ВАЛІДАЦІЯ АНАЛІТИЧНИХ МЕТОДИКВАЛІДАЦІЯ АНАЛІТИЧНИХ МЕТОДИК

Національний фармацевтичний університетКафедра фармацевтичної хімії

Вступ

Валідація аналітичної методики - це експерименталь ний доказ того, що методика придатна для розв'язан ня поставлених завдань.

Усі методики і випробування, включені у Фармакопею, є валідованими і потребують проведення тільки верифікації (перевірки). Верифікація має підтверди ти на підставі експериментальних даних, що дана лабораторія спроможна коректно відтворити фармако пейну методику чи випробування.

випробування на ідентифікацію;

кількісні випробування для визначення

домішок;

випробування на граничний вміст для

контролю до мішок;

кількісні випробування для визначення діючої

ре човини та інших компонентів у субстанціях і

готових лікарських засобах.

Аналітичні випробування і методики, які підлягають валідації

Типові валідаційні характеристики правильність; прецизійність; збіжність; внутрішньолабораторна прецизійність; специфічність; межа виявлення; межа кількісного визначення; лінійність; діапазон застосування. робасність• зміна у синтезі лікарської субстанції; • зміна у складі готового лікарського засобу;• зміна в аналітичній методиці.

Валідаційні характеристики відповідно до рекомендацій ICH та фармакопеї США - однакові.ICH USP

• Accuracy• Precision

• Repeatability• Intermediate precision• Reproducibility

• Specificity• Detection Limit• Quantitation Limit• Linearity• Range• Robustness

• Accuracy• Precision• Specificity• Detection Limit• Quantitation Limit• Linearity• Range• Robustness is not part of formal

validation

Типові валідаційні характеристики

Валідаційні характеристики, які розглядаються для різних випробувань і методик

1. Специфічність — здатність однозначно оцінювати аналізовану речовину у присутності інших компонентів, які можуть бути присутніми у зразку. Це можуть бути домішки, продукти розкладу, допоміжні речовини і т.д.

Недолік специфічності випробування може бути компенсований іншим (іншими) додатковими випробу ваннями.

2. Правильність - характеризує ступінь відповідності між відомим справжнім значенням або довідковою величиною і значенням, одержаним за даною методикою. - застосування аналітичної методики до зразка з відомим ступенем чистоти; - порівняння результатів аналізу, з результатами арбітражного методу, правильність і прецизійність якого відомі; -висновок про правильність можна зробити після того, як установлені прецизійність, лінійність і специфічність.

Подання даних. Правильність оцінюють не менше як для дев'яти визначень та не менш ніж для трьох різних концентрацій, охоплюючих увесь діапазон за стосування, наприклад три концентрації і три визначення для кожної. Визначення мають включати усі стадії методики.

Правильність виражають у відсотках знайденого зна чення від уведеної кількості або як різницю між се реднім і справжнім значенням з урахуванням відпові дних довірчих інтервалів.

3. Прецизійність аналітичної методики виражає ступінь близькості (або ступінь розкиду) ре зультатів для серії вимірів, виконаних за даною мето дикою на різних пробах одного і того самого одно рідного зразка.

- не менше дев'яти визначень, охоплюючих діапазон застосування методики (наприклад, три концент рації/три повтори) або - не менше шести визначень для зразків із вмістом аналізованої речовини, близьким до номінального.

3.1. Збіжність характеризує пре цизійність методики при її виконанні в одних і тих самих умовах (зокрема, одним і тим самим аналітиком або групою аналітиків) протягом невеликого про міжку часу. 3.2. Внутрішньолабораторна прецизійність характеризує вплив внутрішньолабораторних варіацій: різні дні, різні аналітики, різне обладнання і т.п. 3.3. Відтворюваність характеризує прецизійність у міжлабораторному експерименті.

Подання даних. Стандартне відхилення, відносне стандартне відхилення і довірчий інтервал.

Правильність і прецизійність

?

• Неправильна• Прецизійна

Правильність і прецизійність

• Не прецизійна

• Неправильна

Правильність і прецизійність

• Неправильна• Непрецизійна

??Правильність і прецизійність

4. Межа виявлення для конкретної аналітичної методики являє собою мінімальну кількість аналізованої речовини у зразку, яка може бути виявлена (при цьому не обов'язково має бути визначене точне значення).

