишке со стороны брюшной

полости [Воробьев Г.И. и др., 2005].

Колоноскопию при динамическом наблюдении оперированных больных

колоректальным раком проводили через 3, 6, 12 месяцев и затем ежегодно

после хирургического лечения. С помощью гастроскопии выявляли

сопутствующие заболевания пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки.

Интраоперационной колоноскопией уточняли локализации опухолей

небольших размеров и границы резекции кишки больных.

Эндоскопически удаляли полипы с помощью колоноскопа «Olympus» CF-

40L, XCF-230LY, CF-Q-160AL (Япония) с одним или двумя

инструментальными каналами, а также используя ректоскопы

«Красногвардеец» (Россия) и «Richard Wolf» (Германия) с применением петель,

щипцов и электрохирургических аппаратов PDS «Olympus» и «ЭС-100»

(Россия).

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости проводили с

помощью приборов «ССД-630» и «ССД-500», «ALOKA» (Япония).

Вагинальное ультразвуковое обследование женщин осуществляли при помощи

конвексного датчика с частотой 3.5 МГц. Оценивали характер

метастатического поражения печени, размер, число и локализацию метастазов.

Эндоректальным ультразвуковым исследованием регистрировали изменения в

44

кишечной стенке, утолщение стенки, протяженность новообразования,

вовлечение в опухолевый процесс соседних органов и тканей.

Мониторинг эффективности лечения больных, при помощи

ультрасонографии, проводили 1 раза в течение 3 месяцев, а в дальнейшем не

реже 1 раза в течение 6 месяцев в первый год после операции по поводу рака

ободочной и прямой кишки. Критериями оценки эффективности

противоопухолевого лекарственного лечения являлись рецидивы заболевания,

формирование так называемых «считываемых очагов» в виде метастазов в

печени и в парааортальных лимфатических узлах. При выявлении метастазов в

печени выполняли рентгеновскую компьютерную томографию.

Рентгенологические исследования органов грудной клетки, проводили с

целью выявления возможного метастатического поражения легких, наличия

метастазов в лимфатических узлах средостения брюшной полости.

Рентгенологические исследования толстой кишки проводили с помощью

контрастной бариевой клизмы. Ирригоскопию выполняли на аппарате «EDR-

750B» под контролем видеотелевидения. Этим методом оценивали состояние

наружной и внутренней стенок толстой кишки, степень распространения

опухоли в ободочной кишке, наличие разного рода деформаций. При

ирригоскопии применяли классическую триаду: 1 – тугое наполнение; 2 –

изучение рельефа (полное опорожнение); 3 – двойное контрастирование.

Рентгенологический контроль проводили в течение 6 – 12 месяцев после

операции и далее каждые полгода.

2.3.4 Иммунохимический анализ опухолевых маркеров

Цельную венозную кровь (5 мл) центрифугировали в течение 15 мин. при

1000 об/мин. Аликвоты сыворотки объемом 1 мл замораживали, хранили при

температуре −350С [Назаренко Г.И. и др., 2000]. Метод

электрохемолюминесценции выполнен на автоматическом комплексе «Elecsys

2010» («Roche», Швейцария) при помощи тест-систем «Roche». Количество

45

онкомаркеров в образцах определяли по калибровочной кривой, построенной

через контрольные точки, и по эталонной кривой, полученной с помощью

штрихового кода реактива. Диапазон измерений РЭА составлял 0.2-1000 нг/мл,

АФП – 0.604-1210 нг/мл, СА 19-9 – 0.500-1000 МЕ/мл. Нормальные показатели

онкомаркеров при использовании этих тест-систем: РЭА – 0-2.5 нг/мл, АФП –

0-13.0 нг/мл, СА 19-9 – 0-30.0 МЕ/мл.

2.3.5 Морфологические исследования

Работа выполнена в патоморфологической лаборатории под

руководством к.м.н. Е.С. Патлусовой. Биоптаты, препараты толстой кишки,

взятые во время эндоскопического исследования или интраоперационный

материал кишечной стенки с опухолевой тканью от слизистой до серозной

оболочки, непосредственно после резекции фиксировали в 15% формалине. С

целью оценки глубины инвазии опухолевых клеток отбирали участки опухоли

и окружающей, внешне неизменной ткани, а для выяснения радикальности

удаления новообразования брали края хирургического разреза [Кныш В.И.,

1997].

Препараты маркировали согласно исследуемым участкам. Региональные

лимфатические узлы исследовали, если необходимо определить присутствие

близкорасположенных метастазов. Образец ткани, обработанный

последовательно возрастающими концентрациями метилового спирта для

уплотнения и обезвоживания материала, заливали парафином [Автандилов Г.Г.,

1990]. Из каждого парафинового блока на микротоме (марка) готовили срезы

толщиной 5 мкм. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином

[Аруин Л.И. и др, 1998] и по Ван Гизон для выявления волокнистых структур

[Автандилов Г.Г., 1990]. Исследование микропрепаратов проводили при

помощи микроскопа «Leica» при увеличении ×200 и ×400. Оценивали

состояние опухолевой ткани, глубину инвазии, вторичные изменения в

опухоли, метастазы в лимфатических узлах.

46

При исследовании удаленной кишки с опухолью оценивали

макроскопический препарат. В протокол исследования заносили длину кишки с

опухолью, расстояние от проксимальной и дистальной границ резекции до

верхнего и нижнего полюсов опухоли, характер роста опухоли и ее

протяженность, глубину инвазии опухоли в кишечную стенку, окружающую

клетчатку, соседние органы. Для оценки объемов резекции у пациентов группы

1 выделяли и подсчитывали удаленные лимфатические узлы брыжейки толстой

кишки по стандартной методике, или по методике химического клиринга

[Аруин Л.И. и др., 1998; Царьков П.В. и др., 2004] или по методике

химического клиринга.

По стандартной методике Царькова П.В. (2004) брыжейку удаленной

кишки нарезали секционным ножом с шагом 0.5-1.0 см. Лимфатические узлы,

имеющие на срезе серо-розовый цвет, забирали для последующего

микроскопического исследования. В этом случае размер выявляемых

лимфатических узлов составлял не менее 0.5 см. После отделения от

операционного препарата брыжейку помещали в раствор n-гексана на 2 час для

экстракции липидов, далее образец помещали в 70% раствор этанола на 20 час

для фиксации макропрепарата. Выделяли лимфатические узлы из брыжейки

кишки и исследовали их морфологию. Цитологическое исследование

препаратов проводили по методу Паппенгейма [Автандилов Г.Г., 1990]. Мазки

фиксировали в течение 2 мин в красителе-фиксаторе эозина метиленового,

приготовленного по методу Май-Грюнвальда [Автандилов Г.Г., 1990]. Затем

препараты промывали водой и докрашивали смесью 0.1% раствора азур-эозина

в течение 6 мин. Краситель смывали водой. Препарат высушивали и

микроскопировали, оценивая клеточный состав мазка, наличие элементов

крови (эритроциты и лейкоциты), клеточных элементов воспаления

(нейтрофилы, лимфоциты, гистиоциты и макрофаги). Основное внимание

уделяли появлению опухолевых, либо диспластически измененных

эпителиальных клеток.

47

Получение первичных культур клеток эпителиальной ткани ободочной и

прямой кишки. В стерильных условиях во время операции отобраны образцы

опухолевой и нормальной ткани больных КРР. Нормальная эпителиальная

ткань расположена на расстоянии 10 см от опухоли. Образцы ткани помещали в

стерильную среду культивирования (МЕМ, Hyclone, Logan, UT) c добавлением

10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и

1% антибиотиков (Sigma, St. Louis, MO). Образцы ткани тщательно отделяли от

жира и некрозов, промывали от крови три раза в растворе МЕМ (40С) с

добавлением 1% антибиотиков (стрептомицин, пенициллин, канамицин, Sigma)

и 1% сывороточного альбумина человека (Sigma). Образцы ткани измельчали

на кусочки размером 1 см и помещали в стерильные флаконы с МЕМ (370С),

ДНК-азой I (15 мкг/мл). Фрагменты ткани подвергали механической и

ферментативной дезагрегации на шейкере при 100 об/мин в течение 20 мин при

370С (Brennan J.K. et al., 1991; Giavazzi R. et al., 1986). Затем клетки

центрифугировали в течение 10 мин при 1250 об/мин при 40С и отмывали

дважды средой МЕМ с добавлением антибиотиков. Затем снова

центрифугировали и ресуспендировали в среде МЕМ. Клетки помещали в 100

мм чашки для культивирования. В состав среды культивирования входили

следующие компоненты (Sigma): 6.16 мл среды МЕМ; натрий фосфатный

буфер 7.5%; 1.6 мл инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого

скота; 0.08 мл L-глютамина; 0.08 мл раствора антибиотиков (на 1 мл среды

пенициллина 100 Ед, цефазолина 5 Ед, канамицина 5 Ед). Чашки с суспензиями

клеток помещали в термостат с 370С и 5% атмосферой СО2. После

прикрепления к поверхности чашек и деления клетки обработывали трипсином

(0.25%) и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА в конечной

концентрации 0.25%). Приготовленную таким образом суспензию клеток

использовали в экспериментах.

Метод колониеобразования. Колониеобразующую активность клеток

оценивали по стандартному методу [Brennan J.K. et al., 1991]. Суспензии в

концентрации 1×105

клеток в 20 мл агаризованной (0.6%) МЕМ среде с

48

добавками помещали в 100 мм чашки для культивирования. Чашки с

суспензиями клеток инкубировали в термостате при 370С и 5% атмосфере СО2 в

течение 7 дней. Колониеобразующая активность выражена в процентах по

формуле 1:

К/N×100%, (1)

где К – количество колоний на чашку, N – количество засеянных на

чашку клеток. Эксперименты проведены в трех повторностях по 5 чашек в

каждом контрольном и экспериментальном варианте.

Оценка резистентности клеток к химиопрепаратам. Суспензии

первичных культур клеток в МЕМ среде с добавками помещали в 96-луночные

стерильные иммунологические планшеты в концентрации 1×103 клеток на

лунку и добавляли лекарственные препараты. В контрольном варианте в

инкубационную среду с клетками добавляли деионизованную

дистиллированную воду в объеме 10 мкл, соответствующему объему раствора

лекарственного препарата. Клетки в планшетах инкубировали 24, 48, 72, 96 час.

Оптическую плотность (ОП) как безразмерную величину по системе СИ

[Власов А.Д., 1990.] и ГОСТ 8.417-81, т.е. показатель преломления суспензии

клеток в МЕМ среде, измеряли на UV-спектрофотометре Biospec-mini

(Shimadzu, Япония) при длине волны 630 нм. Скорость роста опухолевых

клеток рассчитывали по формуле 2 [Deisboeck T.S. et al., 2001]:

R=exp(-t)≈∆N/N, (2)

где N – ОП суспензии необработанных химическим соединением опухолевых

клеток, ∆N – ОП суспензии обработанных химическим соединением

опухолевых клеток. Эксперименты проведены в трех повторностях.

Анализ хромосомных аберраций в клетках первичных культур

эпителиальных клеток. Чашки со средой и культурами клеток инкубировали в

термостате при 370С в течение 48 час. Для блокирования митоза на стадии

метафазы за 2 час до окончания инкубации в инкубационную среду добавляли

49

раствор колхицина (Sigma) в конечной концентрации 0.002 мкг/мл. После

окончания инкубации суспензию клеток переливали в центрифужные пробирки

и центрифугировали при 1250 об/мин в течение 15 мин для осаждения клеток.

Надосадочную жидкость удаляли водоструйным насосом, добавляли

предварительно подогретый до 370С гипотонический раствор (0.75 М КCl) и

ресуспендировали в нем осадок клеток. Пробирки с клетками выдерживали на

водяной бане (370С) 10-12 мин. Затем клетки центрифугировали при 1250

об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляли.

Клетки ресуспендировали в 1-1.5 мл свежеприготовленного раствора

фиксатора, состоящего из метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в

соотношении 3:1, затем объем фиксатора доводили до 10 мл. Смену фиксатора

с последующим центрифугированием при 1250 об/мин в течение 15 мин

проводили дважды. После фиксации суспензию клеток наносили на

предметные стекла. Препараты сушили, затем гидролизовали в 5 N растворе

HCl в течение 10 мин и окрашивали по методу Гимза. Анализировали при

помощи микроскопа «Leica» при увеличении ×1000 в каждом препарате 100

метафаз. Подсчитывали количество клеток с распознаваемыми без

кариотипирования хромосомными аберрациями: ацентрические парные,

одиночные и точковые фрагменты, центрические и ацентрические кольца,

полицентрики.

Хромосомные аберрации регистрировали в метафазных пластинках,

удовлетворяющих следующим требованиям: метафазы содержат 45-47

хромосом; отсутствует продольное наложение хромосом; отсутствуют

хромосомы, вошедшие в анафазу или из других метафаз; хромосомы четко

окрашены; уровень конденсации хромосом позволяет видеть малые

акроцентрические хромосомы и деление хромосом на 2 хроматиды.

Митотический индекс. Для оценки пролиферативной активности клеток

используют такой показатель, как митотический индекс [Worthley D.L., 2007],

соответствующий проценту митозов в исследуемой популяции клеток и

рассчитываемый по формуле 3:

50

МИ = М/К×100%, (3)

где М – количество делящихся клеток в популяции, К – общее количество

клеток (не менее 1000) в популяции.

Количество анеуплоидных клеток рассчитывали по формуле 3, в которой

«М» (количество делящихся клеток) заменен показателем «А» (совокупность

полиплоидных и анеуплоидных клеток с гиподиплоидным или

гипердиплоидным набором хромосом). Суммирование полиплоидных и

анеуплдоидных клеток в показателе «А» объясняется тем, что опухолевые

полиплоидные клетки возникают вследствие нарушения хода митоза и часто

содержат набор хромосом превышающий диплоидный, но не кратный

гаплоидному.

Цитостатики. Использовали препараты в конечных концентрациях

мкг/мл: 20 − N-метил-N-нитро-N’-нитрозгуанидин (МННГ), 50 − 5-бром-

дезоксиурацил (5-БУ), 18 − 5-фтор-дезоксиурацил (5-ФУ), 0.43 − цисплатин

(ЦП), 0.29 − лейковорин (Л), 2 − томудекс (Т). Клетки облучали в течение 20

сек. ультрафиолетовым излучением (УФ). При облучении клетки находились на

расстоянии 30 см от источника излучения. После обработки препаратами

клетки инкубировали в течение 48 час при 370С.

Выделение ДНК и РНК из клеток. К клеткам суспендированным в буфере

LST (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0.25 М сахароза)

добавляли равный объем буфера 4× TNLB (29 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ

NaCl, 3 мМ MgCl2, 5% сахароза, 4% Np-40). Затем суспензию клеток

центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток дважды

промывали буфером LST. К осадку клеток добавляли буфер TNE (10 мМ трис-

HCl рН 8.0, 10 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА), 1% СДС (лаурилсульфат натрия) и

протеиназу К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение РНК из клеток

опухолевой и нетрансформированной ткани проводили с помощью набора

TRIzol (Life Technologies, Inc.) согласно прилагаемой инструкции.

51

Праймеры. При выборе праймеров, для повышения специфичности ПЦР,

учитывали следующие условия: длина праймера от 20 до 50 нуклеотидов в

зависимости от назначения; избегали появления вторичных структур в

праймере и присутствия более трех-четырех одинаковых нуклеотидов подряд;

используемые в одной реакции праймеры аллелей дикого типа не имели

комплементарных участков. Для оценки структуры праймеров использовали

компьютерную программу Primer Express (Applied Biosystems).

Использованные в работе праймеры (Евроген, Россия) представлены в таблице

3.

Таблица 3

Использованные праймеры

Ген F-праймер R-праймер

β-актин 5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’ 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’

MSH6 5’-GATGGCATTTTCACAAGGATGGG-3’ 5’-CTGGCGGATAATGGGTGACAAAC-3’

MSH2 5’-ACAAGGGGCTGGGTTAGCAAAAG-3’ 5’-AGTCACCATTCTCTTCCGCTTTCG-3’

PMS2 5’-TTCTCAGGTTATCGGAGCCAGCAC-3’ 5’-CTTCGTCCCAATTCACCTCAGTGG-3’

MLH1 5’-CAGGTTTCATTTCACAATGCACGC-3’ 5’-TTACCTTCAACATCCAGCAGTGGC-3’

MSH3 5’-GGCAACAGTTCGACTCCTTTCAAG-3’ 5’-TTGATACCCTCCCCGTTATCTCGC-3’

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-RT).

Метод ПЦР с обратной транскрипцией [Chang C. et al., 2000] использовали для

получения продуктов, которые анализировали в 1% агарозном геле с

добавлением 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Температура отжига определяет

жесткость условий гибридизации праймеров с мишенью и, следовательно,

специфичность амплификации, которая зависит от длины праймеров. Для

приблизительной оценки температуры отжига использовали формулу 4:

40С × (G+C)+2

0С × (A+T)–4 (4)

Точное значение температуры подбирали экспериментальным путем,

используя температурный градиент. Реакцию проводили в конечном объеме 30

мкл в следующих условиях: 2 мкг РНК, 1 µl M-MulV (обратная транскриптаза,

52

СибЭнзим), 300 нM (5.0 пмоль) прямого и обратного праймера, 0.1 µM

(2.5

пмоль), 5.0 нM MgCl2, SYBR Green, 10 мM трис–HCl pH 8.0, 3.5 нМ TaqMan

ДНК-полимеразы (Sigma),

200 µM каждого из четырех дезоксинуклеотид-

трифосфатов и 50 мM KCl. Цикл включал этап нагревания до 250C в течение 5

мин. Затем проводили 40 циклов при 950C

в течение 15 сек, 52

0C в течение 20

сек и 720C в течение 25 сек. Реакцию заканчивали охлаждением инкубационной

смеси до 40C.

Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле. Разделение ДНК

проводили в 0.8% агарозном геле в ТАЕ буфере (40 мM трис–HCl pH 8.5, 5.71%

ледяной уксусной кислоты, 0.04 мМ ЭДТА) в присутствии бромистого этидия

(0.5 мкг/мл). Электрофорез проводили при 10-15 В/см в течение 120 мин.

Результаты протоколировали с помощью BioRad.

2.4 Статистическая обработка данных

Данные тематических карт и экспериментальных работ, обрабатывали

методами математической статистики. Статистический анализ результатов

проводили с использованием методов описательной статистики, парного t-

критерия Стьюдента и парного T-критерия Вилкоксона для двух попарно

связанных выборок, непараметрического U-теста Манна-Уитни (Mann-Whitney

U Test), метода линейного корреляционного анализа Пирсона для оценки связи

между показателями. Результаты в большинстве таблиц, рисунков и в тексте

представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m)

с указанием стандартного отклонения SD и величины выборки n. Различия или

показатели связи считались статистически значимыми при p<0,05. Расчеты

выполнены при помощи компьютерной программы Excel 2003.

53

ГЛАВА 3

КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

БОЛЬНЫХ, ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ

КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА В ПЕРМСКОМ РЕГИОНЕ

3.1. Заболеваемость колоректальным раком в Пермском регионе

Анализ данных годовых отчетов продемонстрировал, что в Пермском

регионе 18.2±0.2 заболеваний колоректальным раком на 100000 человек

статистически достоверно выше, чем 15.5 заболеваний КРР на 100000 человек в

Российской Федерации. В Пермском регионе в 1999-2006 гг. уровень

заболеваемости населения раком ободочной кишки составлял − 18.4±0.3, раком

прямой кишки − 18.1±0.3 на 100000 населения (рис. 1 А).

А

Б

Рис. 1. Показатели заболеваемости колоректальным раком населения

Пермского регионе за 1999-2006 гг. А. Количество больных колоректальным раком на 100000 населения.

0

20

40

60

80

100

РОК РПК

Коли

чест

во б

ольн

ых

IV с

тад

ии

, %

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

0

5

10

15

20

25

30

РОК РПК

Коли

чест

во б

ольн

ых

на

100000 н

асел

ени

я

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

54

Б. Распространенность колоректального рака IV стадии, p<0.0001.

Показатели заболеваемости КРР в Пермском регионе существенно ниже,

чем в Санкт–Петербурге и Москве, которые соответственно составляют 33.6 и

30.3 случаев заболевания на 100000 человек.

Показателем эффективности диагностики является количество

запущенных форм КРР, особенно IV стадии. В последние годы количество

больных имеющих запущенные формы колоректального рака, особенно рака

прямой кишки, достоверно возросло (рис. 2 А, Б).

А

Б

Рис. 2. Заболеваемость колоректальным раком жителей городов и

сельских районов Пермского региона в 1999-2006 гг. А. Абсолютное значение распространенности колоректального рака.

Б. Распространенность (%) колоректального рака IV стадии.

I − Жители городов. II − Жители сельской местности.

0

5

10

15

20

25

30

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

ко

ли

чес

тво н

а 100000

нас

елен

ия

год

РОК (I) PОК (II) РПК (I) РПК (II)

0

20

40

60

80

100

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

%

год

РОК (I) PОК (II) РПК (I) РПК (II)

55

Количество выявленного колоректального рака составляет (49.57±5.09)%,

рака ободочной кишки − 30.30±1.46%, рака прямой кишки − (68.84±1.71)%.

Количество случаев рака ободочной кишки на 100000 жителей сельских

районов в 1.6 раза меньше, чем на 100000 жителей городов Пермского региона

(21.1±0.3).

Уровень заболеваемости КРР в Пермском регионе приблизительно равен

данным других регионов России [Чисова В.И., 2003]. Исключением является

уровень заболеваемости раком прямой кишки, который составляет 24.6±0.6

случаев на 100000 жителей сельских районов и статистически достоверно в 1.4

раза больше уровня заболеваемости жителей городов (17.8±0.1 случаев на

100000). Тенденция увеличения в 1.6 раза количества жителей сельской

местности (53.3±5.3)% с запущенными формами КРР, по сравнению с

жителями городов, может свидетельствовать как о поздней диагностике

заболевания, так и о специфике риска развития заболевания, обусловленной

условиями жизни. Например, заболеваемость на 100000 жителей сельской

местности составляет 87.3±1.4, т.е. в 1.4 раза выше, чем заболеваемость

городских жителей (61.4±0.8).

3.2 Анамнестические данные обследованного контингента

Анализ анкетных и анамнестических данных

Анкетные данные показали, что возраст больных КРР варьировал от 28 до

78 лет. Средний возраст респондентов составлял 57.8±9.4 года (табл. 4).

Таблица 4

Распределение больных по полу и возрасту

Пол Возраст, лет

Количество

больных % больных

20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70 и старше

Женщины 1 1 11 13 18 8 52 48.1

Мужчины 1 1 10 20 16 8 56 51.9

56

Анкетные данные больных группы 1 показали отсутствие зависимости

развития заболевания от географического места проживания, на юге – 17 (25%),

на севере – 15 (22%), на западе -8 (12%), на востоке – 8 (12%), в г. Перми – 20

(29%). Количество респондентов со стажем более 30 лет работы в разных

отраслях промышленности и в условиях воздействия потенциально

канцерогенных химических соединений составляет 46,8% (29 человек) от

общего числа опрошенных (рис. 3).

Рис. 3. Количество больных колоректальным раком, имеющих стаж

работы более тридцати лет в различных отраслях производства.

