!

!!

CLONACIÓN!Y!EXPRESIÓN!DE!LA!31FITASA!A!DE!Aspergillus*niger*EN!Pichia*pastoris!!!!!!!!!!!!

Valentina!González!Méndez!!!!!!!!!!!

!!

Pontificia!Universidad!Javeriana!Facultad!de!Ciencias!Microbiología!Industrial!

Grupo!de!Biotecnología!Ambiental!e!Industrial!(GBAI)!Bogotá!D.C.!

2018!!!!

! 2!

CLONACIÓN!Y!EXPRESIÓN!DE!LA!31FITASA!A!DE!Aspergillus*niger*EN!Pichia*pastoris!!!!!!!!!

Valentina!González!Méndez!!!

Tesis!presentada!como!requisito!parcial!para!optar!al!título!de:!Microbióloga!Industrial!

!!!!

APROBADO:!!!!!!______________________________!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!_______________________________!!!!!!!!!Concepción!Puerta!B.,!PhD!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Marcela!Franco!Correa.,!PhD!!!!!!!!!!!!!Décana!Académica!! !!!!!!!!!Directora!de!la!carrera!

!!!!!!!!!!

Pontificia!Universidad!Javeriana!Facultad!de!Ciencias!Microbiología!Industrial!

Grupo!de!Biotecnología!Ambiental!e!Industrial!(GBAI)!Bogotá!D.C.!

2018!!

! 3!

!CLONACIÓN!Y!EXPRESIÓN!DE!LA!31FITASA!A!DE!Aspergillus*niger*EN!Pichia*pastoris!

!!!!!!

Valentina!González!Méndez!!!!!!!

APROBADO!!!!!

___________________________________!! __________________________________!Claudia!M.!Rivera!Hoyos,!Biól.,!M.Sc.,!Ph.D.! Raúl!A.!Poutou!Piñales,!BQ.,!M.Sc.,!Ph.D.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Directora! ! ! ! ! ! CoBDirector!

!!!!!

___________________________________!José!Salvador!Montaña,!Biól.,!M.Sc.,!Ph.D.!

Evaluador!!!!!!!

Pontificia!Universidad!Javeriana!Facultad!de!Ciencias!Microbiología!Industrial!

Grupo!de!Biotecnología!Ambiental!e!Industrial!(GBAI)!Bogotá!D.C.!

2018!!

! 4!

!!!!!!!!!!!!!!!!

Nota!de!advertencia!–!Artículo!23!de!la!Resolución!No.!13!de!Julio!de!1946!!!!!

“La$Universidad$no$se$hace$responsable$por$los$conceptos$emitidos$por$sus$alumnos$en$sus$trabajos$de$tesis.$Sólo$velará$por$que$no$se$publique$nada$en$contrario$al$dogma$y$a$la$moral$católica$y$por$qué$las$tesis$no$contengan$ataques$personales$contra$persona$alguna,$antes$bien$

se$vea$en$ellas$el$anhelo$de$buscar$la$verdad$y$la$justicia.”$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

!

! 5!

AGRADECIMIENTOS!!!

!Agradezco! a!Dios! principalmente,! por! guiarme! y! darme! la! fuerza! y! espíritu! necesarios! para!luchar!contra!todas!las!adversidades!a!lo!largo!de!mi!carrera!y!en!el!proceso!de!mi!trabajo!de!grado.!!!A!mis! padres! Alvaro! y! Rocío,! por! apoyarme,! por! escucharme,! por! ser! las! personas! más!especiales!en!mi!vida,!por!estar!a!mi! lado!cada!vez!que! lo!necesito,!porque!siempre!me!han!brindado!consejos!y!cariño,!por!ser!el!motivo!de!crecer!cada!día!para!ser!una!mejor!persona.!A!mi!hermana!Alejandra,!por!ser!esa!persona!fuerte!que,!a!pesar!de!ser!la!menor,!me!enseña!bastante!con!su!forma!de!ser!y!actuar.!A!mis!seres!queridos!por!entenderme!y!brindarme!una!mano!siempre!que!lo!necesitaba.!!!A!mis! tutores! Claudia! Rivera! y! Raúl! Poutou,! por! orientarme! a! lo! largo! del! trabajo,! por!corregirme! y,! además,! enseñarme! cosas! nuevas,! por! darme! la! oportunidad! de! ser! parte! del!grupo!de!laboratorio!y!por!brindarme!consejos!para!mi!vida!personal!y!laboral.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

! 6!

!RESUMEN!

!Las! fitasas! (E.C.! 3.1.3.8),! son! enzimas! fosfocatalíticas! que! realizan! la! hidrólisis! parcial! o! total! de! los!ortofosfatos!presentes!en!el!ácido!fítico.!El!fósforo!y!el!inositol!se!almacenan!principalmente!como!ácido!fítico! en! los! cereales! y! legumbres! que! se! usan! comercialmente! como! pienso! para! animales!monogástricos! y! en! las! semillas! oleaginosas,! constituyendo! entre! el! 60B90%! del! contenido! total! de!fósforo!en!las!plantas.!Las!fitasas!hidrolizan!el!ácido!fítico!a!una!molécula!de!inositol!y!seis!moléculas!de!fosfato! inorgánico.! Sin! embargo,! estos! fitatos! no! pueden! hidrolizarse! en! el! intestino! de! animales!monogástricos,! y! los! fosfatos! asociados! permanecen! sin! absorberse,! siendo! necesaria! la! adición! de!fosfatos!en!la!dieta!para!así!evitar!deficiencias!de!fósforo,!y!disminuir!su!presencia!en!la!excreta!de!estos!animales.! El! objetivo! fue! expresar! la! 3BFitasa! A! recombinante! obtenida! a! partir! de! la! secuencia!codificante! optimizada! de!Aspergillus$ niger$ en!Pichia$ pastoris.! El! gen! sintético!PhyA! se! clonó! bajo! el!control!del!promotor!constitutivo!de!la!gliceraldehidoB3BfosfatoBdeshidrogenasa!(GAP)!de!P.$pastoris.!Se!seleccionaron!dos!clones!recombinantes!para!evaluar!los!parámetros!de!crecimiento!y!producción!de!la!enzima!a!escala!de!100!mL!en!un!tiempo!total!de!incubación!de!156!horas.!La!máxima!actividad!fitasa!para!cada!clon!se!obtuvo!a!las!10!horas!con!15.86!mUmLB1!y!una!actividad!específica!de!0.48!mUmgB1!para! el! clon! 1,! y! 26.87! mUmLB1! con! una! actividad! específica! de! 0.81! mUmgB1! para! el! clon! 2,! los!parámetros!obtenidos!para!cinética!de!reacción!cero!(velocidad!volumétrica)!para!el!clon!1,!K0=!0.160!hB1!y!td=!4.53!h!y!para!el!clon!2, fueron!K0=!0.209!hB1!,!td=!3.502!h,!creciendo!más!rápido!y!en!menos!tiempo!el!clon!2.!Los!resultados!obtenidos!sugieren!que!el!diseño!realizado!previamente!para!clonar!y!expresar!la! PhyA! de!A.$ niger$ en!P.$ pastoris$ bajo! un! promotor! constitutivo! es! factible,! y! se! propone! escalar! el!proceso!de!producción,!así!como!el!mejoramiento!del!medio!de!cultivo!para!obtener!una!mayor!actividad!fitasa,!con!el!fin!de!generar!una!alternativa!económica!de!producción!de!fitasas!para!uso!en!la!industria!pecuaria.!!Palabras!clave:!Fitasas,!3BPhyA,!Aspergillus$niger,!Pichia$pastoris,!promotor!GAP.!!

ABSTRACT!!

Phytases! (E.C.! 3.1.3.8),! are! phosphocatalytic! enzymes! that! perform! partial! or! total! hydrolysis! of!orthophosphates! present! in! phytic! acid.! Phosphorus! and! inositol! are! stored! mainly! as! phytic! acid! in!cereals! and! legumes! that! are! used! commercially! as! feed! for! monogastric! animals! and! in! oilseeds,!constituting!between!60B90%!of!the!total!content!of!phosphorus!in!plants.!Phytases!hydrolyze!phytic!acid!to!one!molecule!of! inositol!and!six!molecules!of! inorganic!phosphate.!However,! these!phytates!are!not!hydrolyzed! in! the! intestine!of!monogastric!animals,!and!the!associated!phosphates!remain!unabsorbed,!requiring! the! addition! of! phosphates! in! the! diet! to! avoid! phosphorus! deficiencies,! and! decrease! their!presence! in! the! excreta! of! these! animals.! The! aim,! was! to! express! the! recombinant! 3BPhytase! A,!obtained!from!the!optimized!coding!sequence!of!Aspergillus$niger! in!Pichia$pastoris.!The!synthetic!gene!PhyA! was! cloned! under! the! control! of! the! constitutive! promoter! of! glyceraldehydeB3Bphosphate!dehydrogenase!(GAP)!of!P.$pastoris.!Two!recombinant!clones!were!selected!to!evaluate!the!growth!and!enzyme!production!parameters!at!a!100!mL!scale!in!a!total!incubation!time!of!204!hours.!The!maximum!phytase!activity!for!each!clone!was!obtained!after!10!hours!with!15.86!mUmLB1!and!a!specific!activity!of!0.48!mUmgB1! for! clone! 1,! and! 26.87!mUmLB1! with! a! specific! activity! of! 0.81!mUmgB1! for! clone! 2.! The!parameters!obtained! for!volumetric! reaction!kinetics! for!clone!1,!K0=!0.160!hB1!y! td=!4.53!h! for!clone!2,!were!K0=!0.209!hB1,! td=!3.502!h,! growing! faster! and! in! less! time! the! clone!2.!The! results! suggest! that!previously!carried!out!design!to!clone!and!express!the!PhyA!of!A.$niger!in!P.$pastoris!under!a!constitutive!promoter!is!feasible,!and!it!is!proposed!to!scale!the!production!process,!as!well!as!the!improvement!of!the!culture!medium! to! obtain! greater! phytase! activity,! in! order! to! generate! an! economic! alternative! to! the!production!of!phytases!for!use!in!the!livestock!industry.!!Key!words:!Phytases,!3BPhyA,!Aspergillus$niger,!Pichia$pastoris,!GAP!promoter.!!!!

! 7!

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TABLA!DE!CONTENIDO!

1.! INTRODUCCIÓN!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!10!2.! PLANTEAMIENTO!DEL!PROBLEMA!Y!JUSTIFICACIÓN!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!11!3.! MARCO!TÉORICO!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!12!3.1.!Fósforo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!12!3.2.!Formas!del!fósforo!en!el!suelo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!14!3.2.1.!Fósforo!orgánico!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!14!3.2.1.1.!Ácido!fitico!! 15!3.2.2.!Fósforo!inorgánico! 15!3.3.!Importancia!de!las!fitasas!en!la!alimentación!animal! 16!3.4.! Importancia! de! las! fitasas! en! la! dieta! de! animales! monogástricos! y! en! la! industria!alimentaria!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!19!3.5.! Uso! de!microorganismos! para! mejorar! el! ciclo! del! fósforo! y! para! la! suplementación!alimentaria!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!20!3.5.1.!Aspergillus$niger$ 21!3.5.2.!Pichia$pastoris!(Huésped!para!la!producción!de!fitasa)! 22!3.6.!Importancia!ambiental,!nutricional!y!económica!de!las!fitasas!! 22!4.!!PREGUNTA!DE!INVESTIGACIÓN! 24!5.!OBJETIVOS! 24!5.1.!Objetivo!general! 24!5.2.!Objetivos!específicos!! 24!6.!MATERIALES!Y!MÉTODOS! 25!6.1.!Preparación!del!gen!y!el!plásmido!para!la!clonación!! 25!6.2.!Transformación!de!Escherichia$coli!con!el!plásmido!de!expresión!! 25!6.3.!Extracción!del!ADN!plásmidico!de!Escherichia$coli$ 26$6.4.!Preparación!de!Pichia$pastoris!para!electroporación! 26!6.5.!Transformación!de!Pichia$pastoris!por!electroporación!! 27!6.6.!Curva!patrón!para!cuantificación!de!fósforo!inorgánico! 27!6.7.!Determinación!de!la!actividad!enzimática! 27!6.8.!Estudios!preliminares!de!expresión!de!la!fitasa!recombinante!3BPhyA!en!Pichia$pastoris$!! 28$7.!RESULTADOS!Y!DISCUSIÓN!! 30!8.!CONCLUSIÓNES!! 44!9.!RECOMENDACIONES! 44!10.!REFERENCIAS!! 44!

!!!

! 8!

!!!!!

ÍNDICE!DE!FIGURAS!!

Figura!1.!!Descomposición!del!fitato!en!inositol!y!fósforo!por!la!acción!de!la!fitasa!! 18!!Figura!2.!Digestión!enzimática!para!PhyA!y!para!pGAPZ!FA! 30!!Figura!3.!Fragmentos!de!ADN!unidos!por!la!ligasa!T4! 31!!Figura!4.!Curvas!patrón!para!determinar!el!fósforo!inorgánico!libre!y!para!cuantificar!la!concentración!de!azucares!reductores!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!32!!!Figura!5.!Inoculación!por!triplicado! 34!!Figura!6.!Curva!de!crecimiento!del!control!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,!producción!de!proteínas!extracelulares!totales!mg!mLB1!y!glucosa!residual!g!LB1.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!35!!Figura!7.!Curva!de!crecimiento!del!clon!1!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,!producción!de!proteínas!extracelulares!totales!mgmLB1,!consumo!de!glucosa!!gLB1,!actividad!fitasa!mUmLB1!y!actividad!específica!mUmgB1.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!36!!!!!!!!!!!!Figura!8.!Curva!de!crecimiento!del!clon!4!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,!producción!de!proteínas!extracelulares!totales!mgmLB1,!consumo!de!glucosa!!gLB1,!actividad!fitasa!mUmLB1!y!actividad!específica!mUmgB1.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!38!!!!!!!!!!

!!!!!

!!

! 9!

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ÍNDICE!DE!TABLAS!!

Tabla!1.!Origen!y!ubicación!de!las!fitasas!! 10!!Tabla!2.!Screening!de!los!clones!con!mayor!producción!de!fósforo!inorgánico!liberado!(determinación!indirecta!de!la!Actividad!Fitasa)!a!partir!del!ácido!fítico.!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!33!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Tabla!3.!Párametros!cinéticos!orden!cero!y!orden!uno!para!el!control!Pichia$pastoris!XB33!(ausencia!del!gen!3BPhyA),!el!clon!1!y!clon!4!(presencia!del!gen!3BPhyA)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!39!!Tabla!4.!Datos!comparables!entre!diferentes!estudios!para!evidenciar!la!actividad!fitasa!a!partir!de!cepas!de!Aspergillus!evidenciando!una!expresión!heteróloga!o!una!expresión!nativa! 42!

! 10!

CLONACIÓN!Y!EXPRESIÓN!DE!LA!31FITASA!A!DE!Aspergillus*niger*EN!Pichia*pastoris!!

1.! INTRODUCCIÓN!!El! fósforo! es! uno! de! los! macronutrientes! más! importantes,! necesario! para! plantas! y!microorganismos!como!constituyente!esencial!del!ARN,!el!ADN,!el!ATP!y!los!fosfolípidos,!pero!a!causa!de!que!otros!elementos!se!unen!al! fósforo,! (principalmente!elementos!metálicos),!su!disponibilidad!disminuye.!Las!fitasas!(E.C.!3.1.3.8)!forman!parte!de!un!subgrupo!de!enzimas!de!la! familia! de! las! fosfatasas! ácidas,! de! tipo! hidrolasas.! Estas! enzimas! actúan! rompiendo! los!enlaces! fosfomonoéster,! degradando! los! fitatos! a!mioinositolhexafosfato! y! fósforo! inorgánico,!los!cuales!tienen!un!efecto!quelante! inferior!o!nulo!en!comparación!con! los!fitatos!(Kim!et$al.,!2006).!Existen!fuentes!de!fitasas!(Tabla!1)!en!donde!se!pueden!encontrar!de!forma!natural,!así!como!diversos!microorganismos,! entre! los! que! se!encuentran!Aspergillus$spp.,$Bacillus$spp.,$Pseudomonas$spp.,! levaduras,!etc.! (Jeroch!1994q!Diplock!et$al.,! 1999q!Keshavarz!and!Austin!2004).!!Tabla!1.!Origen!y!ubicación!de!las!fitasas!(Keshavarz!and!Austin!2004).!

Origen! Ubicación!

Animal! Intestino!de!rumiantes,!principalmente!ganado!bovino.!

Vegetal! Cascarilla!y!granos!de!cereales,!legumbres!y!algunos!vegetales.!

Microbiana!exógena! Aspergillus$spp,$Candida$spp,$Pseudomonas$spp,!entre!otros.!

Microbiana!endógena! E.$coli!principalmente!!El!uso!de!fitasas!microbianas!en!la!industria!de!alimentos!ha!tenido!gran!importancia!debido!a!la! posibilidad! de! ser! empleadas! en! el! desarrollo,! crecimiento! y! nutrición! de! animales!monogástricosq! lo! que! ha! llevado! al! desarrollo! de! distintos! procesos! biotecnológicos! para! su!producción,! principalmente! a! partir! de!Aspergillus$ spp.! (Frontela! et$ al.,! 2008q! Ali! and! Zulkali!2011).!La$Fitasa!A!(PhyA)!producida!por!Aspergillus$niger!fue!la!primera!fitasa!comercializada!y!debido!a!que!tiene!una!alta!eficiencia!catalítica,!ha!ocupado!una!parte!importante!del!mercado!mundial!con!un!volumen!en!ventas!de!500!millones!de!dólares!(Kim!et$al.,!2006).!!Las!fitasas!de!origen!fúngico!tienen!dos!ventajas!principales!sobre!las!de!origen!bacteriano:!1)!el!pH!óptimo!de! las! fitasas!de!origen!fúngico!está!entre!2.5!y!5.5,!valores!similares!a! los!que!posee!el! tracto! intestinal!de! los!animales!monogástricos,!a!diferencia!de! las! fitasas!de!origen!bacteriano,!cuyo!pH!óptimo!es!cercano!al!neutro!(Dvorakova!et$al.,!1997q!Dvorakova!1998)q!2)!las!fitasas!fúngicas!se!pueden!separar!de!la!matriz!en!donde!se!producen!con!mayor!facilidad!debido! a! que! son! extracelulares,! a! diferencia! de! las! bacterianas,! que! son! intracelulares,!exceptuando!las!del!género!Bacillusq!por!esta!razón,!los!procesos!de!purificación!de!las!fitasas!de!origen!fúngico!son!más!económicos!(Ebune!et$al.,!1995q!Costa!et$al.,!2010).!!