5. Межа кількісного визначення для аналітичної методики являє собою мінімальну кількість аналізованої речовини у зразку, яка може бути кількісно визначена з потрібною правильністю і прецизійністю. Межа кількісного визначення є валідаційною характеристикою методик кількісного виз начення малих концентрацій речовин у зразку і розг лядається в основному при визначенні домішок і/або продуктів розкладання.

6. Лінійність - це здатність методики (у ме жах діапазону застосування) давати величини, прямо пропорційні концентрації (кількості) аналізованої ре човини у зразку.

Для підтвердження лінійності використовують не мен ше п'яти концентрацій. Інші підходи мають бути обґрунтовані.

7. Діапазон визначення аналітичної мето дики є інтервал між мінімальною і максимальною концентраціями (кількостями) аналізованої речовини у зразку (включаючи ці концентрації), для якого пока зано, що аналітична методика має потрібну прецизійність, правильність і лінійність.

8. Робасність - це здатність аналітичної методики не зазнавати впливу малих контрольованих аналітиком змін в умовах виконання методики. Робасність є показником надійності методики при її використанні у зазначених умовах.

РобасністьТипові приклади параметрів, які вивчаються: — стійкість у часі аналітичних розчинів; — час екстракції. У разі рідинної хроматографії: — рН рухомої фази; — склад рухомої фази; — колонки (різні серії і/або постачальники); — температура; — швидкість рухомої фази. У разі газової хроматографії: — колонки (різні серії і/або постачальники); — температура; — швидкість газу-носія.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ЩОДО КРИТЕРІЇВ ПРИ ПРОВЕДЕННІ ВАЛІДАЦІЇ ДЛЯ МЕТОДИК КІЛЬКІСНОГО АНАЛІЗУ

• Вимоги до невизначеності аналізу.• Критерії незначущості.• Нормалізовані координати.

Вимоги до невизначеності аналізу

ПрикладиПриклади

Реакція ідентифікації рибофлавіну розчином срібла нітрату

№р-ну

Мод. розчин,

%

C,мг/мл

0,02 % ізотонічний розчин рибофлавіну

Лаб. № 1 Лаб. № 2 Лаб. № 3

R, %nk α1 Р(Сk) nk α1 Р(Сk) nk α1 Р(Сk)

1. 70 0.14 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

2. 85 0.17 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

3. 100 0.20 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

4. 115 0.23 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

5. 130 0.26 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

6. холост. 0 20 1 0 20 1 0 20 1 0 0 0

7. контр. 2.0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100

Результати дослідження ймовірності виявлення рибофлавіну за реакцією з срібла нітратом у присутності натрію хлориду

Реакція зі срібла нітратом Модифікація методу

До 2 –3 мг рибофлавіну додають 2 мл води та 5-6 кр. срібла нітрату, поступово утворюється оранжево-червоне забарвлення.

Вивчення співвідношення лікарської форми та реагенту: 1 мл (0.2 мг/мл) + 0.01 мл розчину срібла нітрату. Вивчення специфічності реакції у присутності натрію хлориду. Валідація методики для розчинів аптечного виготовлення. у концентраційному діапазоні 70 – 130 %.

)( kCP

Запропоновано методику для ідентифікації рибофлавіну у розчинах аптечного виготовлення в умовах аптек та лабораторій з аналізу

Ідентифікація рибофлавіну за флуоресценцієюОпис існуючого методу Проведені дослідження

Спостереження флуоресценції у відбитому світлі або світлі УФ лампи, її зникнення після додавання розчину лугу чи кислоти.

Підбір пробопідготовки, 2∙10-5 г/мл . У ході валідації досліджено достовірність ефекту реакції для 0.02 % та ізотонічного розчинів рибофлавіну у діапазоні визначення 70 – 130 %.

№р-ну

Мод.р-н, %

C,мг/мл

ізотонічний 0.02 % розчин рибофлавіну

Лаб. № 1 Лаб. № 2 Лаб. № 3

nk α1 Р(Сk) nk α1 Р(Сk) nk α1 Р(Сk)

1. 70 0.014 0 0 1 0 0 1 0 0 1

2. 85 0.017 0 0 1 0 0 1 0 0 1

3. 100 0.020 0 0 1 0 0 1 0 0 1

4. 115 0.023 0 0 1 0 0 1 0 0 1

5. 130 0.026 0 0 1 0 0 1 0 0 1

6. хол. 0 20 1 0 20 1 0 20 1 0

7. контр. 0.01 0 0 1 0 0 1 0 0 1

Опис існуючого методу Проведені дослідження

До 5 мл розведення 1∙10-5 г/мл додають 0.02 г натрію гідросульфіту після чого зникає забарвлення та флуоресценція розчину, які відновлюються при струшуванні розчину на повітрі.