Факторами риска развития рака являются фоновые заболевания

ободочной и прямой кишки их имели 35 человек (51,5%) только 1-й группы,

причем чаще полипы – 20 (57,1%). Анализ распространенности этих

заболеваний в группе обследуемых пациентов представлен на рисунке 4.

28%

16% 40%

16%

химическая промышленность, в том числе, производство анилиновых красителей (12%)

металлургическая промышленность

нефтеперерабатывающая промышленность

работа с горючесмазочными веществами

57

Рис. 4. Фоновые заболевания толстой кишки больных

колоректальным раком.

Анкетирование обследуемого контингента показало, что 64 (94.1%)

пациента предпочитают пищу богатую животными жирами, все они из 1-й

группы, а 40 (100%) пациентов 2 – группы предпочитают пищу богатую

растительной клетчаткой.

Заболеваниями, сопутствующими КРР являются сердечно-сосудистые,

среди которых ишемическую болезнь сердца, стенокардию напряжения 2-3

функционального классов имели 26 или 24.1% респондентов, артериальную

гипертензию – 45 или 41.7% респондентов, атеросклероз сосудов сердца,

головного мозга – 64 или 59.3% респондента. Сахарный диабет 2 типа имели 50

46.3% респондентов. Такие заболевания органов желудочно-кишечного тракта,

как желчнокаменная болезнь, хронический калькулезный холецистит имели 6

или 5.6% пациентов. Миому матки, как и аденому предстательной железы,

имели по 2 или 1.9% респондента. Анкетированием больных выявлено

наследование злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта или

органов малого таза родственниками первой линии родства 18 (26,5%)

респондентов только из 1-й группы.

Клинические симптомы у больных КРР представлены в таблице 5.

1,9% 1,9%

17%

020%

003% 030%

026%

1,8%

колит, энтерколит полипоз толстой кишки

комбинированный геморрой 2-3 ст. дивертикулярная боезнь толстой кишки

неспецифический язвенный колит единичный полип толстой кишки

множественные полипы толстой кишки синдром раздраженной толстой кишки

58

Таблица 5

Клинические симптомы колоректального рака при первичном обращении

больных

Симптомы Количество больных

абс. %

Стойкое понижение или отсутствие аппетита 40 58.8

Снижение массы тела 32 47.1

Болевой синдром 24 35.3

Тенезмы 20 29.4

Изменение характера стула 22 36.7

Патологические выделения из прямой кишки:

Кровянистые 28 41.1

Слизистые 16 23.5

Запор 28 41.3

Запор, сменяющийся поносом 14 20.6

Учет симптоматики КРР позволил определить предполагаемый отдел или

сегмент поражения толстого кишечника, выбрать лабораторно-

инструментальный алгоритм дальнейшего исследования. Выполнен

физикальный осмотр, который позволил выявить 12 (20.6%) случаев

расположения опухоли на расстоянии 7 см от края ануса. Пальцевым

исследованием прямой кишки определены величина, протяженность, высота,

ширина, подвижность или неподвижность опухоли. Материал, взятый для

цитологического исследования, подтвердил наличие признаков клеточной

атипии (рис. 5).

59

А Б

Рис. 5. Скопление атипичных клеток с полиморфизмом и

гиперхромией ядер (смывы с инструментов). Окраска по Паппенгейму.

Увеличение ×240. А. Цитограмма больного С., 50 лет.

Б. Цитограмма больного К., 66 лет.

3.3 Результаты лабораторных методов исследования

Общеклиническое исследование крови показало, что больные 1-ой группы

имели токсико-анемический (41.1%) синдром, повышенное СОЭ (63.2%),

гипохромную и гипорегенераторную анемии (41.1%), лейкоцитоз, изменение

лейкоцитарной формулы со сдвигом влево (41.1%), лимфопению (38.2%),

эхиноцитоз, анизоцитоз и пойкилоцитоз эритроцитов (соответственно 35.3%,

29.4%, 29.4%). Выявленные патологические сдвиги показателей

эритроцитарного ростка костного мозга связаны с продуктами метаболизма

клеток опухоли опосредованно через регулирующие системы организма. У

больных 2-ой группы выявлено лишь повышение СОЭ у 2 пациентов (5%).

Изменения биохимических показателей крови пациентов представлены в

таблице 6.

60

Таблица 6

Биохимические показатели сыворотки крови больных КРР

Биохимический показатель Норма Больные

КРР

Количество больных с

анормальными

биохимическими

показателями, %

Общий белок, г/л 65-85 40.5±3.5 58.8 а

Мочевина, мг/Дл 15-50 75.6±0.2

2.7 б

Креатинин, мкмоль/л 44-132 143±0.4 2.7

Глюкоза, ммоль/л 3.9-6.4 9.8±3.6

46.3 в

Общий холестерин, мг/дл 140-250 259±2.4 51.9

Общий билирубин, мкмоль/л 3.4–17.1 19.2±0.4 2.7

Щелочная фосфатаза, МЕ/л 39–117 134.2±1.2 9.3

Желчные кислоты, мкмоль/л 34–137 14.2±0.2 44.1 а – гипопротеинемия

б − прорастание опухоли в мочевыводящие пути

в − пациенты с сахарным диабетом 2 типа

Биохимическое исследование крови выявило, что в сыворотке крови

больных 1-й группы повышенный уровень желчных кислот имел место в 2.9

раза чаще, чем у больных 2-й группы (соответственно 44.1% и 15%), кроме

того, у больных с КРР была гипопротеинемия (58.8%).

Выявлено, что примерно половина пациентов имели повышенное

содержание глюкозы в крови, что анамнестически подтверждало наличие

сахарного диабета. Выявление и предотвращение тромботических осложнений

требовало определения признаков гиперкоагуляционного синдрома [Логинов

А.С., 2000].

Гиперкоагуляционный синдром относится к состоянию, для которого

характерна скудная неспецифическая клиническая симптоматика и

лабораторные признаки гиперкоагуляционной направленности гемостаза на

фоне отсутствия тромбозов. Взаимосвязь между тромбозом и онкологическим

заболеванием известна более 120 лет, при этом полагают, что венозная

тромбоэмболическая болезнь может стать основным клиническим проявлением

нераспознанного рака. Показатели системы гемостаза больных КРР

представлены в таблице 7.

61

Таблица 7

Показатели системы гемостаза больных КРР

Показатели Норма Результат

Значения

показателей

Количество

больных

Значения

показателей

Количество

больных

АЧТВ, с 27.2±0.6 74 30.2±0.4* 34

Фибриноген, г/л 2.4±1.8 72 5.2±0.2* 36

ПДФ, мг/л 6.7±2.6 72 14.5±3.5* 36

Д-димер, мкг/л 0.2±0.1 72 0.7±0.3* 36

* − р < 0.05

Исследование системы гемостаза показало, что гиперкоагуляционный

синдром с продуктами деградации фибриногена на фоне отсутствия тромбозов

имел место у 35.3% больных с КРР. Выявленные изменения показателей

системы гемостаза свидетельствовали о развитии 1 фазы хронического

диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови больных КРР.

Исследование кала на скрытую кровь. У больных 1-й группы выявлена резко

положительная реакция в половине случаев, у больных 2-й группы –

слабоположительная – в 10%. По нашим исследованиям ценность этого

скринингового метода составляет 31.5%, что соответствует ранее полученным

данным [Назаренко Г. И., Кишкун А.С. 2000].

Содержание онкомаркеров в крови пациентов определяли до

оперативного вмешательства и в ходе послеоперационного мониторинга через 6

мес, затем через 1, 2, 3, 4, 5 лет. Повышенное содержание СА 19-9 и РЭА в

сыворотке крови 64 (94.1%) пациентов и α-фетопротеина в сыворотке крови

пяти больных КРР до операции подтвердило, что содержание онкомаркеров

повышается в организме больных на всех стадиях заболевания (табл. 8).

Отсутствие изменений содержания α-фетопротеина в организме

приблизительно 93% больных свидетельствует, на наш взгляд, о низкой

информативности в случае использования этого онкомаркера в диагностике

62

первичной опухоли и метастазов рака толстой кишки, исключая поражение

печени.

Таблица 8

Содержание онкомаркеров в сыворотке крови больных c разными

стадиями колоректального рака

Стадия

заболевания

РЭА, нг/мл СА 19-9, Ед/мл

I 10.2±1.2 38.3±2.3

II 12.2±2.2 46.2±1.8

III 16.7±1.9 59.5±3.5

IV 18.2±1.3 78.4±4.8

В сыворотке крови больных 1-й группы до операции (при норме РЭА – 0-

2.5 нг/мл, АФП – 0-13.0 нг/мл, СА 19-9 – 0-30.0 МЕ/мл) выявлено повышенное

содержание онкомаркеров СА 19-9 (65.7±0.09 МЕ/мл) и РЭА (14.2±0.4 нг/мл) у

64 (94.1%) больных, а повышение содержания α-фетопротеина (до 24.8 нг/мл)

лишь у 5-и (7.4%), что свидетельствует о низкой информативности этого

онкомаркера в диагностике первичной опухоли толстого кишечника. У

больных 2-й группы показатели уровня онкомаркеров были в пределах

физиологической нормы.

Показатели онкомаркеров значительно превышающих референтные

значения в сыворотке крови также зарегистрированы в течение 5 лет

наблюдений. Количество больных КРР с высоким содержанием онкомаркеров в

крови отражено в таблице 9.

63

Таблица 9

Количество больных КРР с высоким содержанием онкомаркеров

Маркеры Группы

больных

Доля пациентов с измененным уровнем маркеров, %

6 мес 1 год 2 года 3 года 4 года 5 лет

РЭА 1а 10 10 6.7 36.7 36.7 3.3

1б 2.9 2.9 23.5 5.9 23.5 23.5

СА 19-9 1а 16.7 10 10 36.7 36.7 3.3

1б 2.9 2.9 11.8 2.9 23.5 23.5

АФП 1а 6.7 10 6.7 3.3 26.7 26.7

1б - - - 2.9 - -

Необходимо отметить, что в случае метастатического поражения печени

пяти больных (4.6%) содержание трех опухолевых маркеров в сыворотке крови

статистически достоверно на уровне p<0.05 превышало верхнюю границу

нормы РЭА – 24.6±0.8 нг/мл, СА 19-9 – 105.4±3.6 Ед/мл, α-фетопротеин –

18.4±3.2 Ед/мл, приблизительно в 1.5-30 раз. В крови четырех больных (3.7%) с

солитарными метастатическими узлами в печени отмечено повышение

содержания только РЭА до 20.3±0.7 нг/мл и СА 19-9 до 100.9±1.3 Ед/мл.

3.4 Результаты инструментальных исследований

С помощью ректороманоскопии определены расстояния от опухоли, а

также от ее проксимального и дистального краев до края ануса, и

распространение опухоли по окружности кишки. Ректороманоскопией

диагностировано 26.8% новообразований в прямой и сигмовидной кишках. В

19 (17.6%) наблюдениях опухоли размером до 30 см и в 10 случаях (96%)

размером более 3 см располагались на передней стенке, в 6 (5.6%) случаях на

задней стенке, в 6 (5.6%) случаях на правой, а в 5 (4.6%) случаях на левой

стенке. Опухоль облитерировала просвет кишки 10 (9.6%) пациентов, тубус

ректоскопа проходил за дистальный край опухоли 19 (17.6%) пациентов.

64

Эндоскопическое исследование левых отделов толстой кишки 28 (25.9%)

больных помогло диагностировать опухоли сигмовидной кишки.

Выявлено при помощи колоноскопии неопластическое поражение

толстой кишки 58.3% пациентов.

Основные выявленные рентгенологические симптомы неопластического

поражения толстого кишечника представлены в таблице 10.

Таблица 10

Рентгенологические симптомы неопластического поражения толстой

кишки

Симптом Количество больных

Дефект наполнения

− неровный контур на протяжении

− кольцеобразный контур

20

26

Атипическая перестройка рельефа слизистой

оболочки толстой кишки

40

Ригидность кишечной стенки 36

Утолщение стенки кишки 56

Сужение участка кишки 56 Выявленные при помощи рентгенологических методов симптомы

позволили верифицировать опухоль, оценить критерий Т. Неровный контур

сигмовидной кишки, протяженностью 5-7 см, характерный для Т4, и

кольцеобразный контур ободочной кишки, характерный для Т 2-3 выявлен при

обследовании 20 (18.5%) (рис. 6) и 26 (24.1%) пациентов.

Рис. 6. Местнораспространенный рак сигмовидной кишки Т4N1 M0.

65

Неопластическое поражение толстой кишки 56 (51.9%) пациентов

выявлено при помощи ирригоскопии, которую применяли в случае

противопоказаний проведения колоноскопии. Верифицировано

новообразование диаметром более 2 см. Однако ирригоскопия не позволила

выявить полипы, диаметр которых составлял менее 1 см.

3.5 Сравнительная характеристика диагностической ценности

лабораторных и инструментальных методов исследования

колоректального рака

Проведенный сравнительный анализ результатов диагностики,

выполненной при помощи методов, применяемых в поликлинических и

стационарных исследованиях больных, позволил не только определить

доброкачественные или злокачественные новообразования толстой кишки, но и

диагностическую ценность методов, которая представлена в таблице 11.

Таблица 11

Диагностическая ценность методов исследования толстой кишки

Метод исследования Количество наблюдений

абс. %

Проба Вебера 34 31.5

Пальцевое исследование 14 13.0

Ректороманоскопия 29 35.3

Сигмоскопия 28 35.3

Колоноскопия 63 58.3

Ирригоскопия 56 51.9

Результаты работы показали, что максимально высокой

информативностью в диагностике колоректальных новообразований обладают

колоноскопия и ирригоскопия. Дополнительными методам диагностического

66

исследования колоректального рака являются УЗИ и рентгеновская

компьютерная томография, поскольку этими методами уточняют

распространенность опухолевого поражения стенки толстой кишки, выявляют

измененные лимфатические узлы и отдаленные метастазы. Эндоректальное

ультразвуковое исследование позволило четко визуализировать 5 слоев

кишечной стенки (рис. 7).

Рис 7. Эхограмма прямой кишки

Сопоставление результатов ультразвуковых и патоморфологических

исследований показало, что наибольшее количество ошибок допущено при

определении Т2 степени инвазии опухоли. Получена правильная оценка

результатов исследования 90-94% больных КРР с Т1 и Т3 степенями инвазии, и

только 5 (35%) больных КРР с Т2 степенью инвазии (рис. 8 А, Б).

А Б

Рис 8. Умереннодифференцированная аденокарцинома

среднеампулярного отдела прямой кишки с глубиной инвазии Т1.

67

А – эхограмма опухоли с инвазией Т1 диаметром 1,2 см, инфильтрирующая

подслизистый слой.

Б – умереннодифференцированная аденокарцинома. Увеличение ×400

Эхографические признаки опухолей прямой кишки оценены по

критериям, сформулированным М.К. Михайловой (2003) (табл. 12).

Таблица 12

Эхографические признаки опухолей прямой кишки

Признак Количество

больных

Неравномерное утолщение стенки прямой кишки, >10 мм 18

Нарушение слоистости стенок прямой кишки 16

Эхопозитивность образования 12

Неровность контура органа 18

Отсутствие симметричности поражения 10

Сужение просвета кишки 12

Обнаружено, что ультразвуковое исследование занижает на 33%

выявляемость поражения лимфатических узлов. Злокачественное поражение

лимфатических узлов обнаружено в организме 10 больных, причем, 8 больных

имели метастатически измененные лимфатические узлы, а 2 больных имели

гиперплазию лимфатических узлов.

Применение рентгеновской компьютерной томографии (РКТ) в

дооперационном обследовании толстой кишки не рекомендуется из-за низкой

точности метода в случае идентификации ранних стадий злокачественных

образований. Низкая точность РКТ исследований объясняется техническими

трудностями, которые не позволяют оценить глубину инфильтрации опухоли в

пределах стенки кишки, а также диагностировать злокачественную

аденопатию. Диагностика злокачественной аденопатии является важным

этапом прогнозирования резектабельности опухоли. Метод РКТ использован в

нашей работе с целью оценки распространения опухоли на соседние органы и

ткани. Выявлено, что 8 больных имели метастатическое поражение печени

(рис. 9 А), а в печени 6 больных обнаружен единичный солитарный метастаз, и

68

солитарный метастаз определен в правой доле печени одного больного (рис. 9

Б).

А

Б

Рис. 9. Множественные метастазы в печени (А) больного КРР,

история болезни № 1203-05 г. Солитарный метастаз в правой доле печени

(Б) больного КРР, история болезни № 1343-06 г.

Рентгеновскую компьютерную томографию применяли в случаях, если

необходимо

69

определить резектабельность опухоли и возможность применения

дооперационной лучевой терапии (24 пациента);

провести проектирование полей облучения (24 пациента);

выявить осложнения, связанные с опухолью, например, перфорацию с

формированием абсцесса, преобструктивную ишемию в случае полной

окклюзией опухолью просвета кишки (6 пациентов).

При обследовании при помощи РКТ 38 пациентов в послеоперационный

период выявлено три рецидива заболевания, метастазы в печени 8 больных и

поражение забрюшинных лимфатических узлов 3 больных. «Структурные и

морфологические» изменения наблюдали в надпочечниках и легких двух

больных.

Резюмируя результаты проведенных инструментальных исследований,

необходимо отметить, что основным диагностическим инструментом

выявления колоректального рака является колоноскопия. Наиболее

оптимальными для массового скрининга являются методы ректороманоскопии,

сигмоскопии и пальцевого исследование прямой кишки. Основными

рентгенологическими признаками при диагностике опухолей толстой кишки

являются неровность контура кишки и утолщение её стенки. Связано это с тем,

что внутристеночный рост опухоли кишки, особенно на начальных этапах ее

возникновения, является проявлением рака кишки. Методы УЗИ и РКТ кишки

следует считать дополнительными в диагностике опухолевых поражений, но

они позволяют выбрать приемлемую тактику лечения.

3.6 Локализация и стадирование опухолевого процесса

Первичная опухоль у всех больных с КРР (1-я группа) прорастала, все

слои кишечной стенки и врастала в окружающую клетчатку. В группе больных

с доброкачественными заболеваниями (2-я группа) опухоль располагалась в

слизистом слое (30 пациентов) и подслизистом слое (10 пациентов). Варианты

70

анатомической локализации неопластического поражения толстой кишки

представлены в таблице 13.

Таблица 13

Локализация опухоли в толстом кишечнике

Локализация опухоли

Группы больных Количество

больных 1-я 2-я

абс. % абс. % абс. %

Слепая кишка 6 8.8 5 12.5 11 10.2

Восходящая ободочная

кишка 8 11.8 10 25.0 18 16.7

Поперечная ободочная

кишка (проксимальная

треть)

12 17.6 10 25.0 22 20.4

Сигмовидная кишка 18 26.5 10 25.0 28 25.9

Прямая кишка 20 29.4 5 12.5 25 23.1

Анальный канал 4 5.9 4 3.7

Всего 68 100 40 100 108 100

Характеристика распространенности опухоли сделана на основании

международной классификации рака ободочной и прямой кишки по системе

TNM [Бронштейн А.С., 2001] (табл. 14).

Таблица 14

Распространенность первичной опухоли

TNM Стадия

по Dukes

Больные с колоректальным раком Количество

больных

Хирургичское

лечение

Комбинированное

лечение абс.

число %

абс. число абс. число

T2N0M0 А 5 10 15 22.1

T3-4N0M0 В 10 10 20 29.4

T3-4N1-2M0 С 15 18 33 48.5

71

Распространенность опухоли Т3-Т4 имели 28 (25.9%) больных,

впоследствии получивших комбинированное лечение (подгруппа 1б), и 25

(23.1%) оперированных больных (подгруппа 1а). В регионарных

лимфатических узлах 30.5% больных группы 1 обнаружены метастазы.

3.7 Лечение больных с неопластическим поражением толстой кишки

Объем оперативного вмешательства, проведенный у больных со

злокачественным поражением толстой кишки, представлен в таблице 15.

Таблица 15

Объем резекции толстой кишки больных колоректальным раком

Объем резекции ободочной кишки

Количество

больных

абс. %

Правосторонняя гемиколэктомия 6 8.8

Резекция поперечной ободочной кишки 12 17.6

Резекции сигмовидной кишки 10 14.7

Правосторонняя гемиколэктомия по типу операции Лахея 8 11.8

Левосторонняя гемиколэктомия по типу операции Гартмана 6 8.8

Резекция сигмовидной кишки по типу операции Микулича 1 1.5

Резекция сигмовидной кишки по типу операции Гартмана 1 1.5

Передняя резекция прямой кишки с наложением аппаратного

шва 10 14.7

Низкая передняя резекция прямой кишки с наложением

аппаратного шва и разгрузочной колостомы 5 7.4

Экстирпация прямой кишки 5 7.4

Местное иссечение опухоли анального канала 4 5.9

Всего 68 100

Выполнены резекция ободочной кишки, иссечение тканей передней

брюшной стенки и паранефральной клетчатки 10 (14.7%) пациентам, имеющим

глубокое прорастание опухоли в окружающие ткани,. Комбинированное лечение

72

проведено 38 (55.8%) пациентам, в опухолевый процесс которых вовлечены

различные органы брюшной полости. Комбинированное лечение состояло из

резекции ободочной кишки и удаления двух и более органов опухолевого

конгломерата (рис. 10 А и Б).

А Б

Б. Местнораспространенная опухоль восходящей ободочной кишки, врастающая в

окружающую клетчатку. Больной В., 64 года.

В опухолевом конгломерате присутствовали тонкая кишка, мочевой

пузырь и матка с придатками, как изолированно, так и в сочетании с другими

органами брюшной полости и забрюшинного пространства. Хирургическую

тактику определяли индивидуально с учетом интраоперационной ситуации.

Решение принимали на основании анализа результатов ревизии органов

брюшной полости и забрюшинного пространства, интраоперационного

ультразвукового исследования и срочного цитологического исследования (рис.

11 А-Г).

Рис. 10. Интраоперационное УЗИ опухоли восходящей ободочной

кишки и брыжейки правой половины ободочной кишки. А. Увеличенные лимфатические узлы в проекции подвздошно-ободочных сосудов

(указаны стрелками). Больной В., 64 года.

73

А Б

В Г

Рис. 11. Цитограммы. Окраска по Паппенгейму. Увеличение ×600.

Мезотелий брюшины. А. Боковой канал брюшины больного 62 лет, правосторонняя

гемиколэктомия. Структура в виде сот из клеток мезотелия с признаками пролиферации. Б.

Серозная оболочка толстой кишки на уровне опухоли больной 68 лет. Правосторонняя

гемиколэктомия. Пласт пролиферирующего мезотелия с укрупнением и полиморфизмом

ядер в отпечатке. Атипичные клетки серозной оболочки. В. Правая половина ободочной кишки в

области опухоли больного в возрасте 74 лет. Полиморфизм ядер в клетках. Г. Толстая кишка

на уровне опухоли больного в возрасте 55 лет. Крупный комплекс клеток аденокарциномы с

полиморфизмом ядер и явлениями дистрофии в отпечатке.

Оперативное вмешательство носило циторедуктивный характер, так как

удаляли видимую часть опухоли. В процессе оперативного вмешательства

резецированы дополнительные органы (табл. 16).

