1984 schlissel virus-transformed pre-b cells show ordered activation but not inactivation of...

8/6/2019 1984 Schlissel Virus-Transformed Pre-B Cells Show Ordered Activation but Not Inactivation of Immunoglobulin Gene

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V i r u s - t r a n s f o r me d P r e - B C e l l s S h o w O r d e r e dA c t i v a t i o n b u t No t I n a c t i v a t i o n o f I mmu n o g l o b u l i nG e n e Re a r r a n g e me n t a n d T r a n s c r i p t i o nB y Ma r k S . S c h l i s s e l , L y n n M . C o r c o r a n , a n d Da v i d Ba l t i mo r e

F r o m t h e Wh i t e h e ad I n s t i t u t e , C a mb r i d g e , Ma s s a c h u s e t t s 0 2 1 4 2 , a n d T h e Ro c k e f e l l e rU n i v e r s i t y , N e w Y o r k , N e w Y o r k 1 0 0 2 1

S u mma r yV i r u s - t r a n s f o r me d p r e - B c e l l s u n d e r g o o r d e r e d i mmu n o g l o b u l i n ( I g ) g e n e r e a r r a n g eme n t s d u r i n gc u l t u r e . We d e v i s e d a s e r i e s o f h i g h l y s e n s i t i v e p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n a s s a y s f o r I g g e n er e a r r a n g e m e n t a n d u n r e a r r a n g e d I g g e n e s e g m e n t t r a n s c r i p t i o n t o s t u d y b o t h t h e p o s s i b l er e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e p r o c e s s e s i n c u l t u r e d p r e - B c e l l s a n d t h e r o l e p l a y e d b y h e a v y ( H )c h a i n ( , u ) p r o t e i n i n r e g u l a t i n g g e n e r e a r r a n g e m e n t . Ou r a n a l y s i s o f p r e - B c e l l c u l t u r e s r e p r e s e n t i n gv a r i o u s s t a g e s o f ma t u r i t y r e v e a l e d t h a t t r a n s c r i p t i o n o f e a c h g e r m l i n e I g l o c u s p r e c ed e s o r i sc o i n c i d e n t w i t h i t s r e a r r a n g e m e n t . Ce l l l i n e s c o n t a i n i n g o n e f u n c t i o n a l r e a r r a n g e d H c h a i n a l l e l e ,h o w e v e r , c o n t i n u e t o t r a n s c r i b e a n d t o r e a r r a n g e t h e a l l e l i c , u n r e a r r a n g e d H c h a i n l o c us . T h e s ec e l l l i n e s a p p e a r t o i n i t i a t e b u t n o t t e r mi n a t e r e a r r a n g e m e n t e v e n t s a n d t h e r e f o r e p r o v i d e i n f o r ma t i o na b o u t t h e r e q u i r e me n t s f o r a c t i v a t i n g r e a r r a n g e m e n t b u t n o t a b o u t a l l e l i c e x c l u s i o n me c h a n i s ms .

T h e m a t u r e c e l l s o f t h e b o d y a r i s e b y d i f f e r e n t i a t i o n f r o mi mma t u r e p r e c u r s o r s t h r o u g h ma n y s t a g e s t h a t t o g e t h e rf o r m a l i n e a g e . Ge n er a l l y , t h e s e s t a g e s a r e d i f f i c u l t t o d e f i n eb e c a u s e p u r e c e l l p o p u l a t i o n s r e p r e s e n t i n g i n d i v i d u a l s t a g e sc a n n o t b e p r e p a r e d . I n t h e B l y mp h o c y t e l i n e a g e , v i r a l l y t r a n s -f o r m e d t u mo r c e l l s o f i mma t u r e p h e n o t y p e h a v e p r o v i d e de x t r e me l y u s e f u l mo d e l s o f i n d i v i d u a l d e v e l o p me n t a l s t a g e s .T h e s e mo d e l s h a v e l i m i t a t i o n s , h o w e v e r . B e i n g t u mo r c e l l s ,t h e y mi g h t n o t r e p r e s e n t n o r m a l c e l l s w i t h f i d e l i t y . F u r t h e r -mo r e , t h e y o f t e n d i s p l a y a mi x e d p h e n o t y p e b e c a u s e i n d i v i d u a lc e l l s a p p e a r t o s l o w l y p r o g r e s s t h r o u g h t h e l i n e a g e , w h e r e a sa s t e m l i n e o f r e l a t i v e l y f i x e d p h e n o t y p e p e r s i s t s .

Ch a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s e p r e - B c e l l t r a n s f o r m a n t s h a s b e e ne x t e n s i v e ( 1 , 2 ) . I g g e n e r e a r r a n g e me n t s c a n b e u s e d a s m a r k e r sf o r s u c c e s s i v e d e v e l o p me n t a l s t a g e s s i n c e t h e v a r i o u s H a n dL c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t s a r e o r d e r e d d u r i n g B c e l l d e v e l -o p m e n t ( 2 , 3 ) . T h e m o s t i mma t u r e a r e l i n e s d e r i v e d b y P a l a c i o se t a l . ( 4 ) , wh i c h h a v e g e r m l i n e H a n d L c h a i n l o c i b u t c a nb e i n d u c e d t o d i f f e r e n t i a t e u n d e r s p e c i a l c o n d i t i o n s . L y D 9a n d B a F 3 , wh i c h d i s p l a y t h e B 2 2 0 p a n - B c e l l s u r f a c e m a r k e r ,a r e r e p r e s e n t a t i v e s . P r e - B c e l l s t h a t a r e ma i n l y g e r m l i n e a tt h e H c h a i n l o c i b u t c a r r y o u t t h e e a r l i e s t s t a g e s o f H c h a i ng e n e r e a r r a n g e m e n t ( D t o J j o i n i n g ) a r e t y p i f i e d b y H A F T Lc e l l l i n e s ( 5 ) , f e t a l l i v e r c e l l s t r a n s f o r m e d b y H a r v e y l e u k e mi av i r u s . A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me d f e t a l l i v e r a n d b o n e ma r r o wp r e - B c e l l s a r e s o me wh a t mo r e m a t u r e . T h e s e i n c l u d e e a r l yl i n e a g e c e l l s s u c h a s 3 0 0 - 1 9 ( 6 ) , wh i c h c a r r y o u t p r e d o mi -n a n t l y H c h a i n V t o DJ r e a r r a n g e m e n t s , a n d mo r e ma t u r ec e l l l i n e s l i k e P D 3 1 , wh i c h h a v e f u n c t i o n a l H c h a i n g e n e r e a r -r a n g e me n t s a n d r e a r r a n g e t h e L c h a i n l o c us i n c u l t u r e ( 7 ) .T h e s e p r e - B c e l l a n a l o g u e s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d l a r g e l yb y c u mb e r s o me s u b c l o n i n g e x p e r i me n t s t h a t a r e l i mi t e d t o

e x a mi n i n g t h e ma j o r i t y p h e n o t y p e s . A l s o , H c h a i n - r e l a t e de v e n t s h a v e b e e n s t u d i e d mo r e e x t e n s i v e l y t h a n L c h a i n - r e l a t e de v e n t s . T h e s e a n a l y s e s s u g g e s t e d t h a t o n l y H c h a i n - p r o d u c i n gc e l l l i n e s c o u l d r e a r r a n g e t c L c h a i n g e n e s a n d t h a t H c h a i n -p r o d u c i n g c e l l s i n a c t i v a t e f u r t h e r H c h a i n g e n e r e a r r a n g e -me n t a n d u n r e a r r a n g e d g e n e t r a n s c r i p t i o n ( 2 , 8 ) .We r e c e n t l y d e v e l o p e d a s e mi - q u a n t i t a t i v e P C R a s s a y f o rg e n e r e a r r a n g e m e n t a n d e x p r e s s i o n ( 9 ) t h a t a l l o ws b u l k c e l lp o p u l a t i o n s t o b e a s s a y e d f o r m a n y d i f f e r e n t e v e n t s . U s i n gt h i s me t h o d o l o g y , we s h o w e d t h a t H c h a i n p r o t e i n wa s n o tn e c e s s a r y f o r K g e n e r e a r r a n g e m e n t a n d t h a t i n c r e a s e d l e v e l so f g e r m l i n e t c g e n e t r a n s c r i p t i o n c o r r e l a t e d w i t h g r e a t e r f r e -q u e n c y o f a g e n e r e a r r a n g e m e n t ( 9 ) . H e r e , we p r o v i d e a ne x t e n s i v e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t r a n s f o r m e d p r e - B c e l l s t h a t mo r ec o mp l e t e l y d e f i n e s t h e i r p r o p e r t i e s . We f i n d t h a t t h e s e c e l l se f f e c t i v e l y i n i t i a t e b u t r a r e l y t e r mi n a t e t h e e v en t s o f B c e l ld e v e l o p me n t a n d t h e r e f o r e p r o v i d e g o o d mo d e l s f o r s t u d y i n gt h e r e q u i r e me n t s f o r r e a r r a n g e m e n t , b u t n o t n e c e s s a r i l y f o ra l l e l i c e x c l u s i o n ( 1 0 , 1 1 ) , a n e v e n t t h o u g h t t o i n v o l v e t h e r e g u -l a t e d t e r m i n a t i o n o f r e a r r a n g e m e n t ( 3 ) . We s h o w t h a t f o rb o t h H a n d L c h a i n g e n e s , r e a r r a n g e m e n t i s c o r r e l a t e d t ot r a n s c r i p t i o n o f v a r i a b l e a n d c o n s t a n t r e g i o n g e n e s e g me n t s ,a n d t h a t a f u n c t i o n a l H c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t d o e s n o tp r e v e n t f u r t h e r u n r e a r r a n g e d H c h a i n g e n e t r a n s c r i p t i o n o rr e a r r a n g e m e n t i n v i r a l l y t r a n s f o r me d p r e - B c e l l l i n e s .Ma t e r i a l s a n d Me t h o d s