! 11!

2.!PLANTEAMIENTO!DEL!PROBLEMA!Y!JUSTIFICACION!!Después! del! nitrógeno,! el! fósforo! es! el! nutriente! inorgánico! más! requerido! por! plantas,!microorganismos!y!animales.!En! los!animales!se!destaca!que!son! incapaces!de!absorber! los!fitatos!presentes!en! los!alimentos,!debido!a! la! falta!de!enzimas!para!degragarlo!en!su! tracto!digestivo,!lo!que!hace!que!no!puedan!utilizar!el!fósforo!ligado!en!estos!compuestos,!por!lo!que!se! excretan! casi! en! su! totalidad.! Además,! el! fósforo! en! el! suelo! es! un! factor! limitante! del!desarrollo! vegetal! ya! que! se! une! a! otros! elementos! como!el!Calcio,! el!Hierro! y! el!Magnesio!(Alexander!1980q!Fernández!et$al.,!2005).!Una!de!las!estrategias!para!contrarrestar!la!falta!de!fósforo!en!la!alimentación!de!animales!monogástricos!(aves,!cerdos,!peces),!se!ha!enfocado!en!el!uso!de!enzimas!como!las!fitasas,!esta!estrategia!se!basa!en!la!capacidad!que!tienen!estas!enzimas! para! liberar! parte! del! fósforo! contenido! en! el! fitato! presente,! por! ejemplo,! en! las!semillas,!para!volverlo!disponible!en!los!piensos!para!suplir! las!necesidades!de!fósforo!de!los!animales!(Lin!et$al.,!2017).! Las!fitasas!son!las!enzimas!más!comúnmente!empleadas!en!los!sectores!porcícola!y!avícola,!después!de!las!xilanasas!(E.C.!3.2.1.8)!seguidas!por!las!celulasas!(E.C.!3.2.1.4).!El!uso!de!las!fitasas! producidas! naturalmente,! como! las! provenientes! de! Aspergillus$ niger! u! otros!microorganismos,! generan! una! mejora! en! el! valor! nutricional! de! los! alimentos,! además,! de!ocasionar! un! aumento! en! el! crecimiento! y! la! producción! animal.! De! este! modo,! las! fitasas!empleadas!como!suplemento!en!piensos!de!animales!monogástricos! también! representa!una!gran!oportunidad!de!negocio!a!nivel! internacional!para! la!nutrición!agrícola,!ya!que!el!uso!de!fitasas! (200!a!1000!U/kg)! reduce!entre!el! 25! y!50!%! la!excreción!de! fitatos!en! las!heces!de!animales! monogástricos! (Acosta! and! Cárdenas! 2006).! Se! ha! demostrado! en! numerosos!estudios!que!la!adición!de!fitasa!microbiana!a!las!dietas!porcinas!puede!promover!la!digestión!de!los!alimentos,!el!uso!del!fósforo!y!reducir!la!excreción!de!fitatos!(Harper!et$al.,!1997q!Sands!et$al.,!2001q!Liao!et$al.,!2005).!!!Uno!de! los!problemas!principales!generados!por! la!presencia!de! fitatos!en!el!alimento!de! los!animales! monogástricos,! consiste! en! el! poco! valor! nutricional! que! estos! poseen,! ya! que! el!fósforo! que! puede! ser! asimilado! es! bajo,! debido! a! que! se! encuentra! asociado! con! otros!elementos.! Teniendo! en! cuenta! que! las! dietas! de! estos! animales! se! constituyen! por!ingredientes!en!los!que!el!fósforo!está!presente!casi!totalmente!como!fitato!y!su!disponibilidad!es! muy! baja! debido! al! bajo! nivel! intestinal! de! las! fitasas,! los! fitatos! se! convierten! en! un!antinutriente!crítico!que!se!excreta!casi!en!su!totalidadq!generando,!además,!de!la!baja!nutrición!en!los!animales!y!problemas!de!contaminación!graves!(Coelho!1996).!Una!vez!en!el!suelo,!el!exceso! de! fósforo! llega! a! los! embalses! y! lagos!mediante! la! erosión! y! escorrentías,!mientras!que! a! los! cuerpos! de! agua! subterráneos! llega! por! infiltración.! La! vegetación! acuática! y! las!cianobacterias! utilizan! grandes! cantidades! de! este! mineral,! lo! que! ocasiona! la! proliferación!desmesurada!de!dichos!organismos!y!promueve!el!proceso!de!eutrofización.!La!proliferación!causa!disminución!en!los!niveles!de!oxígeno!disuelto!en!el!agua!y!finalmente!provoca!la!muerte!de!la!biota!acuática!por!hipoxia!(Acosta!and!Cárdenas!2006).!!

! 12!

Debido! a! que! los!métodos! fisicoquímicos! para! hidrolizar! el! fitato! son! costosos! y! reducen! el!valor! nutritivo! de! los! alimentos,! la! industria! está! interesada! en! la! optimización! y! mejora! de!enzimas! fitasas! para! incorporarlas! en! la! alimentación! animal! (Neira! et$ al.,! 2013),! sumado! a!esto,! la! expresión! de! proteínas! recombinantes! en! levaduras! ha! ganado! importancia! en! la!industriaq!generando!ventajas!en!la!producción!de!enzimas!recombinantes!en!comparación!con!el! uso! de! hongos! filamentosos,! por! lo! que! se! pretende! en! este! trabajo! clonar! y! evaluar! la!expresión!de!una!fitasa!recombinante!proveniente!de!Aspergillus$niger!en!Pichia$pastoris,!con!la! finalidad! de! que! a! futuro,! los! resultados! que! se! obtengan! no! sólo! puedan! significar! una!mejora! en! la! calidad! nutricional! de! animales! monogástricos,! sino! también! para! mitigar! la!contaminación!ambiental!causada!por!el!incremento!de!fitatos!en!los!ecosistemas!producto!de!la!acumulación!de!estos!en! la!heces,!problema!que!se!genera!principalmente!en! los!sectores!porcícola!y!avícola.!!!!Según! estimaciones! actuales,! si! se! añadieran! fitasas! a! todos! los! comederos! para! cerdos! y!aves,!no!sólo!se!mejoraría! la!nutrición!de! los!animales,!sino!que!sería!posible! reducir!a!nivel!mundial! la! cantidad! de! fitatos! liberados! en! el! medio! ambiente! en! 2,5!millones! de! toneladas!cada!año!(Leske!and!Coon!2002q!Payne!et$al.,!2005).!!!3.!MARCO!TEÓRICO!!!3.1!Fósforo!!El!fósforo!es!un!elemento!esencial!para!la!vida,!su!función!fisiológica!principal!es!intervenir!en!procesos! de! acumulación! y! liberación! de! energía! durante! el! metabolismo! celular! (Conney!2000)q!sin!embargo,!el! fósforo!soluble!es!un!nutriente! limitado!para! la!producción!de!biomasa!en!un!ecosistema!natural!(Hameeda!et$al.,!2006).!!En!los!ecosistemas!naturales!se!encuentran!suelos!tropicales!y!suelos!subtropicales!los!cuales!presentan! una! baja! disponibilidad! de! fósforo,! por! lo! que! éste! elemento! debe! ingresar! a! los!suelos! como! fertilizante.! Sin! embargo,! este! no! es! un! recurso! renovable! y! las! reservas!mundiales!se!agotan!rápidamente!(Restrepo!et$al.,!2015).!Se!estima!que!las!reservas!actuales!de!fósforo!disminuirán!a!la!mitad!entre!los!años!2040!y!2060,!por!tal!motivo!el!alce!de!precios!en! el! mercado! de! los! fertilizantes! fosfóricos! se! incrementaría! lo! que! hace! necesario! la!búsqueda! de! estrategias! sostenibles! de! fertilización! (Lambers! et$ al.,! 2006q! Restrepo! et$ al.,!2015).!!Las! plantas! al! encontrarse! en! bajas! condiciones! de! fósforo,! su!mecanismo!de! supervivencia!hace!que!aumenten!el!crecimiento!de! las! raíces!o! los!pelos! radicales,!para! lograr!una!mayor!búsqueda!en!la!superficie!del!suelo!(Gahoonia!et$al.,!2001).!Los!microorganismos!asi!como!la!fauna!vegetal!pueden!incrementar!la!solubilidad!del!fósforo!inorgánico!(Pi)!pobremente!soluble!a! través!de! la! liberación!de!protones,! iones!OHB!o!CO2!y!aniones!de!ácidos!orgánicos!como!citrato,! malato! y! oxalato! (Jones! 1998)! y! pueden! mineralizar! el! fósforo! orgánico! (Po)! por! la!liberación!de!varias!enzimas!fosfatasas!(Zhang!et$al.,!2010q!Restrepo!et$al.,!2015).!

! 13!

!“Más!del!90!%!del! fósforo! total!en!el!sistema!sueloBplantaBanimal!está!en! los!suelos!y!menos!del!10!%!en!el!resto!de!los!sistemas!biológicos.!Su!contenido!en!los!suelos!se!presenta!en!un!rango!de!200!a!5000!mg!KgB1,!con!un!promedio!de!600!mg!KgB1.!En!las!rocas!primarias!y!en!los!suelos!jóvenes,!el!fósforo!se!encuentra!unido!principalmente!al!calcio!y!al!magnesio”!(Tiessen!2008q!Restrepo!et$al.,! 2015),! con!una!solubilidad! típica! cercana!a!0.5!mg!LB1.!En!el! suelo! se!presentan! distintas! formas! de! fósforo! en! donde! las! rocas! y! los! depósitos!minerales! (apatita,!hidroxiapatitas!y!las!oxiapatitas)!son!insolubles!(Bashan!et$al.,!2013q!Restrepo!et$al.,!2015).!Los!procesos! de! fijación! y! precipitación! permiten! la! transformación! de! los! minerales! primarios! a!minerales! secundarios! ya! que! dependen! en! gran! parte! del! pH! y! el! tipo! de! suelo.! En! suelos!ácidos,!el!fósforo!es!fijado!por!óxidos!e!hidróxidos!libres!de!hierro!y!aluminio,!mientras!que!en!los!alcalinos!es!fijado!por!el!calcio!(Rodríguez!and!Fraga!1999q!Restrepo!et$al.,!2015).!El!fosfato!mineral! puede! encontrarse! también! asociado! a! la! superficie! hidratada! de! óxidos! de! hierro,!aluminio! y! manganeso! que! son! escasamente! solubles! y! no! asimilables.! Esta! es! una!característica!de!los!suelos!ferralíticos!en!los!que!la!hidratación!y!acumulación!de!estos!óxidos!aumenta!la!inmovilización!del!fósforo!(Ohkate!et$al.,!1996q!Restrepo!et$al.,!2015).!En!suelos!en!donde!se!presentan!altas!concentraciones!de!metales!pesados! (Ni,!Cr!y!Co)! la!presencia!de!fósforo!es!bajo!(Rajkumar!et$al.,!2009q!Restrepo!et$al.,!2015).!!!Las!fuentes!de!nutrientes!para!las!plantas!en!el!suelo!se!distinguen!de!tres!formas:!!1)!fósforo!inorgánico!en!solución! (Psol),!2)! fósforo!orgánico!y!3)! fósforo! inorgánico!asociado!a!partículas!mineralesq! de! las! cuales,! el! Psol,! está! principalmente! en! forma! de! ortofosfato,! que! es! el!considerado!disponible!para!las!plantas!(Arai!and!Sparks!2007q!Restrepo!et$al.,!2015).!!El! suelo! se! clasifica! en! dos! fracciones! y! dependiendo! del! tipo! de! suelo,! se! puede! decir! que!entre! el! 50B60%! corresponde! a! la! fracción! orgánica,! mientras! que! el! resto! se! encuentra! en!forma! inorgánica.!Las!plantas!asimilan!el! fósforo!en! forma! inorgánica!en!estado!soluble,!pero!cuando!se!introduce!al!suelo!en!forma!de!fertilizante,!más!del!90%!de!este!pasa!rápidamente!a!formas!solubles!no!disponibles.!De!esta!manera,!gran!parte!de!los!fertilizantes!fosfatados!que!se!aplican,!no!son!utilizados!por!las!plantas,!sino!que!se!almacenan!en!el!suelo!(Fernández!et$al.,!2005).!! !! !! !! ! !La!mayoría!de!los!suelos!contienen!grandes!cantidades!de!fósforo!que!estan!presente!tanto!en!fracciones!orgánicas!como! inorgánicas,!el!mayor!componente!de!fósforo!orgánico!en!el!suelo!se!conoce!como!fitato!(ácido!fítico)!y!este!compuesto!es!degradado!por!una!clase!de!enzimas!llamadas!fitasas!(Sanyal!and!De!Data!1991q!Richardson!2001).!El! fitato!es!considerado!como!un!factor!antinutricional!debido!a!su!acción!quelante!sobre!cationes!divalentes,!como!Ca+2,!Zn+2!y! Fe+2! y! la! interacción! con! proteínas! nutricionalmente! importantes,! disminuyendo! la!biodisponibilidad!de!ambos!tipos!de!nutrientes!(Urbano!et$al.,!2000).!Debido!a!la!inhabilidad!de!las! plantas! de! usar! el! fósforo! contenido! en! el! fitato! y! teniendo! en! cuenta! que! existen!microorganismos! capaces! de! transformar! el! fitato,! se! han! usado! técnicas! moleculares! que!permiten! la! manipulación! de! genes! de! fitasas! con! el! fin! de! obtener! microorganismos! más!eficientes!que!ayuden!a!aumentar!la!movilización!y!la!disponibilidad!de!fósforo!para!las!plantas!(McLaughlin!et$al.,!1988).!

! 14!

!En!el!material! vegetal! (cereales,! leguminosas,!semillas),!el! fósforo!se!encuentra!en! forma!de!fitato!(mioBinositol!hexa!cis!fosfato)q!estos!vegetales!se!usan!como!alimento!para!animales!en!la!industria! porcina,! avícola! y! piscícola.! Sin! embargo,! el! fósforo! presente! en! forma! de! fitato! no!puede!ser!absorbido!por!estos!animales!monogástricos,!por!lo!que!es!necesario!añadir!fósforo!inorgánico!en!la!dieta!de!los!animales!para!cubrir!la!demanda!de!este!nutriente,!mientras!que!el!fitato!no!absorbido!es!excretado!en!las!heces,!causando!un!problema!ambiental.!La!razón!por!la! que! los! animales! monogástricos! no! asimilan! el! fitato,! es! la! ausencia! de! enzimas! fitasas!(mioinositol! hexacisfosfato! fosfohidrolasas,! E.C.! 3.1.3.8),! enzimas! que! catalizan! la! liberación!del! fósforo!de!la!molécula!de!fitato.!Si!se!adicionan!fitasas!en!la!dieta!animal,!es!muy!posible!que! no! sea! necesaria! la! adición! de! fósforo! inorgánico! y! además,! la! excreción! de! fitatos!disminuiría,!controlándose!así!la!contaminación!por!este!mineral.!!Por!ejemplo,!los!cerdos!y!las!aves!de!corral!producen!alrededor!del!20%!del!estiércol!total!en!la!agricultura! animal,! pero! excretan! alrededor! del! 36%! de! la! producción! total! de! fósforo!(Crenshaw! et$ al.,! 1995).! En! granos! de! cereal! y! comidas! de! semillas! oleaginosas! que!constituyen! la!mayor!parte!de! las!dietas!de! los!animales!no!rumiantes,!dos! tercios!de! fósforo!están! orgánicamente! unidos! en! forma! de! fitato.! Esta! forma! de! fósforo! no! está! disponible! en!gran!medida!para!los!animales!monogástricos,!que!carecen!de!suficientes!enzimas!digestivas!necesarias!para!eliminar!los!radicales!fosfato!de!los!complejos!orgánicos!(Denbow!et$al.,!1995).!Por!lo!tanto,!el!fósforo!inorgánico!se!suplementa!a!las!dietas!de!animales,!principlamente!para!cumplir!con!el!requisito!de!fósforo!que!estos!animales!requieren,! lo!que!lleva!a!una!excreción!excesiva!de!este!nutriente!(Poulsen!2000q!Knowlton!et$al.,!2004).!!!3.2!Formas!del!fósforo!en!el!suelo!!3.2.1!Fósforo!orgánico!!“El! fósforo! orgánico! proviene! de! restos! vegetales! y! animales! que! al! ser! degradados! por! los!microorganismos!del!suelo!liberan!compuestos!fosfatados,!constituye!del!29!al!65%!del!fósforo!presente!en!la!superficie!del!suelo,!donde!la!mayoría!corresponde!a!compuestos!de!bajo!peso!molecular”!(Arzuaga!et$al.,!2005).!Las!principales!formas!de!fósforo!orgánico!son!el!inositol,!los!ácidos!nucleicos!y!los!fosfolípidos,!los!cuales!tienen!origen!principalmente!microbiano.!El!nivel!de!fósforo!orgánico!en!los!suelos!puede!variar!entre!el!3!y!el!85%!del!fósforo!total!(Zhu!et$al.,!2014).!!Los!ácidos!nucleicos,!se!originan!a!partir!de!la!descomposición!de!microorganismos,!animales!y! restos! vegetales.! El! contenido! de! fósforo! orgánico! depende! de! varios! factores:! clima,!vegetación,!textura,!prácticas!de!fertilización,!riegos!y!drenaje!y!uso!del!suelo!(Restrepo!et$al.,!2015).!El!tiempo!de!residencia!media!del!fósforo!orgánico!en!el!suelo!se!ha!estimado!entre!350!y!2000!años!(KögelBKnabner!2006).!!El! proceso! de! liberación! del! fósforo! orgánico! a! fósforo! inorgánico! se! conoce! como!mineralización,! y! en! el! suelo! tres! grupos! de! enzimas! participan! en! esta! transformación!(Rodríguez!et$al.,!2006q!Restrepo!et$al.,!2015):!“!1)!Las!Fosfatasas!ácidas!no!específicas,!que!