74

Таблица 16

Органы, резецированные вместе с первичной опухолью

Резецированные смежные

органы Количество

резекций

Количество

истинных

прорастаний

Количество

перифокальных

воспалений

Тонкая кишка 8 4 4

Мочевой пузырь 6 3 3

Матка, придатки 10 6 4

Желудок,

двенадцатиперстная кишка 2 1 1

Селезенка 2 2 0

Слепая кишка, аппендикс 3 2 1

Мочеточники 2 2 0

Печень, желчный пузырь 2 2 0

Левая почка 3 2 1

Всего резецировано органов 38 24 12

Всего больных 38 24 12

Структура послеоперационных осложнений и летальность больных

представлена в таблице 17.

Таблица 17

Структура послеоперационных осложнений и летальность больных

колоректальным раком

Осложнения

Подгруппа

1а

Подгруппа

1б

Всего

Абс. %

Несостоятельность анастомоза 1 1 2 16.7

Поддиафрагмальный абсцесс 0 1 1 8.3

Абсцесс в полости малого таза 1 1 2 16.7

Инфильтрат брюшной полости 1 1 2 16.7

Нагноение лапаротомной раны 1 1 2 16.7

Тромбоэмболия легочной артерии 1* 0 1 8.3

Острая сердечная недостаточность 1* 0 1 8.3

Пневмония 1 1 8.3

Итого 7 5 12 100 *летальный исход

75

Не выявлено достоверных отличий показателей послеоперационных

осложнений и летальности оперированных больных и пациентов, которым

проведено комбинированное лечение. Предположительно, причинами,

вызвавшими послеоперационные осложнения, являются такие неучтенные

факторы риска, как высокая вероятность инфицирования условно патогенной

микрофлорой, снижение иммунитета, запущенность опухолевого процесса.

Электроэксцизию полипов осуществляли током высокой частоты в режимах

«резание» и «коагуляция». Полипы размером до 0.5 см в диаметре удаляли

методом тотальной биопсии при помощи биопсийных щипцов. Полипы на ножке

удаляли электроэксцизией с помощью диатермической петли, а полипы на

широком основании лазерной фотодеструкцией и электрокоагуляцией по

стандартному методу [Воробьев Г.И. и др., 2005].

Химиотерапевтическое лечение проводилось по показаниям 34 больным по

классической схеме клиники Мейо(5-фторурацил – 425 мг/м2 и лейковорин – 20

мг/м2 в течение 5-и дней, каждые 4-5 недель), 4 пациентам проведено

химиолучевое лечение - химиотерапия и дистанционная мегавольтная γ-терапия

прямой кишки и клетчатки малого таза с использованием аппаратов «РОКУС-АМ»

(Россия) и «АГАТ-РМ» (Россия) в режиме классического фракционирования

(разовая очаговая доза 2-2.5 Гр, суммарная 40-50 Гр).

3.8 Отдаленные результаты комбинированного лечения больных

колоректальным раком

Наблюдение за 64 больными КРР проводилось на протяжении 5 лет.

Местные рецидивы заболевания не имели больные КРР и доброкачественными

опухолями. Отдаленные метастазы диагностированы в организме 4 (7.1%)

больных, получивших комбинированное лечение и 7 (11.8%) оперированных

больных.

Суммарная характеристика течения заболевания в группах пациентов,

получавших различные виды лечения, представлена в таблице 18. Анализ

76

данных показывает, что в целом у больных, получавших комбинированное

лечение наблюдалось более благоприятное лечения заболевания.

Таблица 18

Оценка течения заболевания у больных КРР, получавших различные

виды лечения, абс. (%).

Проявления

заболевания

6 мес 1 год 2 года 3 года 4 года 5 лет

Рецидив ХЛ - - 2 (6,7) 5 (16,7) 11 (36,7) 13(43,3)

КЛ - - 3 (8,8) 4 (11,8) 8 (23,5) 8 (23,5)

Появление

метастазов

ХЛ 2 (6,7 ) 3 (10,0) 5 (16,7) 6 (20,0) 7 (23,3) 7 (23,3)

КЛ 1 (2,9) 2 (5,9) 3 (8,8) 4 (11,8) 4 (11,8) 4 (11,8)

Умерло ХЛ - - 2 (6,7) 5 (16,7) 11 (36,7) 11 (36,7)

КЛ - - 3 (8,8) 4 (11,8) 8 (23,5) 8 (23,5)

Живы ХЛ 30 (100) 30 (100) 28 (93,4) 25 (83,3) 19 (63,3) 19 (63,3)

КЛ 34 (100) 34 (100) 31 (91,2) 30 (88,2) 26 (76,5) 26 (76,5)

ХЛ – хирургическое лечение,

КЛ – комбинированное лечение

Срок выявления отдаленных метастазов варьировал от 6 до 48 месяцев

(табл. 19). При анализе сроков выявления отдаленных метастазов установлено,

что чаще всего отдаленные метастазы, как в основной, так и в контрольной

группе выявлялись на 2 - 3 году наблюдения с момента операции.

Статистически достоверных различий между группами по срокам рецидива

заболевания не зафиксировано.

Таблица 19

Срок обнаружения отдаленных метастазов

Рецидив

заболевания, мес

Группа

1 2

6-12 1 3

13-18 2 2

19-24 1 1

25-30 − −

31-36 − −

37-48 − 1

77

Анализ данных показал, что отдаленных метастазы характерны для

больных низкодифференцированной или слизистой аденокарциномами (табл.

20).

Таблица 20

Отдаленные метастазы при опухолях с различным гистологическим строением

Гистологическое

строение опухоли

Комбинированное лечение Хирургическое лечение

Количество

больных

Отдаленные

метастазы

Количество

больных

Отдаленные

метастазы

Высоко- и умеренно-

дифференцированная

аденокарциномы

22 1 (2.6 %) 12 3 (10%)

Низкодифференци-

рованная

аденокарцинома

8 1 (2.6%) 10 2 (6.7%)

Слизистая

аденокарцинома

6 2 (5.2%) 7 2 (6.7 %)

Перстневидно-

клеточный рак

2 - 1 -

Наиболее неблагоприятным фактором, определяющим прогноз

заболевания, является опухолевое поражение лимфатических узлов.

Отдаленные метастазы в печени имел 1 больной из группы больных,

получивших комбинированное лечение (табл. 21). Отсутствовало

метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов (N0) этого

больного, хотя первичная опухоль проросла через все слои кишечной стенки и

глубоко вросла в клетчатку (Т4). Отмечено, что все больные обеих групп имели

отдаленные метастазы в регионарных лимфатических узлах.

78

Таблица 21

Количество больных с отдаленными метастазами и распространенностью

опухолевого процесса

TNM

Комбинированное лечение Хирургическое лечение

Количество

больных

Отдаленные

метастазы

Количество

больных

Отдаленные

метастазы

T2N0M0 8 0 6 0

T3N0M0 1 0 14 0

T3N1-2M0 5 0 3 0

T4N0M0 24 0 24 1 (4.2%)

T4N1-2M0 18 4 (22.2%) 15 6 (40.0%)

Примеры клинического наблюдения иллюстрируют влияние

гистологического строения опухоли и метастазов в регионарных

лимфатических узлах на прогноз течения заболевания.

Клинические примеры. Больной Ю., 62 лет, история болезни №1737 поступил в

ООД 10.06. 1999 г. с жалобами на периодически возникающую боль схваткообразного

характера в правых отделах живота, вздутие живота. неустойчивый стул. Из анамнеза

известно, что считает себя больным в течение 4 месяцев, когда появились указанные жалобы.

При колоноскопии в области правого изгиба ободочной кишки выявлена плотная, бугристая

опухоль, циркулярно суживающая просвет кишки до 0,7 см. Кроме того, зафиксированы

мелкие полипы (до 3 мм в диаметре) в средней трети поперечной ободочной, в сигмовидной

и прямой кишке.

При цитологическом и гистологическом исследовании биопсийного материала из

области опухоли обнаружены комплексы малодифференцированной аденокарциномы. При

ирригоскопии в восходящей ободочной кишке, ближе к правому изгибу ободочной кишки

визуализирована циркулярная опухоль, суживающая просвет кишки до 2 мм, протяженность

до 5 см. При ультразвуковом исследовании органов брюшной полости не обнаружено

очаговых изменений в печени, при рентгенографии органов грудной клетки свежих очаговых

или инфильтративных процессов в легких, при эзофагогастродуоденоскопии органических

изменений не выявлено.

79

На основании клинико-инструментального обследования установлен диагноз: рак

восходящей ободочной кишки T 4 N х M 0. Из сопутствующих заболеваний: мелкие полипы

ободочной кишки, атеросклероз сосудов сердца, аорты, сосудов головного мозга,

артериальная гипертония II стадии, хронический простатит.

Больной 21.06.99 г. оперирован в плановом порядке. При ревизии органов брюшной

полости в восходящей ободочной кишке, ближе к правому изгибу ободочной кишки,

обнаружена крупная опухоль, прорастающая все слои кишечной стенки, до 6 см в диаметре.

Решено выполнить правостороннюю гемиколэктомию. Первым этапом с помощью

электрокоагуляции мобилизованы слепая кишка и терминальный отдел подвздошной кишки.

Далее рассечена желудочно-ободочная связка в средней трети по направлению к правому

изгибу ободочной кишки. После пересечения диафрагмально-ободочной связки произведена

мобилизация правого изгиба и восходящей ободочной кишки с опухолью, далее пересечены

подвздошно-ободочные, правые ободочные и правая ветвь средних ободочных сосудов и

брыжейки по направлению к границам резекции. Подготовлены площадки для

формирования илеотрансверзоанастомоза. С помощью аппаратов “УО-40” и “УО-60”

пересечена подвздошная кишка, отступя 10 см от илеоцекального угла, затем поперечная

ободочная кишка на границе средней и проксимальной трети в 9 см дистальнее опухоли.

Операция закончена формированием илеотрансверзоанастомоза по типу “конец в конец” с

помощью аппарата “ILA-75” с 3 кассетами. Длительность операции составила 210 минут,

кровопотеря 100 мл.

Послеоперационный период протекал без осложнений. Перистальтика кишечника

восстановилась через 24 ч после оперативного вмешательства. Начато энтеральное питание.

Инфузионная терапия продолжалась в течение 48 ч после операции. Антибактериальную

терапию проводили в течение 5 дней: цефабол по 1,0 г 2 раза и метронидазол по 500 мг 3

раза в сутки. Способность к самообслуживанию восстановилась на 4-й день после

вмешательства. Больной в удовлетворительном состоянии выписан из стационара на 10-е

сутки после операции. Через 20 дней после выписки приступил к работе.

При гистологическом исследовании удаленного операционного препарата № 5734-38

опухоль представлена низкодифференцированной аденокарциномой, инфильтрирующей все

слои кишечной стенки и прорастающей в клетчатку. В 3 из 5, обнаруженных лимфатических

узлах, обнаружены метастазы низкодифференцированной аденокарциномы. Больному

проведено 6 курсов адьювантной химиотерапии в режиме Мейо.

При очередном контрольном обследовании больного через 24 месяца после операции

обнаружены множественные метастазы в обеих долях печени. Больному проведено 5 курсов

80

химиотерапии препаратом второй линии (томудекс). Однако, несмотря на лечение, больной

умер от дальнейшей прогрессии заболевания через 33 месяца после операции.

По поводу рецидива заболевания оперирована 1 пациентка, получившая

комбинированное лечение через 10 месяцев после правосторонней гемиколэктомии. При

ревизии установлено, что один больной имеется метастаз в большой сальник, прорастающий

в подвздошную кишку. Выполнена резекция поперечной ободочной, подвздошной кишки с

резекцией большого сальника и формированием илеотрансверзоанастомоза. Через 6 месяцев

после повторной операции пациентка погибла от дальнейшего прогрессирования

заболевания, несмотря на химиотерапию.

Отдаленные трехлетние результаты прослежены у 20 из 38 больных с

комбинированным лечением и 20 из 30 пациентов получивших только

хирургическое лечение (рис. 12 13). Из 20 пациентов, получивших

комбинированное лечение три и более года назад, 16 (80.0%) больных не имели

признаков рецидива заболевания. Отдаленные метастазы диагностированы в

организме 4 (20.0%) пациентов. Все больные погибли от прогрессии основного

заболевания в срок от 17 до 33 месяцев после операции, средняя

продолжительность их жизни составила 24.0±7.8 месяца. Фактическая

трехлетняя выживаемость пациентов, после комбинированного лечения,

составила 80.0%, безрецидивная – 80.0%.

Рис. 12. Безрецидивная трехлетняя выживаемость больных КРР

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

%

лет

комбинированное хирургическое

81

Из 20 больных, оперированных 3 и более года назад, 10 человек не имели

признаков рецидива заболевания. Отдаленные метастазы диагностированы в

организме 6 пациентов. В результате диссеминации основного заболевания

через 22 до 35 месяцев после операции погибли 5 (13.2 %) пациентов. Средняя

продолжительность жизни этих больных составила 27.4±5.6 месяцев. Одна

больная с выявленными множественными метастазами в печень жива по

настоящее время, ей проводят химиотерапию. Таким образом, фактическая

трехлетняя выживаемость пациентов составила 80.8%, а безрецидивная

трехлетняя выживаемость – 84.2%.

Рис. 13. Фактическая трехлетняя выживаемость больных

колоректальным раком

При анализе зависимости трехлетней выживаемости от

распространенности опухолевого процесса установлено, что основным

фактором, снижающим этот показатель, являют метастазы в регионарные

лимфатические узлы (табл. 22).

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

%

лет

комбинированное хирургическое

82

Таблица 22

Безрецидивная трехлетняя выживаемость больных в зависимости от

распространенности опухолевого процесса

Распространен-

ность

опухолевого

процесса

Группа 1 Группа 2

Количество

оперированных

больных

Количество

больных,

проживших

более 3 лет

Количество

оперированных

больных

Количество

больных,

проживших

более 3 лет

T2N0M0 4 4 4 4

T3N0M0 8 8 5 5

T3N1-2M0 3 3 2 2

T4N0M0 5 5 16 15

T4N1-2M0 8 4 11 6

Так, если при распространенности первичной опухоли T4N0 от рецидива

заболевания умер 1 из 16 пациентов 1-ой группы , то при наличии первичной

опухоли с распространенностью T4N1-2 в течении 3 лет умерли 4 из 8

пациентов, получивших хирургическое лечение, и 5 из 11 пациентов

получивших комбинированное лечение. На протяжении 5 лет прослежена

судьба 14 (36.84%) из 38 пациентов, получивших комбинированное лечение, и

21 (70%) из 30 пациентов после хирургического лечения. Живы в течение 5 лет

10 больных из 14 пациентов после комбинированного лечение, умерли 4

пациента от прогрессирования основного заболевания в срок от 17 до 33

месяцев после операции. Средняя продолжительность жизни таких пациентов

составила 24.2±7.8 месяца. Фактическая 5-летняя выживаемость пациентов,

получивших комбинированное лечение, составила 76.5%. В группе из 21

больного, получивших хирургическое лечение, продолжительность жизни 10

пациентов 5 и более лет. Умерли 7 человек в срок от 22 до 35 месяцев после

операции, средняя продолжительность их жизни составила 27.4±5.6 месяца. В

настоящее время живы 2 больных с признаками прогрессии заболевания. Таким

83

образом, фактическая 5-летняя выживаемость в контрольной группе составила

63.0%.

В 68 случаях оценены уровни онкомаркеров (РЭА, СА 19-9, АФП) в

периферической крови больных. В результате исследования выделены 2

группы: в первую вошли 40 пациентов, нормализация уровней онкомаркеров в

организме которых происходила в течение 18 месяцев после операции. В

течение 18 месяцев после операции высокое содержание онкомаркеров

отмечено в организме 28 пациентов.

В первой группе нормализация содержания опухолевых маркеров в крови

больных происходит в течение 6-18 месяцев и имеет вполне отчетливые

закономерности. Если до лечения повышена концентрация одного из

онкомаркеров (в подавляющем большинстве случаев – РЭА), то он же

определяется и через 6-12 месяцев, при этом, как правило, значение этого

показателя снижается постепенно с каждым полугодием. В тех наблюдениях,

когда до операции повышены концентрации 2 или 3 опухолевых маркеров,

чаще происходила их поочередная нормализация.

Нормальная концентрация всех опухолевых маркеров через 18 месяцев

после оперативного вмешательства является достоверным признаком

отсутствия метастазов и рецидива колоректального рака. Возрастание

концентрации онкомаркеров или изменение соотношение содержания

онкомаркеров через 6-12 месяцев после операции свидетельствует о

прогностически неблагоприятном течении заболевания. Постоянное

повышение концентрации в течение 18 месяцев после операции или повторное

увеличение показателей одного, двух или трех опухолевых маркеров

свидетельствует о наличии отдаленных метастазов или рецидиве

колоректального рака с вероятностью 76.9%.

Проведенный сравнительный анализ отдаленных результатов лечения 64

больных КРР в течение 5 лет выявил следующие закономерности.

Исследование в сыворотке крови онкомаркеров РЭА, СА 19-9, АФП в динамике

за этот период показало, что у 40 (62.5%) больных происходила нормализация

84

их уровней через 24 месяца после окончания лечения в стационаре, что

соответствует отсутствию метастазов и рецидивов заболевания. Сохранение их

высокой концентрации в течение всего периода наблюдения (РЭА – 12.2±0.7,

СА19-9 – 49.0±2.4, АФП – 4.6±0.6) имело место у 28 (43.8%) больных, что

подтверждало наличие генерализации онкологического процесса. Неуклонное

возрастание содержания этих онкомаркеров, а также изменение их

соотношения в течение 6-12 месяцев после лечения можно считать

прогностически неблагоприятными. Статистически значимых различий

изменения уровня онкомаркеров от вида лечения не выявлено. Рецидивы

заболевания возникали в срок от 2-х до 5-и лет, причем, чаще на 4-м году

наблюдения. В группе больных, получавших комбинированное лечение, 1б

подгруппа – 34 человека, они возникали реже, чем в группе больных,

получавших только хирургическое лечение, 1а подгруппа – 30 человек

(соответственно 23.5% и 36.7%). Однако статистически значимых различий

между подгруппами мы не выявили (р>0.05; Uэмп = 6, р≥0.05; Uэмп = –

р≥0.01). Метастазы возникали в срок от 6-ти месяцев до 4-х лет, причем, чаще

на 3-м году наблюдения. У больных 1б подгруппы они возникали реже, чем у

больных 1а подгруппы (соответственно 11.8% и 23.3%). Однако статистически

значимых различий между подгруппами нами также не выявлено (р>0.05; Uэмп

= 6, р≥0.05; Uэмп = – р≥0.01). Фактическая пятилетняя выживаемость

пациентов после комбинированного лечения составила 76.5% (26 из 34

пациентов живы). Смерть восьми пациентов возникла через 4 года после

операции в результате прогрессирования заболевания. Фактическая пятилетняя

выживаемость после хирургического лечения составила 63% (19 из 30

пациентов живы). Смерть одиннадцати пациентов возникла через 4 года после

операции также в результате прогрессирования заболевания. Показатели 5-

летней выживаемости у пациентов получавших комбинированное лечение

статистически значимо выше, чем у пациентов получавших только

хирургическое лечение (Uэмп = 7, р≤0.05; Uэмп = 3 р≤0.01).

85

ГЛАВА 4. ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ

РАКОМ

4.1 Патоморфологические характеристики опухолевых тканей

Степени дифференцировки и гистологическое строение опухоли

определяли согласно международной гистологической классификации

опухолей кишечника N15, принятой ВОЗ в 1981 г. [Кныш В.И., 1997].

Опухоли больных группы 1 представлены в основном аденокарциномами

разной степени дифференцировки (табл. 23).

Таблица 23

Распределение гистологических форм опухолей в группах больных,

получавших разные виды лечения

Гистологические формы

опухолей

Группа 1 Количество

больных

Хирургичес-

кое лечение

Комбинирован-

ное лечение

абс.

%

Высокодифференцирован-

ная аденокарцинома 4 2 6 8.8

Умереннодифференцирован-

ная аденокарцинома 20 25 45 66.2

Низкодифференцированная

аденокарцинома 2 3 5 7.3

Слизистая аденокарцинома 2 2 4 5.9

Перстневидно-клеточный рак 2 2 4 5.9

Плоскоклеточный рак 0 4 4 5.9

Всего 30 38 68 100

Реже выявляли слизистую аденокарциному и перстневидно-клеточный

рак. Проведено гистологическое исследование 68 фрагментов кишечной стенки

с микроскопически хорошо выраженным ростом опухоли, которая чаще

вдавалась в просвет кишки в виде узла. Граница опухоли в стенке кишки, как

правило, не определялась. В ткани опухоли присутствовали вторичные

86

изменения в виде участков некроза и кровоизлияний, возникающих в процессе

роста атипичной ткани. Гистологически во всех объектах подтвержден

злокачественный процесс в виде аденокарциномы. Плоскоклеточный рак со

слабовыраженным ороговением идентифицирован у 4 больных.

Высокодифференцированная аденокарцинома имеет гистологические

признаки, аналогичные признакам нормального эпителия. Со стороны

слизистой оболочки в стенку кишки до мышечного или серозного слоев

распространяются атипичные железистые структуры. Выстилка желез

представлена одно- или многоядерным эпителием кишечного типа с

признаками клеточного атипизма. Ядра клеток имеют овальную форму.

Ядерно-цитоплазматическое соотношение смещается в сторону ядра. Ядро

располагается в базальной или апикальной части клеток, а хроматин

представлен в виде мелких зерен и глыбок. В препаратах на одну железу

присутствуют от 5 до 6 клеток в стадии митоза, в том числе, его атипичной

формы. Наблюдаются дистрофические изменения опухолевых клеток. Анализ

соотношения паренхиматозных элементов и стромы показал, что

специфические железистые структуры расположены в виде групп, которые

разделены прослойками волокнистой ткани. В мышечном слое кишечной

стенки располагаются цепочки атипичных клеток. Среди волокон

соединительной ткани выявлены мелкие артерии, вены и капилляры с

выраженным полнокровием, наличием периваскулярных кровоизлияний и

отложением в периваскулярных областях зерен гемосидерина. Повреждение

стенок сосудов способствует проникновению опухолевых клеток в сосудистое

русло и распространению гематогенных метастазов. Выявлены крупные зоны

некроза, как на поверхности опухоли, так и в глубоких отделах узла, что

свидетельствует об инвазивном росте структур опухоли и повреждающем ее

действии на ткань. Поскольку опухолевая ткань имеет более или менее

выраженную степень анаплазии, то в процесс ее роста включаются иммунные

механизмы местной защиты макроорганизма. На границе опухолевого роста и

87

между структурами опухоли выявлены разной плотности скопления зрелых

лимфоцитов, а также фибробластическая реакция стромы (рис. 14).

Рис. 14. Высокодифференцированная аденокарцинома толстой

кишки. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×400.