Ce l l L i n e s a n d C u l t u r e . L y D 9 ( 4 ) wa s p r o v i d e d b y D r . R o nP al a c i o s ( B a s e l , S w i t z e r l a n d ) , H A F T L ( 5 ) b y D r . J a c k l y n P i e r c e( N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ) , 3 0 0 - 1 9 ( 6 ) b y D r . Da v i d We a v e r( D a n a - F a r b e r C a n c e r C e n t e r , B o s t o n , MA ) , a n d 2 2 3 - 1 8 ( 2 ) b y D r .N a o m i Ro s e n b e r g ( T u f t s U n i v e r s i t y , B os t o n , MA ) . Ce l l l i n e s M8 ,

J . E x p . Me d . T h e Ro c k ef e l l e r U n i v e r s i t y P r e s s " 0 0 2 2 - 1 0 0 7 / 9 1 / 0 3 / 0 7 1 1 / 1 0 $ 2 . 0 0V o l u me 1 7 3 Ma r c h 1 9 9 1 7 1 1 - 7 2 0


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M9 , a n d M1 0 w e r e g e n e r a t e d b y A b e l s o n v i r u s t r a n s f o r ma t i o n o fmu r i n e b o n e ma r r o w ( 1 2 ) a n d k i n d l y p r o v i d e d b y Ma r j o r i e Oe t -t i n g e r ( Wh i t e h e a d I n s t i t u t e ) . K 4 0 F . 1 a n d K 4 0 F 1 . 2 w e r e g e n e r a t e db y A l a n S h a p i r o a n d Dr . T o n y De F r a n c o ( U n i v e r s i t y o f Ca l i f o r n i a ,S a n F r a n c i s c o ) . K 4 0 F . 1 wa s o b t a i n e d b y l i mi t i n g d i l u t i o n c l o n i n go f t h e A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me d c e l l l i n e K 4 0 . K 4 0 F . 2 i s a Hc h a i n - p r o d u c i n g d e r i v a t i v e o f K 4 0 F . 1 o b t a i n e d b y s i b - s e l e c t i o n .Wi t h t h e e x c e p t i o n o f L y D9 , a l l c e l l s w e r e ma i n t a i n e d i n RPM Is u p p l e me n t e d w i t h 1 0 % i n a c t i v a t e d F C S , 5 0 A M / 3 - m e r c a p t o -e t h a n o l , p e n i c i l l i n , a n d s t r e p t o my c i n . L y D 9 wa s g r o wn i n I s c o v e ' sme d i a s u p p l e me n t e d w i t h 5 % F C S , 1 0 % WE H I - 3 - c o n d i t i o n e dme d i u m, 5 0 A M / 3 - me r c a p t o e t h a n o l , p e n i c i l l i n , a n d s t r e p t o my c i n .L i mi t i n g d i l u t i o n c l o n i n g wa s d o n e i n 9 6 - we l l mi c r o t i t e r p l a t e s .On l y c l o n e s f r o m p l a t e s c o n t a i n i n g < 3 0 p o s i t i v e w e l l s w e r e u s e d .P r e p a r a t i o n o f N u c l e i c A c i d s . T o t a l R N A wa s p r e p a r e d u s i n g t h eg u a n i d i n i u m me t h o d e x a c t l y a s d e s c r i b e d ( 1 3 ) . D N A wa s p r e p a r e df o r P C R b y l y s i n g 1 0 6 c e l l s i n 2 0 0 p l P C R l y s i s b u f f e r ( 1 0 m MT r i s , p H 8 . 4 , 5 0 mM K CI , 2 M M Mg C 1 2 , 0 . 4 5% N P - 4 0 , 0 . 4 5 %T w e e n - 2 0 , 6 0 p g / ml p r o t e i n a s e K ) , i n c u ba t i n g t h e m a t 5 5 C f o r1 h , t h e n i n a c t i v a t i n g t h e p r o t e a s e b y h e a t i n g t o 9 5 C f o r 1 0 mi n .T h i s DNA , a t a c o n c e n t r a t i o n o f 5 , 0 0 0 g e n o me s / p l , wa s u s e dd i r e c t l y f o r P C R .D N A P C R A s s a y s . 5 0 - p , 1 P C R r e a c t i o n s c o n t a i n e d 2 A l t e m-p l a t e ( 1 0 , 0 0 0 g e n o m e s ) , 1 0 m M T r i s , p H 8 . 4 , a t 2 0 C , 5 0 m MK CI , 2 . 0 M M M g C 1 2 , 1 0 0 j i g / ml B S A ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a -t o r i e s , B e t h e s d a , MD ) , 1 0 0 n g o f e a c h p r i me r ( 2 5 m e r s , s e e b e l o w ) ,a n d 1 U T a q p o l y me r a s e ( A mp l i t a q ; C e t u s C o r p . , Eme r y v i l l e , CA ) .3 0 c y c l e s o f a mp l i f i c a t i o n w e r e p e r f o r me d , u s i n g a D N A t h e r ma lc y c l e r ( C e t u s Co r p . ) , c o n s i s t i n g o f 1 mi n a t 9 4 C , 1 mi n a t 6 0 C,a n d 1 . 7 5 mi n a t 7 2 C , f o l l o we d b y a s i n g l e 1 0 - mi n p e r i o d a t 7 2 C .On e- f i f t h o f e a c h r e a c t i o n wa s a n a l y z e d o n a 1 . 4 % a g a r o s e g e l i nt r i s - b o r a t e b u f f e r . T h e g e l wa s b l o t - t r a n s f e r r e d t o a n y l o n mem-b r a n e ( Z e t a b i n d ; A me r i c a n B i o a n a l y t i c a l , Na t i c k , MA ) a n d p r o b e dw i t h 3 2 P - l a b e l e d D N A f r o m t h e a p p r o p r i a t e I g c o n s t a n t r e g i o n( s e e b e l o w) .

T h e s e q u e n c e s o f t h e v a r i o u s p r i me r s u s e d i n t h e s e e x p e r i me n t sa r e s h o w n b e l o w. T h e J p r i me r s a r e u n i q u e s e q u e n c e s 2 5 n u c l e o -t i d e s i n l e n g t h . Ge r m l i n e a l l e l e s w e r e d e t e c t e d u s i n g a p r i me r ( Mu O )3 2 2 n u c l e o t i d e s 5 ' t o J N 1 . T h e D R a n d L p r i me r s a r e mi x t u r e so f o l i g o n u c l e o t i d e s d e g e n e r a t e a t t wo a n d t h r e e p o s i t i o n s , r e s p e c -t i v e l y , wh i c h a r e h o mo l o g o u s t o a l l o f t h e me mb e r s o f t h e D f l 1 6a n d D s p 2 D g e n e f a m i l i e s ( 9 o f t h e 1 0 k n o w n mu r i n e D mi n i g e n e s ) .D t o J r e a r r a n g e m e n t s w e r e d e t e c t e d a s a mp l i f i e d f r a g m e n t s o f- 1 , 0 3 3 , - 7 1 6 , o r - 3 3 3 n u c l e o t i d e s d e p e n d i n g o n w h e t h e r J H 1 ,J 2 , o r J 3 wa s r e a r r a n g e d . T h e a s s a y f o r V t o DJ r e a r r a n g e m e n tu s e s a mi x t u r e o f t h r e e d i f f e r e n t d e g e n e r a t e ( a t t h r e e p o s i t i o n s ) o l i -g o n u c l e o t i d e s h o mo l o g o u s t o c o n s e r v e d f r a me wo r k r e g i o n 3 ( F R3 )s e q u e n c e s o f t h r e e V g e n e f a m i l i e s ( V 7 1 8 3 , V 5 5 8 , a n d V Q5 2 )a n d t h e J 3 p r i me r . T h i s r e s u l t s i n a mp l i f i e d V D J r e a r r a n g e m e n t so f - 1 , 0 5 8 , - 7 4 1 , o r - 3 5 8 n u c l e o t i d e s . P C R p r o d u c t s w e r e d e -t e c t e d a n d q u a n t i f i e d b y S o u t h e r n b l o t t i n g a n d h y b r i d i z a t i o n w i t ha p p r o p r i a t e I g g e n e p r o b e s .B o t h DJ a n d V D J r e a r r a n g e m e n t r e s u l t i n l o s s o f t h e M u O s e -q u e n c e a n d i t s a mp l i f i c a t i o n p r o d u c t . L i k e w i s e , a n y V t o DJ r e a r -r a n g e m e n t e v e n t r e s u l t s i n l o s s o f a l l t h e D L p r i me r t a r g e t s e -q u e n c e s a n d a mp l i f i e d DJ f r a g me n t s .R N A P C R A s s a y s . Co n s t a n t r e g i o n ( MuO , D C , a n d C K )R N A P C R a s s a y s w e r e p e r f o r me d o n c D N A ma d e b y r a n d o mp r i mi n g o f t o t a l R N A s a mp l e s ( 1 4 ) . 3 l A g o f R N A wa s r e v e r s et r a n s c r i b e d i n a r e a c t i o n c o n t a i n i n g 2 0 0 U c l o n e d Mo l o n e y l e u k e mi av i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) , 5 pmo lr a n d o m h e x a m e r s ( P h a r ma c i a F i n e Ch e mi c a l s , P i s c a t a wa y , N J ) , 1 0m M T r i s , p H 8 . 4 , 5 0 m M K CI , 2 . 0 M M MgC 1 2 , 1 0 0 , u g / ml B S A

