ფაგებისგამოყოფა კლონირება...
TRANSCRIPT
ფაგების გამოყოფა, კლონირება,
კონცენტრირება და გასუფთავება
ბესარიონ ლასარეიშვილი
აგრარული უნივერსიტეტი, უჯრედული იმუნოლოგიის
ლაბორატორია
გ.ელიავას სახელობის ბაქტერიოფაგიის, მიკრობიოლოგიის,
ვირუსოლოგიის ინსტიტუტი
ბაქტერიების ვირუსების მოკლედახასიათება
რატომ იმსახურებენ ფაგები ინტერესს?
• მედიცინა და ვეტერინარია
• ეკოლოგია და გარემოს დაცვა
• ბიოტექნოლოგია და გენეტიკური ინჟინერია
• ინჯინერია
• კვლევის მოდელი ფუნდამენტურ მეცნიერებებში
Historical Background
Eliava Institute of
Bacteriophages,Tbilisi
Since 1923
G. Eliava and F. D’Herelle,
Tbilisi, 1930
Therapeutic phage
preparations (2016, Georgia)
ბაქტერიების ვირუსების ძირითადი
მორფოლოგიურ ტიპები
• ძაფისებური (ფილამენტური) ფაგები
• უკუდო, სფეროსებური ფაგები
• მოკლე კუდით (პოდოვირიდე)
• გრძელი, უკუმშველი კუდით (სიფოვირიდე)
• შედარებით გრძელი, მკუმშავი კუდით (მიოვირიდე)
ფაგების გენომი და ზომები
• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი დნმ
• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი რნმ
რგოლისებური (შედარებით იშვიათად), გახსნილი /ხაზოვანი/ ან
ფრაგმენტირებული ფორმით
• ზომები: 20-დან 100 ნმ-მდე
კუდის დიამეტრი 12-25 ნმ-ია, მისი სიგრძე 14-250 ნმ-ია
სიმწიფის მიხედვით განასხვავებენ
• ინფექციურ (მომწიფებულ) ფაგები
ვირულენტური (მალიზირებელი) ფაგები ანუ ფაგი-აგრესორები
ზომიერი (ლიზოგენური, ლატენტური) ფაგები ანუ ფაგი-
კომენსალები
• არაინფექციური ანუ ვეგეტაციური (მოუმწიფებელი)
ფაგები
ფაგების სასიცოცხლო ციკლი
• პროდუქციული (ლიზისური)
• რედუქციული (ლიზოგენური, ინტეგრაციული)
• აბორტული ინფექცია
ფაგების პროდუქციული (ლიზისური)
სასიცოცხლო ციკლი 20-40 წთ-ი გრძელდება
• ადსორბცია (მოქმედების სპექტრი)
ტიპოსპეციფიკური (ტიპიურ ანუ T-ფაგები)
მონოვალენტური (მონოფაგები, სახეობასპეციფიკური)
პოლივალენტური (პოლიფაგები) ფაგები
• გენომის ინექციის (ეჟექციის)
• ვირიონების ბიოსინთეზიდა აწყობა
• ბაქტერიულიუჯრედისლიზისიდა ვირიონების გამოსვლა
გარემოდან ფაგების გამოყოფა,
კონცენტრირებულიდა გასუფთავებული
ფაგური პრეპარატის მომზადება
კონცენტრირებული და გასუფთავებული
პრეპარატების გამოყენება
• იმუნობიოლოგიური მოქმედების შესწავლა
• ფიზიკო-ქიმიური თვისებების შესწავლა
• მოლეკულურ-ბიოლოგიური თვისებების შესწავლა
• ინტრავენურად საინექციო პრეპარატის წარმოება
კონცენტრირებული და გასუფთავებული
პრეპარატების გამოყენება
• ფაგის იზოლაცია გარემოდან
• ფაგის გენეტიკურად სუფთა ხაზის მიღება და
დახასიათება
• ფაგის დაკონცენტრირება
• გაწმენდა
ფაგების გამოყოფა: ნიმუშის გამდიდრება დადეტექცია
ნიმუშის გაწმენდა მასში არსებული ბაქტერიებისგან
მასპინძელი ბაქტერია
საკვები არე