Умереннодифференцированная аденокарцинома по набору

гистологических признаков занимает промежуточное положение между

высокодифференцированными и низкодифференцированными опухолями. При

микроскопическом исследовании опухолей этой группы выявлены железы

кишечного типа, аналогичные железам высокодифференцированной

аденокарциномы. Выявлены и менее дифференцированные структуры,

построенные по типу криброзных, а также клеточные поля с четким

инвазивным типом роста. Выявлены крупные клетки с большими одним или

несколькими ядрами. Железистые и криброзные структуры и расположены

рядом и отделены друг от друга небольшими участками стромы. На границе и в

толще опухолевой ткани обнаружены густые скопления клеток лимфоидного

ряда и мелкие фолликулы. В отдельных случаях, в состав клеточного

инфильтрата входят нейтрофильные лейкоциты, макрофаги, клетки

фибробластического ряда. Сосудистый компонент опухоли представлен

многочисленными мелкими артериями, венами и капиллярами с избыточным

88

кровенаполнением, явлениями стаза и диссоциацией крови на плазму и

форменные элементы. Хорошо развитая сосудистая сеть способствует процессу

метастазирования. Среди дифференцированных структур встречаются железы с

кистозными изменениями, выстланные уплощенным атипичным эпителием. В

просветах таких структур обнаружены перстневидные, продуцирующие слизь

клетки, которые имеют округлую форму и сдвинутое на периферию

уплощенное ядро. Цитоплазма выглядела прозрачной за счет накопления слизи,

которая заполняет пространство между клеточными структурами. Описанная

морфологическая картина соответствует умереннодифференцированной

аденокарциноме с элементами мукоцеллюлярного рака (рис.15).

А Б

В Г

Рис. 15. Структура аденокарцином толстой кишки. Окраска

гематоксилином-эозином. Увеличение × 400.

89

Умереннодифференцированная аденокарцинома с (А) инфильтрирующим ростом,

некрозом опухолевой ткани, которая прорастает в сосуды; (Б) с элементами слизистого рака;

(В) с элементами высокой степени дифференциации, присутствуют перстневидные клетки,

полости со слизью; инфильтрирующий рост с началом инвазии в мышечную ткань, хорошо

выраженная лимфоцитарная инфильтрация на границе опухоли и здоровой ткани. Низкодифференцированная аденокарцинома (Г) с диффузным ростом, перстневидными

клетками, заполненными слизью полостями, криброзные и солидные структуры в плотной

волокнистой ткани.

Плоскоклеточный рак представлен комплексами атипичных клеток

многослойного плоского эпителия (рис. 16).

Рис. 16. Плоскоклеточный рак анального канала. Окраска

гематоксилином-эозином. Увеличение × 400.

Комплексы клеток диффузно располагаются в стенке кишки, имеют

округлую или овальную форму. В центральных отделах слоистых комплексов

выявлены массы ороговевших клеток. В состав атипичных клеточных

комплексов входят клетки шиповатого слоя. В клетках видны крупные ядра с

зернистым расположением хроматина. Ядра расположены в центральных

отделах клеток. Митозы встречаются редко, на уровне базальных отделов

клеточных комплексов. Строма опухолевой ткани хорошо выражена,

представлена зрелыми коллагеновыми волокнами с наличием между ними

зрелых клеток лимфоидного ряда, одиночных нейтрофилов, эозинофилов,

плазмоцитов и клеток фибробластического ряда. Строма рыхлая с умеренным

отеком и одиночными полнокровными сосудами.

90

Удалены и извлечены для гистологического исследования 150 полипов во

время проведения эндоскопических полипэктомий 40 пациентов группы 1.

Гистологический анализа показал, что удаленные полипы имеют строение

тубулярных и тубулярно-ворсинчатых аденом, а также ворсинчатой аденомы

(табл. 24).

Таблица 24

Гистологическое строение полипов

Морфологический тип Количество больных

абс. %

Гиперпластический полип 10 6.7

Тубулярная аденома 50 33.3

Тубулярно-ворсинчатая аденома 50 33.3

Ворсинчатая аденома

Из них − малигнизированные

40

10

26.7

6.7

Всего 150 100.0

Гиперпластических полипов обнаружено в 2 раза больше, чем

малигнизированных ворсинчатых аденом.

4.2 Изучение чувствительности к химиотерапевтическим препаратам

первичных культур клеток опухолевой и нормальной эпителиальной

ткани кишечника

Термин «химиотерапия опухолей» подразумевает все виды

лекарственного лечения в виде воздействия фармакологических средств на

пролиферацию и жизнеспособность опухолевых клеток. Недостатком

традиционных режимов химиотерапии неопластических заболеваний является

активация в клетках механизмов адаптации и резистентности к

цитотоксическому действию препаратов. Перспективное решение этой

комплексной проблемы учитывает биологическую гетерогенность опухолей и

кластеров клеток разных зон одной опухоли, предполагает применение

91

препаратов-ингибиторов нескольких ключевых молекулярных мишеней в

опухолевых клетках. Стратегически обоснованным подходом повышения

эффективности терапевтических схем лечения является определение

индивидуальных фенотипических и генетических профилей опухолевых

клеток, которое возможно при правильном выборе тест-объекта. В работе в

качестве тест-объекта для оценки чувствительности к противоопухолевым

препаратам использованы первичные неперевиваемые культуры клеток разных

гистологических форм КРР выделенные из биопсийного материала больных

подгруппы 1а, получивших комбинированное лечение (табл. 25).

Таблица 25

Гистологический анализ опухолевой ткани больных КРР

№ Гистологические формы

1 Низкодифференцированная аденокарцинома. Диффузный рост с наличием

перстневидных клеток, полостей, заполненных слизью, криброзных и

солидных структур, расположенных среди плотной волокнистой ткани.

2 Низкодифференцированная аденокарцинома. Инвазивный рост, большое

количество митозов. Клеточный атипизм, ядерный полиморфизм.

Массивные некрозы. Опухоль прорастает всю стенку кишки.

3 Умереннодифференцированная аденокарцинома. Перстневидные клетки,

полости заполненные слизью. Инфильтрирующий рост с началом инвазии в

мышечную стенку, лимфоцитарная инфильтрация на границе опухоли и

здоровой ткани.

4 Умереннодифференцированная аденокарцинома с элементами слизистого

рака.

5 Умереннодифференцированная аденокарцинома. Криброзные структуры,

клеточный атипизм, митозы атипичного вида.

6 Умереннодифференцированная аденокарцинома. Диффузный рост.

Большое количество митозов и клеток с несколькими ядрышками в ядрах.

Опухоль прорастает в стенку кишки.

7 Умереннодифференцированная аденокарцинома. Инфильтрирующий рост

опухолевой ткани, некрозы. Опухоль прорастает в сосуды.

8 Высокодифференцированная аденокарцинома. Эпителиальные клетки

92

расположены плотно, железы образованы атипичным эпителием,

формируют комплексы и поля, тип роста инфильтрирующий. Клеточные

ядра разные, присутствует хроматин. Некрозы.

9 Низкодифференцированная аденокарцинома. Большое количество митозов.

10 Умереннодифференцированная аденокарцинома. Диффузный рост

опухоли, которая прорастает в стенку кишки. Митозы, несколько ядрышек

в ядрах клеток.

4.3 Характеристика первичных культур клеток

В нашей работе из фрагментов аденокарцином и нормальной

эпителиальной ткани при помощи механической и ферментативной

дезагрегации получены суспензии клеток, которые не подвергались

пассированнию и субкультивированию, и согласно требованиям к выделению и

идентификации, принятым в Международной федерации Коллекций Культур

[Churchill, Livingstone, 1975], называются первичными неперевиваемыми

культурами клеток.

При делении клеточных культур на 3 категории учитывают стабильность

морфологических характеристик и особенности деления клеток в условиях in

vitro. Первичные культуры не требуют использования специальных методов

культивирования, в отличие от культур которые получили название линии

клеток. Клетки со стабильными биологическими свойствами, диплоидным

набором хромосом, которые сохраняются без изменения в течение 10 — 12 мес

(до 50 пассажей) и получены из эмбриональных тканей называются

эмбриональные линии клеток. Термином перевиваемые линии клеток

обозначают клетки, полученные из нормальных и раковых тканей, которые

размножаются неограниченно долго и адаптированны к росту и делению в

стандартных ростовых питательных средах [Willmer E.N., Paul J., 1965].

Работа с первичными культурами клеток не предполагает создания

типового паспорта с описанием условий культивирования и криоконсервации,

определения жизнеспособности клеток, их морфологии, видовой

93

идентификации клеточных линий с помощью кариологического и

изоферментного анализа.

В нашей работе первичные неперевиваемые культуры, полученые из

нормальной ткани, содержали клетки с диаметром 3.5±0.02 мкм (n=25, SD=0.1),

с субстрат зависимым ростом, площадь ядра клеток составляла 50.6±1.0 мкм2

(n=25, SD=5). Клетки были жизнеспособны в течение 30 дней. В культурах,

полученных из аденокарцином, овальные, круглые и перстневидные по форме

клетки имели малую (3.6±0.2 мкм, n=25, SD=0.8) и большую (12.0±0.6 мкм,

n=25, SD=3.8) полуоси. Площадь ядер в клетках составляла 147.2±10.5 мкм2 –

низкодифференцированная (n=25, SD=52.5), 213.7±3.4 мкм2 –

умереннодифференцированная (n=25, SD=17) и 375.0±17.0 мкм2

–

высокодифференцированная (n=25, SD=85) аденокарциномы. Опухолевые

клетки сохраняли жизнеспособность в течение 50 − 60 дней. Пролиферацию

клеток поддерживали систематической сменой питательной среды.

Микроскопирование препаратов первичных культур клеток показало, что

70% − 80% клеток относятся к эпителиальной ткани, а остальные относятся к

другим видам тканей. Эти данные соответствуют исследованиям Vierck J.L.

(2000) и Quinlan S. (2010). Установлено, что такой уровень контаминации

клетками других тканей стимулирует рост и развитие первичных культур

эпителиальных клеток в условиях in vitro [Quinlan S., 2010]. Предотвращение

преимущественного роста клеток других тканей достигали двойной обработкой

трипсином культур эпителиальных клеток согласно рекомендациям Paul J. [Paul

J., 1975].

Контроль микробиологической контаминации культур клеток

осуществляли классическими микробиологическими методами – посев на

чашки с селективно-дифференциальными средами (Эндо, Мак Конки,

Олькеницкого). В экспериментальной работе использовали образцы первичных

культур клеток, в которых смесь антибиотиков (стрептомицин, пенициллин и

канамицин) подавляли рост и развитие микрофлоры.

94

Нарушение регуляции адгезии и роста раковых клеток вызывает

необратимое нарушение морфогенетических реакций на контакты с другими

клетками и поверхностью лабораторной посуды [Abdelkader H. et al., 2010]. Это

явление получило название AIG (anchorage-independent growth) или субстрат-

независимый рост клеток. Количественная оценка субстрат-независимого роста

используется для выявления чувствительности или резистентности опухолевых

клеток к цитостатикам [N. Ke et al., 2004].

4.4 Изучение количества клеток с хромосомными аберрациями,

анеуплоидных, пролиферирующих и колониеобразующих клеток в

первичных культурах

Основными типами хромосомных аберраций (ХА) в опухолевых клетках

являются дицентрические хромосомы − (0.57±0.03)%, парные и непарные

хроматидные делеции − (0.71±0.01)% (рис. 17 А, Б), уровень которых в

нормальных эпителиальных клетках соответственно (0.01±0.001)% и

(0.02±0.004)%.

А Б

Рис 17. Хромосомные аберрации в опухолевых клетках.

95

Стрелкой указаны дицентрик и парные хроматидные делеции (А), непарная хроматидная

делеция (Б). Увеличение ×1000.

Обнаружено, что количество клеток с хромосомными аберрациями (ХА)

и уровень митотического индекса (МИ) в первичных культурах нормальных

эпителиальных клеток составляют соответственно 0.2±0.002% (n=10, SD=0.007)

и 22.3±0.3% (n=6, SD=0.6). В первичных культурах клеток, полученных из

низко- и умереннодифференцированных аденокарцином, клеток с ХА от

2.1±0.4% (n=7, SD=1.07) до 12.1±3.6% (n=7, SD=9.5). В культурах полученных

из высокодифференцированной аденокарциномы клеток с ХА 8.1±0.9% (n=8,

SD=2.6). Корреляционная зависимость уровня клеток с ХА от МИ отсутствует в

культурах, полученных из двух низко- и трех умереннодифференцированных

аденокарцином (табл. 26). Корреляционная зависимость количества клеток с

ХА от МИ обнаружена в культурах клеток, полученных из одной низко-, трех

умеренно- и одной высокодифференцированной аденокарцином.

Таблица 26

Корреляционная зависимость количества клеток с хромосомными

аберрациями и пролиферирующих клеток в первичных культурах

№ п/п

боль

ного

Вид

аденокарциномы

Количество

клеток с

хромосомными

аберрациями,

M±m (%)

Митотический

индекс, M±m

(%)

Коэффицие

нт

корреляции

n р

1 Низко- 5.7±0.9 39.5±3.2 0.33 12 >0.05

2 Дифференци- 9.6±0.9 27.0±3.6 0.48 10 >0.05

3 Рованная 11.2±3.1 29.2±2.7 0.55 11 <0.05

4 12.1±3.6 26.8±1.1 0.67 10 <0.05

5 3.6±1.0 27.6±1.4 0.02 10 >0.05

6 Умеренно- 7.4±2.0 34.9±3.6 0.32 12 >0.05

7 Дифференци- 15.1±3.7 41.7±7.3 0.69 11 <0.05

8 Рованная 2.1±0.4 27.1±2.2 0.52 11 <0.05

9 4.8±0.8 25.5±2.0 0.001 12 >0.05

10 Высоко-

дифференцированн

ая

8.1±0.9 8.1±0.9 0.64 11 <0.05

96

Количество анеуплоидных клеток в первичных культурах нормальных

эпителиальных клеток в 2.8 раза меньше, (1.6±0.04%), чем в культурах клеток

аденокарцином − 5.7±0.9%, (p<0.05). В суспензиях эпителиальных клеток,

полученных из биоптатов больных КРР, процент клеток с колониеобразующей

активностью составляют 1.0×10-3

– 2.3×10-2

%. Эти результаты свидетельствуют

о том, что клетки с колониеобразующей активностью могут быть обнаружены в

нормальной ткани, расположенной рядом с аденокарциномами, которые имеют

разную степень дифференциации. Несмотря на различия гистологических

форм, эти виды аденокарцином имеют такие общие характеристики, как

присутствие некрозов и большое количество клеток с высокой

пролиферативной активностью.

4.5 Определение чувствительности к химиотерапевтическим

препаратам эпителиальных клеток кишечника больных

колоректальным раком in vitro

Химические соединения с разными механизмами действия, обладающие

цитотоксической и цитостатической активностью, использованы в качестве

позитивного контроля в экспериментах по тестированию устойчивости

неопластических клеток к лекарственным препаратам. Классическими

представителями электрофильных соединений группы эффективных

противоопухолевых препаратов являются N-метил-N’-нитро-N-

нитрозогуанидин (МННГ) и циклофосфамид (ЦФ) [Wyatt M.D. et al., 2006].

Химические соединения, такие как МННГ (монофункциональное, SN1 группа)

и ЦФ (бифункциональное, SN2 группа), вызывают образование 12 видов

алкилированных аддуктов азотистых оснований в нуклеотидной

последовательности ДНК. Основное отличие действия моно- и

бифункциональных соединений заключается в том, что кроме алкилирования

ДНК такие метаболиты ЦФ, как свободные радикалы, вызывают окисление

нуклеотидов. В результате токсического действия алкилирующих соединений

97

активируется процесс апоптоза или индуцируется Р53-независимый некроз

определенных популяций опухолевых клеток [Bardelli A., et al., 2001].

А Б

В Г

Рис. 18. Дозо зависимое изменение количества колониеобразующих,

анеуплоидных, пролиферирующих клеток и клеток с хромосомными

количество клеток с колониеобразующей активностью

количество клеток с пролиферативной активностью

клетки с хромосомными аберрациями

количество анеуплоидных клеток

Циклофосфамид Циклофосфамид

N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидин

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50

коли

чес

тво к

лет

ок, %

мкг/мл 0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 к

оли

чес

тво к

лет

ок, %

мкг/мл

0

5

10

15

20

25

30

35

0 25 50 75 100

коли

чес

тво к

лет

ок, %

мкг/мл 0

10

20

30

40

0 25 50 75 100

коли

чест

во к

лет

ок, %

мкг/мл

98

аберрациями в культуре нормальных (А, В) и опухолевых (Б, Г)

эпителиальных клеток, обработанных N-метил-N’-нитро-N-

нитрозогуанидином и циклофосфамидом.

Концентрации цитостатиков в инкубационной среде больше 20 мкг/мл

(МННГ) или 50 мкг/мл (ЦФ) вызывают повышение количества клеток с

пульверизацией хромосом и снижение количества клеток с колониеобразующей

активностью. Пульверизация хромосом не является следствием аккумуляции

множественных разрывов ДНК [Stevens J.B. et al., 2007]. Предполагают, что

массовая фрагментация хромосом возникает в результате разрывов фрагильных

(ломких) участков микросателлитной ДНК в клетках, которые имеют такие

специфические характеристики [Rowley J.D. et al., 2008], как дефекты

процессов конденсации хроматина, репарации ДНК, ДНК-белковых

взаимодействий. Следствием массовой фрагментации хромосом является

гибель клеток [Hübner B.J.H. et al., 2009], которая искажает оценку

резистентности клеток к цитостатикам. Экспериментально установлено, что

уровни геномной и хромосомной нестабильности, колониеобразующей и

пролиферативной активности нормальных эпителиальных клеток и клеток

аденокарцином после воздействия 20 мкг/мл МННГ или 50 мкг/мл ЦФ

функционально не зависят от явления массовой фрагментации и пульвиризации

хромосом. Эти результаты работы показали, что 20 мкг/мл МННГ или 50

мкг/мл ЦФ являются оптимальными концентрациями в контрольных вариантах

экспериментов с культурами клеток аденокарцином других гистологических

форм.

Обработка ЦФ клеток, полученных из низкодифференцированных

аденокарцином, или обработка ЦФ и МННГ клеток, полученных из умеренно- и

высокодифференцированных аденокарцином, вызывают снижение

митотического индекса. Аналогичное влияние на клетки, полученные из

умеренодифференцированных аденокарцином, оказывают 5-БУ в комбинации с

ультрафиолетовым излучением (рис. 19 А).

99

А Б

Рис. 19. Влияние N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина (МННГ),

циклофосфамида (ЦФ), 5-бромурацила в комбинации с УФ излучением (5-

БУ+УФ) на пролиферативную активность (А) и на количество клеток с

хромосомными аберрациями (Б) в культурах клеток, полученных из НД –

низкодифференцированной, УД – умереннодифференцированной и ВД –

высокодифференцированной аденокарцином.

* – р < 0.05 по отношению к контролю.

Действие 5-БУ в комбинации с ультрафиолетовым излучением

заключается в активации процесса апоптоза в клетках эукариот, мутантных по

гену, кодирующему тимидилат-синтетазу [Worthley D.L., 2007]. Обработка

тестерными химическими соединениями или 5-БУ в комбинации с УФ вызвала

повышение количество клеток с хромосомных аберрациями в первичных

культурах, полученных из низкодифференцированных аденокарцином. Если в

культурах клеток, полученных из умереннодифференцированных

аденокарцином, тестерные мутагены не вызвали изменение количества клеток с

ХА, то обработка циклофосфамидом или 5-БУ в комбинации с УФ культур

клеток полученных из высокодифференцированной аденокарциномы вызвала

соответственно повышение или уменьшение количества клеток с

хромосомными аберрациями.

НД НД УД ВД УД ВД

Коли

чес

тво к

лет

ок с

хром

осо

мн

ым

и а

бер

рац

иям

и, %

100

Хромосомная и геномная нестабильность, митотический индекс.

Использование панели музейных перевиваемых культур неопластических

клеток [Baer J.C. et al., 2008] помогает решить задачу доклинического

скрининга цитостатиков, выбрать схему противоопухолевой терапии, оценив

эффективность действия препаратов на рост и деление неопластических клеток

с известными фенотипическими и генотипическими характеристиками.

Очевидно, при помощи такой системы скрининга невозможно определить

индивидуальную чувствительность или прогнозировать развитие

химиорезистентности опухолевых клеток больных КРР. С целью устранения

перечисленных недостатков в работе апробирована модель скрининга, в

которой тестерным объектом являются первичные культуры клеток,

полученные из опухолевой ткани больных КРР. Результаты работы показали,

что концентрации цитостатиков, соответствующие их терапевтическим дозам,

максимально эффективно снижают количество анеуплоидных клеток, клеток с

хромосомными аберрациями и митотический индекс в первичных культурах

клеток, полученных из высокодифференцированной аденокарциномы (рис. 20

А-Г). Цисплатин, лейковорин и 5-ФУ вызывают снижение количества

анеуплоидных клеток в первичных культурах клеток, полученных из низко- или

умереннодифференцированной аденокарцином (рис. 20 А, В, Г). Максимально

эффективное влияние на геномную стабильность и деление клеток всех

подгрупп первичных культур клеток аденокарцином оказала комбинация 5-ФУ

с лейковорином (рис. 20 Ж). Необходимо отметить, что по сравнению с 5-

БУ+УФ излучение такие препараты, как цисплатин, 5-ФУ и их комбинации с

лейковорином вызвали повышение в 1.4-1.8 раза количества клеток с

хромосомными аберрациями в культуре клеток, полученных из

умереннодифференцированных аденокарцином (рис. 20 А, Б, Г, Д и Ж).

101

А Б

В Г

Д Е

Ж

Рис. 20. Количество клеток с хромосомными аберрациями,

полиплоидных и пролиферирующих клеток (%) в культурах клеток,

полученных из низко- (НД), умеренно- (УД) и

высокодифференцированных (ВД) аденокарцином, обработанных

противоопухолевыми препаратами.

0

2

4

6

8

10

НД УД ВД ко

ли

чес

тво

клет

ок, %

5-фторурацил+лейковорин

0

5

10

15

20

НД УД ВД

коли

чес

тво к

лет

ок, %

томудекс+лейковорин

0

5

10

15

20

НД УД ВД

коли

чес

тво к

лет

ок, %

цисплатин+лейковорин

0

10

20

30

40

НД УД ВД

коли

чес

тво

клет

ок, %

лейковорин

0

20

40

60

80

100

НД УД ВД ко

ли

чес

тво

клет

ок, %

цисплатин

0

5

10

15

20

НД УД ВД

кол

ич

еств

о к

лет

ок, %

5-фторурацил

* *

*

* *

*

*

* * *

*

*

*

*

* *

*

*

*

*

* * * *

*

*

0

20

40

60

80

100

НД УД ВД

ко

ли

чес

тво

клет

ок, %

томудекс

*

количество клеток с хромосомными

аберрациями

количество анеуплоидных клеток

количество пролиферирующих

клеток

102

* – р < 0.05 по отношению к монопрепарату

Колониеобразующая активность. Первичные культуры клеток,

полученные из аденокарцином с различной степенью дифференциации,

различаются не только по митотическому индексу, уровню клеток с

повреждением хромосом, геномными аномалиями, но и колониеобразующей

активностью. Анализ результатов показал, что как циклофосфамид, в отличие

от МННГ, так и 5-ФУ, ЦП, ЛВ, ТД стимулируют колониеобразующую

активность клеток, полученных из низкодифференцированных аденокарцином.

Все цитостатики, кроме лейковорина и томудекса не влияют на

колониеобразующую активность клеток, полученных из

умереннодифференцированных аденокарцином (рис. 21).