! 15!

llevan! a! cabo! la! desfosforilación! de! los! enlaces! fosfoéster! o! fosfoanhidro! de! la! materia!orgánica,! 2)! Las! fitasas,! que! actúan! específicamente! provocando! la! liberación! de! fósforo! del!ácido!fítico,!y!3)!Las!fosfonatasas!(E.C.!3.1.3.1)!y!carbonoBfósforo!liasas!(E.C.!4.7)!que!pueden!romper! las!uniones!carbonoBfósforo!presentes!en! los!organofosforados.!La!principal!actividad!enzimática! corresponde! a! las! fosfatasas! ácidas! (E.C.! 3.1.3.2)! y! a! las! fitasas,! debido! a! la!presencia!en!el!suelo!de!los!sustratos!sobre!los!que!actúan!de!forma!predominante!”!(Estrada!et$ al.,! 2013q! Restrepo! et$ al.,! 2015).! Las! bacterias! solubilizadoras! de! fósforo! (BSF)! son!importantes! debido! a! que! involucran!mecanismos!de! solubilización! y!mineralización,! además!procesos!de!acidificación,!quelación,!reacciones!de!intercambio,!producción!de!ácidos!y!acción!enzimática!(Cromwell!1989q!Ferket!et$al.,!2002q!Sánchez!et$al.,!2012),!estas!BFS!son!de!gran!importancia!por!su!eficiencia!en!estos!procesos.!!3.2.1.1!Ácido!fítico!!El!ácido!fítico!(PA)!es!el!principal!compuesto!de!almacenamiento!de!fósforo!en!las!semillas!que!representa!hasta!el!80%!del!fósforo!total!de!la!semilla!y!contribuye!tanto!como!el!1.5%!al!peso!seco! de! la! semilla.! El! fosfato! cargado! negativamente! en! PA! se! une! fuertemente! a! cationes!metálicos!de!Ca,!Fe,!K,!Mg,!Mn!y!Zn,!haciéndolos!insolubles!y!por!lo!tanto!no!disponibles!como!factores!nutricionales.!El! fitato!se!acumula!principalmente!en!vacuolas!de!almacenamiento!de!proteínas!como!globoides,!predominantemente!ubicadas!en!la!capa!de!aleurona!(trigo,!cebada!y! arroz)! o! en! el! embrión! (maíz).!Durante! la! germinación,! el! fitato! es! hidrolizado! por! fitasa(s)!endógena(s)!y!otras!fosfatasas!para!liberar!fósforo,!inositol!y!micronutrientes!para!ayudar!a!las!plántulas! emergentes.! El! PA! y! sus! derivados! también! están! implicados! en! la! exportación! de!ARN,! la! reparación!del!ADN,! la!señalización,! la!endocitosis!y!el! tráfico!de!células!vesiculares!(Bohn!et$al.,!2008).!!!3.2.2!Fósforo!inorgánico!!!Esta! fracción!del! fósforo!se!encuentra! formando!parte!de!minerales,! los!más! importantes!son!las!apatitas,!la!estregita!y!la!variscita!(predominan!en!suelos!ácidos).!El!fósforo!en!el!suelo!se!encuentra! en! su! mayoría! en! forma! de! ortoBfosfatos,! los! compuestos! formados! pueden!encontrarse! en! forma! de! sales! en! solución,! sales! cristalinas,! o! sales! absorbidas! por! los!coloides!del!suelo!(Fernández!et$al.,!2005).!!!Las!formas!de!fósforo!inorgánico!principales!son!fosfatos!de!calcio!(hidroxiapatita,!fluorapatita,!fosfato! dicálcico,! fosfato! monocálcico,! entre! otros),! fosfatos! de! hierro! (como! livianita! y!estrengita)!y!fosfatos!de!aluminio!(principalmente!variscita),!todos!estos!compuestos!tienen!una!menor! solubilidad! que! los! compuestos! fosfatados! orgánicos! (Sanyal! and! De! Data! 1991).! La!solubilización!presentada!en! las! reservas!de! fósforo!como! las! rocas! fosfatadas!y! las!de!otras!fuentes!de!fósforo! inorgánico,!es!una!alternativa!fundamental!para! incrementar! la!cantidad!de!nutriente!disponible!para!las!plantas!(Illmer!and!Schinner!1992q!Fernández!et$al.,!2005).!!!Los! suelos! de! uso! agrícola! contienen! grandes! cantidades! de! fósforo,! pero! en! formas! no!disponibles!para! las!plantas.!Se!calcula!que!el!70!%!del! fósforo! inorgánico!proveniente!de! la!

! 16!

aplicación!de!fertilizantes!pasan!rápidamente!a!formas!insolubles,!tales!como!fosfato!de!calcio,!de! aluminio! e! ión! fosfato! (Rodríguez! et$ al.,! 2006q! Restrepo! et$ al.,! 2015).! Estos! fosfatos!insolubles!sólo!pueden!ser!llevados!a!formas!solubles!por!la!acción!microbiana.!!Se! han! aislado! de! distintos! suelos! bacterias! solubilizadoras! de! fosfato! pertenecientes! a! los!géneros! Pseudomonas,! Bacillus,! Rhizobium,! Agrobacterium,! Burkholderia,! Achromobacter,!Microccocus,! Aerobacter,! Flavobacterium! y! Erwinia! (Nahas! 1996q! Kumar!et$ al.,! 2001).! Estos!microorganismos! crecen! en! medios! con! fosfato! tricálcico,! apatita! o! materiales! insolubles!similares!como!única!fuente!de!fosfato!además!de!asimilarlo!pueden!solubilizarlo!(Fernández!et$al.,! 2005).! El!mecanismo!microbiológico! principal! por! el! cual! los! compuestos! fosfatados! son!movilizados! es! el! descenso! continuo! del! pH! del!medio! por! la! liberación! de! ácidos! orgánicos!(Alexander!1980).!!3.3!Importancia!de!las!fitasas!en!la!alimentación!animal!!El!ácido! fítico!o! fitato! (1,! 2,! 3,! 4,! 5,! 6!mioinositol! hexakis!dihidrógeno! fosfato),! es! la!principal!forma! de! almacenamiento! de! fósforo! en! el! material! vegetal! y! se! encuentra! ampliamente!distribuida! en! cereales,! leguminosas! de! grano! y! harinas! oleaginosas! en! concentraciones! de!alrededor!de!7B!8!g!KgB1!en!maíz!a!50B60!g!KgB1!en!subproductos!de!cereales!(Eeckhout!and!De!Paepe!1994).!El!fósforo!del!ácido!fítico!es!poco!disponible!para!las!aves!de!corral!y!los!cerdos!debido!a!la!falta!de!fitasa!endógena!en!el!intestino!de!estas!especies!(Cowieson!et$al.,!2016).!Shan! and! Davis! (1994),! notaron! que! la! adición! de! fitato! a! una! dieta! semipura! generó!reducciones!significativas!en!el!crecimiento!y!producción!en! la! tasa!de!conversión!alimenticia!de!pollos!de!engorde!(Feed$Convertion$Ratio!B!FCR),!por!lo!tanto,!la!presencia!de!fitatos!en!las!dietas! y! piensos! de! animales!puede!actuar! como!un!antinutriente,! disminuyendo!el! potencial!alimenticio.!!!Ravindran!et$al.,$ (2006),!notaron!disminuciones!significativas!en! las!proteínas!y!digestibilidad!de!aminoácidos!para!pollos!de!engorde!cuando!las!concentraciones!de!ácido!fítico!en!la!dieta!se! incrementaron!de!alrededor!de!10!a!14!g!KgB1.!Algunos! intentos!de!evaluar!el!efecto!de! la!eliminación!de!fitato!se!han!realizado.!Por!ejemplo,!Newkirk!and!Classen!(2001)!evaluaron!las!implicaciones! de! la! eliminación! de! fitato! en! el! valor! nutricional! de! la! harina! de! canola! para!pollos!de!engorde!y!concluyeron!que!el!pretratamiento!de!la!harina!de!canola!con!fitasa!resultó!en!(apparent$metabolisable$energy! B!AME)!mejorada,!digestibilidad!de!aminoácidos!y!una!alta!producción!en! la!FCR.!Sin!embargo,!aunque!el! ácido! fítico! se!encuentra!en!concentraciones!bajas!en!relación!con!el!almidón,!la!proteína,!la!grasa!y!la!fibra,!desempeña!un!papel!central!en!la!biodisponibilidad!de!cationes,! fósforo!y! también!ciertos!aminoácidos!e!hidratos!de!carbono!(Cowieson!and!Bedford!2009).!!!La! participación! del! ácido! fítico! en! la! nutrición! se! asocia! principalmente! con! la! fuerte! carga!electronegativa!de!los!diversos!grupos!de!fosfato!en!el!anillo!de!inositol.!Esta!electronegatividad!del!ácido!fítico!en!condiciones!intestinales!reduce!la!solubilidad!y!digestibilidad!de!P,!Ca,!varios!cationes! alternativos,! Fe,! Zn! y! proteínas,! conduciendo! a! diversas! cascadas! fisiológicas!perjudiciales! (Cowieson! et$ al.,! 2016).! Según! los! términos! convencionales! de! referencia!

! 17!

intestinal,!el!ácido!fítico!tendría!una!carga!negativa!sustancial!en!el!buche,!una!carga!negativa!moderada!en!el!proventrículo!/!molleja!(o!estómago!en!cerdos)!y!una!carga!negativa!cada!vez!más!sustancial!en!el!intestino!delgado!y!grueso!(Cosgrove!1972q!Cowieson!et$al.,!2016).!!!!!Cowieson!and!Ravindran!(2007),!exploraron!la!interacción!entre!la!concentración!de!ácido!fítico!y! la!fitasa!en!una!dieta!semisintética!en!la!que!el!ácido!fítico!se!tituló!como!fitato!de!sodio!en!una!dieta!basada!en!caseína!y!almidón!de!maíz.!En!este!caso,!el!efecto!de!la!fitasa!(500!FTU!KgB1)! fue! equivalente! si! la! concentración! de! ácido! fítico! fue! de! 8.5,! 11.5! o! 14.5! g! KgB1.! Por!ejemplo,! la!hidrólisis!de!ácido! fítico!en!harina!de!soja!aumentó!de!35%!a!72%!(>!107%)!con!adición!de!fitasa!exógena,!mientras!que!la!misma!dosis!de!fitasa!aumentó!la!hidrólisis!de!ácido!fítico!de!33%!a!48%!(>!44%)!en!salvado!de!arroz!(Leske!and!Coon!1999).!!!Las! fitasas! son! enzimas! que! tienen! una! importancia! elevada! en! la! nutrición! animal,! y! al! ser!utilizadas! en! técnicas! agrícolas! sostenibles! y! amigables! con! el! medio! ambiente,! han!demostrado! ser! benéficas! en! muchos! aspectos.! Son! un! grupo! de! enzimas! capaces! de!degradar! las! moléculas! orgánicas! que! contienen! fosfato,! liberando! fósforo! inorgánico! de!manera! gradual! (Balwani! et$ al.,! 2017).! Los! estudios! han! demostrado! que! el! suelo! contiene!fósforo!principalmente!en!forma!de!un!compuesto!orgánico,!el!fitato,!que!no!puede!ser!utilizado!directamente! por! las! plantas! y! puede! causar! una! fuerte! contaminación,! donde! el! exceso! de!fósforo! puede! causar! la! eutrofización! y! la! generación! de! neurotoxinas! al! estimular! el!crecimiento!de!organismos!acuáticos!(Holm!et$al.,!2002q!Lei!and!Porres!2003).!Por!lo!tanto,!las!fitasas! se! agregan! exógenamente! ya! que! modifican! estas! moléculas! de! tal! manera! que! su!absorción!puede!mejorar!el!crecimiento!de!las!plantas!y!animales!y!proporcionar!una!nutrición!adecuada.!Actualmente,!se!han!caracterizado!numerosas!fitasas!de!diferentes!fuentes!y!se!han!empleado!en!técnicas!de!ingeniería!de!proteínas,!biorremediación!de!suelos!contaminados!con!fitato,!nutrición!animal!y!procesamiento!de!alimentos!para!humanos,!por!lo!que!hoy!en!día,!se!incluye! la! enzima! en! la! categoría! de! nutracéuticos! (Balwani!et$ al.,! 2017).! Como! solución,! la!investigación! de! la! fitasa! y! sus! aplicaciones! son! lo! más! reciente! para! degradar! el! fitato!antinutriente! durante! el! procesamiento! de! los! alimentos! y! en! la! agricultura! para!mantener! la!sostenibilidad!(Kumar!et$al.,!2010).!!!!Las!fitasas!forman!parte!de!un!subgrupo!de!enzimas!de!la!familia!de!las!fosfatasas!ácidas,!las!cuales! son! del! tipo! hidrolasas.! Éstas! actúan! rompiendo! los! enlaces! fosfomonoéster,!degradando!los!fitatos!a!mioinositol!hexafosfato!y!fósforo!inorgánico,!los!cuales!tienen!un!efecto!quelante!menor! o! nulo! (Kim!et$ al.,! 2006q!Neira!et$ al.,! 2017).! Las! enzimas! fitasas! se! pueden!dividir!en!dos!clases:!3Bfitasas!(E.C.!3.1.3.8)!y!6Bfitasas!(E.C.!3.1.3.26).!Los!microorganismos!y!los! hongos! producen! 3Bfitasas,! que! elimina! el! ortofosfato! de! la! posición! 3,! y! las! plantas,!contienen! las! 6Bfitasas! (Lynch! 1996).! Adicionalmete,! las! fitasas! son! enzimas! que!mejoran! la!absorción!del! fósforo!en! los!piensos!utilizados!en! la!alimentación!porcina!y!en!general!de! los!animales!monogástricos.!Por!tanto,!su!interés!radica,!principalmente,!en!que!permiten!un!mejor!uso!del!fósforo!a!partir!de!la!dieta!de!los!animales!(Balwani!et$al.,!2017q!Neira!et$al.,!2017).!!!!Las! fitasas! están! catalogadas! como! enzimas! que! pertenecen! a! una! “subfamilia! de! las!fosfatasas! ácidas! de! histidina! de! alto! peso!molecular”! (Ostanin! et$ al.,! 1992).! Estas! enzimas!

! 18!

actúan!mediante!mecanismos!de!reacción!que!abarcan!dos!fases!en! las!que!es!obligatoria! la!presencia! de! una! unión! covalente! de! fosfohistidina! (Ostanin! et$ al.,! 1992).! Estas! enzimas!reciben! su! nombre! según! la! posición! específica! en! donde! comienza! la! hidrólisis! en! el! grupo!éster!fosfato!en!la!molécula!de!fitato!(Lassen!et$al.,!2001).!!Las!3Bfitasas!han!sido!señaladas!como! “mejores”!que! las!6Bfitasas.!Esto!se!debe!al!producto!final!que! forman! las!3Bfitasas,!que!es! IP1!(Inositol! fosfato!–! IP)! ,! tras! la!degradación!continua!del!fitato!(Figura!1).!Por!otro!lado,!las!6Bfitasas!detienen!su!acción!sobre!la!formación!de!IP4!y!otros!ésteres!inferiores!que!dan!menos!eficacia!a!nivel!comercial!(Greiner!and!Konietzny!2011).!!

!Figura!1.!Descomposición!del!fitato!en!inositol!y!fósforo!por!la!acción!de!la!fitasa.!Hidrólisis!del!fitato!en!diferentes!subBproductos!(IP6!a!I)!resultado!de!la!enzima!3Bfitasa!la!cuál!permite!su!degradación!continua!(Balwani!et$al.,!2017).!!Teniendo! en! cuenta! las! aplicaciones! en! biotecnología,! las! fitasas!microbianas! han! sido! una!solución!comercial!prometedora!para!disminuir!la!contaminación!por!fitatos.!Son!más!efectivas!que! las! fitasas! de! plantas! ya! que! tienen! amplio! espectro! de! actividad! a! distintos! pH.! Son!estables!a!pH!tan!bajo!como!3.0!y!tan!alto!como!8.0,!mientras!que!la!estabilidad!de!las!fitasas!de! las! plantas! disminuye! por! debajo! de! 4.0! y! por! encima! de! 7.5.! Las! fitasas! microbianas!también! son! resistentes! a! la! activación! por! calor! y! conservan! su! actividad! bajo! estas!condiciones!(Cao!et$al.,!2007q!Lei!et$al.,!2013).!!3.4!Importancia!de!las!fitasas!en!la!dieta!de!animales!monogástricos!y!en!la!industria!alimentaria.!!!Como! se! ha! mencionado! a! lo! largo! del! texto,! el! fósforo! es! un! mineral! esencial! para! los!animales,!y!entre!otras!funciones,! juega!un!papel! importante!en!el!desarrollo!y!mantenimiento!del! sistema! esquelético.! Además,! el! fósforo! participa! en! la! síntesis! de! diversos! compuestos!orgánicos! y! desempeña! un! papel! importante! en! casi! todas! las! reacciones! bioquímicas! en! el!cuerpo! (Cromwell! 1989).! La! eficacia! general! de! la! utilización! de! fósforo! en! la! dieta! es!relativamente!baja!(20B27%),!y!una!cantidad!significativa!de!fósforo!está!contenida!en!la!basura!y!en!el!estiércol!(Ferket!et$al.,!2002).!Dado!que!los!seres!humanos,!perros,!cerdos,!aves!y!otros!animales! no! rumiantes! carecen! de! enzimas! fitasas,! el! fósforo! no! se! utiliza! cuando! está! en!