Підбір аліквот для аналізу. 0.2 мл ЛФ розводять до 2 мл водою Р та додають 0.01 г натрію гідросульфіту. Вивчення достовірності ефекту реакції у діапазоні визначення 70 – 130 %.

Реакція з натрію гідросульфітом

Вивчення достовірності ефекту реакції у концентраційному діапазоні

Специфічні випробування, що дозволяють відрізнити рибофлавін від речовин зі схожими фізико-хімічними властивостями в умовах аптеки. Запропоновані для впровадження в роботу аптек та лабораторій.

Результати валідації методик ідентифікації кислоти аскорбінової у порошках аптечного виготовлення

Рис. Крива ефективності реакції кислоти аскорбінової з мідно-тартратним розчином

№досліду

m(к-ти аск.),

мг/мл

Порошок кислоти аскорбінової

Р(Сk) R, %

1. 1 1 100

2. 1.5 1 100

3. 2 1 100

4. 2.5 1 100

5. 3 1 100

холост. 0 0 0

контр. 2 1 100

Достовірність ефекту реакції кислоти аскорбінової з розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу

Для порошків з глюкозою: •через можливість виявлення хибно-позитивного ефекту реакції ідентифікацію кислоти аскорбінової не проводять з розчином срібла нітрату та мідно-тартратним розчином;•використовують для ідентифікації реакції з розчином калію перманганату, 0.05 М розчином йоду, 2,6-дихлорфеноліндофенолу титрованим розчином.

Запропоновано для ідентифікації кислоти аскорбінової у порошках аптечного виготовлення

-0,05

0,15

0,35

0,55

0,75

0,95

1,15

0 2 4 6 8 10 12 14m(к-ти аскорб.), мг

P(Ck), % P(C) - імовірність виявлення α - частота невиявлення

Інтервал ненадійності

С0,95С0,05

Методи кількісного визначення кислоти аскорбінової у простих порошках

Критерії прийнятності

Прописана маса простого порошку, г (Наказ МОЗ України № 626)

0.1 0.2 0.5 1.0

допуски вмісту, % ± 10 ± 10 ± 5 ± 3

max ΔAs, % 3.2 3.2 1.6 0.96

max δRL(80, 120), % 2.14 2.14 1.07 0.64

max So, % 1.0433 1.0433 0.5216 0.3130

min r 0.9988 0.9988 0.9993 0.9997

RSD range 21.9577 21.9577 14.6385 14.6385

max a 5.12 5.12 2.56 1.536

Критерії прийнятності валідаційних характеристик методик кількісного визначення кислоти аскорбінової у простих порошках

За загальною статтею ДФУ «Приготування порошків «ex tempore» відхилення вмісту діючих речовин мають становити не більше ± 10 % від вмісту.

Метод Опис обраних методів Прогноз невизначеності аналізу, %

Йодометричний розчин крохмалю Р, 0,05 М розчин йоду 0.97

Алкаліметричний розчин фенолфталеїну Р, 0,1 М розчин натрію гідроксиду 0.91

Йодохлорометричний розчин крохмалю Р, 0.05 М, розчин йодмонохлориду 0.97

Йодатометричний розчин кислоти хлористоводневої, 1% розчин калію йодиду, розчин крохмалю Р, 0.0167 М розчин калію йодату 0.97

Порівняння метрологічних характеристик титриметричних методик кількісного визначення кислоти аскорбінової у простих порошках

Валідаційні параметри

Йодометричний метод

Алкаліметричний метод

Йодохлорометричний метод

Йодатометричний метод

Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2

Вивчення точності та правильності

Z, % 100.23 100.45 100.37 99.83 101.39 101.66 99.62 99.77

Sz, % 0.6766 0.2637 0.4922 0.6083 0.5242 0.4247 0.8499 0.5827

Δz, % 1.1917 0.4645 0.8669 1.0714 0.9233 0.7480 1.4969 1.0263

δ, % 0.23 0.45 0.37 0.17 1.39 1.66 0.38 0.23

Вивчення лінійності

b 0.9870 0.9994 1.0269 1.0267 1.0401 1.0203 1.0204 1.00896

a 1.0298 0.5086 2.2815 2.7907 2.5693 0.3585 2.3830 1.1014

Вивчення відтворюваності

Zintra, % 100.34 100.10 101.53 99.70

SDz, % 0.5253 0.6191 0.4895 0.7356

Δintra, % 0.3263 0.3846 0.3041 0.4569

Інформаційний лист № 192 – 2009 “Контроль якості порошків аптечного виготовлення, які містять кислоту аскорбінову”, на який отримано 11 актів впроваджень.