Рис. 21. Колониеобразующая активность опухолевых клеток больных

КРР

Аденокарциномы: НД – низкодифференцированная, УД – умереннодифференцированная, ВД

– высокодифференцированная.

р < 0.05 по отношению к а – N-метил-N’-нитро-нитрозогуанидину,

б – N-метил-N’-нитро-

нитрозогуанидину и циклофосфамиду, в – 5-фторурацилу или лейковорину,

г – цисплатину,

д –

томудексу.

Лейковорин ингибирует колониеобразующую активность клеток,

полученных из умереннодифференцированных аденокарцином. Цисплатин и

0

50

100

150

200

МННГ ЦФ 5-ФУ ЦП ЛВ ТД 5-

ФУ+ЛВ

ЦП+ЛВ ТД+ЛВ

Коли

чес

тво к

олон

иео

браз

ую

щи

х

клет

ок

НД УД ВД

а

г

д

а а

а

а

в

б б б

103

лейковорин стимулирует клониеобразующую активность клеток, полученных

из высокодифференцированной аденокарциномы.

4.6 Ингибирование химиотерапевтическими препаратами

пролиферативной активности опухолевых клеток

Динамика роста опухолевых клеток, обработанных цитостатиками in

vitro, имеет индивидуальные особенности (рис. 22).

А Б

В

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 1 2 3 4 5 6

Оп

тическ

ая п

лотн

ост

ь, О

П

час

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 24 48 72 96

Оп

тическ

ая п

лотн

ост

ь, О

П

час 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 24 48 72 96

Оп

тичес

кая

плотн

ост

ь, О

П

час

Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной

Основной Основной Основной Основной Основной Основной Основной час контроль

5-фторурацил

цисплатин

томудекс

лейковорин

104

Рис. 22. Влияние цитостатиков на динамику роста культур клеток,

полученных из аденокарцином:

А – низкодифференцированных, Б – умереннодифференцированных, В –

высокодифференцированных.

Клетки первичных культур, полученных из низкодифференцированных

аденокарцином, практически не чувствительны к цитотоксическому действию

лекарственных препаратов, которые добавляли в конечных концентрациях,

соответствующих их терапевтическим дозам. Исключением является высокая

чувствительность к томудексу клеток, полученных из

низкодифференцированных аденокарцином (рис. 22 Б). Максимально

чувствительными к цитотоксическому действию противоопухолевых

препаратов являются клетки, полученных из высокодифференцированных

аденокарцином.

Экспериментально выявлено, что комбинации противоопухолевых

препаратов эффективнее подавляют развитие опухолевых клеток (рис. 23).

105

А Б

В

Рис. 23. Влияние комбинаций цитостатиков на динамику роста

культур клеток, полученных из аденокарцином:

А – низкодифференцированных, Б – умереннодифференцированных, В –

высокодифференцированных.

Клетки первичных культур, полученных из аденокарцином с разной

степенью дифференциации, различаются по чувствительности к цитостатикам,

которые относятся к разным группам химических соединений. Детальная

характеристика опухолевых клеток представлена в таблице 27.

противоопухолевые препараты обладают не только цитостатическим, но и

мутагенным действием. В ответ на мутагенное действие цитостатиков в

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 24 48 72 96

Оп

тичес

кая

плотн

ост

ь, О

П

час 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 24 48 72 96

час

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 24 48 72 96

Оп

тичес

кая

плотн

ост

ь, О

П

час

Основной Основной Основной Основной Основной Основной

Основной Основной Основной Основной Основной Основной

час контроль

5-фторурацил + лейковорин

цисплатин + лейковорин

томудекс + лейковорин

106

опухолевых клетках активируется процесс мутагенеза. Гипермутагенез и

снижение чувствительности клеток к цитостатическому действию препаратов

являются признаками мутаторного фенотипа клеток, который подтвержден при

помощи метода ПЦР.

4.7 Оценка экспрессии генов репарации ошибочно спаренных оснований

системы больных колоректальным раком

Одной из причин развития КРР являются соматические мутации в генах

системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММR система) [Genschel

et al., 1998]. В клетках, мутантных по гену MSH6, высокая экспрессия белка

MSH3, а в клетках, мутантных по гену MSH2, не экспрессируются белки MSH3

и MSH6 [Drummond et al., 1997]. Анализ продуктов ПЦР реакции

свидетельствует о присутствии мутаций в генах MSH6 (два пациента с

умереннодифференцированной и один пациент с высокодифференцированной

аденокарциномами) и MSH2 (два пациента с умереннодифференцированной и

один пациент с низкодифференцированной аденокарциномами) (рис. 24).

1 3 4 6 8 10

1 4 2 5 7 9

Рис. 24. Анализ экспрессии генов MSH3 и MSH2 в клетках больных

колоректальным раком

Экспрессия гена MSH3 в опухолевых клетках, мутантных по гену MSH6 –

пациенты «4» и «6» с умереннодифференцированной и «10» пациент с

высокодифференцированной аденокарциномами.

β-актин

MSH3

β-актин

MSH2

107

Экспрессия гена MSH6 в опухолевых клетках, мутантных по гену MSH2 –

«2», «5», «7» и «9» пациенты с умереннодифференцированной

аденокарциномами.

В качестве контроля в анализе использованы праймеры к гену, продуктом

которого является β-актин.

108

Таблица 27

Фенотипические и генотипические характеристики опухолевых клеток

Характеристики

Степень дифференциации аденокарцином

низкая умеренная Высокая

1 2 9 3 4 5 6 7 10 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Контроль

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

5.7±0.9 9.6±0.02 11.2±0.04 12.1±0.9 3.6±0.1 7.4±0.04 15.2±0.6 2.1±0.01 4.8±0.4 8.2±0.02

Митотический индекс, % 36.6±0.2 20.8±0.2 23.6±1.8 18.2±2.4 6.2±0.2 26.6±3.4 38.4±1.8 5.2±0.02 13.3±0.02 15.4±0.2

Количество анеуплоидных

клеток, %

2.8±0.2 7.4±0.2 15.2±0.2 10.1±1.3 4.6±0.2 15.7±0.9 2.3±0.3 1.7±0.9 3.6±0.02 9.1±0.1

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

2.3×10-2

1.2×10-2

0 1.0×10-3

0 0 1.0×10-4

0 0 3.0×10-5

MSH6 + + +

MSH2 + + +

R 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5-фторурацил

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

22.4±0.02 29.1±0.9 6.7±0.02 15.8±0.04 5.6±0.4 12.2±0.2 9.8±0.06 3.4±0.3 7.2±0.2 9.4±0.02

Митотический индекс, % 12.1±0.9 14.2±1.2 9.2±0.2 10.4±0.8 17.8±0.2 9.8±0.6 10.6±0.4 3.4±0.3 14.2±0.2 12.6±0.2

Количество анеуплоидных

клеток, %

8.1±0.1 13.3±0.01 2.2±0.001 9.4±0.2 4.8±0.002 6.2±0.02 4.4±0.2 6.1±0.01 10.4±0.8 7.2±0.4

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

2.8×10-2

6×10-4

1.0×10-5

2×10-4

0 0 0 0 1.0×10-4

0

R 0.063 0.12 0.75 0.063 0.9 0.125 0.563 0.813 0.563 0.438

Цисплатин

Количество клеток с 15.2±0.4 13.4±0.6 4.8±0.2 14.6±0.02 8.4±0.6 13.2±02. 19.5±0.5 12.1±0.1 4.4±0.02 5.3±0.3

109

хромосомными аберрациями,

%

Митотический индекс, % 23.8±0.2 14.6±0.02 6.9±0.1 35.9±0.9 2.4±0.02 11.2±0.4 27.4±0.2 38.6±0.4 34.2±0.2 10.4±0.3

Количество анеуплоидных

клеток, %

7.2±0.4 14.6±0.4 9.6±0.2 8.2±0.02 4.8±0.6 15.3±0.9 3.1±0.01 4.4±0.2 2.2±0.02 6.4±0.04

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

3.4×10-2

2.4×10-2

0 1.5×10-3

1.×10-5

0 1.9×10-3

0 0 1.1×10-4

R 0.12 0.188 0.813 0.438 0.875 0.813 0.5 0.75 0.813 0.563

Томудекс

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

8.7±0.3 9.6±0.4 8.1±0.001 6.2±0.2 4.4±0.02 2.2±0.02 9.2±0.04 2.3±0.3 3.8±0.04 4.2±0.02

Митотический индекс, % 4.4±0.02 7.4±1.2 4.4±0.02 9.7±0.3 2.6±0.01 2.2±0.02 7.1±0.1 5.4±0.2 4.3±0.3 3.4±0.2

Количество анеуплоидных

клеток, %

6.2±0.02 8.0±0.001 0.4±0.001 5.2±0.02 6.2±0.01 3.1±0.01 2.1±0.02 3.3±0.03 1.7±0.001 6.5±0.5

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

1.9×10-2

8.2×10-3

0 0 0 0 0 0 0 0

R 0.25 0.313 0.75 0.118 0.125 0.688 0.75 0.313 0.125 0.0625

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Лейковорин

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

13.8±1.2 14.6±0.4 6.9±0.03 5.4±0.02 3.8±0.01 4.2±0.02 17.8±0.6 3.7±0.01 4.5±0.5 20.4±3.2

Митотический индекс, % 9.8±0.6 19.6±0.3 7.3±0.3 12.3±0.9 2.4±0.02 4.2±0.02 15.6±0.4 5.6±0.2 13.1±0.1 22.4±0.4

Количество анеуплоидных

клеток, %

11.2±0.4 9.5±0.5 2.3±0.3 4.7±0.9 0.4±0.03 6.4±0.02 12.8±1.1 4.4±0.04 5.7±0.03 25.5±0.5

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

9.8×10-3

1.2×10-4

1.3×10-6

0 0 0 1.7×10-4

0 0 8.3×10-5

R 0.438 0.313 0.563 0.062 0.188 0.062 0.5 0.438 0.062 0.125

110

5-фторурацил+лейковорин

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

8.2±0.02 5.7±0.03 4.3±0.03 5.2±0.02 3.2±0.2 8.3±0.3 4.1±0.01 2.2±0.02 4.2±0.02 4.2±0.04

Митотический индекс, % 16.6±1.2 24.6±0.8 9.3±0.9 8.1±0.3 3.4±0.02 5.2±0.02 5.9±1.3 6.2±0.02 1.02±0.01 15.3±0.3

Количество анеуплоидных

клеток, %

2.2±0.02 10.4±0.4 9.7±0.03 6.8±0.02 4.4±0.04 16.3±1.3 12.2±0.2 5.4±0.4 2.7±0.03 6.7±0.9

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

1.3×10-2

1.8×10-4

2.1×10-6

0 0 0 0 0 0 0

R 0.875 0.75 0.813 0.688 0.875 0.875 0.875 0.875 0.875 0.125

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Цисплатин+лейковорин

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

12.7±0.01 10.2±0.2 2.1±0.01 9.5±0.5 5.2±0.02 3.2±0.04 4.5±0.5 2.7±0.03 3.2±0.9 8.4±0.04

Митотический индекс, % 14.2±0.8 8.01±0.01 11.4±0.2 15.6±0.9 7.0±0.5 23.2±0.2 24.6±0.4 15.3±0.3 27.2±0.8 9.7±0.3

Количество анеуплоидных

клеток, %

4.2±0.2 15.4±0.4 3.1±0.3 8.2±0.02 5.2±0.02 4.8±0.4 4.4±0.04 8.2±0.2 6.2±0.2 4.6±0.4

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

9.2×10-3

1.1×10-2

0 0 0 0 1.1×10-6

0 0 2.3×10-2

R 0.563 0.5 0.75 0.125 0.5 0.313 0.25 0.188 0.25 0.438

Томудекс+лейковорин

Количество клеток с

хромосомными аберрациями,

%

9.9±0.03 8.4±0.04 4.2±0.02 15.7±2.3 3.3±0.03 4.4±0.04 2.2±0.02 3.6±0.02 5.8±0.04 17.2±0.1

Митотический индекс, % 1.5±0.9 0.9±0.9 0.8±0.9 1.5±0.9 5.7±0.9 5.7±0.9 5.7±0.9 5.7±0.9 5.7±0.9 5.7±0.9

Количество анеуплоидных

клеток, %

22.2±0.8 9.5±0.5 10.4±0.4 3.2±0.02 3.6±0.04 4.4±0.04 8.4±0.04 6.3±0.03 17.2±1.2 3.3±0.03

Количество клеток с

колониеобразующей

активностью

8.3×10-3

2.3×10-2

2.1×10-4

0 0 0 0 0 0 7.8×10-5

R 0.75 0.813 0.125 0.5 0.125 0.062 0.125 0.062 0.062 0.75

111

4.8 Сопоставление результатов цитогенетического тестирования

опухолевых клеток с данными клинических исследований

Масштабные исследования на уровне популяции дают важную

информацию о заболеваемости и смертности онкологических больных,

позволяют дать приблизительный прогноз эффективности лечения.

Комплексной задачей популяционных исследований является математическое

моделирование влияния факторов окружающей среды, в том числе микросреды,

на генетически детерминированную предрасположенность заболевания

колоректальным раком. Сходная проблема существует в области

математического моделирования эффективности лечения генетически

вариабельных опухолей. Терапевтическое действие препаратов на

генотипически вариабельные опухолевые клетки имеет нелинейную динамику

[Knox S.S., 2010], обусловленную разнообразными нарушениями функций

клеточных систем [Pastor D.M., 2010]. Создание модели интегральной

статистически значимой оценки эффективности химиотерапии возможно в

случае накопления массива информации о молекулярных процессах, которые в

ответ на действие противоопухолевых препаратов активируются в клетках

опухолей колоректальной локализации. Ключевым моментом реализации этих

исследований является накопление и сопоставление данных о дисфункциях

молекулярных механизмов в клетках с результатами клинических исследований

этих больных [Knox S.S., 2010].

В нашей работе результаты экспериментов in vitro показали, что клетки,

мутантные по генам MSH6 (пациенты «4», «6» и «10») или MSH2 (пациенты

«5», «7» и «9»), по уровню колониеобразования и скорости деления

чувствительны к действию ТД в комбинации с ЛВ (табл. 26). Клетки пациентов

«6», «10» и «5», «7» чувствительны к действию ЦП в комбинации с ЛВ. Эти

комбинации препаратов дополнительно ингибируют хромосомную и геномную

нестабильность, а также пролиферативную и колониеобразующую активности,

но только в клетках MSH6. Максимальное ингибирование цисплатином деления

112

клеток и колониеобразующей активности наблюдается в культурах,

полученных из аденокарциномы пациента «2».

Чувствительность к 5-фторурацилу клеток MSH2 может быть ранжирован

по изменению скорости деления (R): «2» = «5» > «7» > «9» (табл. 26).

Колониеобразующая активность клеток аденокарцином пациентов «2», «7» и

«9» также ингибируется действием 5-ФУ. Исключением является активация 5-

ФУ колониеобразования клетками пациента «5». Клетки MSH6 пациентов «4»,

«6» и «10» не чувствительны к комбинации 5-ФУ с ЛВ.

Усиление процесса мутагенеза 5-ФУ в клетках аденокарциномы пациента

«2», и одновременное усиление этим препаратом мутагенеза и

пролиферативной активности клеток пациента «5», может быть следствием

сложных нарушений клеточных функций. Ответ клеток MSH2 на действие

лекарственных препаратов свидетельствует об отсутствии линейной

зависимости параметров мутагенеза или пролиферативной активностью от

чувствительности клеток к препаратам.

Сопоставление результатов тестирования в экспериментах in vitro, с

данными клинических исследований, проведенных через 3 года после

комбинированного лечения, показало, что солитарные метастазы образовались

в левой доле печени больного «10». Метастазы обнаружены в правой доле

печени пациентов «1» и «9». Содержание онкомаркеров в организме пациентов

составляло 12.3±0.6 − РЭА и 45.0±3.5 − СА 19-9. Через 5 лет после

комбинированного лечения метастазы выявлены в печени пациентов «4», «5» и

«6». Множественные метастазы обнаружены в печени и забрюшинных

лимфатических узлах пациента «7».

Содержание 42.4 МЕ/мл онкомаркера СА19-9 в организме пациентов «3»

и «8» отличалось от показателей нормы. Выявлено, что высокое содержание

онкомаркера в организме пациента «3» и «8» обусловлено развитием

лекарственного гепатита. Необходимо отметить, что опухолевые клетки эти

больных имели максимальную чувствительность к действию 5-ФУ.

113

Результаты этого раздела работы показали, что данные тестирования

первичных культур опухолевых клеток могут скорректировать химиотерапию

онкологических больных, повысить ее эффективность, снизить или исключить

осложнения, вызванные токсическим действием лекарственных препаратов.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Колоректальный рак является гетерогенным заболеванием с

многофакторной этиологией и частотой распространения в популяции 1 на 200

человек [Барсуков Ю.А., Кныш В.И., 2006]. Математическая обработка

результатов исследований, направленных на изучение таких этиологических

факторов заболевания, как пищевые предпочтения, алкоголь, курение,

канцерогенные соединения, показала, что вклад этих факторов в риск развития

КРР (0.2-0.5%) ниже влияния генетического фактора (1.2%), играющего

доминирующую роль [Wacholder S. et al., 2004]. Риск возникновения КРР

максимально коррелирует с генетически полиморфными вариантами

предрасположенности к заболеванию. Причем рак прямой и ободочной кишки

имеют разные степени риска и развиваются на фоне разных соматических и

эпигенетических мутаций. Пенентрантность редкого полиморфизма ДНК в

половых клетках имеет значение не только для индивидуального высокого

риска развития КРР, но и при постоянном воздействии негенетических

факторов влияет на уровень риска популяции. Примером является

распространенность в популяции независимых локусов 8q24.21, 11q23, 18q21.1

(SMAD7), 8q23.1 (EIF3H), 15q (GREM1), 19q13.1 (RHPN2), 20q12.3, 14q22.2

(BMP4), 16q22.1 (CDH1) и 10p14, которые обуславливают высокий риск

развития КРР, увеличивающийся в два раза в гомозиготных вариантах

[Tomlinson.P.M. et al., 2010].

В Пермском регионе в 1965 г. заболеваемость колоректальным раком

составила 4.2 %, в 2002 г. – 17.7 %, в 2001 г. – 19.2 %. Проведенное

анкетирование больных не позволило выявить доминирующий этиологический

114

фактор, вызывающий заболевание у жителей Пермского региона. Вероятно,

длительное воздействие потенциально канцерогенных факторов на

производстве, употребление продуктов, богатых животными жирами, и

воспалительные заболевания кишечника, вносят равный вклад в развитие КРР.

Третье место колоректального рака в структуре онкологических заболеваний и

причин смерти в России [Гатауллин И.Г., 2003; Мартынюк В.В., 2004], после

рака легких, желудка и молочной железы, подтверждает необходимость

проведения исследований сопряженности действия негенетических и

генетических факторов. Более того, исследования Ahmadiyeha N. (2010), Martin

E.S. (2003), Roy B (2010), Tokuoka M. (2009), Tomlinson I.P.M. (2008) показали,

что повреждения одних и тех же локусов ДНК могут вызывать как

колоректальный рак, так и рак легких, желудка или молочной железы (табл.

22). Актуальность исследований взаимовлияния генетических и негенетических

факторов объясняется не отсутствием этих работ, а, прежде всего,

необходимостью выявления риска развития заболевания до появления его

клинических симптомов. Отечественные и зарубежные исследователи

отмечают низкую специфичность скрининговых методов онкомаркерной

диагностики, теста на скрытую кровь и пальцевого исследования [Бронштейн

А.С., 2001; Lieberman D., 2010]. Перечисленные методы скрининга в сочетании

с уточняющими инструментальными приемами не дают корректную оценку

персонального риска на ранних стадиях развития заболевания.

Согласно результатам работы, оптимальными диагностическими

методами исследования являются колоноскопия, ректороманоскопия,

ирригоскопия и уточняющее эхографическое трансабдоминальное

обследование больных с выраженными клиническими симптомами КРР.

Эндоректальная сонография помогает решить следующие диагностические

задачи: величина опухоли, степень поражения стенки кишки, глубина

инфильтрации параректальных тканей, метастатическое поражение

параректальных лимфатических узлов, распространение опухолевого процесса

на расположенные рядом органы, эффективность лучевой терапии.

115

Ультразвуковое исследование, компьютерная томография, магнитно-

резонансная томография толстой кишки являются дополнительными методами

диагностики опухолевых поражений.

Кроме оценки влияния комплекса факторов на генетические и

эпигенетические механизмы инициации КРР и диагностики ранних стадий

заболевания, важной задачей является повышение эффективности приемов

лечения больных. Современная концепция совершенствования терапии

онкологических заболеваний основана на замене редукционистской парадигмы

этиологии злокачественного заболевания на системную модель, в которой

учитывается информация инициации и развития опухоли на клеточном,

молекулярном и генетическом уровнях [Lynch H.T. et al., 2009; Knox S.S., 2010].

Причинами перехода к системной модели лечения онкологических заболеваний

является низкая эффективность существующих схем лечения, которые не

учитывают индивидуальные генетические особенности больных. Исследования

показали, что только 50% пациентов получают эффективное лечение

химиотерапевтическими противоопухолевыми препаратами [Knox S.S., 2010]. В

США приблизительно три миллиона ошибочных или неэффективных

назначений регистрируют ежегодно, более 100000 человек умирают каждый

год от побочного действия противоопухолевых препаратов. Активно

обсуждается разработка терапевтических схем персонализированной медицины

с учетом уникального генетического профиля каждого больного и

молекулярных процессов, которые индуцируются в клетках разных стадий

развития опухоли в ответ на воздействие лекарственных средств. Очевидно,

оптимальное решение этой проблемы возможно в случае выбора качественно

нового тест-объекта исследований, альтернативного музейным перевиваемым

культурам неопластических клеток КРР, которые в АТСС коллекции (American

Type Cultures Collection, http://www.lgcstandardsatcc.org/, США) представлены

линиями SW480, SW620, HT29 и НСТ116. Музейные линии культур клеток

используют с 70-х годов XX века, В результате длительного культивирования и

многочисленных пассажей в ДНК накопились спонтанные мутации, которые

116

изменили фенотипические и генотипические характеристики клеток [Knox S.S.,

2010; Pastor D.M. et. al., 2010].

В нашей работе впервые при исследовании колоректального рака

использован новый методический подход оценки индивидуальной

чувствительности к противоопухолевым препаратам. В качестве тест-системы в

работе использованы первичные культуры неопластических клеток больных

КРР. Результаты работ Hamid S. (2007) и Pastor D.M. et al. (2010) подтвердили

адекватность применения первичных неперевиваемых культур опухолевых

клеток больных КРР для изучения экспрессии маркерных генов, скорости

пролиферации, хемиорезистентности и таких ключевых характеристик, как

экспрессия тумор-ассоциированных белков, туморогенность и инвазивность

клеток. Клетки первичных неперевиваемых культур репрезентативны

оригинальным клеткам опухолевых тканей, не подвергались искусственной

иммортализации или трансформации. Исследования показали, что до создания

альтернативных методов, этот тест-объект остается важным инструментом

изучения биологии канцерогенеза. Как и в случае других методов исследования

in vitro, прогнозирование чувствительности клеток солидной опухоли к

лекарственным препаратам с использованием экстраполяции данных

химиорезистентности суспензии первичных культур опухолевых клеток,

ограничено тем, что in vivo процессы значительно сложнее и имеют более

деликатный баланс биохимических реакций.