! 19!

forma!enlazada!como!fitato,!presente!en!los!piensos,!por!lo!que!se!excreta!directamente!en!las!áreas!de!agricultura!animal!intensiva,!que!contribuyen!a!la!contaminación!ambiental!por!exceso!de!fósforo!que!recientemente!se!ha!considerado!como!una!preocupación!ecológica!importante!(Balwani!et$al.!2017).!!!!La!función!principal!del!tracto!gastrointestinal!es!descomponer!las!macromoléculas!de!la!dieta!en! restos! micromoleculares! simples! para! su! absorción.! Durante! este! proceso,! hay! una!secreción! continua! de! proteínas! endógenas,! en! forma! de! enzimas! digestivas,! moco! y!enterocitos! descamados! en! el! intestino! (Nasset! and! Ju! 1961q! Ravindran! 2016).! Como!suplemento! alimenticio! para! animales,! las! fitasas! se! han! explotado! a! nivel! comercial! como!aditivo! para! peces,! cerdos! y! aves! de! corral,! ya! que! estos! organismos! son!monogástricos! y!carecen! de! actividad! ! fitasa! en! su! tracto! digestivoq! razón! por! la! que! los! niveles! de! fósforo!inorgánico!en!su!cuerpo!están!reducidosq!con!el!fin!de!prevenir! la!deficiencia!del!fósforo!en!la!dieta,! los! piensos! para! animales! monogástricos! se! complementan! con! el! fósforo! inorgánico!más! fácilmente! disponible,! como! el! fosfato! dicálcico! (Cao! et$ al.,! 2007! q! Lemos! and! Tacon!2016).!!!!Se!ha!demostrado!que!la!utilización!de!fósforo!aumenta!al!agregar!fitasa!en!la!dieta!de!harina!de! carpa! a! base! de! soja! (Segueilha! et$ al.,! 1993).! Kemme! et$ al.,! (1999)! han! demostrado! el!efecto!de!la!proteína!de!las!fitasas!de!A.$niger!complementadas!con!la!dieta!de!harina!de!maíz!y! soja! para! el! crecimiento! en! los! cerdos.! La! adición! de! fitasa! microbiana! aumentó! la!digestibilidad! ileal! aparente! (DIA)! de! N! y! otros! aminoácidos! (Kemme! et$ al.,! 1999).! Según!Stewart!et$al.,!(2018),!otra!importancia!de!añadir!fitasas!como!suplemento!alimenticio!en!aves,!es! que! mejora! la! producción! de! esperma,! la! calidad! del! semen! y! las! concentraciones! de!minerales!séricos,!por!lo!que!permite!una!mejora!en!la!reproducción!animal.!!!Adicionalmente,!el!uso!de!fitasas!como!suplemento!nutritivo!incluido!en!la!dieta!de!los!animales!monogástricos! tiene! los! siguientes! efectos! positivos:! reducción! significativa! en! el! fósforo!inorgánico!que!se!emplea!obligatoriamente!en!la!alimentación!animal,!disminución!del!impacto!ambiental! implicado! en! la! descarga! de! fitato! en! los! excrementos! de! los! animales,! y! la!asimilación! mejorada! de! minerales! (Ca+2,! Cu+2,! Zn+2,! Mn+2,! Fe+2),! proteínas! y! aminoácidos!(Pavlova! et$ al.,! 2008).! Así! mismo,! la! adición! de! fitasas! en! la! dieta! de! estos! animales! ha!mostrado!mejoras!en!el! rendimiento!y!en!el!crecimiento!esquelético!de! los!animales,!además!de! ocasionar! ventajas! en! la! alimentación! porcícola! y! avícola,! en! la! protección! ambiental,! la!preservación!del!fósforo!en!la!roca,!en!la!nutrición!humana!y!aplicaciones!industriales!(Simons!et$al.,!1990q!Lei!et$al.,!2013q!Dersjant!et$al.,!2014).!!!!!Las! fitasas! pueden! utilizarse! también! en! la! industria! alimentaria! ya! que! pueden! degradar! el!fitato!existente!en!los!alimentos!durante!el!procesamiento!de!los!mismos.!El!pan!que!contiene!fibra,!es!un!alimento!básico!en!muchos!países!del!mundo!y!contiene!niveles!de!fitato!de!0.29B1.05%,!!tras!la!adición!de!fitasas!durante!la!fabricación!de!la!masa,!el!fitato!puede!hidrolizarse!(Vohra!and!Satyanarayana!2003q!Ranjan!et$al.,!2015).!La!suplementación!de!fitasa!aislada!de!A.$ niger! en! ingredientes! de! masa! ayuda! a! aumentar! la! calidad! del! pan! al! aumentar! la!disponibilidad!de!calcio!(Haros!et$al.,!2001q! Ismail!et$al.,!2014),!además,!ajusta!el!proceso!de!

! 20!

fermentación,!contribuye!a!la!suavidad!de!la!miga!y!mejora!su!forma!y!volumen!(Caransa!et$al.,!1988q!Dahiya!2016).!!!3.5!Uso!de!microorganismos!para!la!transformación!del!fósforo!y!para!la!suplementación!alimentaria.!!En! la! actualidad! se! está! realizando! un! esfuerzo! global! por! desarrollar! microorganismos!recombinantes!que!promuevan!un!uso!eficiente!del!fósforo!del!suelo!y!de!los!fertilizantes!para!las! plantas.! De! este! modo,! la! ingeniería! genética! constituye! una! alternativa! importante! que!puede! ayudar! a! minimizar! el! efecto! adverso! al! medio! ambiente! causado! por! el! uso!indiscriminado!de!fertilizantes!y!la!acumulación!de!fósforo!no!disponible!en!el!suelo,!debido!al!aumento! en! la! crianza! de! ganado! bovino! y! porcino,! aves! y! peces.! Así,! el! uso! de!microorganismos! modificados! genéticamente,! o! el! uso! de! fitasas! recombinantes,! podría!mejorar! la! nutrición! de! los! animales,! así! como! la! disponibilidad! del! fósforo! para! las! plantas!mediante!la!clonación!de!genes!de!fitasa!en!hospederos!apropiados!(Fernández!and!Rodríguez!2006).!!Los!microorganismos! involucrados!en! la! solubilización!de! fósforo! juegan!un!papel! importante!en! la! variación! de! la! disponibilidad! del! fósforo! del! suelo,! una! porción! significativa! de! ellos!pueden! ser! aislados! de! la! rizosfera,! predominando! especies! de! los! géneros! Bacillus,!Pseudomonas,!Penicillium!y!Aspergillus! (Kucey!1983q!Wyss!1999).!Como!se!ha!mencionado,!las! fitasas! son!enzimas!que! favorecen! la!mineralización! y! solubilización!del! fósforo!orgánico,!catalizando! el! proceso! de! hidrólisis! del! ácido! fítico,! liberando! de! forma! secuencial! hasta! 6!grupos! ortoBfosfatos! (H2POB

4BHPOB4)! y! son! importantes! debido! a! su! variedad! de! aplicaciones!

comerciales!y!ambientales.!Las!fitasas!pueden!encontrarse!en!varias!partes!de!la!naturaleza!y!hasta! en! tejidos! de! animales! (Tabla! 1)! (Liu! 1998).! Existen! evidencias! de! que! estas! enzimas!pueden! incrementar!significativamente!el!uso!de! fósforo!proveniente!de! los! fitatos,!hecho!que!ha! sido! descrito! como! de! gran! interés! en! nutrición! humana! y! animal,! además! de! mitigar! el!impacto!para!el!medio!ambiente!ya!que!considera!una! reducción!en! la!excreción!y!por! tanto,!acumulación!de!fósforo!(Bohn!et$al.,!2008).!!!La! mayor! parte! de! la! investigación! científica! se! ha! llevado! a! cabo! sobre! fitasas! de! origen!fúngico! (hongos! filamentosos),! incluidas! especies! de! Aspergillus$ ficuum,!Mucor$ piriformis! y!Cladosporium!(Cao!et$al.,!2007).!La!primera!fitasa!comercial!que!entró!en!el!mercado!se!obtuvó!de!un!hongo,!Aspergillus$niger!NRRL!315!(ATCC!66876)!en!1990!(Irving!and!Cosgrove!1972).!Después!de!su!éxito!como!suplemento!de!alimento!para!animales,!se!empleó!en!otras!áreas!de!la!acuicultura!(Yoo!et$al.,!2005)!y!en!nutrición!humana!(De!Silva!et$al.,!2005).!En!la!actualidad,!se! están! llevando! a! cabo! investigaciones! para! obtener! fitasas! más! eficientes! a! partir! de!especies! de! Aspergillus! mediante! la! clonación! de! genes,! usando! tecnología! del! ADN!recombinante!(Balwani!et$al.,!2017).!!!!Las!fitasas!de!origen!fúngico!han!mostrado!tener!una!actividad!a!temperaturas!mayores!a!la!del!cuerpo! corporal! de! los! animales! monogástricos! ,! para! la! producción! de! fitasas! fúngicas!termófilas,! se! usan! principalmente! la! fermentación! en! estado! sólido! y! la! fermentación!

! 21!

sumergida.!Pero! para! la! producción! comercial,! sólo! se! usa! la! fermentación! en! estado! sólido!(Singh!and!Satyanarayana!2011)!ya!que!conduce!a!una!mayor! formación!de!producto!que! la!fermentación! sumergida! usada! clásicamente.! Además,! los! productos! generados! tienen!estabilidad! extendida! con! bajos! costos! de! producción! (McKinney! et$ al.,! 2015).! Las! fitasas!producidas!por!Aspergillus$niger!son!proteínas!de!alto!peso!molecular!que!varían!de!50!kDa!a!456! kDa,! son! activos! a! una! temperatura! óptima!entre! 50! y! 60! °C! y! son! de! naturaleza! ácida!(Berka!et$al.,!1998q!Singh!and!Satyanarayana!2015).!!!!Debido!a!que!las!fitasas!naturales!aisladas!tienen!una!termoestabilidad!limitada!y!se!degradan!durante! las! técnicas! de! procesamiento! de! alimentos,! las! fitasas! con! termoestabilidad!aumentada!se!han!clonado!a!partir!de! fuentes! fúngicas! termófilas! (Vohra!and!Satyanarayana!2003q! Ranjan! et$ al.,! 2015).! Es! claro! que! las! investigaciones! enfocadas! en! los! usos!biotecnológicos,! y! en! el! mejoramiento! de! las! características! de! las! fitasas,! indudablemente!brindará!soluciones!efectivas!hacia!la!agricultura!sostenible!y!la!protección!del!medio!ambiente!en!los!próximos!años,!además,!de!que!proporcionará!una!estrategia!para!reducir!los!costos!de!ingresos!que!se!vuelven!innecesariamente!altos!debido!a! la!adición!de!fertilizantes!de!fósforo!(Balwani!et$al.,!2017).!!!!3.5.1!Aspergillus*niger**Los! microorganismos! productores! de! fitasas! incluyen! hongos! filamentosos! del! género!Aspergillus.!En!varios!estudios,!se!descubrió!que!estos!hongos!producen!la!enzima!extracelular!más!activa! con! las! características!más!adecuadas!de!pH!y!estabilidad!a! temperatura.!Por! lo!tanto,! los! microorganismos! del! género! Aspergillus,! son! los! más! utilizados! en! la! producción!industrial!de!estas!enzimas!(Haefner!et$al.,!2005q!Bhavsar!et$al.,!2012).!!*Este!hongo!tiene!la!capacidad!de!mineralizar!y!solubilizar!una!parte!del!fósforo!presente!en!el!suelo! de! forma! natural! a! través! de! la! producción! de! las! enzimas! fitasas,! permitiendo! la!liberación!de! los!grupos! fosfato!del!ácido! fítico! (Fernández!and!Rodríguez!2006q!Neira!et$al.,!2017).! El! uso! de! hongos! filamentosos! para! la! producción! de! metabolitos! de! importancia!comercial!se!ha!incrementado,!utilizando!el!cultivo!en!estado!sólido!y!sumergido!(FSS),!donde!se!ha!estudiado!la!producción!de!las!enzimas!fitasas!especialmente!de!Aspergillus$niger!(Singh!et$ al.,! 2015),! con!una!actividad! fitasa! de! 50! a! 103!U/mg!a! pH!5.5! (valor! similar! al! del! tracto!digestivo!de!los!animales)!y!a!temperatura!de!55°C!(Mezelia!et$al.,!2017).!

!La!Organización!Mundial!de! la!Salud!(OMS)!declaró! la!fitasa!de!Aspergillus$niger!benéfica!en!muchos! aspectos,! segura! para! consumo! humano! y! también! como! suplemento! en! la!alimentación!de!animales!monogástricosq!se!especificó!que!la!fitasa!a!utilizar!debe!ser!estable!a!pH!ácido!durante!el!período!de!retención!en!el!ventrículo!gástrico,! favoreciendo!la!actividad!enzimática!y!aumentando!la!biodisponibilidad!de!fósforo!(Bohn!et$al.,!2008q!Nielsen!and!Meyer!2016q!Balwani!et$al.,!2017).!!!La! actividad! de! las! enzimas! fitasas! se! mide! en! unidades! fitasa! (FTU)! y! se! define! como! la!cantidad!de!enzima!capaz!de! liberar!1!µmol!de! fosfato! inorgánico!por!minuto!a!partir!de!una!

! 22!

solución!1mM!de!fitato!de!sodio!a!temperatura!de!55°C!y!a!pH!de!5.5.!La!actividad!promedio!de!la! 3Bfitasa! es! de! 106! FTU/mg! y! se! utiliza! en! un! rango! de! 5B70! g/Kg! en! los! productos!alimenticios!(dependiendo!de!la!aplicación!industrial!y!el!contenido!de!fitatos),!(Frontela!et$al.,!2008q!Nielsen!et$al.,!2013q!Humer!et$al.,!2015).!!! 3.5.2!Pichia*pastoris*(Huésped!para!la!producción!de!fitasa)!*Pichia$pastoris!es!una!levadura!muy!utilizada!como!sistema!de!expresión!para!la!producción!de!proteínas! recombinantes,! debido! a! su! fácil! manipulación! genética,! a! los! altos! niveles! de!producción! tanto! intra!como!extracelular!de! la!proteína!de! interés,!a! la!habilidad!para!realizar!modificaciones! postraduccionales! similares! a! las! de! organismos! eucariotas! como! la!glicosilación!y!procesado!proteolítico!que!generan!un!plegamiento!correcto!de!la!proteína,!y!en!términos!de!expresión!extracelularq!lo!que!podría!considerarse!una!ventaja!debido!a!la!facilidad!por! ejemplo,! en!procesos!de! concentración! y! purificación!de! la! proteína! recombinante! (NiñoBGomez,!!2016).!*Pichia$pastoris!es!un!microorganismo!usado!para!la!expresión!de!proteínas!principalmente!de!uso! farmacéutico! y! enzimas! de! uso! industrial.! Esta! levadura! metilotrófica! es! un! sistema! de!producción! que! se! caracteriza! por! su! crecimiento! a! altas! densidades! celulares,! por! los!promotores! fuertes! y! estrictamente! regulados!que!están!disponibles,! y! por! las! opciones!para!producir!cantidades!de!proteína!recombinante!por!litro!de!cultivo!tanto!intracelularmente!como!secretadas!al!medio!de!cultivo!(Ahmad!et$al.,!2014).!!! !3.6!Importancia!ambiental,!nutricional!y!económica!de!las!fitasas!!!En!los!estudios!realizados!en!el!campo!de!la!ingeniería!genética,!ellos!se!han!enfocado!hacia!la!búsqueda!de!fitasas!con!el!fin!de!añadirlas!en!las!dietas!de!animales!monogástricos,!debido!a!que! tienen! bajos! niveles! de! actividad! fitasa! en! sus! tractos! digestivos! y! como! una! vía! para!reducir! la! contaminación! ambiental,! disminuir! el! proceso! de! eutrofización,! favorecer! el!aprovechamiento! del! fósforo! presente! en! las! dietas! y! contrarrestar! la! interferencia! en! la!absorción!de!nutrientes!(Fernández!and!Rodríguez!2006).!!!En!el!estudió!de!Simmons!et$al.,!(1990)!la!enzima!fitasa!fue!capaz!de!degradar!in$vitro!el!fitato!presente!en!harina!de!soja,!maíz!y!un!alimento! líquido!para!cerdos,!cuando!se!agregó! fitasa!microbiana! a! dietas! bajas! en! fósforo! para! pollos! de! engorde,! la! disponibilidad! de! fósforo!aumentó!a!más!del!60%!y!la!cantidad!de!fósforo!en!los!excrementos!disminuyó!en!un!50%.!Por!otro!lado,!la!adición!de!fitasa!microbiana!a!las!dietas!para!los!cerdos!en!crecimiento!aumentó!la!capacidad!de!absorción!aparente!de!fósforo!en!24%!y!la!cantidad!de!fósforo!en!las!heces!fue!35%!menor!(Simons!et$al.,!1990)!!!Nelson! et$ al.,! (1968)! fueron! los! primeros! en! agregar! fitasa,! producida! por! un! cultivo! de!Aspergillus$ficuum,!a!harina!de!soja!líquida.!El!alimento!se!incubó!durante!24h!a!50°C.!Después!del!secado,!se!alimentó!a!pollos!de!1!día!de!edad,!las!aves!mostraron!un!aumento!considerable!