7 1 2

( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) , 5 m M D T T , a n d 2 0 U RNa s i n( B o e h r i n g e r Ma n n h e i m B i o c h e mi c a l s , I n d i a n a p o l i s , I N) i n a f i n a lv o l u me o f 2 0 , l . T h e r e a c t i o n wa s i n c u b a t e d f o r 1 h a t 4 2 C t h e nh e a t - i n a c t i v a t e d a t 7 5 C f o r 1 0 mi n u t e s . S a mp l e s w e r e k e p t o n i c eo r s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 C u n t i l e v a l u a t i o n b y P C R .V a n d V K P C R a s s a y s , wh i c h d o n o t s p a n i n t r o n s , r e q u i r e dp r e t r e a t me n t o f p u r i f i e d R N A w i t h D N a s e t o e l i mi n a t e c o n t a mi -n a t i o n w i t h g e n o mi c D N A . 1 0 h g o f R N A wa s d i g e s t e d w i t h2 U RQ1 R N a s e - f r e e D N a s e ( P r o m e g a B i o t e c , Ma d i s o n , WI ) f o r1 0 mi n a t 3 7 C i n a 1 5 - A l r e a c t i o n c o n t a i n i n g 1 U/ p l RNa s i n( B o e h r i n g e r Ma n n h e i m B i o c h emi c a l s ) , 1 0 m M T r i s , p H 7 . 5 , 2 m MMgC1 2 , a n d 5 m M D T T T h e D N a s e wa s h e a t - i n a c t i v a t e d a t 7 5 Cf o r 1 0 mi n . 3 A g o f D N a s e - t r e a t e d R N A wa s r e v e r s e t r a n s c r i b edi n a 2 0 - A l r e a c t i o n a s a b o v e , e x c e p t t h a t t h e r a n d om h e x a m e r s w e r er e p l a c e d w i t h 2 5 0 n g o f e a c h 3 ' r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p r i me r ( d e -g en e r a t e o l i g o n u c l e o t i d e s h o mo l o g o u s t o t h e h e p t a me r - n o n a me rr e g i o n i mme d i a t e l y 3 ' t o t h e V g e n e s ) . T h e c D N A s a mp l e s w e r ek e p t o n i c e o r s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 C u n t i l u s e d f o r P C R .2 A l o f c D N A wa s u s e d i n a 5 0 - 1 4 1 P C R r e a c t i o n i n t h e s a m eb u f f e r a n d u n d e r t h e - s a m e c o nd i t i o n s a s f o r D N A ( a b o v e ) . E a c ht r a n s c r i p t wa s a n a l y z e d w i t h s p e c i f i c p r i m e r s ( s e e b e l o w) i n a s e p a -r a t e r e a c t i o n . T h e a mp l i f i e d p r o d u c t s w e r e s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o -r e s i s o n a g a r o s e g e l s a n d b l o t - t r a n s f e r r e d t o n y l o n me mb r a n e s . T h ep r o b e s u s e d f o r b l o t h y b r i d i z a t i o n c am e f r o m g e l - p u r i f i e d c o n t r o la mp l i f i c a t i o n r e a c t i o n s t h a t w e r e l a b e l e d b y s t a n d a r d me t h o d s ( 1 5 ) .

P C R a n d R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n P r i me r s . T h e f o l l o wi n g p r i me r sw e r e u s e d i n t h e s e e x p e r i me n t s : V H B : G G W C T G A S G A C G T C R -A M S T G G A ; V 5 5 8 R : G C T G C A G Y T G A G Y T G C A T G W A G G C ;VAT T G W G G T W S Y M W C A C T G T G ; V KB : G A C A T T C A G C -T G A C C C A G T C T C C A ; V KR : G T Y C C W G A Y C C A C T G C C A C TG A A S C ; V K R T G G C C C G G G T T T W T G T T M W G R B Y T G T A K -C A C A G T G ; Mu O : C C G C A T G C C A A G G C T A G C C T G A A A G A -T T A C C ; VH5 5 8 : C G A G C T C T C C A R C A C A G C C T W C A T G C A -R C T C A R C ; V 7 1 8 3 : C G G T A C C A A G A A S A M C C T G T W C C TG C A A A T G A S C ; V Q5 2 : CG G T AC C AG AC T G AR C A T C A S C A A -G G A C A A Y T C C ; D R : T T T T G Y T G M T G G A T A T A K C A C T G A G ;DN L : G G A A T T C G M T T T T T G T S A A G G G A T C T A C T A C T G T G;J 3 : G T C T A G A T T C T C A C A A G A G T C C G A T A G A C C C T G G ; J 4 :T C C C T C A A A T G A G C C T C C A A A G T C C ; C : A T G C A G A T C TC T G T T T T T G C C T C C ; K : T C C A C G C A T G C T T G G A G A G G -G G G T T ; C . : G T C C T G A T C A G T C C A A C T G T T C A G.

T h e s e q u e n c e s a r e p r e s e n t e d 5 ' t o 3 ' . D e g e n e r a t e n uc l e o t i d e p o -s i t i o n s a r e c o d e d a s f o l l o w s : R = A o r G ; Y = C o r T S = Co r G ; M= Ao r C ; K = Go r T W= A o r T B= C , Go rT . V B a n d V B w e r e a d a p t e d f r o m r e f e r e n c e 1 6 . Mo s t P C Rp r i me r s c o n t a i n a r e s t r i c t i o n e n z y m e l i n k e r s e q u e n c e a t t h e i r 5 'e n d a n d - 2 5 n u c l e o t i d e s o f t a r g e t h o mo l o g y .

RN a s e P r o t e c t i o n A s s a y f o r O c t - 2 . O c t - 2 m R N A l e v e l s w e r e m e a -s u r e d b y R N A a s e p r o t e c t i o n , u s i n g a p r o b e d e r i v e d f r o m t h e 5 'e n d o f a mu r i n e O c t - 2 c D N A . T h e p r o b e s p a n s t h e r e g i o n h o mo l -o g o u s t o n u c l e o t i d e s 4 3 6 - 5 4 7 i n t h e h u m a n c D N A s e q u e n c e ( 1 7 ) .3 0 l A g o f t o t a l c y t o p l a s mi c R N A wa s u s e d i n e a c h e x p e r i me n t . Asa c o n t r o l f o r t h e a m o u n t o f R N A p r e s e n t i n e a c h h y b r i d i z a t i o n ,a p a r a l l e l e x p e r i me n t wa s p e r f o r me d u s i n g a n t i - a c t i n p r o b e T h ea m o u n t o f p r o b e p r o t e c t e d i n e a c h e x p e r i me n t wa s q u a n t i f i e d u s i n ga b l o t a n a l y z e r ( m o d e l 6 0 3 ; B e t a g e n , Na t i c k , MA ) .Re s u l t sH Ch a i n G e n e R e a r r a n g e me n t s i n Cu l t u r e d C e l l s . We d e -v i s e d a s e r i e s o f a s s a y s t o s e n s i t i v e l y d e t e c t H c h a i n g e n e r e a r -r a n g e me n t s i n a c e l l p o p u l a t i o n u s i n g t h e P C R . F i g . 1 i n d i -

c a t e s t h e p o s i t i o n s o f t h e v a r i o u s P C R p r i m e r s u s e d t o d e t e c tRe g u l a t i o n o f I g Ge n e Re a r r a n g eme n t i n V i r u s - t r a n s f o r m e d P r e - B C e l l s


3/10

7 1 3 S c h l i s s e l e t a l .

F i g u r e 1 . Di a g r a m o f t h e v a r i o u s P C R a s s a y su s e d t o e v a l u a t e I g H c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n ta n d g e r ml i n e g e n e t r a n s c r i p t i o n . T h e u p p e r l i n ei s a s c h e ma t i c ma p o f t h e g e r ml i n e I g H c h a i nl o c u s ( n o t d r a wn t o s c a l e ) . S u b s e q u e n t l i n e sd e pi c t v a r i o u s p a r t i a l l y o r f u l l y r e a r r a n g e d a l -l e l e s o r p r o c e s s e d g e r ml i n e g e n e t r a n s c r i p t s . T h es h o r t a r r o w s s h o w t h e p o s i t i o n s o f P C Rp r i me r s a n d t h e s h a d e d b a r s r e p r e s e n t p r e d i c t e dP C R p r o d u c t s . H a n d N r e p r e s e n t t h e c o n -s e r v e d h e p t a me r a n d n o n a m e r r e c o mb i n a t i o ns i g n a l s e q u e n c e s . T h e s i z e s o f t h e e x p e c t e d P C Rp r o d u c t s a n d t h e s e q u e nc e s o f t h e P C R p r i me r sa r e a s s h o w n i n Ma t e r i a l s a n d Me t h o d s .