Преимуществом этого тест-объекта является возможность получения

достоверных результатов при помощи микроэррей мРНК, так как выделение

мРНК из тканей часто искажено деградацией молекул. Культуры клеток

являются практически неограниченным источником ДНК для выполнения ПЦР

анализа маркерных генов, продукты которых участвуют в канцерогенезе.

Поскольку экспрессия микроРНК относится к идеальным маркерам

химиорезистентности опухолевых клеток [Bo Song et al., 2010], то оценка

экспрессии этой РНК в клетках первичных культур позволит приблизиться к

117

созданию эффективных противоопухолевых препаратов и к разработке

индивидуальных схем лечения.

Несмотря на индивидуальную вариабельность уровней хромосомной или

геномной нестабильности, колонеобразующей активности и резистентности к

химиопрепаратам, по средним значениям этих параметров и характеристикам

гистологических форм КРР, опухолевые клетки десяти больных КРР могут

быть условно ранжированы. Низко- и умереннодифференцированные

аденокарциномы с большим количеством митозов и ядрышек в клетках

обладают максимально высокими геномной и хромосомной нестабильностями

и резистентностью. Часть умереннодифференцированных аденокарцином и

опухоли с перстневидными и атипичными клетками, некрозами, ядерным

полиморфизмом имеют средний уровень геномной нестабильности.

Высокодифференцированная аденокарцинома с инвазивным ростом,

массивными некрозами, большим количеством митозов, атипичными клетками

и полиморфизмом клеточного ядра чувствительна к цитотоксическому

действию аналогов азотистых оснований. Таким образом, генетически

детерминированные характеристики клеток разных вариантов одной

гистологической формы КРР не обязательно идентичны.

Культуры клеток из морфологически нормальной эпителиальной ткани

кишечника, расположенной на расстоянии 10 см от низкодифференцированной

или высокодифференцированной аденокарцином могут обладать

резистентностью к алкилирующим соединениям, которая подтверждена

появлением колонеобразующей активности в ответ на обработку клеток МННГ

и ЦФ. В клеточных линиях опухолевых клеток, отобранных по

гипермутабильности и признаку устойчивости к алкилирующим соединениям

SN1, SN2, не обнаружены аллели дикого типа MSH3 и MSH6 (два пациента с

умеренно- и один пациент с низкодифференцированной аденокарциномами),

или MSH3, MSH6 и MSH2 (два пациента с низко- и один пациент с

умереннодифференцированной аденокарциномами). Опухолевые клетки с

разной пролиферативной активностью и разным уровнем геномной

118

нестабильности отличаются по индивидуальной чувствительности к

противоопухолевым препаратам, среди которых максимальным

цитотоксическим эффектом обладают 5-ФУ и иринотекан.

Таким образом, внедрение в практику современных ДНК-технологий в

период предшествующий созданию полной карты вариаций генома человека

[Altshuler D.M. et al., 2010] является важным моментом повышения

эффективности диагностики и лечения КРР. Карта вариаций генома человека

(HapMap, haplotype map) содержит информацию о локусах наследуемой

предрасположенности к онкологическим заболеваниям и о полиморфизме

генов. Например, выявленный полиморфизм гена UGT1A1, кодирующего УДФ-

глюкуронозилтрансферазу 1А1 влияет на эффективность противоопухолевого

действия иринотекана [Marsh S. et al., 2006]. Очевидно, что переход к

персонализированной медицине возможен в случае расшифровки

индивидуальных генетических профилей больных.

С учетом патогенетических механизмов развития КРР мы разработали

следующую схему диагностики и лечения больных с неопластическим

поражением толстого кишечника (рис. 25).

119

Рис. 25. Схема диагностики и лечения колоректального рака.

Анкетирование пациентов, сбор

жалоб, анамнестических данных,

физикальное исследование, пальцевое

исследование прямой кишки.

Лабораторное определение генетически и

эпигенетически детерминированной

предрасположенности к заболеванию

(анализ экспрессии генов).

Модификационные исследования

кала на скрытую кровь

(«Гемоселект», «Гемоквант»).

Инструментальные исследования:

ирригоскопия с двойным

контрастированием или

колоноскопия, ректороманоскопия с

биопсией, эндоректальная эхография

(при раке прямой кишки).

Уточняющие методы: КТ и

МРТ. Гистологический

анализ.

На материале индивидуальных первичных

культур клеток, полученных из биоптатов

определение

-генетически и эпигенетически

детерминированной предрасположенности

к заболеванию (анализ экспрессии генов);

-эффективности химиотерапевтического

лечения;

-комбинации противоопухолевых

препаратов и их терапевтические дозы.

Оперативное

вмешательство.

Химиотерапия. Лучевая

терапия.

Ранняя диагностика (скрининг)

Диагностика на этапе проявления клинических симптомов

Персонализация лечения

120

Выводы

1. Заболеваемость колоректальным раком в Пермском регионе выше, чем в

целом по Российской Федерации (18.2±0.2 против 15.5±0.5). Факторами риска

развития колоректального рака в Пермском регионе являются

неблагоприятные условия труда, пища богатая нерафинированными жирами,

фоновые заболевания толстой кишки.

.

2. Цитогенетические исследования опухолевых клеток эпителия толстой

кишки, позволяют оценить воздействие химиотерапевтических и

иммуномодулирующих препаратов, что является основанием для подбора

эффективных схем комбинированного лечения больных колоректальным

раком.

3. Цитогенетический анализ клеток позволяет изучать молекулярные

механизмы развития колоректального рака и репарации ДНК, что необходимо

при патогенетическом обосновании и оптимизации комбинированного метода

лечения неопластического поражения толстого кишечника.

4. Разработана схема верификации и лечения неопластического поражения

толстой кишки, которая включает:

− анкетирование, для оценки рискометрических параметров в развитии

неопластического поражения толстой кишки;

− скрининговые тесты для диагностики рака (тесты «Гемоквант»,

«Гемоселект»), позволяющие оптимизировать методы идентификации бластом

толстого кишечника;

− инструментальные методы, в том числе эндоректальная эхография прямой

кишки, позволяющая определить степень распространения неоплазмы по

слоям кишечной стенки;

− культивирование клеток эпителия толстой кишки, позволяющее

оптимизировать терапию с учетом генотипических и фенотипических

характеристик клеток.

121

Практические рекомендации

1. Для определения тактики и оценки эффективности лечения КРР

необходимо применять культивирование опухолевых клеток с

определением чувствительности к различным лекарственным средствам.

2. Этиопатогенетические аспекты колоректального рака следует учитывать

при профилактике этой патологии, внедряя скрининговые обследования по

выявлению предопухолевых заболеваний кишечника, прежде всего полипов

толстой кишки, и их своевременное удаление. Необходимо активное

лечение воспалительных заболеваний толстой кишки, при которых высок

риск развития опухоли.

3. Следует широко информировать население об этиологических факторах

развития КРР и мерах по снижению вероятности заболеваемости: отказ от

курения, уменьшение или полный отказ от приема алкоголя, уменьшение

приема жирной пищи и продуктов, содержащих большое количество

клетчатки, регулярная физическая активность, контроль массы тела, прием

пробиотиков, профилактические обследования.

122

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. – М.:

Медицина, 1990. – 382 с.

2. Аксель Е.М. Злокачественные новообразования желудочно-кишечного

тракта: Основные статистические показатели и тенденции / Е. М. Аксель, М.И.

Давыдова, Т.И. Ушакова // Современ. онкол. – 2001. – Т. 4, № 3. – С. 4-17.

3. Аксель Е.М. Статистика заболеваемости и смертности от рака

ободочной и прямой кишки. Новое в терапии колоректального рака / Е.М.

Аксель, Т.И. Ушакова; под ред. Н. И. Переводчиковой. – М.: Медицина, 2001. –

С. 6-9.

4. Алиев И.И. Факторы, определяющие лимфогенное метастазирование

рака прямой кишки / И.И. Алиев, И.В. Правосудов, А.В. Гуляев и др. // Вопр.

онкол. – 2009. – Т. 55, № 1. – С. 99-102.

5. Амелина О.П. Выбор метода операции при раке прямой кишки / О.П.

Амелина // Вопр. онкол. – 1988. – № 4. – С. 6-8.

6. Аруин Л.И. Морфологическая диагностика болезней желудка и

кишечника / Л.И. Аруин, Л.Л. Капуллер, В.А. Исаков. – М.: Триада-Х, 1998. –

339 с.

7. Барсуков Ю.А. Современные возможности лечения колоректального

рака / Ю.А. Барсуков, В.И. Кныш. // Современ. онкол. – 2006. – Т. 8, № 2. – С.

7-17.

8. Бартч Х. Поиск агентов, повреждающих ДНК и опасных для человека:

некоторые итоги исследований по этиологии рака / Х. Бартч. // Вопр. онкол. –

2004. – Т. 50, № 3. – С. 261-265.

9. Белев Н.Ф. Генетика рака желудочно-кишечного тракта / Н.Ф. Белев,

Е.Е. Самотыя, Т.П. Казубская и др. // Вестн. Росс. онкол. науч. центра им.

Н.Н.Блохина. – 2001. – № 2. – С. 35-41.

123

10. Белоус Т.А. Патоморфология предраковых состояний толстой кишки /

Т.А. Белоус // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и

колопроктологии. – 2002. – № 4. – С. 50-62.

11. Белоусова Е.А. Синдром абдоминальной боли при хроническом

панкреатите / Е.А. Белоусова, Н.В. Никитина, Т.С. Мишуровская, Г.В. Цодиков

// Фарматека. – 2007. – № 13. – С. 29-34.

12. Беляков И.С. Мутации генов c-Kit и PDGFRA и клинико-

морфологические особенности стромальных опухолей желудочно-кишечного

тракта / И.С. Беляков, О.А. Анурова, П.В. Снигур и др. // Вопр. онкол. – 2007. –

Т. 53, № 6. – С. 677-681.

13. Блинов Н.Н. Об отношении онкологических больных к своему

диагнозу / Н.Н. Блинов, И.П. Хомяков, Н.Б. Шиповников // Вопр. онкол. – 1994.

– № 8.

14. Блинов Н.Н. Роль психоонкологии в лечении онкологических больных

/ Н.Н. Блинов, В.А. Чулкова // Вопр. онкол. – 1996. – № 5. – С. 70-73.

15. Ботезату И.В. Детекция генных мутаций в биопробах онкологических

больных: сопоставление сканирующих методов NIRCA и SSCP / И.В. Ботезату,

В.Н. Кондратова, В.Л. Черкес и др. // Вопр. онкол. – 2007. – Т. 53, № 5. – С. 549-

553.

16. Бронштейн А.С. Руководство по колопроктологии / А.С. Бронштейн,

В.Л. Ривкин, С.Н. Файн. – М.: Медпрактика, 2001. – 488 с.

17. Бурмистрова А.Л. Иммунный гомеостаз и микросимбиоциноз

метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний кишечника / А.Л.

Бурмистрова. – Челябинск: Челябинский дом печати, 1997. – 234 с.

18. Валиев А.А. Иммуноморфологические аспекты диагностики

колоректального рака / А.А. Валиев // Актуальные проблемы колопроктологии:

тез. конф. молодых ученых. – Казань, 2005. – С. 174, 514-516.

19. Валиев А.А. Иммуноморфологические аспекты диагностики

колоректального рака / А.А. Валиев, И.Г. Гатауллин, С.В. Петров // Актуальные

проблемы колопроктологии. – М.: Медпрактика, 2005. – 174 с.

124

20. Вашкамадзе Л.А. Диагностика и лечение рака прямой кишки:

современное состояние проблемы / Л.А. Вашкамадзе, В.Н. Хомяков, Д.В.

Сидоров // Российский онкологический журнал. – 1999. – № 6. – С. 47-48.

21. Веснин А.Г. Атлас лучевой диагностики опухолей опорно-

двигательного аппарата. В 2 частях. Часть 2: Опухоли мягких тканей / А.Г.

Веснин, И.И. Семенов – СПб.: Невский диалект, 2003 – 128 с.

22. Ветшев П.С. Международный конгресс по профилактике и лечению

колоректального рака (хроника) / П.С. Ветшев, Ю.М. Стойко, Н.Н. Крылов //

Колопроктол. – 2005. – Т. 11, № 1. – С. 44-48.

23. Власов А.Д. Единицы физических величин в науке и технике:

Справочник / А.Д. Власов, Б.П.Мурин. – М.: Энергоатомиздат, 1990. – 176 с.

24. Воробьев Г.И. Отдаленные результаты трансанального

эндохирургического удаления доброкачественных и злокачественных

новообразований прямой кишки / Г.И. Воробьев, П.В. Царьков, Л.Ф.

Подмаренкова и др. // Колопроктол. – 2005. – Т. 11, № 1. – С. 32-39.

25. Воробьев Г.И. Выбор метода лечения рака нижнеампулярного отдела

прямой кишки / Г.И. Воробьев, Т.С. Одарюк, Ю.А. Шелыгин // Хирургия. –

1998. – № 1. – С. 87-93.

26. Газиев А.И. Внеклеточная ДНК плазмы – потенциальный маркер

диагностики в онкологии / А.И. Газиев, Г.О. Шайхаве, С.В. Коренев // Вопр.

онкол. – 2008. – Т. 54, № 5. – С. 545-554.

27. Гарькавцева Р.Ф. Анализ генетической предрасположенности к раку в

семьях больных первично-множественными злокачественными

новообразованиями / Р.Ф. Гарькавцева, Т.П. Казубская, В.Ю. Сельчук //

Цитология и генетика. – 1992. – Т. 26, № 2. – С. 6-32.

28. Гатауллин И.Г. Экологические аспекты формирования заболеваемости

населения колоректальным раком / И.Г. Гатауллин, Р.Ш. Хасанов // Алгоритмы

объемов диагностики и комплексного лечения колоректального рака. – Пермь,

2003. – С. 31-34.

125

29. Давыдов М.И. Эволюция онкохирургии и ее перспективы /М.И.

Давыдов // Мат. III съезда онкол.-радиол СНГ. – Минск, 2004. – C. 36-42.

30. Давыдов М.И. Заболеваемость злокачественными новообразованиями

населения России и стран СНГ в 2007 г / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель // Вестник

Российского онкологического научного центра имени Н. Н. Блохина РАМН:

ежеквартальный научно-практический журнал. – 2009. – Т.20, Прил.1 к № 3. –

С. 52-90.

31. Емельянов С.И., Хатьков И.Е, Махонина Е.М. Эндохирургические

операции на прямой кишке / С.И. Емельянов, И.Е. Хатьков, Е.М. Махонина //

Эндоскопическая хирургия. – 2005. – № 2. – С. 46-53.

32. Земляной В.П. Современные методы диагностики и оценки степени

распространенности рака ободочной и прямой кишки / В.П. Земляной, Т.Н.

Трофимова, С.Л. Непомнящая и др. // Практич. онкол. – 2005. – Т. 6, № 2. – С.

71-80.

33. Ивашкин В.Т. Колоректальный рак / В.Т. Ивашкин. // Российский

журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 1999. – Т. 9, № 1.

– С. 67-72.

34. Имянитов Е.Н. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака:

этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения / Е.Н. Имянитов //

Практич. онкол. – 2005. – № 6. – С. 65-70.

35. Кармазановский Г.Г. Спиральная компьютерная томография с

болюсным контрастным усилением в абдоминальной хирургии / Г.Г.

Кармазановский // Медицинская визуализация. – 2004. – № 2. – С. 17-23.

36. Кныш В.И. Рак ободочной и прямой кишки / В.И. Кныш. – М.:

Медицина, 1997. – 304 с.

37. Коган Е.А. Патоморфология предрака / Е.А. Коган. // Российский

журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2002. – № 5. – С.

54-59.

38. Короткова Е.А. Тканевой ингибитор матриксных металлопротеаз 1

типа (ТИМП-1) при раке толстой кишки: взаимосвязь с клинико-

126

морфологическими факторами / Е.А. Короткова, Е.С. Герштейн, В.В. Пророков

и др. // Вопр. онкол. – 2009. – Т. 55, № 2. – С. 171-176.

39. Логинов А.С. Болезни кишечника. Руководство для врачей / А.С.

Логинов, А.И. Парфенов. – М.: Медицина, 2000. – 569 с.

40. Маев И.В. Достижения молекулярной генетики в области

гастроэнтерологии / И.В. Маев, В.М. Говорун. // Российский журнал

гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2004. – № 3. – С. 13-21.

41. МакНелли П.Р. Секреты гастроэнтерологии / Питер Р. МакНелли; пер.

с англ. Под ред. А.А. Курыгина, И.С.Осипова. – М.,СПб.: Бином, Невский

диалект, 1999. – 1024 с.

42. Мартынюк В.В. Рак толстой кишки (заболеваемость, смертность,

факторы риска, скрининг). Практич. онкол.: избранные лекции / В.В.

Мартынюк. – СПб: Питер, 2004. – С. 151-161.

43. Михайлова Г.Ф. Анализ результатов цитогенетических исследований

населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях после

Чернобыльской аварии / Г.Ф. Михайлова. – Обнинск, 2007. – С. 3-23.

44. Моисеенко А.Б. Инсулиноподобный фактор роста – 1, связывающий

его белок (ВР – 3) и инсулин при колоректальном раке / А.Б. Моисеенко, Л.М.

Берштейн // Вопр. онкол. – 2001. – Т. 47, № 4. – С. 383-387.

45. Моисеенко В.М. Адъювантное лечение больных раком ободочной

кишки / В.М. Моисеенко, Р.В. Орлова // Практич. онкол. – 2000. – № 1. – С. 19-

23.

46. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных

исследований / Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. – М.: Медицина, 2000. – 346 с.

47. Новицкий В.В., Степовая Е.А.. Гольдберг В.Е. Эритроциты и

злокачественные новообразования / В.В. Новицкий, Е.А. Степовая, В.Е.

Гольдберг. – Томск: Изд-во ТГУ, 2000. – 286 с.

48. Одарюк Т.С. 5-летние результаты комплексного лечения рака прямой

кишки / Т.С. Одарюк, К.Н. Костромина, П.В. Еропкин и др. // Российский

онкологический журнал. – 2004. – № 4. – С. 4-9.

127

49. Орлова Л.П. Ультразвуковое исследование в диагностике

новообразований толстой кишки / Л.П. Орлова // Визуализация в клинике. –

2004. – № 4. – С. 53-61.

50. Переводчикова Н.И. Новое в терапии колоректального рака:

материалы конференции / Н.И. Переводчикова. – М.: Клевер принт, 2001. – С.

10-21.

51. Переводчикова Н.И. Химиотерапия метастатического колоректального

рака. Практическая онкология: избранные лекции / Н.И. Переводчикова. – СПб:

Питер, 2004. – 244 с.

52. Переводчикова Н.И. Руководство по химиотерапии опухолевых

заболеваний / Н.И. Переводчикова. – М.: Практическая медицина, 2005. – 237

с.

53. Пиманов С.И. Скрининговая диагностика рака ободочной кишки / С.И.

Пиманов, З.А. Лемешко, Е.В. Верасова // Российский журнал

гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. – 2001. – № 6. – С. 15-23.

54. Портной Л.М. Некоторые вопросы лучевой диагностики рака толстой

кишки / Л.М. Портной // Вест. рентген. и радиол. – 2004. – № 2. – С. 20-31.

55. Портной Л.М. Современная лучевая диагностика опухолей толстой

кишки / Л.М. Портной, Г.А. Стащук // Медицин. визуал. – 2000. – № 2. – С. 4-

19.

56. Пророков В.В. Современные принципы диагностики и скрининга рака

прямой кишки. Практическая онкология: избранные лекции / В.В. Пророков,

А.Г. Малихов, В.И. Кныш. – СПб.: Питер, 2004. – С. 162-167.

57. Самотыя Е.Е. Аденомы и рак прямой кишки / Е.Е. Самотыя. – Минск:

Знание, 2006. – 267 с.

58. Секачева М.И. Скрининг колоректального рака в России / М.И.

Секачева, В.Т. Ивашкин // Рос журн. гастроэнтерол., гепатол. – 2006. – № 4. – С.

44-49.

59. Семенов Н.Н. Активность оксалиплатина при платиночувствительных

опухолях / Н.Н. Семенов. // Фарматека. – 2005. – № 18. – С. 1-3.

128

60. Семенов Н.Н. Элоксатин в химиотерапии колоректального рака / Н.Н.

Семенов // Русский медицинский журнал. – 2005. – Т. 13, № 23. – С. 3-6.

61. Силантьева Н.К. Компьютерная томография у больных раком прямой

кишки / Н.К. Силантьева, Б.А. Бердов, З.Н. Шавладзе // Медицин. визуал. –

2004. – № 4. – С. 70-75.

62. Сухарев А.Е. Иммунохимическое исследование сыворотки крови и

кишечной слизи при колоректальном раке / А.Е. Сухарев, В.И. Есин, А.М.

Кушалаков // Актуальные проблемы колопроктологии. – Иркутск, 1999. – С.

180-182.

63. Таразов П.Г. Элоксатин – новые возможности регионарной

химиотерапии в лечении метастазов колоректального рака / П.Г. Таразов //

Consilium medicum. – 2005. – № 5. – С. 6-10.

64. Теплоухова И.М. Причины возникновения и возможности ранней

диагностики колоректального рака / И.М. Теплоухова, В.И. Кныш // Вопр.

онкол. – 1990. – Т. 36, № 1. – С. 101-107.

65. Тимофеев Ю.М. Злокачественные опухоли анального канала / Ю.М.

Тимофеев, Д.З. Зикиряходжаев. – Душанбе: Ирфон, 1997. – 380 с.

66. Трапезников Н.Н. Прогресс и перспективы развития методов лечения

сарком костей /Н.Н. Трапезников, Ю.И. Соловьев, Н.Е. Кушлинский и др. //

Рос. онкол. журн. – 1998. – Т.10, № 3. – С. 21-25.

67. Трапезников Н.Н. Лечение остеосаркомы конечностей на рубеже

столетий (полувековой опыт исследований) / Н.Н. Трапезников, Г.Н. Мачак,

Ю.Н. Соловьев и др. // Вестник РАМН. – 2001. – № 9. – С. 46-48.

68. Тюляндин С.А. Адъювантное лечение рака толстой кишки / С.А.

Тюляндин // Новое в терапии колоректального рака: сб. науч. тр.; под ред. Н.И.

Переводчиковой. – М.: Наука, 2001. – С. 74-82.

69. Фарелл Р. Язвенный колит / Р. Фарелл, М. Пепперкорн //

Международный медицинский журнал. – 2003. – № 1. – С. 32-37.

70. Царьков П.В. Место и роль расширенной аорто–подвздошно–тазовой

лимфаденэктомии в лечении рака нижнеампулярного отдела прямой кишки.

129

Практическая онкология: избранные лекции / П.В. Царьков, Г.И. Воробьев, Т.С.

Одарюк. – СПб.: Питер, 2004. – С. 168-180.

71. Черешнев В.А. Патофизиология / В.А. Черешнев, Б.Г. Юшков. – М.:

Вече, 2001. – 302 с.

72. Чисов В.И., Старинский В.В. Злокачественные новообразования в

России / В.И. Чисов. – М.: Медицина, 2006. – 156 с.