! 23!

en!el!porcentaje!de!la!masa!muscular!sobre!los!controles!que!no!recibieron!fosfato!inorgánico!(Nelson!et$al.,!1968)!!!Por!otra!parte,! las!fitasas!también!favorecen!la!nutrición!humana,!ya!que!las!fitasas!de!origen!microbiano!han!sido!empleadas!en!el!estudio!de!la!absorción!mineral,!mostrando!un!creciente!interés! en! el! empleo! de! estas! fitasas! para! mejorar! la! calidad! nutricional! de! los! alimentos!(Frontela!et$al.,!2008).!El!uso!de!fitasas!de!origen!microbiano!está!actualmente!autorizado!para!su!empleo!en!alimentación!animal,!con!la!intención!de!incrementar!la!disponibilidad!del!fósforo!a!partir!del!ácido! fíticoq! reduciendo! la!excreción! fecal!del!mismo!al!ambiente! (Tomschy!et$al.,!2000).!Sandberg!et$al.,!(1996)!han!comprobado!el!efecto!de!la!adición!de!fitasa!procedente!de!Aspergillus$niger!(3Bfitasa)!en!harina!de!trigo,!observando!que!incrementa!la!absorción!de!hierro!en!humanos.!!Ushasree!et$al.,! (2017)!destacan! la! importancia!de! la! tecnología! recombinante!de!ADN!a! las!investigaciones! relacionadas! con!el! uso!de! fitasas!durante! la! última!década,! la! aplicación!de!herramientas! moleculares! modernas! han! ayudado! al! descubrimiento! de! nuevos! genes! de!fitasas!facilitando!su!producción!comercial!y!ampliado!sus!aplicaciones.!!!La!aplicación!mundial!de!estas!enzimas!como!suplemento!de!dieta!en!animales!monogástricos!ha!estimulado!un!progreso!significativo!en!el!uso!de!fósforo!por!parte!de!estos!animales,!y!de!este!modo!se!han!resuelto!en!parte!los!problemas!del!agotamiento!mundial!de!las!reservas!de!fósforo!presentes!en!la!roca!fosfórica,!y!el!impacto!ambiental!de!la!producción!ganadera.!Esta!aplicación!de!enzimas!ha! favorecido! los!sectores!de! la!agricultura,!acuicultura,!biomedicina!y!tambien!la!nutrición!humana!(Dahiya!2016q!Balaban!et$al.,!2017).!!!Desde!1980!se!introdujo!al!mercado!una!fitasa!en!forma!recombinante!(NatuphosB3Bfitasa)!para!uso!comercial!y!este!ha!sido!un!hito! importante!en! la! investigación!de!fitasas.!El!uso!de!esta!fitasa! recién!presentada! tuvo!un!beneficio!económico! inmediato!para! la!producción!animal,!el!rendimiento!de!la!alimentación!porcina!y!su!efecto!sobre!la!escalada!del!mercado!de!enzimas!fue!sustancial.!Finalmente,!se!lanzaron!varias!fitasas!recombinantes!en!el!mercado!de!enzimas!de!alimentación,! la!mayoría!de!ellas!con!cualidades!específicamente!optimizadas!(Gifre!et$al.,!2017).!!La!demanda!de!fitasas!para!la!aplicación!de!alimentos!para!animales!puede!estar!directamente!relacionada! con! el! aumento! de! la! demanda! de! piensos,! principlamente! de! granjas! avícolas,!porcícolas!y!piscícolas.!Además,!como!las!fitasas!ayudan!a!reducir!el!impacto!ambiental!de!la!contaminación!por!fósforo,!están!ganando!una!posición!significativa!en!Europa!y!Norteamerica!(Urhasree!et$al.,!2017).!Igualmente,!aumentar!la!disponibilidad!de!fósforo!en!la!alimentación!es!otra! razón! que! impulsa! la! demanda! de! fitasas.! El! ingreso! de! las! fitasas! al! mercado! se! ha!incrementado!desde!finales!de!2007!y!principios!de!2008!debido!a!un!aumento!en!el!precio!y!la!escasez! de! alimentos.!Además,! un! estudio! reciente! sobre! la! alimentación! animal! con! fitasas!que! fue! transmitido! al! vasto! repositorio! del! centro! de! investigación! de! mercado,! se! tituló!"Informe$de$alimentación$animal$con$ fitasa$2017F2022$en$el$mercado$global$y$de$ los$Estados$Unidos",!indica!que!el!mercado!mundial!ganó!impulso!en!el!2016!y!se!espera!alcanzar!un!alto!

! 24!

valor! en!millones! de!USD! a! fines! de! 2022,! también! se! estimó! que!Asia! ocupará! una!mayor!cuota!de!mercado!durante!el!período!2016B2022,!especialmente!en!las!regiones!de!China,!India!y!el!sudeste!asiático!(Urhasree!et$al.,!2017).!!Actualmente,!la!fitasa!se!ha!convertido!en!la!enzima!más!utilizada!en!el!mundo.!Majidzadeh!et$al.,!(2016)!sugieren!la!degradación!de!fitato!como!un!nuevo!mecanismo!probiótico.!El!papel!de!esta! enzima! en! la! salud! humana! debe! explorarse! más! utilizando! cultivos! probióticos!recombinantes.! Por! lo! tanto,! en! el! futuro,! un! enfoque! integrado! que! incluya! el! análisis!ambiental,!estudios!genómicos,!y!la!ingeniería!de!enzimas,!puede!conducir!a!una!mejora!de!las!fitasas!para!diferentes!especies!y!dietas.!!!4.!PREGUNTA!DE!INVESTIGACIÓN!!!¿Cuál! es! la! cinética! de! producción! de! la! 3BFitasa! A! recombinante! producida! de! manera!

constitutiva! en! Pichia$ pastoris,$ obtenida! a! partir! de! la! optimización! del! gen! proveniente! en!

Aspergillus$niger?!

!!5.!OBJETIVOS!5.1.!Objetivo!general!!

•! Expresar! de! manera! constitutiva! la! 3BFitasa! A! obtenida! a! partir! de! la! secuencia!genómica!optimizada!de!Aspergillus$niger!en!Pichia$pastoris.!

!5.2.!Objetivos!específicos!!!

•! Clonar!el!gen!PhyA!de!Aspergillus$niger!en!Pichia$pastoris!para!su!expresión.!

•! Seleccionar! los! clones! recombinantes! que! permitan! obtener! los! valores! de! actividad!

fitasa!más!altos.!!

•! Evaluar!los!parámetros!cinéticos!(µ(x),!td,!K0,!td,!Y(x/s),!P(x)!y!P(“p”)),!durante!la!producción!de!la!3Bfitasa!A!recombinante!en!Pichia$pastoris.!!

!!6.!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!Este! Trabajo! de! Grado! hace! parte! del! proyecto! de! investigación! “Clonación$ y$ expresión$constitutiva$ de$ las$ Fitasas$ 3FFitasa$ A$ y$ 3FFitasa$ B$ de$ Aspergillus$ niger$ bajo$ el$ control$ del$promotor$pGAP$en$Pichia$pastoris”,!propuesta!ID:!00007217,!proyecto!ID:!00007390,!financiado!por!la!Vicerrectoría!de!Investigaciones!de!la!Pontificia!Universidad!Javeriana,!Bogotá!D.C.!!

! 25!

En! dicho! proyecto! de! investigación,! se! realizó! la! optimización,! el! diseño! de! la! secuencia!sintética,!la!modelación!3D,!el!docking!molecular!de!la!proteína!de!las!3BFitasa!A!y!3BFitasa!B!de!Aspergillus$niger$con!el!fin!de!expresarlas!de!manera!constitutiva!en!Pichia$pastoris$(NiñoBGomez!et$al.,!2017).!Por!tanto,!para!dar!continuidad!a!los!estudios!ya!realizados!se!planteó!la!siguiente!metodología!para!evaluar!la!expresión!de!la!3Bfitasa!A!recombinante!en!P.$pastoris.$El!presente!trabajo,!se!inició!a!partir!de!la!clonación!del!gen,!con!el!fin!de!seleccionar!los!clones!recombinantes,! y! hacer! el! screening! inicial! para! seleccionar! los! clones! con! mayor! actividad!fitasa.$$$6.1!Preparación!del!gen!y!el!plásmido!para!la!clonación!!El! gen!PhyA! fue! separado! del! plásmido! portador! (pUC57)!mediante! digestión! enzimática,! el!plásmido!de!expresión!pGAPZ!BA!también!fue!digerido!con!las!enzimas!de!restricción!EcoRI!y!NotI.!Se!realizó!una!electroforesis!en!gel!de!agarosa!(1%!p/v)!para!purificar!el!ADN!de!interés,!y!posteriormente!se!trasladó!cada!ADN!(gen!PhyA!y!plásmido!pGAPZ!BA)!en!un!tubo!para!ser!purificado! según! el! protocolo! sugerido! por!Wizard$SV$Genomic! –!Promega®.! A! partir! de! los!insertos!de!ADN!purificados,!se!realizó! la! ligación!del!gen!de! interés!y!el!vector!de!expresión!usando!la!enzima!T4!ligasa!(LigaFast$–$Invitrogen$®),!es!decir!que$se!uniieron!los!fragmentos!correspondientes!a!PhyA!+#pGAPZ!A,!para!posteriormente!replicar!el!vector!recombinante!en!Escherichia$coli$y!obtener!mayor!cantidad!del!plásmido!de!expresión!con!el!gen!de!interés.!!!6.2!Transformación!de!Escherichia*coli*con!el!plásmido!de!expresión!!Con! el! fin! de! obtener! células! competentes,! se! creció! E.$ coli$ sin! el! plásmido! en! medio! LB!(peptona!de!caseína!y!extracto!de!levadura),!las!células!se!incubaron!a!37ºC!y!se!mantuvieron!en!agitación!constante!durante!toda!la!noche.!Al!siguiente!día,!se!tomó!una!alícuota!del!cultivo!y! se! transfirió! a! caldo! LB! fresco,! para! incubar! durante! 3h! más.! Al! finalizar! este! tiempo,! la!muestra! se! trasladó! a! un! tubo! de! eppendorf! nuevo! y! se! dejó! en! hielo! durante! 20! min.!Posteriormente,!se!centrifugó!a!4000!x!g!a!4ºC!durante!15!min,!se!eliminó!el!sobrenadante!y!se!resuspendió!la!biomasa!en!400!µL!de!CaCl2!0.5!M!a!0ºC.!Se!dejó!en!enfriar!sobre!hielo!durante!20!min!y!se!repitió!de!nuevo!el!paso!de!centrifugación!hasta!la!resuspensión,!luego!se!dejó!en!hielo!hasta!utilizar!las!células!de!E.coli.!!Posteriormente,! se! tomarón! 5! µL! del! plásmido! o! la! ligación! (según! el! caso)! y! 50! µL! de! las!células!competentes! frescas.!Se!mezcló!suavemente!y!se!colocaron!en!baño!frío!por!20!min,!luego!se!aplicó!choque!térmico!durante!2!min!a!42ºC!e!inmediatamente!los!tubos!se!llevaron!a!baño! frío!por!2!min.!Después!se!añadieron!950!µL!de!medio!LB!a! temperatura!ambiente,!se!mezclaron,! y! se! incubaron! los! viales! a! 37ºC! durante! 3h! a! 200B220! rpm.! Por! último,! se!sembraron! 100! µL! de! la!mezcla! en! agar! LB! suplementado! con! 40! µg!mLB1! de! zeocina! y! se!incubaron!a!37ºC!durante!la!noche.!!!!!!

! 26!

6.3!Extracción!del!ADN!plásmidico!de!Escherichia*coli!!Para!la!extracción!de!ADN!plasmídico!de!E.$coli$se!usó!el!kit!de!extracción!MiniPrep$SV$Plus$–$Promega$ ®,! siguiendo! las! especificaciones! del! fabricante,! con! algunas! modificaciones!realizadas!en!el!laboratorio.!A!partir!de!las!colonias!transformates!aisladas!se!realizó!un!cultivo!en!caldo!LB!durante!toda!la!noche.!El!cultivo!se!centrifugó!durante!5!min!a!10.000!g!(volumen!1B10!mL!de!cultivo),!se!eliminó!el!sobrenadante,!y!las!células!fueron!resuspendidas!en!250!µL!de!la!solución!de!resuspensión.!Se!agregaron!250!µL!de!la!solución!de!lisis!y!se!invirtió!4!veces!para!mezclarlas,!se!agregaron!10!µL!de!la!solución!de!Proteasa!Alcalina!y!se!volvió!a!invertir!4!veces!para!mezclar,!se! incubó!por!5!min!a!ºT!ambiente! (25!ºC)!y!se!agregaron!350!µL!de! la!solución!de!neutralización!y!se!invirtió!de!nuevo,!luego!se!centrifugó!durante!10!min!a!12.000!x!g.!!!Para! la! purificación! del! ADN! plasmídico,! se! insertó! la! columna! de! extensión! a! un! tubo! de!microcentrifuga! a! 2! mL,! se! transfirió! cuidadosamente! el! lisado! a! la! minicolumna! y! luego! se!centrifugó!a!12.000!x!g!por!1!min,!se!descartó!el!filtrado!y!se!reinsertó!la!columna!al!tubo.!!Posteriormente,!se! realizó!el! lavado!en!donde!se!agregaron!750!µL!de! la!solución!de! lavado!que!contiene!etanol,!se!centrifugó!a!12.000!x!g!por!1!min,!y!se!descartó!el!filtrado!y!se!reinsertó!la! columna! del! tubo! de! colección,! se! repitió! el! paso! anterior! con! 250! µL! de! la! solución! de!lavado! y! se! centrifugó! a! 12.000! x! g! por! 2! min! a! ºT! ambiente! (la! muestra! se! dejó! reposar!durante!10!min!para!eliminar!el!exceso!de!etanol).!Por!ultimó!para! la! limpieza,!se!transfirió! la!columna!a!un!nuevo!tubo!de!microcentrifuga,!se!agregaron!100!µL!de!agua!libre!de!nucleasa!a!la! columna,! se! centrifugó! a! 12.000! x! g! por! 1!min! a! ºT! ambiente! y! se! removió! y! descartó! la!columna.!Finalmente,!el!ADN!se!almacenó!a!B20!ºC!hasta!su!uso!para!transformar!la!levadura!con! el! vector! de! expresión.! Para! la! preparación! de! la! muestra! para! transformar! la! levadura!Pichia$pastoris,!el!ADN!se! linearizó!con! la!enzima!de! restricción!AvrII! (New$England$BioLabs$®),!siguiendo!las!instrucciones!del!fabricante.!!6.4!Preparación!de!Pichia*pastoris!para!electroporación!!Se!creció!Pichia$pastoris!en!5!mL!de!YPD!(Extracto!de!Levadura,!Peptona,!Dextrosa)!a!30ºC!durante! la!noche,!posteriormente,!se! inoculó!en!500!mL!de!medio!nuevo!en!un!matraz!de!2L!con! 0.1B0.5!mL! del! cultivo! anterior! hasta! ! obtener! una! DO600! =! 1.3B1.5,! se! centrifugarón! las!células! a! 1500! x! g! durante! 5!min! a! 4ºC,! se! resuspendió! el! sedimento! con! 500!mL! de! agua!estéril!helada!(0ºC),!se!volvió!a!centrifugar!y!a!resuspender!el!sedimento!con!250!mL!de!agua,!de!nuevo!se!centrifugó!y!se!resuspendió!el!sedimento!en!20!mL!de!sorbitol!helado!a!1ºC,!se!repitió!el!paso!en!1!mL!de!sorbitol!helado!a!1ºC!para!obtener!un!volumen!final!de!aprox.!1.5!mL!de!células,!y!se!mantuvieron!en!hielo!hasta!usarse!ese!mismo!día.!!6.5!Transformación!de!Pichia*pastoris!por!electroporación!!!!!Se!mezclaron!80!µL!de!células!con!5B10!µg!de!ADN!linearizado!(se!usó!la!enzima!de!restricción!AvrII)!(en!5B10!µL!de!agua!estéril),!se!transfirieron!a!una!cubeta!de!electroporación!de!0.2!cm!

! 27!

enfriada!con!hielo!(0ºC),!y!la!mezcla!se!incubó!en!hielo!durante!5!min.!Las!células!se!pulsaron!de!acuerdo!a!los!parámetros!sugeridos!para!levaduras!por!el!fabricante!(Eppendorf$®).!Luego!del! pulso,! inmediatamente! se!agregó!1!mL!de! sorbitol! 1M!enfriado! con!hielo! a! la! cubeta,! se!transfirió!el!contenido!de! la!cubeta!a!un! tubo!estéril!de!15!mL,!se!dejó! incubando!a!30ºC!sin!agitar!durante!1B2!horas!y,!por!último,!se!extendieron!volúmenes!de!10,!25,!50,!100!y!200!µL!en!cajas! de! petri! con! agar! YPDS! (Extracto! de! Levadura,! Peptona,! Dextrosa,! Sorbitol)! ! que!contenían! 100! µg/mL! de! Zeocina®! y! se! incubaron! durante! 2B3! días! a! 30ºC! hasta! que! se!formaron!colonias!resistentes!al!antibiótico.!Se!eligieron!5!colonias,!y!se!purificaron!en!cajas!de!petri!con!agar!YPDS!que!contenían!100!µg!mLB1!de!Zeocina®.!!!6.6!Curva!patrón!para!cuantificación!de!fósforo!inorgánico!!!Para! realizar! la! curva! patrón! de! fósforo! inorgánico! libre! presente,! se! realizaron! dos! curvas!patrón! usando! KH2PO4.! Una! curva! de! concentraciones! altas! (1! µM! a! 10! µM)! y! una! de!concentraciones! bajas! (0.1! µM! a! 1! µM),! en! donde! se! realizó! una! mezcla! de! reacción! que!consistió!en!tomar!1!mL!de!muestra!(blanco,!patrón!de!Pi)!y!4!mL!de!Buffer!Acetato!de!sodio!200! mM! (pH! 5.0)! 1g.! LB1! de! Ácido! fítico! (Sodium$ Salt$ Phytate,! Sigma®),! esta! mezcla! de!reacción! se! incubó! durante! 15! min! a! 40! ºC,! luego! se! tomaron! 500! µL! de! la! mezcla! y! se!agregaron!inmediatamente!4!mL!de!la!mezcla!AAM!(Revelador,!1:1:2!de!Molibdato!de!amonio!10! Mm,! Ácido! sulfúrico! 2.5! M! y! Acetona! 100%),! se! realizó! vórtex! durante! 15! seg! para!homogenizar!la!muestra!y!para!que!se!formará!el!amarillo!del!ácido!fosfomolíbdico,!después!se!agregaron!400!µL!de!Ácido!cítrico!1!M!(para!formar!un!complejo!con!el!exceso!de!molibdato!y,!en!caso!de!formarse!un!precipitado,!se!centrifugó!antes!de!medir! la!absorbancia).!Por!último,!se!midió!la!absorbancia!a!355!nm!(Heinonen!and!Lahti!1981q!Qvirist!et$al.,!2015).!!!6.7!Determinación!de!la!actividad!enzimática!!Las!colonias!seleccionadas,!se!cultivaron!en!100!mL!de!caldo!YPD,!y!a!partir!del!sobrenadante!obtenido,!se!determinó!la!actividad!fitasa!monitoreando!el!cambio!en!la!absorbancia!a!355!nm!por!el!método!de!Heinonen!and!Lahti!(1981),!ya!que!la!máxima!absorción!reportada!por!dichos!autores! es! a! 355! nm.! Se! eligió! este! método! ya! que! utiliza! la! detección! directa! del! ácido!fosfomolíbdico! amarillo,! sin! reducción! al! azul! de! molibdeno.! Se! prepararon! tres! soluciones!stock:!Molibdato!de!amonio!10!mM!(Merck),!Ácido!cítrico!1!M!(Sigma)!y!Ácido!sulfúrico!2.5!M!(Merck).!Se!realizó!una!mezcla!de!reacción!que!consistió!en!tomar!1!mL!de!muestra!(blanco,!patrón!de!Pi,!sobrenadante!o!extracto!enzimático)!y!4!mL!de!Buffer!Acetato!de!sodio!200!mM!(pH! 5.0)! 1g.! LB1! de! Ácido! fítico! (Sodium$ Salt$ Phytate,! Sigma®),! esta!mezcla! de! reacción! se!incubó! durante! 15! min! a! 40! ºC,! luego! se! tomaron! 500! µL! de! la! mezcla! y! se! agregaron!inmediatamente! 4!mL! de! la!mezcla! AAM! (Revelador,! 1:1:2! de!Molibdato! de! amonio! 10!Mm,!Ácido!sulfúrico!2.5!M!y!Acetona!100%),!se!realizó!vórtex!durante!15!seg!para!homogenizar! la!muestra!y!para!que!se!formará!el!amarillo!del!ácido!fosfomolíbdico,!después!se!agregaron!400!µL!de!Ácido!cítrico!1!M! (para! formar!un!complejo! con!el! exceso!de!molibdato! y,! en! caso!de!formarse!un!precipitado,!se!centrifugó!antes!de!medir!la!absorbancia).!En!caso!de!formación!de!precipitados,! las!muestras! se! centrifugaron! antes! de!medir! la! absorbancia,! como! lo! hicieron!