F i g u r e 2 . D N A P C R a s s a y s o f g e r ml i n e a n d r e a r r a n g e dI g H c h a i n g e n e s i n c u l t u r e d c e l l s a c t i v e f o r I g g e n e r e a r -r a n g e m e n t . ( A ) A n a u t o r a d i o g r a m o f g e r ml i n e ( G ) , D J( D ) , a n d V D J ( n r e a r r a n g e m e n t a s s a y s p e r f o r me d o n t h ei n d i c a t e d p r e - B a n d T c e l l l i n e s i s s h o w n . T h e p o s i t i o n so f P C R f r a g me n t s c o r r e s p o n d i n g t o DJ o r V D J r e a r r a n g e -me n t s i n v o l v i n g J 1 , J 2 , a n d J 3 a r e i n d i c a t e d . T h e l a n esl a b e l e d B l a n k a r e t h e p r o du c t s o f c o n t r o l a mp l i f i c a t i o n r e a c -t i o n s c o n t a i n i n g n o t e mp l a t e . ( B) T h e c e l l l i n e s H A F T LA a n d 3 0 0 - 1 9 w e r e a s s a y e d b y P C R f o r V D J r e a r r a n g e -me n t s u s i n g V g e n e f a mi l y - s pe c i f i c V p r i me r s . T h ep r i me r s a n d p o s i t i o n s o f mi g r a t i o n o f V D J 1 , V D J 2 , a n dV D J 3 P C R p r o d u c t s a r e i n d i c a t e d . ( C) DJ r e a r r a n g e m e n tP C R a s s a y s w e r e p e r f o r me d o n D N A f r o m H A F T L c e l l su s i n g e i t h e r D H L o r D H R a s t h e 5 ' p r i me r . T h e v a r i o u sDJ r e a r r a n g e m e n t s a r e i n d i c a t e d .


4/10

g e r ml i n e a l l e l e s a n d DJ a n d V D J g e n e r e a r r a n g e m e n t s , a n ds h o w s d i a g r a mma t i c a l l y s e v e r a l o f t h e p o s s i b l e P C R p r o d -u c t s . I n t h e i r u n r e a r r a n g e d s t a t e s , s e q u e n c e s h o mo l o g o u s t ot h e v a r i o u s V , D , a n d c o n s t a n t r e g i o n P C R p r i me r s a r e t o of a r a p a r t t o a l l o w e f f i c i e n t a mp l i f i c a t i o n . R e a r r a n g e me n t s o fmo s t D s e g me n t s o r m a n y me mb e r s o f t h r e e V g e n e f a mi -l i e s ( V H 5 5 8 , V 7 1 8 3 , V Q 5 2 ) t o J 1 , 2 , o r 3 r e s u l t i n d i s -t i n g u i s h a b l e a mp l i f i e d p r o d u c t s . B y l i mi t i n g t h e n u m b e r o fa mp l i f i c a t i o n c y c l e s ( 9 ) , t h e s e a s s a y s c a n p r o v i d e a m e a s u r eo f t h e r e l a t i v e f r e q u e n c i e s o f d i f f e r e n t r e a r r a n g e m e n t e v e n t si n a c t i v e l y r e a r r a n g i n g c e l l p o p u l a t i o n s .

We u s e d t h e s e P C R a s s a y s t o a s s a y f o r H c h a i n g e n e r e a r -r a n g e me n t s i n H A F T L A a n d H A F T L B , i n d e p e n d e n t ,c l o n ed , H- r a s - t r a n s f o r me d p r e - B c e l l l i n e s ( F i g . 2 A ) . T h ep r e s e n c e o f a h y b r i d i z i n g a m p l i f i e d g e r ml i n e f r a g me n t a s we l la s s e v e r a l f r a g m e n t s o f p r e d i c t e d l e n g t h s u s i n g b o t h V a n dD p r i me r s s h o w e d t h a t DJ a n d V D J r e a r r a n g e m e n t s mu s th a v e o c c u r r e d d u r i n g t h e g r o w t h o f t h e s e c l o n a l c e l l l i n e si n c u l t u r e . S i n g l e c e l l c l o n e s o f H A F T L A , c u l t u r e d f o r s e v -e r a l mo n t h s , d i s p l a y a r e a r r a n g e m e n t p a t t e r n s i m i l a r t o t h ep a r e n t a l l i n e ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a t r e a r r a n g e m e n ti s o n g o i n g . L y D 9 ( 4 ) i s a B 2 2 0 + p r o - B c e l l l i n e t h a t u n d e rc e r t a i n c o n d i t i o n s i s c a p a b l e o d i f f e r e n t i a t i o n i n t o ma t u r e ,s u r f a c e I g + B c e l l s . P C R a n a l y s i s d e t e c t e d o n l y g e r m l i n e Hc h a i n a l l e l e s . T h e A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me d p r e - B c e l l l i n e3 0 0 - 1 9 ( 6 ) wa s i n i t i a l l y r e p o r t e d t o h a v e t h e g e n o t y p e DJ / DJ .P C R a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d DJ 3 a n d V D J 3 g e n e r e a r r a n g e -me n t s . Ou r a s s a y d e t e c t e d i n f r e q u e n t DJ r e a r r a n g e m e n t e v e n t s( f a i n t DJ s i g n a l s ; F i g . 2 A ) i n t h e p r e - T c e l l l i n e 2 0 1 7 ( 1 8 ) ,a p h e n o m e n o n p r e v i o u s l y r e p o r t e d i n o t h e r T c e l l s . A v a -r i e t y o f c e l l s f a i l e d t o s h o w a n y r e a r r a n g e m e n t , i n c l u d i n g E LA( T c e l l ) , B A F 3 ( p r o - B ; d a t a n o t s h o w n ) , a n d 3 T 3 ( f i b r o b l a s t ;d a t a n o t s h o w n ) .I n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s l y r e p o r t e d f i n d i n g s i n b o t ht r a n s f o r m e d c e l l s a n d p r i ma r y t i s s u e ( 1 9 ) , P C R a n a l y s i s ( F i g .2 B ) r e v e a l e d t h a t p r e - B c e l l s r e a r r a n g e d i f f e r e n t V g e n ef a m i l i e s a t d i s t i n c t f r e q u e n c i e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e i r d i s t a n c ef r o m t h e c o n s t a n t r e g i o n g e n e c l u s t e r . We a s s a y e d V t o DJr e a r r a n g e m e n t i n H A F T L A a n d 3 0 0 - 1 9 c e l l s u s i n g t h e J 3p r i me r w i t h e a c h o f t h r e e d e g e n e r a t e V g e n e f a mi l y o l i g o -n u c l e o t i d e p r i me r s i n s e p a r a t e r e a c t i o n s . As s h o w n i n F i g .2 B , h y b r i d i z i n g f r a g m e n t s r e p r e s e n t i n g V 7 1 8 3 a n d V Q5 2r e a r r a n g e m e n t s w e r e m u c h mo r e i n t e n s e t h a n t h o s e o b t a i n e du s i n g t h e V 5 5 8 p r i me r , d e s p i t e t h e f a c t t h a t me mb e r s o ft h e mo r e d i s t a l V 5 5 8 g e n e f a mi l y a r e m u c h mo r e n u me r o u s .We f o u n d t h a t D t o J r e a r r a n g e m e n t s a r e a s y mme t r i c . Sym -me t r i c a l h e p a t a me r - 1 2 n u c l e o t i d e s p a c e r - n o n a m e r s e q u e n c e sl i e b o t h 5 ' a n d 3 ' t o e a c h i d e n t i f i e d D g e n e ( 2 0 , 2 1 ) . P r e v i o u s

s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t r e a r r a n g e m e n t c a n o c c u r w i t h d e l e -t i o n o r i n v e r s i o n o f t h e i n t e r v e n i n g D N A ( 2 2 , 2 3 ) . P C R a n a l -y s i s u s i n g p r i me r s s p e c i f i c f o r e i t h e r t h e 5 ' o r 3 ' D H r e c o m -b i n a t i o n s i g n a l s e q u e n c e s ( F i g . 2 C ) r e v e a l e d t h e n e a r l ye x c l u s i v e u s e o f t h e 3 ' s e q u e n c e f o r D t o J r e a r r a n g e m e n ti n H A F T L A c e l l s , a l t h o u g h f a i n t s i g n a l s c o u l d b e s ee n i nt h e D R l a n e o n l e n g t h y e x p o s u r e . We c a n n o t a s y e t o f f e ra me c h a n i s t i c e x p l a n a t i o n o f t h i s o b s e r v a t i o n .A s n o t e d a b o v e , t h e r e c o mb i n a t i o n s i g n a l s e q u e n c e s f l a n k i n gt h e D g e n e s a r e s y mme t r i c a l . I f t e mp l a t e a c c e s s i b i l i t y a l o n e