73. Яицкий Н.А. Современные проблемы лечения рака прямой кишки /

Н.А. Яицкий, И.А. Нечай // Вестник хирургии. – 2002 – № 3. – С. 115-119.

74. Abdelkader A.F. Screening the bio-safety of wheat produced from

pretreated grains to enhance tolerance against drought using physiological and

spectroscopic methods /A.F. Abdelkader, R.A. Hassanein, M.M.Abo-Aly et al. //

Food Chem. Toxicol. – 2010. – V. 48, № 7. – P.1827-1835.

75. Adam L. Three-dimensional and temporo-spatial model to study

invasiveness of cancer cells by heregulin and prostaglandin E2 / L. Adam, A.

Mazumdar, T. Sharma et al. // Cancer Research. – 2001. – № 1. – P. 81-87.

76. Ahmadiyeha N. 8q24 prostate, breast, and colon cancer risk loci show

tissue-specific long-range interaction with MYC/N. Ahmadiyeha, M. Pomerantza, C.

Grisanzio et al. // PNAS – 2010. – V. 107, № 21. – P. 9742-9746.

77. Altshuler D.M. Integrating common and rare genetic variation in diverse

human populations / D.M. Altshuler, R.A. Gibbs, E. Dermitzakis // Nature. – 2010. –

V. 467. – P. 52-58.

78. Amit S. Accomplishments in 2007 in the management of curable metastatic

colorectal cancer / S. Amit, A. Steven, A. Rene // Gastrointest. Cancer Res. – 2007. –

№ 1. – P. 13-18.

79. Andre T. Toxicity report of a phase III trial (GERCOR C 96.1) comparing

bimonthly LV5FU2 to monthly 5FU–leucovorin high–dose (LV HD) in patients with

Dukrs’ B and C colon cancer / T. Andre, P. Colin, C. Louvet et al. // ASCO. – 2000.

– № 19. – P. 25-36.

80. Baer J.C. Depletion of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase correlates

with potentiation of temozolomide and CCNU toxicity in human tumour cells /J.C.

130

Baer, A.A.Freeman, E.S. Newlands et al. // Br. J. Cancer. – 1993. – V. 67. – P. 1299-

1302.

81. Bardelli A. Carcinogen-specific induction of genetic instability / A.

Bardelli, D.P.Cahill, G. Lederer et al. // PNAS. – 2001. – V. 98, № 10. – Р. 5770-

5775.

82. Bartsch H. Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in

inflammation driven carcinogenesis /H. Bartsch, J. Nair // Cancer Detect. Prev. –

2004. – V.28 (6). – P. 385-391.

83. Baylin S.B. Abnormal patterns of DNA methylation in human neoplasia:

potential consequences for tumor progression / S.B. Baylin, M. Makos, J.J. Wu. //

Cancer Cells. – 1991. – V. 3. – P. 383-390.

84. Behrends J. Functional interaction of an axon homolog, conductin, with b-

catenin, APC, and GSK3b / J. Behrends, B.A. Jerchow, M. Wurtele et al. // Science. –

1998. – V. 280. – P. 596-599.

85. Bentwich I. Identification of hundreds of conserved and nonconserved

human microRNAs / I.Bentwich, A. Avniel, Y. Karov et al. // Nat. Genet. – 2005. –

V. 37, № 3. – P. 766-770.

86. Billingham R.P. The diagnosis and management of common anorectal

disorders /R.P. Billingham, J.T. Isler, M.H. Kimmins et al. // Curr. Probl. Surg. –

2004. – V.41 (7). – P.586-645.

87. Bird A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation / A.P.

Bird // Nature. – 1986. – V. 321. – P. 209-213.

88. Bird A.P. DNA methylation patterns and epigenetic memory /A.P. Bird //

Genes Dev. – 2002. – V. 16. – P. 6-21.

89. Bo Song Molecular mechanism of chemoresistance by miR-215 in

osteosarcoma and colon cancer cells / Bo Song, Yuan Wang, Matthew A Titmus et al.

// Mol. Cancer. – 2010. – V. 9. – P. 96.

90. Bosset J.F. EORTC Radiotherapy Group Trial 22921. Chemotherapy with

preoperative radiotherapy in rectal cancer / J.F. Bosset, L. Collette, G. Calais et al. //

New England J. Med. – 2006. – V. 355, № 11. – P. 1114-1123.

131

91. Boulay J.L. SMAD7 is a prognostic marker in patients with colorectal

cancer / J.L. Boulay, G.A. Mild, A. Lowy et al. // Int. J. Cancer. – 2003. – V. 104. –

P. 446-449.

92. Braendengen M. Randomized phase 111 study comparing preoperative

radiotherapy with chemoradiotherapy in nonresectable rectal cancer / M.

Braendengen, K.M. Tveit, A. Berglund et al. // Clinic. Oncol. – 2008. – V. 26, № 1. –

P. 87-94.

93. Brennan J.K. Interactions of dimethyl sulfoxide and granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor on the cell cycle kinetics and phosphoproteins

of G1-enriched HL-60 cells: evidence of early effects on lamin B phosphorylation

/J.K. Brennan, K.S. Lee, M.A. Frazel et al. // J. Cell Physiol. – 1991. – V. 146 (3). –

P. 425-434.

94. Brensinger J.D. Variable phenotype of familial adenomatous polyposis in

pedigrees with 3' mutation in the APC gene / J.D. Brensinger, S.J. Laken, M.C. Luce

et al. // Gut. – 1998. – V. 43. – P. 548-552.

95. Bronner C.E. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologueh

MLH1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer /C.E. Bronner, S.M.

Baker, P.T. Morrison et al. // Nature. – 1994. – V. 368. – P. 258-261.

96. Bunyan D.J. Genotype-phenotype correlations of new causative APC gene

mutations in patients with familial adenomatous polyposis / D.J. Bunyan, J. Shea-

Simonds, A.C. Reck et al. // J. Medical. Genet. – 1995. – V. 32. – P. 728-731.

97. Burgart L.J. Testing for defective DNA mismatch repair in colorectal

carcinoma a practical guide / L.J. Burgart // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2005. – V.

129. – P. 1385-1389.

98. Cai G. Clinicopathologic and molecular features of sporadic microsatellite-

and chromosomal-stable colorectal cancers /Y. Xu, H. Lu et al. // Internat. J.

Colorectal. Dis. – 2008. – V. 23, № 4. – P. 365-373.

99. Carmichael J. Adjuvant chemotherapy of colorectal cancer /J. Carmichael,

T. Popiela, D. Radstone // New England J. Med. – 2000. – V. 23. – P. 24-31.

132

100. Carolyn C. Colorectal carcinoma: diagnostic, prognostic, and molecular

features / C. Carolyn, M.D. Compton. // Modal Pathol. – 2003. – V. 16, № 4. – P.

376-388.

101. Caspari R. Familial adenomatous polyposis: desmoids tumors and lack

of ophthalmic lesions (CHRPE) associated with APC mutations beyond codon 1444 /

R. Caspari, S. Olschwang, W. Friedl et al. // Humanity Mol. Genet. – 1995. – V. 4. –

P. 337-340.

102. Cellen W.P. Preoperative chemoradiation versus radiation alone for

stage 11 and 111 resectable rectal cancer / W.P. Cellen, Y. Van Nieuwenhove, K.

Fierens // Coch. Database System. Rev. – 2009. – № 1. – P. 331-337.

103. Chang D.K. Steady-state regulation of the human DNA mismatch repair

system / D.K. Chang, L. Ricciardiello, A. Goel et al. // J. Biol. Chem. – 2000. – V.

275, № 24. – Р. 18424-1843.

104. Chapelle. A. Microsatellite instability / A. Chapelle // New England J.

Med. – 2005. – V. 19. – P. 12-15.

105. Chen W. The role of the mismatch repair machinery in regulating mitotic

and meiotic recombination between diverged sequences in yeast / W. Chen, S. Jinks-

Robertson // Genetics. – 1999. – V. 151. – P. 1299-1313.

106. Cheng K.C. Hereditary Colorectal Cancer / K.C. Cheng, L.A. Loeb // J.

Clinical Oncol. – 2008. – V. 22, № 16. – P. 3284-3292.

107. Clevers H. Colon Cancer — understanding how NSAIDs work / H.

Clevers // New England J. Med. – 2004. – V. 14. – P. 23-27.

108. Cocconi G. Results of a European multicentre trial of Tomudex versus

5FU/high dose LV (Machover regimen) / G. Cocconi // 2nd AIOM National

Conference Colorectal Cancer. – Milan, 1997.

109. Cohen S. Colonoscopic screening of average-risk women for colorectal

neoplasia / S. Cohen, J. Neal // New England J. Med. – 2006. – V. 17. – P. 13-24.

110. Cromwell D.M. Cost analysis of alternative approaches to colorectal

screening in familial adenomatous polyposis / D.M. Cromwell, R.D. Moore, J.D.

Brensinger et al. // Gastroenterology. – 2007. – V. 114. – P. 893-901.

133

111. Cunningham D. Lowery and the "Tomudex" colorectal cancer study

group: "Tomudex" (ZD 1694): Results of a randomized trial in advanced colorectal

cancer demonstrate efficacy and reduced mucositis and leucopenia / D. Cunningham,

J.R. Zalcberg, U. Raath U. // Europ. J. Cancer: General Topics. – 1995. – V. 31, №

12. – P. 1945-1954.

112. Cunningham D. Main Types of Treatment / D. Cunningham // New

England J. Med. – 2000. – V. 19. – P. 12-23.

113. Davies R.J. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool

analysis / R.J. Davies, R. Miller, N. Coleman // Nature Rev. Cancer. – 2005. – V. 5. –

P. 199-209.

114. Deisboeck T.S. Pattern of self-organization in tumour systems: complex

growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model / T.S. Deisboeck, M.E.

Berens, A.R. Kansal et al. // Cell. Prolif. – 2001. – V. 34, № 1. – Р. 115-134.

115. De la Chapelle A., Peltomaki P. Genetics of hereditary colon cancer //

Ann. Rev. Gen. – 1995. – V. 29. – P. 329-348.

116. Douillard J.U. Systemic therapy for colorectal cancer / J.U. Douillard, D.

Cunningham, A.D. Roth // New England J. Med. – 2005. – V. 21. – P. 2184-2192.

117. Drammond J.T. Isolation of an hMSh-p160 heterodimer that restores

DNA mismatch repair to tumor cells / Drammond J.T. et al. // Science. – 1997. – V.

286. – P. 1909-1912.

118. Dunst J. Phase I study of capecitabine combined with standard

radiotherapy in patients with rectal cancer / J. Dunst, T. Reese, S. Frings // ASCO. –

2000. – № 19. – P. 256.

119. Ehrlich M. Quantitative analysis of associations between DNA

hypermethylation, hypomethylation, and DNMT RNA levels in ovarian tumors / M.

Ehrlich, C.B. Woods, M.C. Yu et al. // Laird. Oncogene. – 2006. – V. 27. – P. 2636-

2645.

120. Erlichman C. New treatment options for colorectal cancer / C.

Erlichman, J. Daniel. // New England J. Med. – 2006. – V. 12. – P. 1234-1242.

134

121. Fearon E.R. A genetic model for colorectal tumorigenesis / E.R. Fearon,

B. Vogelstein. // Cell. – 2006. – V. 61. – P. 759-767.

122. Feinberg A.P. Hypomethylation distinguishes genes of some human

cancers from their normal counterparts / A.P. Feinberg, B. Vogelstein // Nature. –

1993. – V. 301. – P. 89-92.

123. Fishel R. The human mutator gene homolog MSH2 and its association

with hereditary nonpolyposis colon cancer /R. Fishel, M. Lescoe, M. Rao et al. //

Cell. – 1994. – V. 77. – P. 167.

124. Fong Y. Surgical treatment of colorectal metastases to the liver / Y.

Fong, L.N. Blumgart, A.M. Cohen // Cancer J. Clinic. – 1995. – V. 45. – P. 50-62.

125. Gastrointestinal tumor study group. Survival after postoperative

combination treatment of rectal cancer // New England J. Med. – 1996. – V. 315. – P.

1294-1295.

126. Gavert N. Beta-Catenin signaling in biological control and cancer / N.

Gavert, A. Ben-Ze'ev // J. Cell. Biochem. – 2007. – V. 102, № 4. – P. 820-828.

127. Gebert G.F. Molecular and clinical achievements in identification of

families with FAP / J.F. Gebert, C. Dupon., M. Kadmon // Annals Surgery. – 1999. –

V. 229, № 3. – P. 41-48.

128. Genschel J. Isolation of MutSbeta from human cells and comparison of

the mismatch repair specificities of MutSbeta and MutSalpha / J. Genschel, S.

Littman, J. Drummond, P. Modrich // The Journal of biological chemistry. – 1998. –

V. 273. – P. 19895-19901.

129. Gerrit-Jan Liefers Micrometastases and survival in stage II colorectal

cancer / M.D. Gerrit-Jan Liefers // J. Clinic. Oncol. – 2003. – V. 16, № 11. – P. 1284-

1296.

130. Giavazzi R. Metastatic behavior of tumor cells isolated from primary and

metastatic human colorectal carcinomas implanted into different sites in nude mice /

R. Giavazzi, D.Campbell, J. Jessup et al. // Cancer Res. – 1986. – V. 46, № 5. – Р.

1928-1933.

135

131. Gisselsson D. Connecting mitotic instability and chromosome

aberrations in cancer – can telomeres bridge the gap /D. Gisselsson, M. Hoglund //

Seminars in Cancer Biology. – 2005. – V. 15, № 1. – P. 13-23.

132. Glehen O. Cytoreductive surgery combined with perioperative

intraperitoneal chemotherapy for the management of peritoneal carcinomatosis from

colorectal cancer / O. Glehen, F. Kwiatkowski et al. // New England J. Med. – 2004.

– V. 14. – P. 1234-1244.

133. Goelz S.E. Hypomethylation of DNA from benign and malignant human

colon neoplasms / S.E. Goelz, B. Vogelstein, S.R. Hamilton, A.P. Feinberg. //

Science. – 1985. – V. 228. – P. 187-190.

134. Greenhough A. The cannabinoid delta(9)-tetrahydrocannabinol inhibits

RAS-MAPK and PI3K-AKT survival signalling and induces BAD-mediated

apoptosis in colorectal cancer cells / A. Greenhough, H.A. Patsos, A.C. Williams, C.

Paraskeva // Internat. J. Cancer. – 2007. – V. 121, № 10. – P. 2172- 2180.

135. Gregory S.G. The DNA sequence and biological annotation of human

chromosome / S.G. Gregory, K.F. Barrlow, K.E. McLay et al. // Nature. – 2006. – V.

441 (7091). – P. 315-321.

136. Gryfe R. Molecular biology of colorectal cancer / R. Gryfe, C. Swallow,

B. Bapat et al. // Curr. Probl. Cancer. – 1997. – V. 21, № 5. – P. 233-300.

137. Guillem J.G. Surgical treatment of colorectal cancer / J.G. Guillem, P.B.

Party, A.M. Cohen // Surg. Colorect. Cancer. – 1997. – V. 47, № 2. – P. 113-128.

138. Gunderson L.L. Adenocarcinoma of the rectum and areas of failure

found at reoperation (second or symptomatic look) following curative surgery for

adenocarcinoma of the rectum: clinicopathologic correlation and implications for

adjuvant therapy / L.L. Gunderson, H. Sosin. // Cancer. – 1994. – № 34. – P. 1278-

1292.

139. Halford S. O6-methylguanine methyltransferase in colorectal cancers:

detection of mutations, loss of expression, and weak association with G:C > A:T

transitions / S. Halford, A. Rowan et al. // Int. J. Gast. Hep. – 2005. – V. 54, № 2. – P.

797-802.

136

140. Haller D.G. New approaches to adjuvant therapy for colorectal cancer /

D.G. Haller // Third International Conference Perspectives in Colorectal Cancer, a

consensus meeting. – Dublin, 2001. – P. 107-111.

141. Hamid S. Establishment and characterization of Asian oral cancer cell

lines as in vitro models to study a disease prevalent in Asia / S Hamid., K.P. Lim,

R.B. Zain et al. // Int. J. Mol. Med. – 2007. – V. 19. – P. 453-460.

142. Hasemeier B. Reliable microRNA profiling in routinely processed

formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer specimens using fluorescence

labelled bead technology /B. Hasemeier, M. Christgen, H. Kreipe, U. Lehmann //

BMC Biotechnol. – 2008. – V. 8. – P. 90-95.

143. Heim S. Clonal chromosome abnormalities in neoplastic cells: evidence

of genetic instability / Genetic instability in cancer / Series editor J. Tooze. – Cold

Springs Harbor Laboratory Press, 1996. – P. 247-260.

144. Hellerbrand C. Reduced expression of CYLD in human colon and

hepatocellular carcinomas / C. Hellerbrand, E. Bumes, F. Bataille et al. //

Carcinogenesis. – 2007. – V. 28, № 1. – P. 21-27.

145. Hemminki A., Mecklin J.P., Jarvinen H. et al. Microsatellite instability is

a favorable prognostic indicator in patients with colorectal cancer receiving

chemotherapy // Gastroentetology. – 2000. – V. 119. – P. 921-928.

146. Hickman M.J. Role of DNA mismatch repair and p53 in signaling

induction of apoptosis by alkylating agents / M.J. Hickman, L.D. Samson // Proc.

Natl. Acad. Sci U S A. – 1999. – V. 96. – P. 10764-10799.

147. Hoff P.M. Phase I study of preoperative oral uracil and tegafur plus

leucovorin and radiation therapy in rectal cancer / P.M. Hoff, N.A. Jaujan, E.D. Saad

et al. // J. Clinic. Oncol. – 2000. – V. 182. – P. 3529-3534.

148. Hoskins R.B. Adjuvant postoperative radiotherapy in carcinoma of the

rectum and rectosigmoid / R.B. Hoskins, L.L. Gunderson, D.E. Dozoretz et al. //

Cancer. – 1995. – V. 55. – P. 61-71.

149. Howe J.R. The genetics of colorectal cancer / J.R. Howe, J.G. Guillem. //

Surgent Clinics of North America. – 1997. – V. 77. – P. 175-195.

137

150. Hubner B.J. Chromosome shattering: a mitotic catastrophe due to

chromosome condensation failure /B.J. Hubner, J.S. Strickfaden, J.M. Muller, J.T.

Cremer // Eur. Biophys. J. – 2009. – V. 38. – P. 729-747.

151. Jackman A.L. Thymidylate synthase inhibitor: the in vitro activity of a

series of heterocyclic benzoyl ring modified 2-desamino-2-methyl- N10-substituted-

5,8-dideazafolates / A.L. Jackman, P.R. Marcham, R.G. Moran et al. // Adv. Enz.

Regul. – 1991. – V. 31. – P. 13-27.

152. Jackman A.L. The role of the reduced-folate carrier and metabolism to

intracellusar polyglutamates for activity of ICI D 1694, in Rustum YM (ed): novel

apporoaches to selective treatments of human solid tumours: laboratory and clinical

correlation / A.L. Jackman, W. Gibson, M. Brown et al. – NY: Plenum, 1993. – P.

265-276.

153. Jackman A.L. ICI D 1694, a quinazoline antifolate thymidylate

synthetase inhibitor that is a potent inhibitor of L 1210 tumor cell growth in vitro and

vivo: a new agent for clinical study / A.L. Jackman, G.A. Taylor, W. Gibson et al. //

Cancer Res. – 1991. – V. 51. – P. 5579-5586.

154. Jackson J.C. Development of cervical cancer control interventions for

Chinese immigrants / J.C.Jackson, H. Do, K. Chitnarong et al. // J. Immigr. Health. –

2002. – V.4 (3) . – P. 147-157.

155. Jacobsen B. The urokinase receptor and its structural homologue C4.4A

in human cancer: expression, prognosis and pharmacological inhibition / B. Jacobsen,

M. Ploug. // Curr. Med. Chem. – 2008. – V. 15, № 25. – P. 2559-2573.

156. Jaeger E. Common genetic variants at the CRAC1 (HMPS) locus on

chromosome 15q13.3 influence colorectal cancer risk / E. Jaeger, E. Webb, K.

Howarth et al. // Nature Genetics. – 2008. – V. 40. – P. 26-28.

157. Jann N. Mechanisms of Chemoresistance in malignant glioma / N.

Jann, I. Sarkaria, J.Gaspar et al. // Clin. Cancer Res. – 2008. – V. 15. – P. 2900-2908.

158. Jessup J. M. Diagnosing colorectal carcinoma: clinical and molecular

approaches / J.M. Jessup, H.R. Menek, D.P. Winchester // Cancer J. Clinic. – 1997. –

V. 47. – P. 70-92.

138

159. Jones P.A., Baylin SB. The fundamental role of epigenetic events in

cancer // Nat. Rev. Genet. – 2002. – V. 3. – P. 415-428.

160. Karran P. Self-destruction and tolerance in resistance of mammalian

cells to alkylation damage / P. Karran, M. Bignami // Nucleic Acids Res. – 1992. – V.

20. – P. 2933-2940.

161. Karran P. Genomic instability and tolerance to alkylating agents / P.

Karran, R. Hampson // Cancer Surv. – 1996. – V. 28. – P. 69-85.

162. Ke N., Sundaram R., Liu G. et al. Orphan G protein-coupled receptor

GPR56 plays a role in cell transformation and tumorogenesis involving the cell

adhesion pathway / N. Ke, R. Sundaram, G. Liu et al. // Mol. Cancer Ther. – 2007. –

V.6(6). – P. 1840-1850.

163. Kleczkowska H.E. hMSH3 and hMSH6 interact with PCNA and

colocalize with it to replication foci /H.E. Kleczkowska, M. Giancarlo, T. Lettieri, J.

Jiricny // Genes Development. – 2010.V. 15, № 6. – P. 724-736.

164. Knox S.S. From 'omics' to complex disease: a systems biology approach

to gene-environment interactions in cancer / S.S. Knox // Cancer Cell. – Int. – 2010. –

V. 10.

165. Kubota Y. Chemically reduced fidelity of DNA synthesis in cell extracts

from induced primary thymic lymphomas of mice /Y. Kubota // Cancer Res. – 1995.

– V. 55. – P. 3777-3780.

166. Leach F.S. The human mutator gene homolog MSH2 and its association

with hereditary nonpolyposis colon cancer / F.S. Leach, N.C. Nicolaides, N.

Papadopoulos et al. // Cell. – 1994. – V. 77. – P. 167.

167. Levi Z. A quantitative immunoichemical fecal occult blood test for

colorectal neoplasia / Z. Levi // Annual Internat Med. – 2007. – V. 146. – P. 244-255.

168. Lind G. A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal

carcinomas and colon cancer cell lines / G. Lind // Mol. Cancer. – 2004. – V. 3. – P.

28.

169. Li J. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA

extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells

139

and snap frozen cells / J. Li, P. Smyth, R. Flavin et al. // BMC Biotechnol. – 2007. –

V. 7. – P. 36.

170. Li G.-M. Human MutSa specifically binds to DNA containing

aminofluorene and acetylaminofluorene adducts /G.-M. Li, H. Wang, L.J. Romano. //

J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – Р. 24084-24088.

171. Lieberman D. Progress and challenges in colorectal cancer screening and

surveillance / D. Lieberman // Gastroenterology. – 2010. – V. 138. – P. 2115-2126.