! 28!

Greiner!and!Alminger!(1999).!Por!último,!se!midió!la!absorbancia!a!355!nm!(Heinonen!and!Lahti!1981q!Qvirist!et$al.,!2015).!!Para!determinar!los!µM!de!fósforo!liberados!se!despejó!en!la!curva!patrón!de!fósforo,!y!se!usó!la!siguiente!ecuación!para!determinar!la!actividad!enzimática!(Ecuación!I),!!!!!"#$%$&'

() *+,+-./01 = , 3456,7ó879:9,;<=6:>59,?,@ABC D(F.C) ,!(Ec.!I)!!

!Donde:!!!FD:!Factor!de!dilución!15:! Tiempo! (en! minutos)! de! incubación! de! la! mezcla! de! reacción! para! la! definición! de! las!unidades!enzimáticas.!0.5:!Volumen!(en!mililitros)!de!la!enzima!usada!(sobrenadante!del!cultivo!o!extracto!enzimatico)!!6.8! Estudios! preliminares! de! expresión! de! la! fitasa! recombinante! 31PhyA! en* Pichia*pastoris!*Una!colonia!de!los!transformantes!positivos!se!creció!a!30ºC!en!5!mL!de!medio!YPD!en!tubos!de!50!mL!durante!16!a!20!horas!con!agitación!de!210!rpm!hasta!alcanzar!un!valor!de!ODλ600nm!entre!2B5.!Se!sembraron!2!mL!de!este!inóculo!en!98!mL!de!medio!YPD!en!erlenmeyer!de!500!mL!(2%!v/v).!El!cultivo!se!monitoreó!midiendo!la!densidad!óptica!(ODλ600nm),!concentración!de!proteínas! totales! extracelulares! (mg!mLB1)! empleando!el!método!por! absorción!UV!a!280!nm!(Plummer!1981)!azúcares!reductores!(g!LB1)!por! la! técnica!del!ácido!3,5Bdinitrosalicilico!(DNS)!(Miller!1959)!y!la!actividad!fitasa!(U!LB1),!utilizando!el!método!de!Heinonen!and!Lahti!(1981).!Las!muestras!se!tomaron!cada!2!horas!durante!las!primeras!12!horas!y!luego!cada!24!horas!hasta!completar!204!horas!de!cultivo.!!!Para!calcular!la!concentración!de!biomasa!celular!se!empleó!una!curva!de!calibración!!(X!(g!DCW!LB1)!vs.!ODλ600nm!),!representada!por!la!ecuación!II.!!!I = ,1.1726,x,OPλ600nm,, (R2=!0.987),!!(Ec.!II)!!!!Donde:!X!=!gLB1!de!peso!seco!celular!(!Dry!Cell!Weight!(DCW)).!!Para! orden! cero,! el! dato! de!X! (gLB1! de!DCW),! se! dejó! como!gLB1! y! graficó! vs.! tiempo! (h)q! la!tendencia!de!la!curva!(fase!exponencial)!se!usó!para!calcular!la!velocidad!volumétrica!K0!(hB1),!(Ecuaciones!IIIBVI)!y!el!tiempo!de!duplicación!td!(h),!(Ecuación!VII),!(Doran!1998).!!

!V1W+ = − $[Z]\$] = ^!,!!!(Ec.!III)!

!d[A] ,= ,−,kdt,,!(Ec.!IV)!

! 29!

!!

. * c = ,−, d*W]F

[Z][Z]\

!,!!!(Ec.!V)!!![A] ,=,– ,kt, + [A]0!,!!!(Ec.!VI)!!!!W* = , g#h(%'%,i)

jk

l\!,!!!(Ec.!VII)!

!Para!orden!uno,!el!dato!de!X!(gLB1!de!DCW),!se!transformó!como!Ln!(x/x0)!y!graficó!vs.!tiempo!(h)q!la!tendencia!de!la!curva!(fase!exponencial)!se!usó!para!calcular!la!velocidad!específica!de!crecimiento!µ(x)!(hB1),!(Ecuaciones!VIIIBX)!y!el!tiempo!de!duplicación!td!(h),!(Ecuación!XI),!(Doran!1998).!!

m(x) = BD ,,,

$D$],!!!(Ec.!VIII)!!

!!Ln,x, = ,Ln,x0, + ,m(x)t!,!!!(Ec.!IX)!!!o-,( DD\) = m(x)t!,!!!(Ec.!X)!!Donde:!t = t,fase,log,– t,fase,log,!!!

W* = )"wx(y)!,!!!(Ec.!XI)!

!La! actividad! específica! en! cada! tiempo! de! muestreo! fue! calculada! dividiendo! la! actividad!enzimática!de!cada!hora!de!cultivo!entre! la! concentración!de!proteínas! totales!extracelulares!(Ecuación!XII).!!czW. {|} = Z~].�"Ä.

Åh"~.ÇÉh]!,!!(Ec.!XII)!!!Donde:!Act.Enz!=!U!LB1,!Conc.!Prot.=!mg!mLB1!

!La!productividad!de!la!biomasa!(gLB1!hB1),!(Ecuación!XIII)!y!en!función!de!la!actividad!biológica!de!la!enzima!(ULB1!hB1),!(Ecuación!XIV)!se!calculó!como!sigue!respectivamente!(Doran!1998).!!

Ñ(Ö) ,=(ÜÅá)

] !,!!!(Ec.!XIII)!!

! 30!

!Ñ(�"Ä#(%) =

Z~]àâäãåç] !,!!!(Ec.!XIV)!!

!El!rendimiento!de!la!biomasa!(gLB1!hB1),!(Ecuación!XIV)!!é = , (DwèDB)('Bè'w),,!!!(Ec.!XIV)!!!7.!RESULTADOS!Y!DISCUSIÓN!!Preparación!del!gen!y!el!plásmido!para!la!clonación!!Para!expresar!de!manera!constitutiva!la!3Bfitasa!A!recombinante!de!Aspergillus$niger!en!Pichia$pastoris,! el! plásmido! portador! pUC57! que! contenía! el! gen! PhyA,! se! llevó! a! una! digestión!enzimática!con!las!enzimas!de!restricción!EcoRI!y!NotI.!!!!Adicionalmente,!para!plásmido!de!expresión!(pGAPZ!FA)!se!realizó!la!digestión!enzimática!con!las! mismas! enzimas,! (Figura! 2),! para! generar! los! extremos! cohesivos! que! permitieran! la!construcción!del!vector!de!expresión!con!el!gen!de!interés.!!!

!Figura! 2.! Digestión! enzimática! para! PhyA! y! para! pGAPZ!FA.! A:! Separación! del! plásmido! portador!(pUC57)!del!gen!de!interés!PhyA!por!las!enzimas!de!restricción!EcoRI!y!NotI.!B:!Corte!del!plásmido!de!expresión!pGAPZ!FA$con!las!enzimas!de!restricción!EcoRI!y!NotI.!!Después!de!obtener!los!fragmentos!de!ADN!digeridos!con!las!enzimas!de!restricción,!se!ligó!el!plásmido!pGAPZ!FA! con! el! gen! (PhyA)! en! los! sitios! específicos! (Figura! 3).! Por!medio! de! la!enzima!ligasa!T4,!con!lo!que!se!logró!la!ligación!o!unión!del!fragmento!obteniéndose!el!vector!de!expresión!pGAPZ!FA/PhyA.!!

A

B

! 31!

!

!Figura!3.!Fragmentos!de!ADN!unidos!por!ligasa!T4.!Los!fragmentos!de!ADN!los!cuales!fueron!cortados!por! las! enzimas! de! restricción,! por! medio! de! la! enzima! ligasa! T4! se! logró! la! unión! para! así! obtener!pGAPZ!FA/PhyA$(Reece!et$al.,!2011).!!Se! obtuvo! el! vector! de! expresión! con! el! gen! específico! (PhyA)! para! ser! replicado! en!E.$ coli!(numeral!6.2)!y!obtener!mayor!concentración!de!ADN.!El!constructo!extraído,!se!linearizó!con!la!enzima!de! restricción!AvrII.!Posteriormente,! se!prepararon! las!células!competentes!de!Pichia$pastoris!y!se!transformaron!con!el!constructo!pGAPZ!FA/PhyA!(numeral!6.5)!linearizado,!para!finalmente,! seleccionar! y! realizar! aislamientos! de! las! colonias! transformantes! con! el! fin! de!realizar!el!“screening”!de!los!clones!transformantes!y!seleccionar!el!clon!con!la!mayor!actividad!3Bfitasa!A!recombinante.!!Curva! patrón! para! cuantificación! de! fósforo! inorgánico! y! curva! patrón! para!cuantificación!de!azucares!reductores.!!!Para! realizar! la! curva! patrón! de! fósforo! inorgánico! se! siguió! la! metodología! propuesta! por!Heinonen!and!Lahti!(1981)!y!Qvirist!et$al.,!(2015).!Las!determinaciones!de!la!actividad!fitasa!se!basaron! en! el! análisis! del! fósforo! total! liberado! (Pi),! pero! la! actividad! fitasa! representa! el!producto! liberado! en! función! del! tiempo! a! partir! de! ácido! fítico! (IP6).! Qvirist! et$ al.,! (2015)!evaluaron! diferentes! tiempos! de! incubación! de! la! reacción! enzimática,! evaluando! 15! y! 30!minutos!de!incubación,!determinando!que!el!tiempo!en!que!se!obtenía!la!mayor!actividad!fitasa!era! a! los! 15! min! en! el! ensayo! enzimático.! Adicionalmente,! evaluaron! varios! métodos! de!cuantificación!de!la!actividad!enzimática,!algunos!basados!en!el!producto!liberado!(Pi),!y!otros!en! la!cantidad!de!sustrato!remanenteq!por! lo!que!enfatizan! la! importancia!de!definir!el! tipo!de!actividad! evaluada! y! el! método! usado,! mostrando! que! la! actividad! fitasa! en! algunos! casos!puede!producir!resultados!falsos!positivos!y/o!sobreestimaciones.!El!método!de!Heinonen!and!Lahti!(1981)!usado!en!el!presente!trabajo!y!descrito!en!el!numeral!6.7,! también! fue! evaluado! en! los! estudios! realizados! por! Qvirist! et$ al.,! (2015),! donde!encontraron! un! elevado! coeficiente! de! variación! para! varias! de! las! muestras! analizadas,!

! 32!

producto! incluso,! de! la! composición! del! medio! de! cultivo,! y! el! fósforo! presente! en! ellos.!Adicionalmente,!mencionan! la!posibilidad!de! formación!de!precipitados!en!algunas!muestrasq!por! lo! que! en! dicho! trabajo! se! hizo! necesario! incluir! una! etapa! de! centrifugación! antes! del!análisis!espectrofotométrico,!lo!que!hizo!que!el!método!fuera!más!laborioso.!!!En!la!Figura!4!A!y!B,!se!presentan!las!dos!curvas!patrón,!para!las!diferentes!concentraciones!de!KH2PO4!evaluadas!que!permiten!determinar! la!concentración! (µM)!de! fósforo,! cumpliendo!con!una! linealidad!mayor!o! igual!de!0.9000!(Figura!4!A,!R2=!0.99584!y!en! la!Figura!4!B,!R2=!0.99922).!!!!

!

!!

!

!!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Concentración+(uM)

0 2 4 6 8 10 12

Absorbancia+355nm

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Coefficients:b=5 60,0326m=5 0,2148545455r5²5 0,9958448145

Concentración+(uM)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Absorbancia+355nm

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

Coefficients:b=4 6,6666666667e64m=4 0,1962424242r4²4 0,9992215623

Glucosa((gL,1)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Abs(540nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Coefficients:b=5 60,0185352052m=5 0,5853952484r5²5 0,9963277504

A!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!B!!!!!!!!!!!!!!!!!

C!!

! 33!

Figura!4.!Curvas!patrón!para!determinar!el!fósforo!inorgánico!libre!y!para!cuantificar!la!concentración!de!azucares! reductores.!A:! Curva! patrón! de! concentraciones! altas! para! determinar! el! fósforo! inorgánico!libre!a!355!nm,!B:!Curva!patrón!de!concentraciones!bajas!para!determinar!el! fósforo! inorgánico! libre!a!355! nm,! C:! Curva! patrón! para! cuantificar! la! concentración! de! azúcares! reductores! (glucosa)! por! la!técnica!de!DNS!a!540!nm.!!!Como! se!muestra! en! la! Figura! 4! A,! las! concentraciones! de! KH2PO4! que! se! usaron! para! el!rango!de!concentraciones!altas!fueron!de!1!a!10!µM.!De!este!modo,!la!mínima!absorbancia!a!355! nm! para! concentraciones! altas! fue! de! 0.194! y! la! máxima! de! 2.171.! Por! otro! lado,! las!concentraciones!que!se!usaron!para!el!rango!de!bajas!fueron!de!0.1!a!1!µM,!donde!la!mínima!absorbancia! a! 355! nm! para! las! concentraciones! bajas! fue! de! 0.019! y! la! máxima! de! 0.198!(Figura!4!B).!Para!la!actividad!fitasa,!basada!en!el!análisis!de!Pi!liberado!a!partir!del!fitato,!una!unidad!enzimática!(U),!se!define!como!la!cantidad!de!enzima!requerida!para!liberar!1!µM!de!Pi!del!ensayo!enzimático!por!minuto!(i.e.!fósforo!liberado!de!todos!los!inositol!fosfato!presentes).!!Para! determinar! la! concentración! de! azucares! reductores! gLB1! se! realizó! una! curva! patrón!siguiendo! la! técnica! del! ácido! 3,5Bdinitrosalicilico! (DNS),! (Miller! 1959),! (Figura! 4C),! donde! la!mínima!absorbancia!a!540!nm!fue!de!0.012!y!la!máxima!de!1.145!con!un!R2=!0.9969.!!Screening*preliminar!para!la!selección!de!los!clones!con!mayor!activida!fitasa.!!Se!seleccionaron!y!aislaron!las!colonias!transformantes!que!aparecieron!antes!de!las!72!horas!de! incubación!en!agar!YPD+Zeocina®.!Luego!de! la! transformación!se!aislaron!cinco!colonias!recombinantes,!las!cuáles!se!purificaron!y!posteriormente!se!crecieron!en!matraces!erlenmeyer!con!10!mL!de!caldo!YPD!para! realizar!pruebas!preliminares!de!actividad! fitasa,!con!el! fin!de!realizar! un! screening$ previo! antes! de! proceder! a! realizar! las! curvas! de! crecimiento! con! los!clones!seleccionados!(Tabla!2).!!Tabla!2.!Screening!de!los!clones!con!mayor!producción!de!fósforo!inorgánico!liberado!(determinación!indirecta!de!la!Actividad!Fitasa)!a!partir!del!ácido!fítico.!!!

Enzima!(Muestra+Ácido'fítico+Buffer)!

!Absorbancia!355nm!

Control!(Muestra+Buffer)!

!Absorbancia!355nm!

Blanco! 0.000! Blanco! 0.000!Clon!1! 0.017!! Clon!1! 0.000!Clon!2! 0.015! Clon!2! 0.000!Clon!3! 0.016! Clon!3! 0.000!Clon!4! 0.029!! Clon!4! 0.000!Clon!5! 0.015! Clon!5! 0.000!*En!negrilla,!se!resaltan!los!clones!seleccionados.!!

Como!se!observa!en!la!Tabla!2,!para!cada!clon!se!realizó!un!control!sin!ácido!fítico!(sustrato)!presente!para!determinar!si!la!cuantificación!de!fósforo!estaba!relacionada!con!la!presencia!de!la! fitasa!A!recombinante!y!por! lo! tanto,!del! fósforo! liberado!a!partir!de! la!acción!de! la!enzima!

! 34!

sobre! el! ácido! fítico.! Se! seleccionaron! el! clon! 1! y! el! clon! 4,! para! continuar! con! los! estudios!preliminares!de!curvas!de!crecimiento.!!!!Estudios!preliminares!de!expresión!de!la!31PhyA!recombinante!en*Pichia*pastoris!!Para! las!curvas!de!crecimiento!se!usó!un!control! (Pichia$pastoris$XB33!sin!el!gen!3FPhyA),!el!clon!1!y!el!clon!4!(3FPhyA),!cada!uno!por!triplicado!(Figura!5).!!!

!!