გამდიდრებული სუსპენზიიდან დაუშლელი
ბაქტერიების მოცილება და ფაგების დეტექცია
ფაგური იზოლატის კლონირება - სუფთა
გენეტიკური ხაზის ფაგის გამოსაყოფა
ნეგატიური კოლონიები (ფაგური ბალთა) ფინჯანზე მეჩხრად
იყოს
ავარჩიოთ კონკრეტული ფორმის და ზომის ნეგატიურ ი
კოლონია
ამოვჩხვლიტოთ სხვა კოლონიებისგან კარგად გამიჯნული,
იზოლირებული ფაგური ბალთა
ერთი მორფოლოგიის ნეგატიური კოლონიის მქონე ფაგების 3-7
-ჯერადი პასირება
ფაგური სუსპენზიის სერიული განზავება
ფაგების დაკონცენტრირებითვის ფაგის დაბაქტერიის ოპტიმალურითანაფარდობა უნდა
დადგინდეს
ფაგის გამრავლების შედეგად პეტრის ფინჯანზე
კულტურის 95-98 %-ზე მეტი ნაწილისლიზისი
ფაგის და ბაქტერიის გამრავლების სიჩქარის თანაფარდობა
ფაგის გამოსავალი 1 ბაქტერიულიუჯრედიდან
კულტურა ექსპონენციალური ზრდის ფაზაში
ბაქტერიის ოპტიმალური კონცენტრაცია - 1×109 -1×1010
ფაგის ოპტიმალურ კონცენტრაციად 103-105 CFU/მლ-ში
ფაგების დაკონცენტრირება (2)
მიღებული ფაგოლიზატის შეგროვება
აგარის და დაუშლელი ბაქტერიების მოცილება
ფინჯნიდან მომზადებულფაგოლიზატში ფაგების
კონცენტრაციამ შეიძლება მიაღწიოს 8 ×1011 - 2×1012
CFU/მლ-ში
მაღალსიჩქარიანი ცენტრიფუგირებით ფაგების ,,დაჯენა”
ბუფერის დამატება და დაყოვნება 1-2 დღით
ფაგური ნალექის ფრთხილი გახსნა
გაუხსნელი აგრეგატების მოცილება
ფაგების დაკონცენტრირება (3)
გახსნილ ნალექში ფაგების რაოდენობა შეადგენს 7-9×1012
CFU/მლ-ში.
მომზადებული მაღალ კონცენტრირებული პრეპარატი
გარდა ინტაქტური ფაგური ვირიონებისა, დიდი
რაოდენობით შეიცავს დაზიანებულ ვირიონებს,
ბაქტერიის უჯრედის კედლის კომპონენტებს, ნუკლეინის
მჟავებს
ფაგების გაწმენდა ბაქტერიული
დებრიზისგან და ნუკლეინის მჟავებისგან (1)
• ულტრაცენტრიფუგირება ცეზიუმის ქლორიდის ორმაგ
გრადიენტზე
• ხსნარები მზადდება PH 7,4 ბუფერზე და ემატება ვირიონების
სტაბილიზატორები
• პირველი ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,52-1,6 ρ სიმკვრივის
ხსნარი
• მეორე ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,35-1,4 ρ სიმკვრივის
ხსნარი
• მესამე ფენა ,,ბალიშის” სახით: საქაროზის 30-40 %-ანი ხსნარი
• ულტრაცენტრიფუგირება
ფაგების გაწმენდა ორმაგ გრადიენტზე
ულტრაცენტრიფუგირებით
1,6 ρ CsCl
1,4 ρ CsCl
40% საქაროზა
ულტრაცენტრიფუგირება
(ფიქსირებულროტორიან ცენტრიფუგაზე)
ულტრაცენტრიფუგირება
(Swing-out როტორიან ცენტრიფუგაზე)
გაწმენდილფაგური ბენდში ფაგების
კონცენტრაცია 1-2×1013 CFU/მლ
გაწმენდილი ფაგური ბენდის გამოტანა
ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზესაფრთხილოდა მგრძნობიარე ეტაპია
სადიალიზო ბუფერი უნდა შეიცავდეს ფაგური ვირიონების
სტაბილიზატორებს
ბუფერის მოცულობა სადიალოზო მოცულობას 100-1000 -ჯერ
უნდა აღემატებოდეს
უნდა გრძელდებოდეს მინიმუმ 3-4 საათის განმავლობაში.