F i g u r e 3 . R N A P C R e v a l u a t i o n o f g e r ml i n e I g H c h a i n o r K L c h a i nc o n s t a n t r e g i o n t r a n s c r i p t i o n . ( A ) R N A f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s w e r ea s s a y e d f o r g e r ml i n e Mu ( Mu 0 ) a n d p a r t i a l l y r e a r r a n g e d DJ a l l e l e t r a n -s c r i p t s b y P C R . T h e p o s i t i o n s o f t h e v a r i o u s P C R p r o d u c t s a r e i n d i c a t e d .( B) R N A f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s , g r o wn i n t h e p r e s e n c e ( + ) o r a b -s e n c e ( - ) o f L PS , w e r e a s s ay e d f o r g e r ml i n e K c o n s t a n t r e g i o n t r a n s c r i p -t i o n . T h e p o s i t i o n o f t h e g e r ml i n e C K t r a n s c r i p t i s i n d i c a t e d .d i c t a t e s I g g e n e r e a r r a n g eme n t , o n e mi g h t e x p e c t t o d e t e c tV t o D r e a r r a n g e m e n t s i n c e l l s t h a t t r a n s c r i b e u n r e a r r a n g e dV H g e n e s ( s e e b e l o w ) a n d c a r r y o u t DJ r e a r r a n g e m e n t .Ho we v e r , w e w e r e u n ab l e t o d e t e c t a n y V t o D r e a r r a n g e -me n t i n a w i d e v a r i e t y o f p r e - B c e l l s u s i n g t h e t h r e e V g e n eP C R p r i me r s a n d t h e D H R p r i me r ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i -c a t i n g a l e v e l o f c o n t r o l b e y o n d t h a t o f a c c e s s i b i l i t y a l o n e .T h i s s e n s i t i v e , p o p u l a t i o n - b a s e d P C R a n a l y s i s o f H c h a i ng e n e r e a r r a n g e m e n t c o n f i r ms a n d e x t e n d s p r e v i o u s d a t a . T h eDJ r e a r r a n g e m e n t s p r e v i o u s l y r e p o r t e d i n H A F T L a n d 3 0 0 -1 9 w e r e c o n f i r me d , b u t p r e v i o u s l y u n r e c o g n i z e d V D J a l l e l e sw e r e d e t e c t e d , s h o w i n g t h a t t h e s e c e l l s a r e n o t s t r i c t l y b l o c k e di n p r o g r e s s i o n t h r o u g h t h e r e a r r a n g e m e n t p r o c e s s . T h e p r e f e r -e n c e f o r r e a r r a n g i n g C p . - p r o x i m a l V g e n e s wa s d e f i n i t e l ys h o w n h e r e . T h e p o l a r i t y o f D t o J r e a r r a n g e m e n t s a n d t h el a c k o f V t o D e v e n t s s h o w t h a t c o mp l e x c o n t r o l s d i r e c t t h er e a r r a n g e m e n t p r o c e s s .Ge r m l i n e T r a n s c r i p t s o f I g Co n s t a n t Re g i o n G e n e s . T o t e s tt h e h y p o t h e s i s t h a t t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i s r e q u i r e d f o r I gg e n e r e a r r a n g e m e n t , w e s u r v e y e d a v a r i e t y o f l y mp h o i d c e l ll i n e s , w h o s e p o t e n t i a l f o r g e n e r e a r r a n g e m e n t we h a d d e m o n -s t r a t e d , f o r t h e p r e s e n c e o f t r a n s c r i p t s o f u n r e a r r a n g e d o r p a r -t i a l l y r e a r r a n g e d ( D J ) H a n d K L c h a i n a l l e l e s . R N A wa sr e v e r s e t r a n s c r i b e d u s i n g r a n d o m h e x a me r i c p r i me r s a n d t h e na mp l i f i e d w i t h p r i me r s l o c a t e d s u c h t h a t t h e y s p a n t h e J - CI Li n t r o n ( F i g . 1 ) o r t h e J - C i c i n t r o n . T h e s i z e s o f t h e P C R p r o d -u c t s we d e t e c t e d c o r r e s p o n d e d e x a c t l y t o t r a n s c r i p t s t h a t i n i -t i a t e d u p s t r e am o f t h e 5 ' P C R p r i me r ( Mu O , D L , o r K ) ,a n d w e r e p r o p e r l y s p l i c e d f r o m t h e f i r s t J g e n e t o t h e f i r s tc o n s t a n t r e g i o n e x o n ( F i g . 3 ) .

We d e t e c t e d a n a mp l i f i e d t r a n s c r i p t f r o m t h e c o mp l e t e l yu n r e a r r a n g e d H c h a i n g e n e i n H A F T L c e l l l i n e s , b u t n o t i nt h e p r o - B c e l l l i n e L y D 9 o r i n t h e p r e - T c e l l l i n e 2 0 1 7 ( F i g .3 A) . I t w a s t r a n s c r i b e d , h o w e v e r , i n E L - 4 T c e l l s ( d a t a n o ts h o w n ) . P a r t i a l l y r e a r r a n g e d DJ a l l e l e s , p r e v i o u s l y s h o w n t o

7 1 4 R e g u l a t i o n o f I g G e n e R ea r r a n g e me n t i n V i r u s - t r a n s f o r me d P r e - B C e l l s


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b e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e b y Re t h a n d A l t ( 2 4 ) , w e r e t r a n -s c r i b e d w h e n e v e r p r e s e n t i n p r e - B c e l l s ( s e e b e l o w) .

We c o u l d d e t e c t a n a mp l i f i c a t i o n p r o d u c t c o r r e s p o n d i n gt o a s p l i c e d g e r m l i n e i s c o n s t a n t r e g i o n t r a n s c r i p t ( 2 5 , 2 6 )c o n s t i t u t i v e l y i n a l l p r e - B a n d B c e l l s a t o r b e y o n d t h e s t a g eo f d e v e l o p me n t r e p r e s e n t e d b y 3 0 0 - 1 9 c e l l s ( F i g . 3 B ) . T h i s

F i g u r e 5 . R e l a t i v e l e v e l s o f O c t - 2 m R N A i n v a r i o u s l y mp h o i d c e l l l i n e s .R N A f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s wa s a s s a y e d f o r Or t - 2 s e q u e nc e s a n da c t i n m R N A b y R N a s e p r o t e c t i o n . R a d i o a c t i v i t y wa s q u a n t i f i e d u s i n ga b l o t a n a l y z e r ( B e t a g e n ) a n d n o r ma l i z e d b a s e d o n t h e a s s u mp t i o n o f c o n -s t a n t l e v e l s o f a c t i n m R N A . T h e a mo u n t s o f O c t - 2 m e s s a g e , r e l a t i v e t ot h a t p r e s e n t i n t h e B c e l l S 1 9 4 , a r e s h o w n . T h e r e s u l t s s h o w n f o r H A F T LA a n d H A F T L B a r e t h e a v e r a g e s o f t h r e e a nd t w o i n d e p e n d e n t a s s a y s ,r e s p e c t i v e l y . T h e r e ma i n i n g a s s a y s we r e s i n g l e d e t e r m i n a t i o n s .

7 1 5 S c h l i s s e l e t a l .

F i g u r e 4 . R N A P C R a s s a y s f o r t h e p r e s e n c eo f g e r ml i n e V a n d V g e n e t r a n s c r i p t s . R N AS a mp l e s f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s we r e a s -s a y e d f o r g e r ml i n e V ( A ) a n d g e r ml i n e V K ( B)t r a n s c r i p t i o n . S a mp l e s i n d i c a t e d b y + a n d -e i t h e r d i d o r d i d n o t c o n t a i n r e v e r s e t r a n s c r i p -t a s e i n t h e c D NA s y n t h e s i s s t e p o f t h e a s s a y .T h e l a ne l a b e l e d B l a n k i s a c o n t r o l r e a c t i o n t h a tc o n t a i n e d n o t e m p l a t e .

t r a n s c r i p t wa s w e a k l y i n d u c i b l e b y L PS t r e a t m e n t a t a n e a r -l i e r s t a g e ( HA F TL ) b u t n o t i n L y D 9 c e l l s . I n t e n s e P C R s i g n a l sf r o m t r e a t e d c u l t u r e s ( F i g . 3 B ) s h o w e d t h a t L PS s t r o n g l yi n d u c e d t h e g e r m l i n e C t r a n s c r i p t i n m o s t p r e - B c e l l s , a sh a d b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 2 7 ) . Ge r m l i n e K t r a n s c r i p t s w e r en o t i n d u c e d i n T c e l l s t r e a t e d w i t h L PS ( F i g . 3 ) o r w i t h P MAa n d P H A ( d a t a n o t s h o w n ) , t r e a t m e n t s k n o w n t o i n d u c e t h eK e n h a n c e r b i n d i n g p r o t e i n NF - K B i n t h e s e c e l l s ( 2 8 ) . T h ep r e s e n c e o f t h e s e g e r m l i n e t r a n s c r i p t s c o r r e l a t e d w i t h c o m -p e t e n c e f o r I g g e n e r e a r r a n g e m e n t . E a c h c e l l l i n e c a p a b l e o fr e a r r a n g i n g a g i v e n l o c u s ma d e a r e a d i l y d e t e c t a b l e g e r m l i n et r a n s c r i p t o f t h a t l o c u s ( s e e Di s c u s s i o n ) .