Для порошку 1.0: max ΔAs= 0.96 %, max δ= 0.64 %, max So = 0.3130 %, min r = 0.9997, RSD range=14.6385, max a=1.534.

Розробка та валідація спектрофотометричної методики кількісного визначення піридоксину г/хл

0.0000

0.2500

0.5000

0.7500

275.00 300.00 325.00 350.00 375.00

291.00nm, 0.8817A

Absorbance

A

nm

Рис. 6. Спектр поглинання піридоксину гідрохлориду у 0.1 М кислоті хлористоводневій

Z, % 100.38

Szi, % 0.33

Δintra, % 0.04

max ΔAs, % 2.56

δZintra 0.38

δmax 0.82

Таблиця 15Результати вивчення відтворюваності аналітичної методики

№ р-ну середнє RSDt,% Δt, % δmax, %

Аst* 0.3975 0.31 0.660.82

Ах* 0.4001 0.32 0.68

Таблиця 14Вивчення стабільності аналітичного розчину та розчину стандарту протягом 60 хв.

Патент на корисну модель № 55080

Опис існуючого методу Розробка та дослідження

Спектрофотометрія в УФ та видимій областях для 5 % розчину, МПП, АДХ 292 нм. Вивчено лінійність у діапазоні 2∙10-5-7.5∙10-5 г/мл, розчинник вода Р.

МС, АДХ 292 нм. Розрахунок невизначеності та підбір порядку та схеми розведення, Δsp =1.1 %. Робасність, заміна розчинника 0.1 М HCl та розведення 1∙10-5 г/мл. Дослідження лінійності у діапазоні 0.8∙10-5-1.2∙10-5 г/мл. Валідація для 0.2 % розчину піридоксину гідрохлориду. СФ-46, Specord-200.

Таблиця 13Стійкість оптичної густини до зміни значення рН водного розведення 1∙10-5 г/мл

Рис. 5. Спектр поглинання піридоксину гідрохлориду у воді Р

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

275.00 300.00 325.00 350.00 375.00

292.00nm, 0.5816A

324.00nm, 0.2802A

Absorbance

A

nm

80,0085,0090,0095,00

100,00105,00110,00115,00120,00125,00

80,00 90,00 100,00 110,00 120,00Хі, %

Yi, %

Xi , % Спектрофотометричний метод

Рис. 7. Графік лінійної залежності оптичної густини від концентрації піридоксину гідрохлориду у нормалізованих координатах

рН розчину А, оптична густина ΔpH

4.53 0.690 0.689 0.68748.9 % >>δmax

4.05 0.619 0.615 0.617

5.10 0.373 0.373 0.374

Вибір прийнятної об’ємної методики кількісного визначення піридоксину г/хл

80,0085,0090,0095,00

100,00105,00110,00115,00120,00125,00

80,00 90,00 100,00 110,00 120,00 Хі, %

Yi,

%

Xi, %Yi=0,9897xi+0,7735 (індикатор - бромфеноловий синій)Yi=1,015854xi+2,6754 (індикатор - калію хромат)

80,0085,0090,0095,00

100,00105,00110,00115,00120,00125,00

80,00 90,00 100,00 110,00 120,00Хі, %

Yi,

% Хі, %Yi=1,019702xi-1,3099 (лаб. №1) Yi=0,98142xi+2,6898 (лаб. №2)

Рис. Графік лінійної залежності методу алкаліметрії Рис. Графік лінійної залежності методу аргентометрії

Таблиця 16Результати вивчення метрологічних характеристик

18

Метод S δ

Алкаліметричний 100.64 0.54 0.14 0.24 0.64 100.64±0.24

Аргентометричний (інд. калію хромат) Мора 104.27 1.11 0.29 0.51 4.27 104.27±0.51

Аргентометричний (інд. бромфеноловий синій) Фаянса 99.76 0.48 0.12 0.22 0.24 99.76±0.22

,%__

X Xs X ,%X

X

Критерії прийнятності, %

Допуски за АНД ±8

maxΔAs 2.56

δmax 1.64

S0 1.45

Rc 0.9951

а 4.096Алкаліметричний та аргентометричний методи запропоновані для використання в умовах аптек та лабораторій з аналізу якості