დიალიზის დროს ოსმოსური წნევა თანდათან უნდა
შემცირდეს:
3M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4;
0, 3 M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4
0,9% NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4 ხსნარში
ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზე
კრიტიკული და მგრძნობიარე ეტაპია
სადიალიზო სისტემა შეიძლება ატარებდეს
ფაგების მცირე რაოდენობას
თუ გვაქვს სხვადასხვა ტიპის ფაგები, მათი დიალიზიარ უნდა განხორცილედეს ერთ კონტეინერში
ნეგატიური შეღებვა TEM-ის
P.S. ბადეებზე მუშაობისას ვისუნთქოთ ნელა და ფრთხილად
ფაგებზე მუშაობის კრიტიკული ეტაპები
• კლონირება
• ფილტრიანი პიპეტის წვერების ან ინდივიდუალური
პიპეტების გამოყენება
• ნეგატიური შეღებვისას ბადეებზე ფრთხილი მუშაობა
• ვირიონების სტაბილიზატორების გამოყენება
• გრადიენტის ფრთხილი დაფენა
• გაწმენდილი ფაგური ბენდის ნატიფი გამოღება
• დიალიზი
რა დრო სჭირდება მთელ პროცედურას?
ყველა აღწერილი პროცედურის ბოლომდე შესრულება
ოპტიმალურ პირობებში 4-6 კვირამდე პერიოდს საჭიროებს!
თუმცა ხშირად ამ პროცედურების გასავლელად მკვლევარები
წელიწადზე მეტ დროს კარგავენ
გმადლობთ ყურადღებისთვის!
Production and Application of Phagelysates as New Generation of Immunomodulators
Besarion Lasareishvili
Eka Jaiani, Merina Tediashvili
Agricultural University of Georgia, Tbilisi, Georgia
G. Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and
Virology, Tbilisi, Georgia
Why it’s necessary to stimulate immune
system?
Frequency of immune dysfunctions in population is
increasing
Stimulation of the immune system is important for:
Treatment of malignancies
Treatment of immunodeficiency
Treatment of recurrent, indolent infections
Speed up the healing of chronic wounds and Ulcers
Increase efficacy of antibiotic therapy
Also
Decrease the susceptibility to an emerging infectious agent
Minimize the effects of bio-terroristic attacks
Thinking globally
კლინიკა „კაცთა მაცხოვარი“
Development of immunostimulators
with maximal therapeutic and minimal
adverse effects is of the great practical
value
Groups of Immunothrophic Medications
Immunostimulants
Immunodepressants (immunosupresants)
Immunocorrectors
The microbial lysates were found to be most
effective and cheapest immunostimulants
Immunotherapy by Bacterial Lysates was first
Implemented in 1895
Serratia marcescens (Bact. prodigiosum)
Streptococcus pyogenes
Pioneer of Immunotherapy
William Coley
(1862 – 1936)
Immunotherapy by Very Low dose of Microbial Lysates
Hoya, Germany
Medications based of Lysates:
Bacillus subtilis (Utilin® “H“ )
Mycobacterium phlei (Utilin® “S“ )
Bacillus cereus (Latensin® )
Bacillus firmus (Recarcin® )
Three Major Methods for Obtaining of
Bacterial Lysates
• Physical degradation of microbes (Mechanical, Ultrasound,
freezing-melting out, thermal treatment, electrolise, electrodialise,
etc.)