U n r e a r r a n g e d V a r i a b l e G e n e T r a n s c r i p t i o n . Y a n c o p o u l o s a n dA l t ( 2 9 ) p r e v i o u s l y r e p o r t e d t h e e x i s t e n c e o f t r a n s c r i p t s o fu n r e a r r a n g e d H c h a i n v a r i a b l e g e n e s i n b o t h c u l t u r e d p r e - Bc e l l s a n d m o u s e f e t a l l i v e r . We d e s i g n e d P C R a s s a y s t o d e t e c tt h e s e V t r a n s c r i p t s ( F i g . 1 ) a s we l l a s p o s s i b l e t r a n s c r i p t so f u n r e a r r a n g e d K L c h a i n v a r i a b l e g e n e s t o f u r t h e r t e s t t h er e l a t i o n s h i p b e t we e n t r a n s c r i p t i o n a n d I g g e n e r e a r r a n g e m e n t .T h e p r i me r s u s e d f o r t h e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n s t e p o f t h e a s s a y sw e r e d e g e n e r a t e o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h h o mo l o g y t o t h eh e p t a me r - s p a c e r r e g i o n 3 ' t o t h e V 5 5 8 f a mi l y o f g e n e s o rt o a ma j o r i t y o f t h e V g e n e s . T h e r e f o r e , o n l y u n r e a r r a n g e dg e n e t r a n s c r i p t s c o u l d b e r e v e r s e t r a n s c r i b e d . We t h e n a m p l i f i e dt h e c D NA u s i n g t h e c o mp l e me n t o f t h e V o r V K ( 9 ) D N Aa mp l i f i c a t i o n p r i me r s a n d a s e c o n d d e g e n e r a t e p r i me r , V Bo r V , , B , c o mp l e me n t a r y t o s e q u e n c e s a t t h e 5 ' e n d o f t h e V a n d V , , g e n e f a mi l i e s ( 1 6 ) . S i n c e t h e s e a s s a y s d o n o t c r o s s i n -t r o n / e x o n b o u n d a r i e s , we p e r f o r m e d c o n t r o l r e a c t i o n s t h a tl a c k e d r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( F i g . 4 ) t o e l i mi n a t e D N A c o n -t a mi n a t i o n a s a n a r t i f a c t u a l s o u r c e o f P C R a m p l i f i c a t i o n p r o d -u c t s . N o n e o f t h e R N A s a mp l e s p r o d u c e d a n a m p l i f i e d p r o d u c ti n t h e a b s e n c e o f r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e . We c o u l d f i r s t d e t e c tV t r a n s c r i p t s i n H A F T L c e l l s , a n d t h e y w e r e p r e s e n t i n a l lt h e p r e - B c e l l s we a s s a y e d ( F i g . 4 A ) . T h e y w e r e a b s e n t , h o w -


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F i g u r e 6 . Ge r m l i n e V a n d DJ t r a n s c r i p t i o n i n H c h a i n - p o s i t i v e a n d- n e g a t i v e p r e - B c e l l l i n e s . We a n a l y z e d , b y R N A PCR , t h e a mo u n t s o fg e r ml i n e V ( A ) a n d DJ ( B) t r a n s c r i p t i o n i n t h e i n d i c a t e d p r e - B c e l l l i n e s .T h e q u a n t i t a t i v e n a t u r e o f t h e a s s a y s wa s d e mo n s t r a t e d b y a s s a y i n g s e v e r a ld i l u t i o n s o f 2 2 3 - 1 8 R N A ( l a n e s l a b e l e d 1 : 1 0 0 , 1 : 1 0 , a n d 1 ) . T h e l a n es l a -b e l e d No R T a r e c o n t r o l r e a c t i o n s f r o m wh i c h R T wa s o mi t t e d . T h e l a n esl a b e l e d B l a n k we r e c o nt r o l r e a c t i o ns c o n t a i n i n g n o t e mp l a t e . T h e p o s i t i o no f t h e a mp l i f i e d DJ t r a n s c r i p t i s l a b e l e d D C H .

e v e r , f r o m t h e t wo m a t u r e B c e l l l i n e s s t u d i e d , a s we l l a sf r o m T c e l l s . U n r e a r r a n g e d V , , t r a n s c r i p t s w e r e a b s e n t f r o mL y D 9 a n d H A F T L c e l l s , b u t p r e s e n t i n t h e r e ma i n i n g p r e - Ba n d m a t u r e B c e l l s . V t r a n s c r i p t s w e r e a b s e n t f r o m t h e t woT c e l l l i n e s t e s t e d . C l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f a mp l i f i e d V t r a n s c r i p t s s h o w e d t h a t t h e y i n i t i a t e n e a r t h e s a m e p r o mo t e rs e q u e n c e u s e d b y r e a r r a n g e d r c g e n e s ( d a t a n o t s h o w n ) . I ti s o f n o t e t h a t t h e s e t wo t r a n s c r i p t i o n u n i t s , V . a n d V , , ,c o n t a i n c o n s e r v e d o c t a me r s e q u e n c e s ( 3 0 ; s e e b e l o w) i n t h e i rp r o m o t e r s b u t w e r e d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e d .

O c t - 2 mRN A L e v e l s d u r i n g B Ce l l De v e l o p me n t . T h el y mp h o i d - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r O c t - 2 b i n d s i n v i t r ot o a c o n s e r v e d o c t a me r i c D N A s e q u e n c e i n t h e V a n d V , ,p r o m o t e r s a n d t h e H c h a i n e n h a n c e r ( 3 1 ) . T o d e t e r mi n ew h e t h e r q u a n t i t a t i v e mo d u l a t i o n o f O c t - 2 l e v e l s mi g h t a c -c o u n t f o r d i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n o f t h e s e o c t a me r - c o n t a i n i n gt r a n s c r i p t i o n u n i t s , we m e a s u r e d t h e r e l a t i v e a mo u n t s o f O c t - 2m R N A b y R N A s e p r o t e c t i o n i n a v a r i e t y o f p r e - B , B , a n dT c e l l s . Di f f e r e n c e s i n O c t - 2 mRN A l e v e l s , w h i l e e x t e n s i v e ,d i d n o t c o r r e l a t e w i t h t h e r e g u l a t i o n o f t h e V , V , , , p . g e r m-l i n e , o r DJ t r a n s c r i p t s ( F i g . 5 ) . E LA T c e l l s , wh i c h h a d h i g hl e v e l s o f O c t - 2 m R N A b u t n o d e t e c t a b l e V o r V , , t r a n -s c r i p t s , d i d , h o w e v e r , t r a n s c r i b e t h e g e r m l i n e H c h a i n l o c u s .M a t u r e B c e l l s h a d s i g n i f i c a n t a mo u n t s o f O c t - 2 m R N A a n dt h e y e x p r e s s e d V b u t n o t V t r a n s c r i p t s . T h e s i t u a t i o n i sr e v e r s e d i n H A F T L c e l l s , wh i c h h a d mo d e s t O c t - 2 m R N Al e v e l s a n d V b u t n o t V t r a n s c r i p t s . H A F T L c e l l s a l s o t r a n -s c r i b e d t h e g e r m l i n e H c h a i n g e n e , p r e s u ma b l y w i t h t h e i n -v o l v e me n t o f t h e o c t a me r - c o n t a i n i n g H c h a i n e n h a n c e r . T h e r e -f o r e , o t h e r f a c t o r s , p o s s i b l y a c t i n g i n c o n j u n c t i o n w i t h O c t - 2 ,

mu s t b e r e s p on s i b l e f o r d e t e r mi n i n g t h e p a t t e r n o f V , V . ,DJ , a n d g e r m l i n e W g e n e t r a n s c r i p t i o n d u r i n g d e v e l o p me n t .A P r o d u c t i v e H Ch a i n G e n e R e a r r a n g e m e n t D o e s No t A f f e c tGe r m l i n e H Ch a i n Ge n e T r a n s c r i p t i o n o r R e a r r a n g e m e n t . I ng e n e r a l , B c e l l s h a v e b e e n f o u n d t o e x p r e s s o n l y o n e f u n c -t i o n a l l y r e a r r a n g e d H c h a i n a n d o n e f u n c t i o n a l l y r e a r r a n g e dL c h a i n g e n e ( 1 0 , 1 1 ) . Va r i o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e h y p o t h e -s i z e d t h a t a l l e l i c e x c l u s i o n i s a r e g u l a t e d p h e n o m e n a ( 3 ) . T h a ti s , p r e - B c e l l s t h a t h a v e p r o d u c t i v e l y r e a r r a n g e d a n I g l o c u si n a c t i v a t e t h e a l l e l i c l o c u s f o r f u r t h e r r e a r r a n g e m e n t . F u r -t h e r mo r e , i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t e mp l a t e a c c e s s i b i l i t y ,a s r e f l e c t e d b y t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f u n r e a r r a n g e d g e n es e gme n t s , d e t e r mi n e s r e a r r a n g e m e n t ; a c t i v e l y t r a n s c r i b e d g e n e sr e a r r a n g e a n d , s i m i l a r l y , g e n e s t h a t a r e n o t t r a n s c r i b e d d on o t r e a r r a n g e . T o t e s t t h e s e h y p o t h e s e s , we e x a mi n e d a v a -r i e t y o f c e l l l i n e s w i t h p r o d u c t i v e H c h a i n g e n e r e a r r a n g e -me n t s f o r t h e i r l e v e l s o f u n r e a r r a n g e d g e n e t r a n s c r i p t i o n a n dt h e p r e s e n c e o f o n g o i n g H c h a i n l o c u s r e a r r a n g e m e n t .