Figura!5.! Inoculación!por! triplicado.!Esquema!del!montaje!práctico!para! las! curvas!de! crecimiento!del!control$Pichia$pastoris!XB33!sin!modificar,!el!clon!1!y!el!clon!4!de!la!3FPhyA.!!Con!respecto!a!las!curvas!de!crecimiento!obtenidas!para!el!control,!en!la!Figura!6!A!se!observa!un!aumento!de! la!biomasa!hasta! la!hora!96!donde! la!máxima!producción! fue!de!14.970!gLB1,!por!otro!lado,!para!la!glucosa!residual!en!el!medio!de!cultivo,!a!la!hora!24!se!obtuvo!un!valor!de!1.99! gLB1,! valor! que! se!mantuvo! hasta! finalizar! el! cultivo! en! la! hora! 204.! Para! las! proteínas!totales! presentes! al! inicio! del! cultivo! (hora! 0)! se! obtuvo! un! valor! 33.64! mgmLB1,! y! se!mantuvieron!relativamente!constantes!a!lo!largo!del!proceso!con!una!desviación!estándar!entre!0.2! y! 0.4,! observándose!un!aumento!en! las!horas!48,! 72! y! 96! llegando!al! valor!más!alto! de!34.76!mgmLB1.!Pichia$pastoris!XB33!(sin!el!gen!3BPhyA)!entra!a!su!fase!estacionaria!después!de!la! hora! 96,! fase! en! la! cual! la! tasa! de! crecimiento! disminuyó! como! consecuencia! del!agotamiento!de!la!glucosa!presente!en!el!medio!de!cultivo.!!!

!

! 35!

!!Figura!6.!Curva!de!crecimiento!del!control!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,! producción! de! proteínas! extracelulares! totales! mg! mLB1! y! glucosa! residual! g! LB1.! A:! Curva! de!crecimiento!del!control!Pichia$pastoris!XB33!(ausencia!del!gen!3BPhyA)!que!abarcá!desde!la!hora!0!hasta!la!204.!B:!Ampliación!de! la!curva!de!crecimiento!del! control!Pichia$pastoris!XB33! (ausencia!del!gen!3BPhyA)!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!24.!C:!Fase!de!crecimiento!exponencial!de!la!cepa!control!(Pichia$pastoris!XB33!sin!el!gen!3BPhyA)!donde!se!muestra!que! la!cinética!de!crecimiento!es!una! reacción!de!orden!0.!!!La!Figura!6!B,!muestra!una!ampliación!de!la!cinética!del!cultivo!entre!las!horas!0!y!24!la!cual!permite!observar!mejor!los!valores!obtenidos!en!cada!hora!durante!las!primeras!12!horas!y!de!este! modo! apreciar! la! tendencia! en! cada! variable! presente! (Biomasa! gLB1,! Glucosa! gLB1! y!proteínas!totales!extracelulares!mgmLB1),!para!de!esta!forma,!evaluar!la!cinética!de!crecimiento!de! Pichia$ pastoris! XB33! (control)! con! mayor! exactitud.! La! Figura! 6! C,! muestra! la! fase!exponencial!del!control,!la!cual!se!extendió!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!96,!hora!en!la!que!se!obtuvo!la!mayor!producción!de!biomasa!con!una!productividad!de!0.1479!gLB1!hB1,!cumpliendo!con!una!cinética!de!crecimiento!de!orden!0!(Tabla!3).!!Por!otra!parte,!en!la!Figura!7!A,!(clon!1),$se!observa!el!aumento!de!la!biomasa!hasta!la!hora!96!donde!su!máxima!producción!en!gLB1!fue!de!15.1686.!La!glucosa!residual!a!la!hora!24!fue!de!2!

Control

Tiempo'(h)

0 50 100 150 200 250

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Glucosa'(gL01 )

0

5

10

15

20

25

Prot.'Ext.'(mg'mL01 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

Biomasa5(gL91)

Glucosa5(gL91)

Prot.5Ext5(mg5mL91)

Tiempo'(h)

0 5 10 15 20 25

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Glucosa'(gL01 )

0

5

10

15

20

25

Prot.'Ext.'(mg'mL01 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

Tiempo'(h)

0 20 40 60 80 100 120

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18A

C

B

Coefficients:b=5 1,7504368843m=5 0,1629760586r5²5 0,9149590711

! 36!

gLB1,!valor!que!se!mantuvo!constante!hasta!finalizar!el!cultivo.!Para!las!proteínas!extracelulares!totales! presentes! al! inicio! del! cultivo! (hora! 0)! se! obtuvo! un! valor! de! 33.611! mgmLB1,! y! se!mantuvieron!relativamente!constantes!a!lo!largo!del!proceso!con!una!desviación!estándar!entre!0.1! y! 0.3,! en! las!horas!48,! 72,! 96! y! 204!aumenta! la! producción!de! las!proteínas! llegando!al!valor! más! alto! de! 34,650! mgmLB1.! Con! respecto! a! la! actividad! fitasa,! en! la! Figura! 7! B! se!observa! cómo! desde! la! hora! 0! (14.596! mUmLB1)! hasta! la! hora! 8! (8.462! mUmLB1)! hubo! una!disminución!constante!en!los!valores!obtenidos,!producto!posiblemente!de!la!interferencia!que!se!puede!generar!en!la!medición!por!la!variación!en!el!fósforo!presente!en!el!medio!de!cultivo.!Por! otro! lado,! en! la! hora! 10! se! observó! un! aumento! a! 15.865! mUmLB1! con! una! actividad!específica!de!0.48!mUmgB1!valores!mayores!a!los!iniciales!(hora!0),!doblando!el!valor!de!la!hora!8!alrededor!de!50%,!lo!que!sugiere!que!los!valores!reales!de!actividad!fitasa!se!encuentran!en!las!horas!10,!12!y!24.!Finalmente,!después!de!la!hora!24!se!observó!un!descenso!constante!de!la!actividad!fitasa!hasta!llegar!a!0.!!

!!Figura!7.!Curva!de!crecimiento!del!clon!1!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,!producción!de!proteínas!extracelulares!totales!mgmLB1,!consumo!de!glucosa!gLB1,!actividad!fitasa!mUmLB1!y!actividad!específica!mUmgB1.!A:!Curva!de!crecimiento!del! clon!1! (Pichia$pastoris!XB33!con!el!gen!3BPhyA)! que! abarcá! desde! la! hora! 0! hasta! la! 204.!B:! Ampliación! de! la! curva! de! crecimiento! del! clon! 1!

Clon%1

Tiempo'(h)

0 50 100 150 200 250

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Glucosa'(gL01 )

0

5

10

15

20

25

Prot.'Ext.'(mg'mL01 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

'Act'Fitasa'(m

U'mL01 )

/5

0

5

10

15

20

Esp'Act'(mUmg01

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Biomasa%(gL/1)

Glucosa%(gL/1)

Prot.%Ext%(mg%mL/1)

%Act%Fitasa%(mU%mL/1)

Esp%Act%(mUmg/1)

Tiempo%(h)

0 5 10 15 20 25

Biomasa%(gL/1 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18Glucosa%(gL/1 )

0

5

10

15

20

25

Prot.%Ext.%(mg%mL/1 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

%Act%Fitasa%(mU%mL/1 )

/5

0

5

10

15

20

Esp%Act%(mUmg/1 )

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Tiempo'(h)

0 20 40 60 80 100 120

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18A

B

C

Coefficients:b=% 1,8244877074m=% 0,1600210475r%²% 0,9310649212

! 37!

(Pichia$ pastoris! XB33! con! gen! 3BPhyA)! desde! la! hora! 0! hasta! la! hora! 24.! C:! Fase! de! crecimiento!exponencial! del! clon!1! (Pichia$ pastoris!XB33! con!el! gen!3BPhyA)! donde! se!muestra! que! la! cinética! de!crecimiento!es!una!reacción!de!orden!0.!!La!Figura!7!C,!muestra!la!fase!exponencial!del!clon!1,!que!se!extendió!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!96,!hora!en!la!cual!se!obtuvo!la!mayor!producción!de!biomasa!con!una!productividad!de!0.1505!gLB1!hB1,!cumpliendo!con!una!cinética!de!crecimiento!de!orden!0,!con!un!R2!de!0.9310!(Tabla!3).!!!!En! la!Figura!8!A,! (clon!4),! se!observa!el! aumento!de! la! biomasa!hasta! la! hora!72!donde! su!máxima!producción!en!gLB1!fue!de!14.91!alcanzadas!24!h!antes!que!el!control!y!el!clon!1.!Para!la!glucosa! residual! se!obtuvieron!2!gLB1! a! la!hora!24,! valor!que!se!mantuvo!hasta! finalizar!el!cultivo.!Las!proteínas!totales!extracelulares!presentes!al!inicio!del!cultivo!(hora!0)!con!un!valor!de! 33.682!mgmLB1,! se!mantuvieron! relativamente! constantes! a! lo! largo! del! proceso! con! una!desviación!estándar!entre!0.1!y!0.3,!observándose!un!aumento!en! las!horas!48,!72,!96!y!204!llegando! al! valor! más! alto! de! 34.740! mgmLB1.! Para! la! actividad! fitasa,! en! la! Figura! 8! B! se!observa! cómo! desde! la! hora! 0! (19.88! mUmLB1),! hasta! la! hora! 8! (13.86! mUmLB1! )! hay! una!disminución!en!los!valores,!posiblemente!como!consecuencia!de!la!variación!en!la!cantidad!de!fósforo!presente!en!el!medio,!consumido!probablemente!por! la! levadura.!Por!otro! lado,!en! la!hora! 10! la! actividad! fitasa! aumentó! a! 26.87! mUmLB1! con! una! actividad! específica! de! 0.81!mUmgB1,!demostrando!un!aumento!del!50%!de!la!actividad!con!respecto!a!la!hora!8,!señalando!que!posiblemente,!los!valores!reales!de!actividad!fitasa!en!el!clon!4!también!se!encuentran!en!las!horas!10,!12!y!24.!Además,!en!este!clon!no!sólo!se!observó!una!disminución!constante!de!actividad!luego!de!la!hora!24!como!en!el!clon!1,!sino!que!también!en!la!hora!72!se!observó!un!último!pico!de!actividad!fitasa!de!13.75!mUmLB1!con!una!actividad!específica!de!0.40!mUmgB1,!destacando!a!este!clon!en!comparación!con!el!clon!1.!!!

! 38!

!Figura!8.!Curva!de!crecimiento!del!clon!4!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!204,!producción!de!biomasa!gLB1,!producción!de!proteínas!extracelulares!totales!mgmLB1,!consumo!de!glucosa!gLB1,!actividad!fitasa!mUmLB1!y!actividad!específica!mUmgB1.!A:!Curva!de!crecimiento!del! clon!4! (Pichia$pastoris!XB33!con!el!gen!3BPhyA)! que! abarcá! desde! la! hora! 0! hasta! la! 204.!B:! Ampliación! de! la! curva! de! crecimiento! del! clon! 4!(Pichia$ pastoris! XB33! con! el! gen! 3BPhyA)! desde! la! hora! 0! hasta! la! hora! 24.!C:! Face! de! crecimiento!exponencial! del! clon!4! (Pichia$ pastoris!XB33! con!el! gen!3BPhyA)! donde! se!muestra! que! la! cinética! de!crecimiento!es!una!reacción!de!orden!0.!!!La!Figura!8!C,!muestra!la!fase!exponencial!del!clon!4,!que!se!extendió!desde!la!hora!0!hasta!la!hora!72,!hora!en!la!cual!se!obtuvo!la!mayor!producción!de!biomasa!con!una!productividad!de!0.1969! gLB1! hB1,! cumpliendo! con! una! cinética! de! crecimiento! de! orden! 0,! con! un!R2=! 0.9511!(Tabla!3).!!!Con!respecto!a!los!resultados!obtenidos!en!la!producción!de!biomasa!en!gLB1!para!cada!hora,!se!pudo!observar!el!incremento!en!la!masa!microbiana!para!los!tres!experimentos!(control,!clon!1!y!clon!4)!respectivamente,!como!se!observa!en!las!Figuras!6,!7!y!8.!!En! la!Tabla!3,! se!presentan!varios!parámetros!cinéticos!que!permiten!determinar!cuál!de! los!dos!clones!tuvo!una!mejor!eficiencia!en!cuanto!al!crecimiento!(K0!y!td)!y!a!la!productividad!tanto!

Clon%4

Tiempo'(h)

0 50 100 150 200 250

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Glucosa'(gL01 )

0

5

10

15

20

25Prot.'Ext.'(mg'mL01 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

'Act'Fitasa'(m

U'mL01 )

0

10

20

30

40

Esp'Act'(m

Umg01

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Biomasa%(gL71)

Glucosa%(gL71)

Prot.%Ext%(mg%mL71)

Act%Fitasa%(mU%mL71)

Esp%Act%(mUmg71)

Tiempo'(h)

0 5 10 15 20 25

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Glucosa'(gL01 )

0

5

10

15

20

25

Prot.'Ext.'(mg'mL01 )

32,0

32,5

33,0

33,5

34,0

34,5

35,0

'Act'Fitasa'mU'mL01

0

10

20

30

40

Esp'Act'(mUmg01 )

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tiempo'(h)

0 20 40 60 80

Biomasa'(gL01 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18A

B

C

Coefficients:b=% 1,2010008639m=% 0,2089189767r%²% 0,9511181163

! 39!

enzimática!como!de!la!biomasa,!dichos!valores!permiten!una!comparación!entre!los!clones,!y!el!contról.!!Tabla!3.!Párametros!cinéticos!de!orden!cero!y!orden!uno!para!la!cepa!control!Pichia$pastoris!XB33!(sin!el!gen!3BPhyA),!el!clon!1!y!el!clon!4!(presencia!del!gen!3BPhyA).$!* Orden!cero! Orden!uno!Parámetros!cinéticos!

K0!(h11)! td!(h)! µ(x)!(h11)! td!(h)!

Control* 0.163! 4.741! No!cumple!! No!cumple!Clon!1! 0.160! 4.530! No!cumple! No!cumple!Clon!4! 0.209! 3.502! No!cumple! No!cumple!

!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Otros!parámetros!

! P(x)!(gL11h11)! P(enzima)!(mUL11h11)! Y(x/s)!(g(x)!g(s)11)!Control!! 0.1479! BB! 0.736!Clon!1! 0.1505! 0.1269! 0.741!Clon!4! 0.1969! 0.699! 0.727!

!!Con! respecto!a! la!Tabla!3,! se! logró!determinar! la! fase!exponencial! y!evaluar! los!párametros!cinéticos!correspondientes!para!orden!cero!(K0!y!td)!y!orden!uno!(µ(x)!y!td)!en!el!control!Pichia$pastoris! XB33! (sin! el! gen! 3BPhyA),! el! clon! 1! y! el! clon! 4! (presencia! del! gen! 3BPhyA)!respectivamente,$en!donde!se!puede!asumir!que!factores!ambientales!como!la!temperatura,!el!oxígeno!y!el!pH!promovieron!el! crecimiento!microbiano,! favoreciendo!una!mayor!cantidad!de!células!en!el!medio!(Figuras!6!C,!7!C!y!8!C).!Dando!continuidad!a!lo!anterior,!la!pendiente!(m)!en!la!fórmula!y!=!mx!+!b,!es!equivalente!a!la!velocidad!volumétrica!de!crecimiento!(K0)!(hB1)!que!se!refiere!al!cambio!de!número!de!células!por!unidad!de!tiempo!y!el!tiempo!de!duplicación!(h),!haciendo! referencia! al! tiempo! requerido! en! el! cual! un! microorganismo! crece! de! forma!exponencial! y! tiene! la! capacidad! de! doblar! su! población,! fase! en! la! que! los! nutrientes! se!encuentran! en! total! disponibilidad! para! su! consumo! y! por! consiguiente,! desarrollo! del!microorganismo.!Como!se!observa!en!la!Tabla!3,!el!clon!4!(3BPhyA)!se!destaca!del!clon!1!(3BPhyA),!ya!que!la!velocidad!volumétrica!y!el!tiempo!de!duplicación!fueron!mejores!,!es!decir!que!creció! de! forma!más! rápida! en! un!menor! tiempo! (K0=! 0.209! hB1! y! td=! 3.502! h),! además! es!importante!destacar!que!la!productividad!de!la!enzima!del!clon!4!(0.699!mULB1hB1)!resultó!mayor!a!la!obtenida!en!el!clon!1!(0.1269!mULB1hB1).!!!Los! resultados! que! se! muestran! en! las! Figuras! 6,! 7! y! 8! incluyen! la! velocidad! volumétrica!(cinética!de!orden!cero),!y!se!observa!también! la!fase!exponencial!del!cultivo,! fase!de! interés!por!ser!la!fase!en!la!que!el!incremento!del!número!de!microorganismos!es!el!máximo,!y!durante!este!período!el!número!de!células!y!la!masa!celular!se!duplica.!El!tiempo!de!duplicación,!varía!entre! los!distintos!microorganismos,!por!ejemplo,!algunos!tienen!tiempos!de!duplicación!entre!1h!y!3h,!conociéndose!pocos!microorganismos!que!crezcan!muy!rápidamente!dividiéndose!en!menos!de!10!min,!otros,!tienen!tiempos!de!duplicación!de!varias!horas!o!incluso!días.!El!tiempo!de!duplicación!es!útil!como!indicador!del!estado!fisiológico!de!una!población!celular,!y!es!usado!con! frecuencia! para! comprobar! el! efecto! negativo! o! positivo! de! un! determinado! tratamiento!sobre! un! cultivo! microbiano! (Madigan! et$ al.,! 1997).! Este! tiempo! de! duplicación! está!