• Chemical degradation of microbes (Acid and/or alkaline
thermohydrolysis)
• Biological degradation of microbes (Use of enzymes, burst by
antibiotics, phages…)
Microbe derived drugs – The most potent
immunostimulators
Microbial Lysates
PolyMICROBIAL (Bronchomunal, Immudon, IRS-19, Immunovac vp-4,
Respibrin, Paspat, Dentavacs, Respivax, Urostim)
MonoMICROBIAL(Ruzam, Posterizan)
Partially Purified Components
Lypopolisaccharide - LPS (Prodigiosane, Pirogenale, Salmosane,
Zimosane, Lentinane, Krestine)
Peptidoglycan (Ribomunil, Imunomacs, Biostim, Immunopherone)
Nucleic Acides (Sodium Nucleinat, Ridostin, Lariphan, Ridostin)
Immune active Minimal Phragments
Glucosaminylmuramyl dipeptide - GMDP (Lycopide)
CpG -oligonucleotide (Promune, Actilone, Vacsimune)
Microbial Lysates as a pharmaceuticals (1)
Name Manufacturer Country Count of Mycrobial
Species
Pasterisane Dr. Kade, Germany 1
Pasterisane Phorte Dr. Kade, Germany 1
Paspate (autolisate) Germany 6
Spremmunane France 10
Respibrine 8
Respivax Bulgaria 6
Dentivax Bulgaria 5
Urostime Bulgaria 4
MPV Germany 48
BP-4 Immunovac Russia 4
Ribommunil P. Fabre Medicament,
France
4
Name Manufacturer Country Count of Mycrobial
Species
Broncho-munal “LEK” Slovenia 8
Broncho-Vaxome “OM pharma”
Switzerland
8
Immudone “Solvey Pharma“
France
14
IRS-19 “Solvey-Dufart”
Germany
19
Sebreum “ОМ pharma”
Switzerland
18
Uro-Vaxome “OM” pharma”
Switzerland
18
Solkourovake “Solco” Switzerland 5
Solkotriphage “Solco’’ Switzerland 8 (Strain)
Pacibanile (OK-
432)
Japan 1
La (Mega)-Iomolle Japan 1
Microbial Lysates as a pharmaceuticals (2)
Microbes Often Used to Obtain Bacterial
Lysates
• Staphylococcus aureus
• Streptococcus pneumonie, S.viridans,
S.pyogenes, S.sanguis, S.dysgalactie
• Proteus vulgaris
• Serratia marcescens
• Klebsiella pneumonie, Kl.ozoenae
• Haemophilus influenza
• Moraxella catarrhalis, M. flava, M.
pervlava
• Neisseria perflava, N. catarrhalis
• Corynebacterium pseudodiphteriticum
• Acinetobacter calcoaceticus
• Enterococcus fecalis, E. faecium
• Candida albicans
• Hafnia tetragena,
• Fuzobacterium nucleatum
• Lactobaccilus acidophilus, L.helveticus,
L.delbrueckii, L.fermentum
Main Component of Microbial Lysates –
PAMPs and their receptors PRR
Agonists of following receptors :
Expressed on membranes
TLR (Toll-Like Receptors)
Expressed on cytosole
NLR (Nucleotide-binding
Oligomerization Domain)
RLR (RIG-Like Receptors)
DAI- Receptors
Microbial patterns expressed in high amount
by microbial cells
Microbial Patterns can activate all
type of immune cells
13
Receptors Mon/Macr.
Neutr. Eusin. Mast cells
MyeloidDC
Plasm.DC
NK cells
B cells T cells T reg
TLR1 + + + + + - + + + +
TLR2 + + + + - + ++ - - + + +
TLR3 ++/+ - + - ++ - ++ - + -
TLR4 + + + + + + ++ - + - - +
TLR5 + + - - - + - + + - +
TLR6 + + + - + + - + + ++ +
TLR7 + + + - - + - + + +
TLR8 + + + - - + - + - - +
TLR9 + + + - - + + + + -
TLR10 + + + - + - - + + -
Microbial Patterns can activate all type of immune cells
Interaction between PAMP and PRR
Amplification of various
immunological effects:
Production of Proinflamatory
mediators (Cytokines and Lypid
metabolits)
Production of α- and β- IFNs
Secretion of Cytotoxic Molecules
Stimulation of Phagocytic Activity
Stimulation of Antigen Presentation
14
Various Microbial Patterns cause different type deviation CD4+ T Lymphocytes what can be used in the treatment of
Allergies an Cancers
Bacterial Phagelysates: Complex preparations
Combination of a Vaccine, Adjuvant, Immunostimulant and
specific antimicrobial agent
Pathogen Associated Molecular Patterns
(PAMPs)
Highly Immunogenic Antigens
Viruses of Bacteria (Phages)
Potential of Phagelysates: Historical Background
Eliava Institute of
Bacteriophages,Tbilisi
Since 1923
G. Eliava and F. D’Herelle,
Tbilisi, 1930
Therapeutic phage
preparations (2016, Georgia)
Bacteriophages:
highly specific for the target bacteria
Effective against multiple drug-resistant bacteria
Do not affect normal microflora
Do not cause significant side effects (allergy, intoxication etc).