We s t u d i e d A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me d p r e - B c e l l l i n e s w i t ht h e f o l l o w i n g H c h a i n g e n o t y p e s : 2 2 3 - 1 8 V DJ + / DJ ( + a n d- i n d i c a t e p r o d u c t i v e l y a n d n o n p r o d u c t i v e l y r e a r r a n g e d a l -l e l e s ) ; M8 V DJ - / DJ ; M9 V DJ + / DJ ; M1 0 V DJ - / DJ ;K 4 0 F . 1 V DJ - / DJ ; a n d K 4 0 F . 2 V DJ + / D J . K 4 0 F . 2 wa s o b -t a i n e d b y s i b - s e l e c t i o n f o r c y t o p l a s mi c p . f l u o r e s c e n c e f r o ma p o p u l a t i o n o f K 4 0 F . 1 ( A l a n Sh a p i r o a n d An t h o n y D e F r a n c o ,U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , S a n F r a n c i s c o ; u n p u b l i s h e d d a t a ) .P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t K 4 0 F . 2 wa s V D J + b y v i r t u e o fV g e n e r e p l a c e me n t ( s e e b e l o w) .R N A P C R a s s a y s o f DJ a n d V t r a n s c r i p t s s h o w e d n o

c o ns i s t e n t d i f f e r e n c e i n t h e a m o u n t o f DJ o r u n r e a r r a n g e d

F i g u r e 7 . DJ a n d V D J P C R a s s a y s o n v a r i o u s H c h a i n - p o s i t i v e a n d- n e g a t i v e p r e - B c e l l l i n e s . ( A ) T h e J 4 3 ' P C R p r i me r ( F i g . 1 ) wa s u s e dt o a ss ay t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s f o r r e a r r a n g e m e n t e v e n t s i n v o l v i n g J 3 a n dJ 4 ( B ) . T h e J 3 3 ' P C R p r i me r wa s u s e d t o e x a mi n e DJ 3 a n d V D J 3 r e a r -r a n g e me n t s i n t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s .

7 1 6 R e g u l a t i o n o f I g G e n e R e a r r a n g e m e n t i n V i r u s - t r a n s f o r me d P r e - B C e l l s


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V t r a n s c r i p t s b e t w e e n c e l l l i n e s t h a t p r o d u c e H c h a i n p r o -t e i n a n d t h o s e t h a t d o n o t ( F i g . 6 ) . T h e a s s a y p r o v i d e s q u a n -t i t a t i v e i n f o r ma t i o n b e c a u s e i n c r e a s i n g a mo u n t s o f 2 2 3 - 1 8R N A r e s u l t e d i n i n c r e a s i n g a mo u n t s o f a mp l i f i e d p r o d u c t( F i g . 6 , A a n d B ) . T h e r e f o r e , t h e p r e s e n c e o f a p r o d u c t i v eH c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t d o e s n o t a f f e c t t h e r e g u l a t i o no f u n r e a r r a n g e d g e n e t r a n s c r i p t i o n i n A b e l s o n v i r u s - t r a n s -f o r m e d p r e - B c e l l l i n e s .

We n e x t a s k e d w h e t h e r p r o d u c t i v e r e a r r a n g e m e n t o f t h eH c h a i n l o c u s i n a c t i v a t e d f u r t h e r H c h a i n g e n e r e a r r a n g e -

7 1 7 S c h l i s s e l e t a l .

F i g u r e 8 . V D J 3 r e a r r a n g e me n t s i n l i mi t i n gd i l u t i o n s u b c l o n e s o f H c h a i n - p o s i t i v e ( K 4 0 F . 2 )a n d - n e g a t i v e ( K 40 F . 1 ) c e l l l i n e s . T h e P C Ra s s a y o f V D J 3 r e a r r a n g e m e n t s i n 2 4 s u b c l o n e so f e a c h c e l l p o p u l a t i o n i s s h o w n w i t h t h e p o -s i t i o n o f t h e V D J 3 s i g n a l i n d i c a t e d . L a n e s l a -b e l e d M c o n t a i n p o s i t i v e c o n t r o l r e a c t i o n s , B Ic o n t a i n n o t e mp l a t e c o n t r o l s , a n d E 2 c o n t a i na n a s s a y o f t h e p a r e n t a l K 4 0 F . 2 c e l l p o p u l a t i o n .

men t i n t h e s e c e l l l i n e s . We u s e d a 3 ' p r i me r ( J 4 ; F i g . 1 ) d o w n -s t r e a m o f J H 4 t o l o o k a t r e a r r a n g e m e n t e v e n t s i n v o l v i n g J . 3a n d J H4 . De s p i t e b e i n g a c l o n ed , H c h a i n - p o s i t i v e c e l l l i n ew i t h t h e r e p o r t e d g e n o t y p e DJ 3 / V DJ 3 , 2 2 3 - 1 8 h a d r e a d i l yd e t e c t a b l e l e v e l s o f DJ 4 a n d V D J 4 r e a r r a n g e m e n t s i n a d d i -t i o n t o i t s p r o d u c t i v e l y r e a r r a n g e d V D J 3 a l l e l e ( F i g . 7 A ) .P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t b o t h MOM a n d K 4 0 F . 2 h a d t h eg e n o t y p e DJ 3 / V DJ 4 ( F i g . 7 A ) . T h e a mp l i f i e d V D J 4 a l l e l ei n K 4 0 F . 2 wa s s l i g h t l y s h o r t e r , l e a d i n g u s t o c o n c l u d e t h a te i t h e r a V g e n e r e p l a c e me n t e v e n t ( 3 2 ) o r a s ma l l d e l e t i o n

F i g u r e 9 . Ge r m l i n e I g g e n e t r a n s c r i p t i o na n d r e a r r a n g e m e n t i n c e l l l i n e s r e p r e s e n t i n gv a r i o u s s t a g e s o f B c e l l d e v e l o p me n t . T h ea p p r o x i ma t e d i s t r i b u t i o n o f g e n e r e a r r a n g e -m e n t i n H a n d L c h a i n l o c i , a s d e t e r mi n e db y P C R , i s i n d i c a t e d b e n e a t h e a c h c e l l l i n e .T h e a mo u n t s o f O c t - 2 a n d N F- K B v a r y i nt h e d i f f e r e n t c e l l l i n e s . T h e C K t r a n s c r i p ti s c o n s t i t u t i v e i n t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s , b u tma r k e d l y i n d u c i b l e i n 3 0 0 - 1 9 , 2 3 0 - 2 3 8 , a n dP D 3 1 . Da t a f o r N F- K B a r e f r o m b o t h o u ro wn wo r k a n d t h a t o f o t h e r s ( 1 9 , 3 6 - 4 1 ) .


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wa s r e s p o ns i b l e f o r K 4 0 F . 2 ' s H c h a i n p o s i t i v i t y . T h e p r e s -e n c e o f f a i n t a mp l i f i e d DJ 4 f r a g m e n t s i n b o t h s i b l i n g s i n d i -c a t e d r e ma r k a b l y s i m i l a r r a t e s o f o n g o i n g DJ r e a r r a n g e m e n tw i t h t h e p r e - e x i s t i n g D J L 3 a l l e l e b e i n g r e p l a c e d b y DJ 4 r e a r -r a n g e me n t s i n s o m e c h r o mo s o me s ( F i g . 7 A ) . A c l o s e r l o o ka t t h e DJ 3 a l l e l e u s i n g t h e J 3 3 ' P C R p r i me r s h o w e d t h a tV t o DJ j o i n i n g a l s o o c c u r r e d ( F i g . 7 B , l a n e s l a b e l e d V D J )d e s p i t e t h e p r e s e n c e o f a p r o d u c t i v e V D J 4 r e a r r a n g e m e n t .

T o c o mp a r e t h e r a t e s o f V t o DJ r e a r r a n g e m e n t i n t h e s es i b l i n g c e l l l i n e s d i f f e r i n g o n l y i n t h e f u n c t i o n a l n a t u r e o ft h e i r V D J 4 r e a r r a n g eme n t , we a n a l y z e d 2 4 l i mi t i n g d i l u t i o ns u b c l o n e s o f e a c h l i n e f o r t h e p r e s e n c e o f V t o DJ 3 r e a r r a n g e -me n t . A l l o f t h e s u b c l o n e s h a d r o u g h l y s i m i l a r a mo u n t s o fV D J r e a r r a n g e m e n t r e g a r d l e s s o f t h e p r e e x i s t e n c e o f a f u n c -t i o n a l l y r e a r r a n g e d H c h a i n g e n e ( F i g . 8 ) .We c o n c l u d e f r o m t h e s e o b s e r v a t i o n s t h a t A b e l s o n v i r u s -t r a n s f o r m e d p r e - B c e l l s d o n o t d e m o n s t r a t e a l l e l i c e x c l u s i o n

o f H c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t a n d t h a t H c h a i n p r o t e i n s y n -t h e s i s d o e s n o t a f f e c t u n r e a r r a n g e d H c h a i n g e n e t r a n s c r i p t i o n .