! 40!

directamente! relacionado! con! la! velocidad! de! crecimiento! exponencial,! definido! como! la!pendiente!de!la!curva!de!crecimiento!en!la!fase!de!crecimiento!exponencial!(DelignetteBMuller!1998).!!Pichia$pastoris!se!ha!convertido!en!uno!de!los!microorganismos!principales!para!la!producción!de! proteínas! recombinantes! en! los! últimos! años.! Es! una! levadura! meliotrófica,! pues! puede!utilizar!el!metanol!como!única!fuente!de!carbono!y!energía!(Heyland!et$al.,!2010).!Sin!embargo,!en!este!trabajo!la!fuente!de!carbono!fue!glucosa!ya!que!el!sistema!de!expresión!se!encuentra!regulado!bajo! el! promotor!GAP.!Notablemente,! algunas! publicaciones! indican!que!el! uso! del!promotor! de! la! gliceraldehídoB3Bfosfato! deshidrogenasa! (E.C.! 1.2.1.12),! (GAP),! permite! la!producción!de!la!proteína!de!interes!con!valores!incluso!mayores!utilizando!fuentes!de!carbono!como!el!glicerol!o! la!glucosa,!en!comparación!con! los!valores!que!se!obtienen!con!el!uso!del!promotor! AOX,! donde! es! necesario! el! uso! de! fuentes! de! carbono! tóxicas! para! los! seres!humanos! y! animales,! además! de! inflamables! como! el! metanol! (Mattanovich! et$ al.,! 2009q!Heyland!et$al.,!2010).!!!Para!la!producción!de!proteínas!recombinantes!en!Pichia$pastoris,!se!implementan!parámetros!de!bioprocesos!tales!como!la!temperatura,!el!suministro!de!oxígeno,!la!elección!del!sustrato!y!la! velocidad! de! crecimiento.! En! las! (Figuras! 6,! 7! y! 8),! se! observa! el! comportamiento! de! la!glucosa! residual! en! función! del! tiempo,! en! donde! a! medida! que! el! microorganismo! va!consumiéndola,! produce! una! cantidad! de! biomasa!máxima! de! 15! gLB1.! La! concentración! de!glucosa! inicial!en!el!medio!de!cultivo! fue!de!20!gLB1!y!se!consumió!casi!completamente!en! la!hora!24.!Por!otra!parte,! la!producción!de!biomasa!en! relación!al! consumo!de!glucosa!en! los!tres!experimentos! fue!parcialmente!asociada,!ya!que!a!pesar!de!que! la!glucosa!se!consumió!casi!en!su!totalidad,!el!aumento!de!la!biomasa!se!siguió!generando!y!esto!se!puede!dar!debido!a!que!en!el!medio!de!cultivo!se!encuentran!otros!nutrientes!como!la!peptona!y!el!extracto!de!levadura!que!pueden!favorecer!e!impulsar!el!crecimiento!de!las!células!presentes!hasta!llegar!a!la!fase!estacionaria,!fase!donde!la!tasa!de!crecimiento!disminuye!y!los!nutrientes!se!agotan.!!!Con!respecto!a!la!producción!de!proteínas!totales!extracelulares,!en!el!control!y!en!los!clones!1!y! 4,! se! observa! en! las! Figuras! 6,! 7! y! 8! que! el! comportamiento! fue! similar! y! se! mantuvo!relativamente!constante! la!concentración!en!mgmLB1!a! lo! largo!del!cultivo.!Por!otro! lado,!en!la!hora! 48,! las! proteínas! extracelulares! aumentaron! ligeramente,! y! esto! pudo! deberse! a! que!algunas!de!las!células!comenzaron!a!liberar!su!contenido!celular.!Además,!para!los!clones!1!y!4!el! incremento!en!cada!hora!desde! la!hora!10,!se!puede! relacionar!con!que!a!partir!de!ese!momento!se!obtuvieron! los!valores!reales!de!actividad! fitasa,!por! lo!que!puede!asumirse!que!Pichia$pastoris!secretó! la!proteína!clonada,! lo!que!significa!en! términos!prácticos!un!paso!de!preBpurificación,!en!comparación!con! los!casos!en!donde!es!necesaria! la! ruptura!celular!para!liberar! la!proteína!de! interés.!Adicionalmente,! es! importante!mencionar!que!esta! levadura!no!produce! endotoxinas! por! lo! que! podría! considerarse! un! microorganismo! seguro! (PoutouBPiñales!et$al.,!2005),!y!además,!tiene!la!característica!de!presentar!una!alta!tasa!de!secreción!protéica! (Labarre! et$ al.,! 2007),! sugiriendo! que! puede! ser! una! alternativa! viable! para! la!expresión! de! fitasas! que! puedan! usarse! en! la! industria! de! alimentos! para! animales!monogástricos,!disminuyendo! la!característica!antinutriente!de!dichos!alimentos,! favoreciendo!

! 41!

la!disponibilidad!de!fósforo!en!el!tracto!digestivo,!y!disminuyendo!la!cantidad!de!fósforo!liberado!al!ambiente!como!producto!de!las!excretas!de!los!animales.!!En!los!componentes!del!medio!de!cultivo!YPD,!específicamente!en!el!extracto!de!levadura!y!la!peptona,! el! fósforo! se! puede! encontrar! en! varias! formas,! donde! al! momento! de! evalúar! la!actividad! fitasa,! sea! compleja! cuando! se! usan! técnicas! colorimétricas! como! la! descrita! por!Heinonen! and! Lahti! 1981,! y! usada! en! el! presente! trabajo.! Por! lo! tanto,! la! evaluación! de! la!actividad!fitasa!puede!verse!afectada!por!varias!situaciones:!1)!Los!productos!de!la!reacción!de!la! actividad! fitasa! (IP5,! IP4,! IP3,! hacia! abajo),! también! pueden! ser! sustrato! de! la! misma!enzima,! por! lo! que! se! encuentrarían! más! sustratos! competidores! con! el! IP6,! 2)! Las! fitasas!tienden! a! ser! amplias! en! la! especificidad! por! el! sustrato,! lo! que! significaría! que! algunos!extractos!podrían!contener!otros!compuestos!orgánicos!con!fósforo!degradables!por!las!fitasas,!y!3)!El! IP6!comercial!utilizado!en! la!mayoria!de! los!ensayos!contiene! impurezas!en! forma!de!IP5,! IP4,! o! inferiores.! Carlsson! et$ al.,! (2001)! encontraron! hasta! 12%! de! IP5,! lo! que! podría!conducir! a! resultados! falsos! positivos,! o! incluso! falsos! negativos! de! la! producción! de! Pi!catalizada! por! inositol! fosfatasas! que! incluso! no! sean! fitasas,! y! de! hecho! podría! no! implicar!degradación!alguna!de!IP6.!!En!el!presente! trabajo,!se!usó!el!buffer!acetato!de!sodio!200!mM!a!pH!5.0!con!el!ácido! fítico!como!sustrato,!en!donde!el! fósforo! liberado!ocurrió!como!producto!de! la! fitasa!presente!en!el!medio! de! cultivo.! Los! autores! Olstorpe! et$ al.,! (2009)! siguieron! la! misma! metodología! de!Heinonen!and!Lahti!(1981)!bajo!las!mismas!condiciones!del!presente!trabajo,!donde!detuvieron!la! incubación! en! los! tiempos! de! 5,! 10,! 15,! 30! y! 60!min,! encontrando! que! el! fósforo! liberado!aumentó! en! el! tiempo! 15! min,! tiempo! que! soporta! también,! el! tiempo! seleccionado! en! el!presente!trabajo!para!realizar! la!actividad!enzimática.!Adicionalmente,!el!pH!al!cual!se! llevó!a!cabo!la!reacción!enzimática!fue!de!5.0,!con!una!temperatura!de!incubación!de!40!ºC!durante!15!minutos.!!!En! la! Tabla! 4,! se! presentan! varios! resultados! de! actividad! fitasa! obtenidos! en! trabajos! de!investigación! realizados! por! otros! autores.! Algunos! de! los! resultados! que! se! muestran! son!comparables! en! términos! de! tiempo! de! cultivo,! temperatura! de! incubación,! pH,! fuente! de!CBmedio!de!cultivo,!y!buffer!de!reacción.!En!dichos!trabajos,!la!finalidad!fue!evalúar!la!producción!y!la!actividad!fitasa,!y!se!muestran!resultados!obtenidos!en!microorganismos!recombinantes!o!que!producen!de!forma!nativa!alguna!fitasa.!En!algunos!de!los!experimentos,!se!usa!también!a!Pichia$pastoris!como!hospedero,!debido!a!que!esta!levadura!ofrece!altos!niveles!de!producción!de! proteínas! recombinantes! (PoutouBPiñales! et$ al.,! 2010).! Según! Wu! et$ al.,! (2003),! la!gliceraldehídoB3Bfosfato!deshidrogenasa!(GAP)!es!una!enzima!clave!en!el!ciclo!de!la!glúcolisis!ya! que! proporciona! una! fuerte! expresión! constitutiva! de! la! glucosa! a! un! nivel! comparable! al!observado! con! el! promotor! alcohol! oxidasa! (AOX),! pGAP! tiene! la! ventaja! de! no! requerir!metanol!para!la!inducción,!el!cuál!elimina!los!riesgos!y!disminuye!los!costos!relacionados!con!el!almacenamiento!y!la!entrega!de!metanol.!!!Durante! los! últimos! años,! se! han! utilizado! promotores! para! la! expresión! de! proteínas!heterólogas!usando!como!hospedero!a!P.$pastoris,$ regularmente!se!usan! la!AOX1!y!GAP,!el!

! 42!

promotor!AOX!controla!la!expresión!de!la!alcohol!oxidasa!en!la!vía!de!la!utilización!del!metanol!dentro!del!peroxisoma!de! la!célula,!el!cuál!es!un!promotor! regulado,!ya!que!es! reprimido!por!fuentes!de!carbono!como! la!glucosa,!glicerol!y!etanol,!y! fuertemente! inducido!por!el!metanol.!(Varnai!et$al.,!2014)!!En!la!Tabla!4,!Xiong!et$al.,!(2005),!Zhao!et$al.,!(2007)!y!Yamming!and!Xin!(1999),!utilizaron!el!mismo!promotor! (AOX1),! en! donde!primero! se!busca!producir! biomasa!en!presencia! de!una!fuente!de!carbono!como!glucosa!o!glicerol,!y!posterioriormente!se!induce!el!promotor!AOX1,!y!por! tanto! la! expresión! de! la! proteína! de! interés! con! la! adición! de! metanol! como! fuente! de!carbono.!!!Las! actividades! fitasa! obtenidas! por! estos! autores! superaron! la! actividad! obtenida! con! el!promotor!GAP!(este!trabajo)q!sin!embargo,!es! importante!mencionar!que!en!dichos!casos,! los!volúmenes! en! los! que! se! llevó! a! cabo! la! producción! de! la! enzima! fueron! mayores,! y!adicionalmente,!el!presente!estudio!constituye!una!aproximación!preliminar!a!la!producción!de!fitasa.!Por!lo!que,!a!futuro,!es!necesario!escalar!el!proceso,!y!mejorar!la!composición!del!medio!de! cultivo! en! función! de! mejorar! el! proceso! de! producción! de! la! PhyA! en! P.$ pastoris.!Adicionalmente,!producir!con!metanol!en!el!medio!de!cultivo,!una!enzima!que!va!a!ser!utilizada!en!alimentación!animal!tiene!el!riesgo!de!que!queden!trazas!de!metanol!y!se!genere!toxicidad!en!el!animal!a!menos!que!se!utilice!la!enzima!pura,!lo!que!incrementaría!considerablemente!los!costos!de!producción.!En!el!presente!trabajo,!la!producción!de!UmLB1!de!enzima!fue!baja,!pero!tiene!la!ventaja!de!haberse!usado!el!promotor!GAP,!implicando!que!luego!de!haber!escalado!y!mejorado! el! proceso! de! producción,! se! pueda! utilizar! incluso! el! sobrenadante! del! cultivo!concentrado!directamente!en!la!dieta!del!animal!sin!riesgo!de!toxicidadq!lo!que!indudablemente!sería! una! ventaja! y! una! alternativa! viable! pues! al! no! ser! indispensable! la! purificación! de! la!enzima!se!disminuirían!los!costos!de!producción!y,!por!lo!tanto,!el!precio!del!producto!final.!!!!Tabla!4.!Datos!comparables!entre!diferentes!estudios!para!evidenciar!la!actividad!fitasa!a!partir!de!cepas!de! Aspergillus! evidenciando! una! expresión! heteróloga! o! una! expresión! nativa.!!

! 43!

! !

Microorganismo+origen+

Microorganismo+expresión+

Expresión+ Medio+ Fuente+C+ pH+ T+ Tiempo+De+

reacción+

Buffer+ Actividad+ Observaciones+

Aspergillus*niger!SK&57!

(Xiong!et*al.,!2005).!

Pichia*pastoris*GS115*

Heteróloga!!!!!!!(PhyA&sh)!

!Promotor!AOX1!

1.BMGY(2!días)!!

2.BMMY(2!días)!

Glicerol!y!Metanol!

1.5!hasta!6.5!

Óptimo:!2.5!y!5.5!

20°C!hasta!80°C!Óptimo:!60°C!

2min!a!20min!

Glicina&HCl!(pH!1.5&2.5),!Citrato!de!sodio!(pH!

3.0&5.5),!Tris&HCl(pH!6.0!y!

6.5)!

865!UmL&1!!

Biorreactor!5L!

Después!de!60h!alimentan!con!metanol!para!

inducir!actividad.!

Aspergillus*niger*(Zhao!et*al.,!2007)!

Pichia*pastoris*GS115*

Heteróloga!(PhyA)!

!Promotor!AOX1!

1.BMGY(2!días)!!

2.BMMY(2!días)!

Glicerol!y!Metanol!

5.5! 55°C! 10!min! Glicina&HCl!(pH!1.0&2.5),!Acetato!de!sodio!(pH!

3.0&5.5),!Tris&HAc!(pH!6.0&6.5),!Tris&HCl!(pH!7.0&8.0)!

242!UmL&1!!!

100!ml!de!medio!

!

Usarón!T°!de!60°C!a!90°C!y!concluyerón!que!

la!fitasa!recombinante!es!más!termoestable!que!la!fitasa!comercial.!

Aspergillus!niger!7A&1!

(Neira!et*al.,!2017)!

&&! Nativa!(enzima!purificada!de!SSF)!

El!sustrato!usado!para!la!producción!de!fitasa!en!SSF,!es!una!mezcla!de!residuo!agroindustrial!triticale!más!una!mezcla!estéril!que!contiene:!NH4NO3,!dextrosa,!

lactosa,!Tween!80!y!KCl.!!

Dextrosa,!Lactosa!!

5.3! 56°C! 60!min! Acetato!de!sodio!

Total:!27.28!UmL&1!!

100!mL!de!medio!

Inhibición!de!la!actividad!fitasa!50%!por!Ca,!10%!por!Ni&K&Na,!

efecto!positivo!con!Mg&Mn&Cu&Cd&Ba!

(efecto!estimulador)!

Aspergillus*niger*(Yanming!and!Xin!

1999)!

Pichia*pastoris**X&33!!*

Heteróloga!!!

Promotor!AOX1!

1.BMGY(20!h)!!

2.BMMY!(4!días!)!

Glicerol!y!Metanol!

5.5! 37°C! 15!min! Glicina&HCl!(pH!1.5,!2.5,3.5),!Citrato!de!sodio!(pH!4.5,5.5,6.5),!Tris&HCl!(pH!7.5,8,5)!!

64UmL&1!!

100!ml!de!medio!

Óptimo!pH!2.5!y!5.5!!!

Aspergillus*niger*(este!trabajo)!

Pichia*pastoris!!X&33!!

Heteróloga!!!

Promotor!GAP!!!

YPD! Glucosa! 5.0! 40°C! 15!min! Acetato!de!sodio!

Clon!1:!0.016!UmL&1!!!Clon!4:!

0.027!UmL&1!!!!

100!ml!de!medio!!!

Clon!4!obtuvo!más!alta!actividad!

fitasa!

! 44!

CONCLUSIÓNES**!Se!logró!la!expresión!del!gen!PhyA!de!Aspergillus-niger-en!Pichia-pastoris-X333.-Se!seleccionó-el!clon!1!con!una!actividad!fitasa!de!15.865!mUmL31!y!una!actividad!específica!de!0.48!mUmg31!a!la!10!h!de!cultivo!y!el!clon!4!con!una!actividad!fitasa!de!26.87!mUmL31!y!una!actividad!específica!de!0.81!mUmg31!a! la!10!h!de!cultivo,!destacándose!el!clon!4!con!50%!más!de!actividad!fitasa.!Los!parámetros!cinéticos!para!el!clon!1!fueron!K0=!0.160!h

31,!td=!4.53!h,!P(x)=!0.1505!gL31h31,!P(enzima)=!

0.1269!mUL31h31,!Y(x/s)=! 0.741!g(x)! g(s)31*y!para!el! clon!4! fueron!K0=!0.209!h

31,! td=!3.502!h,!P(x)=!0.1969!gL31h31,!P(enzima)=!0.699!mUL

31h31,!Y(x/s)=!0.727!g(x)!g(s)31.!En!ambos!clones!se!representó!la!

velocidad!volumétrica!creciendo!mas!rápido!y!en!menor!tiempo!el!clon!4,!además!de!tener!una!productividad! de! enzima!mayor.! Los! resultados! del! presente! trabajo! son! la! base! de! próximas!investigaciones!para!obtener!valores!superiores!con! respecto!a! la!actividad!enzimática,! la!cuál!generaría!un!impacto!en!la!industria!alimentaria!como!suplemento!eficaz!para!la!producción!y!el!crecimiento!de!animales!del!sector!porcícola!y!avícola,!reduciendo!los!fitatos!que!se!excretan,!lo!que!disminuiría!la!contaminación!a!nivel!ambiental.!!!!*RECOMENDACIONES**Se!recomienda!usar!medios!mínimos!para!tener!control!del!fósforo!presente,!en!donde!se!limite!su!cantidad!y!permita!mejorar!la!cuantificación!de!fósforo!libre!por!actividad!de!la!fitasa!producida!en!los!mejores!clones!(clon!1!y!clon!4).!Además,!se!recomienda!evaluar!dos!valores!de!pH!(2.5!y!5.5),!un!rango!de!temperatura!(50360!ºC)!y!tiempos!de! incubación!diferentes!(15!min!a!30!min)!que!permitan!mejorar!los!resultados!de!la!actividad!enzimática.!!**REFERENCIAS***!!Acosta! A,! Cárdenas!M.! Enzimas! en! la! alimentación! de! las! aves.! Fitasas,!Revista- Cubana- de-

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Arzuaga!SA,!Fernández!C,!Dalurzo!HC,!Vazquez!S.!Fósforo! total,! fósforo!orgánico!y! fosfatasa!ácida,! en! entisoles,! alfisoles! y! vertisoles! de! corrientes! con! diferentes! usos! agrícolas,!Universidad!nacional!del!nordeste,!Comunicaciones!científicas!y!tecnológicas!2005.!!!

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! 46!

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182,!2000.!*Costa! M,! Torres! M,! Magariños! H,! Reyes! A.! Producción! y! purificación! parcial! de! enzimas!

hidrolíticas! de! Aspergillus- ficuum! en! fermentación! sólida! sobre! residuos! agroindustriales,!Revista-Colombiana-de-Biotecnología,!XII(2):!1633175,!2010.!

!Cowieson!AJ,!Ravindran!V.!Effect! of! phytic! acid! and!microbial! phytase! on! the! flow! and! amino!

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