Ecologically safe - do not accumulate in the environment;
Phage preparations express immunomodulatory properties
( Meipariani et al, 1967; Chanishvili et al, 2009)
How to lyse bacteria by use of phages
Lysis from outside
without phage propagation
Phage/Bacteria ratio : 10/1 to 70/1
Lysis from inside
active propagation of phages in
bacterial cells
Phage/Bacteria ratio: 1/10 to 1/100
Lysates prepared by biologycal methods appear to have better
stimulatory effect on the immune system
Phage Lysates in Experimental Studies
Three species of Gram negative bacteria and their specific phages were
used to obtain phagelysates
E.coli - phage Un (Myoviridae, elongated head)
Erw. carotovora - phage ET9 (Myoviridae, isometric head)
P.aeruginosa - phage PNM (Podoviridae)
100nm
100nm
Obtaining and testing of phagelysates –
experimental study
Phage infection at the different
stages of Exponential Growth phase
Important parameters :
Proper selection of bacteria and phage
Phage / bacteria ratio
Time of phage inoculation
Lysis time
Concentration of live phage particles
Content of Nucleic acids and
proteins, LPS
Fractionation procedure
Induction of Rapid Active Immunity by
Bacterial Phage Lysates
Non-specific (Universal defence)
Effective against various infectious agents
Rapid development (12-24 hours) after
injection of a phagelysate (Rapid defence)
Short-lasting defense : Developed resistance
lasts for 10-14 days
Potential use (e.g. in Veterinary): to minimaze
the results of bioterrorisitic attacks or natural
epidemics ( e.g. in industrial farming)
Defensive effects of phagelysates
Injection of lysates
After 24 hours
(up to 7 days)
Injection of lethal doses S.aureus
100 % survival
Injection of lethal
doses S.aureus
100 % died
After 2-4 hr
Control group
Experimental group
Total survival (100%) of animals observed after stimulation by
PhL - in 24 hr and up to 7 days
Rapid Defense developed against
Dosis certae lethalis (Dcl) of S.aureus 3
PhL-Pae
PhL-Erc
PhL-Eco
Control0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
8 hr12 hr
15 hr24 hr
72hr5 days
7 days10 days
14days
PhL-Pae
PhL-Erc
PhL-Eco
Control
%
of
su
rviv
al
Phage lysates
P.aeruginosa/PMN, Erwinia corotovora/TE9 and E.coli/Un
1 2
Structural changes in liver and kidney of experimental
animals after inoculation of phagelysates
A
B
3
A – Liver; B- kidney; 1 - control ( intact) animals; 2 - phagelysate inoculation;
3 - Thermolysate inoculation (5 days after inoculation)
Minor transient influence of phagelysates
Phage Lysates in Erlich Carcinoma
immunotherapy
Immunomoregulatory properties of phagelysates:
Increase in numbers of CD3 + CD8 +, CD3 + CD4 + and CD16 + CD56+ cells,
Decrease of T-reg’s (CD4CD25, CD25Foxp3 )K. Gambashidze, P. Khorava,E. Jaiani, B. Lasareishvil,M. Tediashvili, Antitumor and adjuvant effects of phagelysates of E.coli in mice with erlich carcinoma, Exp Oncol, 34, 2, 107–111, 2013
Application Fields - Perspectives
Immunodeficiency Status
Chronic, indolent infections
Unhealed wounds and Ulcers
Tumors
Infectious coused by drug-resistent bacteria
Counter Bioterorism
Cass73,9 nm
BL-260,8 nm
Ec-C56,5 nm
Ec-0969,1nm
BL-161,9 nm
Ps.a.65,2 nm
W.P.63,9 nm
lansing56,2 nm
New Podoviridae Phages isolated from Tbilisi’s
and Michigan’s Rivers and Lakes – for use in
future experiments
THANK YOU
Acknowledgment:
Dr. Marina Tediashvili - Eliava Institute, Tbilisi
Dr. Eka Jaiani – Eliava Institute, Tbilisi
Dr. Ketevan Gambashidze – Tbilisi State Medical University