172. Lievre A. Molecular biology in clinical cancer research: the example of

digestive cancers / A. Lievre, P. Laurent-Puig. // Review Epidemiological Sante.

Publique. – 2005. – V. 53, №3. – P. 267-282.

173. Lind G. A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal

carcinomas and colon cancer cell lines / G. Lind, L. Thorstensen, T. Lovig, R. Lothe

// Mol. Cancer. – 2004. – V. 3. – P. 1476-1498.

174. Loeb L.A. A mutator phenotype may be required for multi-stage

carcinogenesis / L.A. Loeb // Cancer Res. – 1991. – V. 51. – P. 3075-3079.

175. Loeb L.A. Many mutation in cancer. Genetic instability in cancer /

Series editor J. Tooze. – Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1996. – P. 329-342.

176. Lynch H.T. Attenuated familial adenomatous polyposis coli. A

phenotypically and genotypically distinctive variant of FAP / H.T. Lynch, T.C.

Smyrk, A. McGinn // Cancer. – 1995. – V. 76. – P. 2447-2433.

177. Lynch H.T. Classification of familial adenomatous polyposis: a

diagnostic nightmare editorial / H.T. Lynch, T.C. Smyrk // Am. J. Hum. Genet. –

1998. – V. 62. – P. 1288-1289.

178. Lynch H.T. Hereditary ovarian cancer: molecular genetics, pathology,

management, and heterogeneity /H.T. Lynch, M.J. Casey, C.L. Snyder et al. // Mol.

Oncol. – 2009. – V. 3, № 2. – P. 97-137.

179. Macdonald J.S. Adjuvant therapy of colon cancer / J.S. Macdonald //

Cancer J. Clinic. – 1997. – V. 47. – P. 243-256.

180. Mamounas E. Comparative efficacy of adjuvant chemotherapy in

patients with Dukes’ B vs Dukes’ C colon cancer: results from four national surgical

140

adjuvant breast and bowel project adjuvant stadies / E. Mamounas, S. Wieaud, N.

Wolmark // J. Cliniс. Oncol. – 1999. – V. 17. – P. 1349-1355.

181. Marsh S. Pharmacogenomics: from bedside to clinical practice / S.

Marsh, H. McLeod // Hum. Mol. Genet. – 2006. – V. 15, № 1. – P. 89-93.

182. Martin E.S. The BCSC-1 locus at chromosome 11q23-q24 is a candidate

tumor suppressor gene / E.S. Martin, R. Cesari, F. Pentimalli et al. // PNAS

September. – 2003. – V. 100, № 20. – P. 11517-11522.

183. McCullock E.A. (edt) Cell culture techniques – clinics in hematology. –

WB Saunders, Eastbourne, 1984. – P. 371-391.

184. Mcinerney N. Low penetrance breast cancer predisposition SNPs are site

specific / N. Mcinerney, G. Colleran, A. Rowan et al. // Breast Cancer Res. Treat. –

2009. – V. 117. – P. 151-159.

185. Mellon I. Transcription-coupled repair deficiency and mutations in

human mismatch repair genes / I. Mellon, D.K. Rajpal, M. Koi // Science. – 1996. –

V. 272. – P. 557-560.

186. Miller J.T. Retrotransposon-related DNA sequences in the centromeres

of grass chromosomes / J.T. Miller, E. Dong, S.A. Jackson et al. // Genetics. – 1998.

– V.150 (4). – P. 1615-1623.

187. Minsky B.D. Multimodality treatment for rectal cancer / B.D. Minsky //

Third international conference perspectives in colorectal cancer, a consensus meeting.

– Dublin, 2001. – P. 47-64.

188. Mitchell E. Combined modality therapy of locally advanced or recurrent

adenocarcinoma of the rectum: preliminary report of a phase I trial of chemotherapy

with CPT-11, 5-FU and concomitant irradiation / E. Mitchell, N. Ahmad, R.D. Fry //

ASCO. – 1999. – V. 18. – P. 247.

189. Monk M. Epigenetic programming of differential gene expression in

development and evolution / M. Monk // Development Genet. – 1995. – V. 17. – P.

188-197.

141

190. Myerson R.J. The national cancer database report on carcinoma of the

anus / R.J. Myerson, L.H. Karnell, H.R. Nenck // Cancer. – 1997. – V. 80. – P. 805-

815.

191. Mu D. Recognition and repair of compound DNA lesions (base damage

and mismatch) by human mismatch repair and excision repair systems / D. Mu, M.

Tursun, D.R. Duckett // Mol. Cell. Biology. – 1997. – V. 17. – P. 760-769.

192. Narayan P.J. High content analysis of histone acetylation in human cells

and tissues /P.J.Narayan, M. Dragunow // J. Neurosci Methods. – 2010. – V.193 (1).

– P.54-61.

193. Nicolaides N.C. Mutation of a mutL homolog in hereditary colon cancer

/ Nicolaides N.C., Wei Y.F., Ruben S.M. et al. // Science. – 1994. – V. 263. – P.

1625-1629.

194. Nicolantonio F. Cancer cell adaptation to chemotherapy / F.

Nicolantonio, S.J. Mercer, L.A. Knight et al. // BMC Cancer. – 2005. – V. 78.

195. Nishiyama T. Eukaryotic ribosomal protein RPS25 interacts with the

conserved loop region in a dicistroviral intergenic internal ribosome entry site /

T.Nishiyama, H. Yamamoto, T.Uchiumi, N. Nakashima // Nucleic Acids Res. –

2007. – V.35 (5). – P.1514-1521.

196. Oltvai Z.N. Systems biology. Life's complexity pyramid / Z.N. Oltvai,

A.L. Barabusi // Science. – 2002. – V.298 (5594). – P.763-764.

197. Pagus F. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in

colorectal cancer / F. Pagus, A. Berger // New England J. Med. – 2004. – V. 17. – P.

1345-1353.

198. Papadopoulos N. Molecular basis of HNPCC: mutations of MMR genes

/ N. Papadopoulos, A.Lindblom // Hum. Mutat. – 1997. – V.10 (2). – P. 89-99.

199. Pastor D.M. Primary cell lines: false representation or model system? A

comparison of four human colorectal tumors and their coordinately established cell

lines / D.M. Pastor, L.S. Poritz, T.L. Olson et al. // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2010. –

V. 3, № 1. – Р. 69-83.

142

200. Paul J.M. Dosimetric reliability of thermoluminescent phosphors (TLD-

too) / J.M. Paul, F.R. Khan // J. Radiol. Electrol. Med. Nucl. – 1995. – V.56 (11). – P.

779-783.

201. Pavelic J. Biological and physiological aspects of action of insulin-like

growth factor peptide family / J. Pavelic, T. Matijevic, J. Knezevic // Indian J. Med.

Resources. – 2007. – V. 125. – P. 511-522.

202. Pazdur R. Colorectal and anal cancer /R. Pazdur, L. Coia, L.D. Wagman,

J.P. Ayoub // Cancer management: A multidisciplinary approach: eds. R. Pazdur. –

NY: Biology, 1998. – P. 65-93.

203. Peltomaki P. Mutations of a mutS homolog in hereditary nonpolyposis

colorectal cancer /P. Peltomaki, S. Sistonen, L. Aaltonen et al. // Cell. – 1993. – V.

75. – P. 1215-1225.

204. Pendas-Franco N. Vitamin D and Wnt/beta-catenin pathway in colon

cancer: role and regulation of DICKKOPF genes / N. Pendas-Franco, O. Aguilera, F.

Pereira // Anticancer Res. – 2008. – V. 28, № 5 A. – P. 2613-2623.

205. Poplin E. Phase III randomized trial of bolus 5FU/leucovorin/levamisole

versus 5FU continuous infusion/levamisole or adjuvant therapy for high risk colon

cancer (SWOG 9415/INT0153) / E. Poplin, J. Benedetti, N. Estes // ASCO. – 2000. –

V. 19. – P. 240.

206. Poynte J.N. Statins and the risk of colorectal cancer / J.N. Poynte, B.

Stephen // New England J. Med. – 2005. – V. 12. – P. 1367-1375.

207. Pluznik D.H. The cloning of normal mast cells in tissue culture / D.H.

Pluznik, L. Sachs // J. Cel. Physiol. – 1965. – V. 66, № 5. – P. 319-324.

208. Qu R.Z. The gene flow of population genetic structure / R.Z. Qu, L.Hou,

H.Lu, H. Li // Yi Chuan. – 2004. – V.26 (3). – P.377-382.

209. Quinlan S.C. Increased risk for lymphoid and myeloid neoplasms in

elderly solid-organ transplant recipients /S.C. Quinlan, L.M. Morton, R.M. Pfeiffer

et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2010. – V.19 (5). – P.1229-1237.

143

210. Quirke P. Local recurrence of rectal adenocarcinoma due to inadequate

surgical resection: histopathologic study of lateral tumor spread and surgical excision

/P. Quirke, P. Durdey, M.D. Dixon. – Dublin: Lancet, 1996. – 999 p.

211. Ransonoff D. Screening for colorectal cancer / D. Ransonoff // New

England J. Med. – 1999. – V. 234. – P. 1123-1126.

212. Razin A. DNA methylation and gene expression / A. Razin, H. Cedar. //

Microbiol. Review. – 1991. – V. 55. – P. 451-458.

213. Reinacher-Schick A. Pathogenesis of colorectal carcinoma / A.

Reinacher-Schick, W. Schmiegel // Praxis. – 2002. – V. 91, № 39. – P. 1589-1593.

214. Rich Т. Patterns of recurrence of rectal cancer after potentially curative

surgery / T. Rich, L.L. Gunderson, R. Lew // Cancer. – 1993. – V. 52. – P. 1317-

1329.

215. Rizki A. Defects in mismatch repair promote telomerase-independent

proliferation / A. Rizki, V. Lundblad // Nature. – 2001. – V. 411. – P. 713-716.

216. Rougier P. Palliative and adjuvant chemotherapy in colorectal cancer / P.

Rougier // Europe. J. Cancer. – 2001. – V. 37. – P. 189-212.

217. Rowley J.D. Chromosomal translocations: revisited yet again / J.D.

Rowley // Blood. – 2008. – V. 112, № 6. – Р. 2183-2189.

218. Roy B. The subunit of eIF3 promotes reinitiation competence during

translation of mRNAs harboring upstream open reading frames / B. Roy, J. Vaughn,

B. Kim et al. // RNA. – 2010. – V. 16. – P. 748-761.

219. Sack J. Colorectal cancer: natural history and management. Journal

Hospital physician / J. Sack, J.M. Rothman. // Clinical Review Article. – 2000. – V.

12. – P. 64-73.

220. Saini A. Multicentre randomized trial of protracted venous infusion 5FU

to 5FU/folinic acid as adjuvant therapy for colorectal cancer / A. Saini, D.

Cunningham, A.R. Norman. // ASCO. – 2000. – V. 19. – P. 240-928.

221. Saltz L.B. Adjuvant therapy for colorectal cancer / L.B. Saltz, J.Y.

Doullard // New England J. Med. – 2006. – V. 1. – P. 6-15.

144

222. Savitsky K. A single ataxia-telangiectasia gene with a product similar to

Pi-3 kinase /K. Savitsky K. et al. // Science. – 1995. – V. 268. – P. 1749-1753.

223. Schmeler K.M. Prophylactic surgery to reduce the risk of gynecologic

cancers in the lynch syndrome / K.M. Schmeler // New England J. Med. – 2003. – V.

12. – P. 120-134.

224. Schmiegel W. Acetylsalicylic acid for prevention of colorectal

adenomas. The APP Study /W. Schmiegel, A. Reinacher-Schick // Internist (Berl). –

2003. – V. 44 (10). – P.1322-1324.

225. Schoenfeld P. Advances in therapy for advanced colon cancer / P.

Schoenfeld, A. Flood // New England J. Med. – 2004. – V. 1. – P. 12-24.

226. Schrag D. Costs and cost-effectiveness of colorectal cancer prevention

and therapy / D. Schrag, J. Weeks // Seminar of Oncol. – 1999. – V. 26. – P. 561-568.

227. Sjöblom T., Mitotic cell death by chromosome fragmentation / Sjöblom

T, J.B. Stevens, G. Liu // Cancer Res. – 2006. – V. 13, № 67. – Р. 7677-7684.

228. Nimmagadda S. The role of DNA synthesis imaging in cancer in the era

of targeted therapeutics / S. Nimmagadda, F. Anthony // Cancer Metastasis Rev. –

2008. – V. 27. – P. 575-587.

229. Stevens J.B. Mitotic cell death by chromosome fragmentation / J.B.

Stevens, G. Liu, S.W. Bremer et al. // Cancer Res. – 2007. – V. 15, № 67. – Р. 7686-

7694.

230. Takahashi T. The lymphatic spread of rectal cancer and effect of

dissection: Japanese contribution and experience /T. Takahashi, M. Veno, K.

Azekura, H. Ota. – Berlin, Heidelberg: Springer, Verlag. – 1997. – P. 164-180.

231. Thibodeau S.N. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon

/S.N. Thibodeau, G. Bred, D. Sched // Science. – 1993. – V. 260. – P. 816-819.

232. Tokuoka M. Genetic susceptibility to gastrointestinal cancer: minireview

of the genomewide studies / M. Tokuoka, H. Ishii, K. Mimori et al. // Ann. Surg.

Oncol. – 2009. – V. 16. – P. 1783-1788.

145

233. Tomlinson I. A genome-wide association study identifies colorectal

cancer susceptibility loci on chromosomes 10p14 and 8q23.3 / I. Tomlinson, E.

Webb, L. Carvajal-Carmona et al. // Nature Genetics. – 2008. – V. 40. – P. 623-630.

234. Trainer A.H. Extra-colonic manifestations of familial adenomatous

polyposis coli / A.H. Trainer // Adv. Exp. Med. Biol. – 2009. – V. 656, № 1. – Р.

119-127.

235. Twelves C. Capecitabine as adjuvant treatment for stage III colon

cancer / C. Twelves // New England J. Med. – 2005. – V. 6. – P. 23-35.

236. Valentini V. Chemoradiation with raltitrexed (tomudex) and concomitant

preoperative radiotherapy has potential in the treatment of stage II/III respectable

rectal cancer / V. Valentini, A.G. Morganti, G. Fiorentino // ASCO. – 1999. – V. 18.

– P. 257a.

237. Vogel I. Disseminated tumor cells in the blood and/or bone marrow of

patients with colorectal carcinoma are an independent prognostic factor / I. Vogel, E.

Soeth, C. Ruder et al. // Annual Oncol. – 2000. – V. 11. – P. 43-183.

238. Vogelstein B. Genetic alterations during colorectal-tumor development /

B. Vogelstein, E.R. Fearon, S.R. Hamilton // New England J. Med. – 1998. – V. 319.

– P. 525-532.

239. Volk Е.Е. Management and outcome of patients with invasive carcinoma

arising in colorectal polyps / Е.Е. Volk, J.R. Goldblum, R.E. Petras et al. //

Gastroenterol. – 1995. – V. 109. – P. 1801-1807.

240. Volm M. Multidrug resistance and its reverse /M. Volm // Anticancer

Res. – 1998. – V. 18. – P. 2905-2918.

241. Wacholder S. Assessing the probability that a positive report is false: an

approach for molecular epidemiology studies / S. Wacholder, S. Chanock, M.Garcia-

Closas et al. // JNCI J. Natl. Cancer Inst. – 2004. – V. 96. – P. 434-442.

242. Waltz B.J. Anatomical prognostic factors after abdominal perineal

resection / B.J. Waltz, M.J. Green, E.R. Lindstrom et al. // International. J. Radiation

Oncol. Biol. Physics. – 1998. – V. 7. – P. 477-484.

146

243. Wang E. A roadmap of cancer systems biology / E.A. Wang // Cancer

Systems Biology. Wang E. ed. Chapman & Hall / CRC Mathematical Computational

Biology, Nature Precedings, 2010.

244. Wang H. Specific binding of human MSH2. MSH6 mismatch-repair

protein heterodimers to DNA incorporating thymine- or uracil-containing UV light

photoproducts opposite mismatched bases / H. Wang, C.W. Lawrence, G.M. Li, J.B.

Hays // J. Biol. Chemi. – 1999. – V. 274. – P. 16894-16900.

245. Watanabe T. Molecular predictors of survival after adjuvant

chemotherapy for colon cancer / T. Watanabe. // New England J. Med. – 2005. – V.

6. – P. 45-51.

246. Willmer E.N. Steroids and cell surfaces / E.N. Willmer // Biol. Rev.

Camb. Philos. Soc. – 1961. – V.36. – P. 368-398.

247. Winawer S.J. Colorectal cancer screening: clinical guidelines and

rationale / S.J. Winawer, R.H. Fletcher, J.H. Bond et al. // Gastroenterology. – 1997.

– V. 112. – P. 594-642.

248. Wingo P.A. Cancer statistics / P.A. Wingo, T. Tong, R. Boldens et al. //

Cancer J. Clinic. – 1995. – V. 45. – P. 8-30.

249. Withers H.R. Postoperative radiotherapy for adenocarcinoma of the

rectum and rectosigmoid / H.R. Withers, M.M. Romsdahl // International J. Radiation

Oncol. Biol. Physics. – 1997. – V. 2. – P. 1069-1074.

250. Wolmark N. Clinical trial to assess the relative efficacy of fluorouracil

and leucovorin, fluorouracil and levamisole, and fluorouracil, leucovorin, and

levamisole in patients with Dukes' B and C carcinoma of the colon: results from

National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project C-04 /N. Wolmark, H.

Rockette, E. Mamounas et al. // J. Clin. Oncol. – 1999. – V. 17 (11). – P.3553-3559.

251. Woodford-Richens K.L. SMAD4 mutations in colorectal cancer probably

occur before chromosomal instability, but after divergence of the microsatellite

instability pathway /K.L. Woodford-Richens, A.J. Rowan, P. Gorman et al. // PNAS.

– 2001. – V. 98. – P. 9719-9723.

147

252. Worthley D.L. Colorectal carcinogenesis: Road maps to cancer / D.L.

Worthley, V.L. Whitehall, K.J. Spring, B.A. Leggett // World J. Gastroenterol. –

2007. – V. 3, № 28. – P. 3784-3791.

253. Wu J. Mismatch repair processing of carcinogen-DNA adducts triggers

apoptosis / J. Wu, L. Gu, H. Wang et al. // Molec. Cell. Biol. – 1999. – V. 19, № 12.

– P. 8292-8301.

254. Wyatt S. Oxytocin receptor antagonists for preterm labour do not

improve infant outcomes more than placebo or other tocolytics /S. Wyatt, D.A. Guinn

// Evid. Based Med. – 2006. – V.11 (3). – P.75.

255. Xi Y. Multi-level gene expression profiles affected by thymidylate

synthase and 5-fluorouracil in colon cancer /Y. Xi, G. Nakajima, J. Schmitz et al. //

BMC Genomics. – 2006. – V. 68. – P. 1186.

256. Young J. A transmembrane protein-encoding gene commonly

methylated in colorectal polyps and cancers / J. Young, K. Biden, L. Simms et al. //

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – V. 98. – P. 265-270.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФП – α-фетопротеин

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ИПФР – инсулиноподобный фактор роста

ИЛ – интерлейкин

КРР – колоректальный рак

ЛВ – лейковорин

МННГ – N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидина

МИ – митотический индекс

ННКРР – наследственный неполипозный колоректальный рак

ОП – оптическая плотность

ПДФ – продукты деградации фибриногена/фибрина

ПМЗН – первично-множественные злокачественные новообразования

ПСХ – первичный склерозирующий холангит

РКТ – рентгеновская компьютерная томография

РОК – рак ободочной кишки

РПК – рак прямой кишки

РЭА – раково-эмбриональный антиген

148

СА 19-9 – карбогидратный антиген

СА – семейный аденоматоз

СОД – суммарная общая доза

ТД – Томудекс

УФ – ультрафиолетовое излучение

5-ФУ – 5-фторурацил

5-БУ – 5-бромурацил

ХА – хромосомные аберрации

ЦП – Цисплатин

ЦФ – циклофосфамид

ЯК – язвенный колит

Ig – иммуноглобулин

149

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Анкета-опросник для пациентов

ПРИЛОЖЕНИЕ № 1

Уважаемый пациент!

Цель данного исследования: изучить историю развития Вашего заболевания,

выявить возможные причины и оценить уровень знаний о Вашей болезни.

Внимательно прочтите вопросы и все варианты ответов. Выберите наиболее

соответствующие Вашему мнению и обведите кружочком цифры, которыми

они обозначены. Если ни один из предлагаемых ответов не отражает Ваше

мнение, допишите свой вариант.

Анонимность опроса гарантируется. Результаты будут использованы только в

обобщенном виде.

Заранее благодарим за участие в исследовании!

1. На каком производстве Вы работали?

На химическом (производство бензола, толуола, ацетона).

На металлургическом.

Нефтеперерабатывающем.

Производство по синтезу анилиновых красителей.

Ваш вариант……………………………………………………………………….

2. Каков Ваш профессиональный стаж?

5 лет

10 лет

20 лет

30 лет

более 30 лет

3. В каком районе города Перми Вы проживаете?

Ваш вариант………………………………………………………………………

4. Сколько лет живете в вышеуказанном районе?

До 5 лет

10 лет

до 30 лет

более 30 лет.

5. Что Вы употребляете в пищу (обведите)

Пища богата жирами

В пище много клетчатки.

6. При наличии у Вас одного из указанных заболеваний, просим

подчеркнуть:

Колит, энтероколит.

Полипоз прямой кишки, полипоз толстой кишки

Геморрой.

Анальная трещина.

Неспецифический язвенный колит.

Болезнь Крона.

150

7. Наследственный заболевания, такие как: синдром Линча1, синдром

Линча2. Другие заболевания, не перечисленные выше ………………...

……………………………………….………………………………………

……………………………………….………………………………………

8. Имеются ли онкологические заболевания у кровных родственников

(перечислите у кого и какие) …………………………………………….

…………………………………………………………………………………

……………………………………………………...…………………….

9. Имеете ли профессиональную вредность по условиям труда и какую

…………………………………………………………………………………

………………...………………………………………………………….

10. Состоите ли Вы на диспансерном учете и по поводу какого заболевания

……………………………………………………………….

……………………………………………………………………………..

11. Имеется ли у Вас:

Стойкое понижение или отсутствие аппетита ДА НЕТ

Понижение массы тела ДА НЕТ

Боли в правой или левой половине живота ДА НЕТ

Ложные позывы на низ ДА НЕТ

Стул лентовидный или типа «овечьего кала» ДА НЕТ

Выделение крови из прямой кишки ДА НЕТ

Выделение слизи из прямой кишки ДА НЕТ

Запоры, сменяющиеся поносами и

сопровождающиеся вздутием живота ДА НЕТ

Запоры ДА НЕТ

12. Просим вписать жалобы не указанные в анкете…………………………

………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………

13. Проводились ли Вам до поступления в клинику следующие

исследования:

Анализ кала на скрытую кровь ДА НЕТ

Ректороманоскопия ДА НЕТ

Бариевая клизма ДА НЕТ

Колоноскопия ДА НЕТ

14. Ваш пол

Мужской

Женский

15. Ваш возраст.

20-29 лет.

30-39 лет.

40-49 лет.

50-59 лет

60-69 лет

70 лет и старше.

Благодарим за искренние ответы!