D i s c u s s i o nL y mp h o i d d e v e l o p me n t c o n s i s t s o f a c a s c ad e o f r e g u l a t e d ,a n d a p p a r e n t l y i n t e r d e p e n d e n t , t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n a n dg e n e r e a r r a n g e m e n t e v e n t s . D u r i n g t h e i r d e v e l o p me n t , c o m -mi t t e d p r o g e n i t o r c e l l s g i v e r i s e t o I g s u r f a c e - p o s i t i v e B c e l l so v e r t h e c o u r s e o f t h r e e t o f i v e c e l l d i v i s i o n s ( 3 3 ) . A b e l s o n

v i r u s , a n d o t h e r a g e n t s , c a n t r a n s f o r m c o mmi t t e d c e l l s i n t oc o n t i n u o u s l y g r o w i n g c e l l l i n e s t h a t d i s p l a y i n d e f i n i t e l y t h ec h a r a c t e r i s t i c s o f p r e - B c e l l s . We h a d p r e v i o u s l y s e e n t h a t i n -d i v i d u a l l i n e s d i f f e r i n p h e n o t y p e a n d c o mp r i s e a s e r i e s o fc e l l s t h a t d e f i n e s t e p s i n t h e d e v e l o p me n t o f t h e l i n e a g e ( 2 ) .Wi t h t h e v a s t l y mo r e s e n s i t i v e P C R a s s a y a n d w i t h t h ea b i l i t y t o a s s a y m a n y mo r e e v e n t s o f i mmu n o d i f f e r e n t i a t i o n ,we n o w s e e t h a t e a c h t r a n s f o r m e d c e l l l i n e r e p r e s e n t s a w i d e rr a n g e o f s t a g e s t h a n wa s p r e v i o u s l y e v i d e n t a n d t h a t w h e r e a sd e v e l o p me n t a l e v e n t s a r e i n i t i a t e d i n a t i me p r o g r e s s i o n , t h e r ei s l i t t l e t e r mi n a t i o n o f t h e e v e n t s ( F i g . 9 ) . T h u s , t h e s e c e l ll i n e s n e i t h e r d i s p l a y a l l e l i c e x c l u s i o n n o r d o t h e y t e r mi n a t eV t r a n s c r i p t i o n e v e n i f t h e y c o n t a i n a n d e x p r e s s a p r o d u c -t i v e V DJ a l l e l e . We c o n c l u d e t h a t t r a n s f o r m e d p r e - B c e l l sa r e v a l u a b l e f o r s t u d y i n g t h e i n i t i a t i o n o f v a r i o u s s t a g e s o fi mmu n o d i f f e r e n t i a t i o n b u t n o t n e c e s s a r i l y t h e i r f u r t h e r r e g u -l a t i o n . We c a n f i n d a p e r f e c t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e i n i t i a -t i o n o f t r a n s c r i p t i o n o f a g e n e s e g me n t a n d i t s a b i l i t y t o b er e a r r a n g e d a s wa s i mp l i e d b y p r e v i o u s , mo r e f r a g m e n t a r y e v i -d e n c e ( F i g . 9 ) ( 9 , 2 4 , 2 9 , 3 4 ) .

T h e C o n t r o l o f i s G e n e T r a n s c r i p t i o n a n d Re a r r a n g e me n t . T h i ss t u d y h a s p r o v i d e d t h e f i r s t d a t a o n t h e i n i t i a t i o n o f t r a n -s c r i p t i o n a r o u n d t h e i s L c h a i n l o c u s . Bo t h V , , a n d C K t r a n -s c r i p t i o n a r e u n de t e c t a b l e i n t h e H A F T L c e l l l i n e s , t h e e a r l i e s ts t a g e we h a v e t h a t a c t i v e l y r e a r r a n g e s H c h a i n l o c i , a n d b e -c o m e e v i d e n t s i mu l t a n e o u s l y i n 3 0 0 - 1 9 a n d 2 3 0 - 2 3 8 , l i n e st h a t r e p r e s e n t mo r e m a t u r e s t a g e s i n t h e l i n e a g e . T h e s e e v e n t sc o r r e l a t e t o t h e a p p e a r a n c e o f a c t i v e NF - K B i n t h e c e l l n u -c l e u s , wh i c h c o u l d d i r e c t C, , t r a n s c r i p t i o n b y b i n d i n g t o i t ss i t e i n t h e i n t r o n r c e n h a n c e r . T h e V g e n e s , h o w e v e r , h a v en o k n o w n N F - 0 s i t e s i n t h e i r p r o m o t e r s . O c t - 2 , a p r o t e i n

o f t h e B c e l l l i n e a g e , i s p r e s en t i n H A F T L c e l l s a n d t h e r e f o r ed o e s n o t c o r r e l a t e t o K g e n e s e g m e n t t r a n s c r i p t i o n . I t a l s od o e s n o t c o r r e l a t e w i t h e i t h e r V o r Cu t r a n s c r i p t i o n ( F i g .9 ) , a n d t h e r e f o r e d o e s n o t a p p e a r t o h a v e a d e t e r mi n a t i v e r o l ei n a n y o f t h e r e g u l a t o r y e v e n t s we h a v e s t u d i e d .

T h e Re l a t i o n s h i p b e t w e e n T r a n s c r i p t i o n a n d I g G e n e R e a r r a n g e -m e n t . Ou r d a t a s u p p o r t t h e n o t i o n t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y o f g e r m l i n e I g g e n e s e i t h e r c a u s e s o r r e f l e c t s l o c a lc h a n g e s i n c h r o mo s o me s t r u c t u r e t h a t p l a y a r o l e i n t a r g e t i n gt h e r e a r r a n g e m e n t p r o c e s s . A l l r e a r r a n g i n g l o c i i n c u l t u r e dp r e - B c e l l s a r e t r a n s c r i b e d b e f o r e o r c o i n c i d e n t w i t h t h e i r r e a r -r a n g e m e n t ( F i g . 9 ) . F u r t h e r m o r e , DJ , b u t n e v e r V D J , r e a r -r a n g e m e n t o c c u r s i n s o m e T c e l l s ( 2 0 ) , a n d we f o u n d t h a ts o m e T c e l l s t r a n s c r i b e t h e g e r m l i n e H c h a i n c o n s t a n t r e -g i o n g e n e b u t n o t t h e V l o c u s .

We c a n s u g g e s t s e v e r a l w a y s i n w h i c h t r a n s c r i p t i o n a n dr e c o mb i n a t i o n mi g h t b e r e l a t e d . T h e r e c o mb i n a t i o n a p p a r a t u smi g h t i n t e r a c t d i r e c t l y w i t h s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o rr e c o g n i z e D N A s e q u e n c e s ma d e a c c e s s i b l e b y t h e p r e s e n c eo f t r a n s c r i p t i o n c o mp l e x e s . A l t e r n a t i v e l y , i t mi g h t u t i l i z eg e r m l i n e t r a n s c r i p t s i n t h e r e a r r a n g e m e n t me c h a n i s m . C o n -v e r s e l y , i t i s p o s s i b l e t h a t t r a n s c r i p t i o n i s t h e r e s u l t o f r e c o m-b i n a s e i n t e r a c t i o n w i t h v a r i o u s l o c i a n d t h e s t r u c t u r a l c h a n g e st h e s e i n t e r a c t i o n s mi g h t i n d u c e . T h i s i s s o m e w h a t l e s s l i k e l yi n o u r v i e w s i n c e t h e a p p e a r a n c e o f g e r ml i n e C t r a n s c r i p t sc l e a r l y p r e c e d e s g e n e r e a r r a n g e m e n t a n d i n c r e a s e d K t r a n -s c r i p t i o n c o r r e l a t e s w i t h a n i n c r e a s e d r a t e o f K g e n e r e a r r a n g e -me n t ( 9 ) .Wh i l e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n p r o v i d e s a s a t i s f y i n g e x -p l a n a t i o n f o r t h e t a r g e t i n g o f r e a r r a n g e m e n t , t h e p r e s e n t s t u d yd o e s n o t a l l o w u s t o m a k e c o n c l u s i o n s r e g a r d i n g t h e p o t e n -t i a l r o l e o f t r a n s c r i p t i o n i n t h e i n a c t i v a t i o n o f H c h a i n g e n er e a r r a n g e m e n t b e c a u s e w e h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t Hc h a i n - p o s i t i v e c e l l l i n e s c o n t i n u e t o r e a r r a n g e t h e H c h a i nl o c u s .H Ch a i n P r o t e i n a n d t h e Re gu l a t i o n o f G e n e R e a r r a n g e -

m e n t . H c h a i n p r o t e i n i s f i r s t d e t e c t e d i n t h e p r e - B c e l l l i n -e a g e b e f o r e t h e a c t i v a t i o n o f K g e n e r e a r r a n g e m e n t ( 2 ) . F u r -t h e r m o r e , n o r e p o r t s e x i s t o f m a t u r e B c e l l s t h a t p r o d u c et wo H c h a i n p r o t e i n s c a r r y i n g d i f f e r e n t i d i o t y p e s ( a l l e l i c e x -c l u s i o n ; 1 0 , 1 1 ) . T h e s e f a c t s h a v e l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a tH c h a i n p r o t e i n mi g h t s e r v e a c e n t r a l r e g u l a t o r y r o l e i n t h eB c e l l l i n e a g e , s i g n a l l i n g t h e c e s s a t i o n o f H c h a i n g e n e r e a r -r a n g e me n t a n d t h e a c t i v a t i o n o f L c h a i n r e a r r a n g e m e n t ( 3 ,6 , 8 ) . On e r e p o r t s u g g e s t e d t h a t a t r a n s f e c t e d , p r o t e i n -p r o d u c i n g H c h a i n g e n e c o u l d a r r e s t V t o DJ j o i n i n g a n da c t i v a t e K r e a r r a n g e m e n t i n t h e c e l l l i n e 3 0 0 - 1 9 ( 8 ) . A s e c o n dr e p o r t ( 2 9 ) s h o w e d t h a t g e r m l i n e V g e n e t r a n s c r i p t i o n d e -c r e a s e d i n t r a n s f o r m e d c e l l s c o n t a i n i n g a f u n c t i o n a l H c h a i ng e n e r e a r r a n g e m e n t .

We c o m p a r e d A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me d p r e - B c e l l s o fs i m i l a r ma t u r i t y t h a t d i f f e r e d o n l y i n t h e o u t c o me o f t h e i rH c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t : 2 2 3 - 1 8 , M9 , a n d K 4 0 F . 2 p r o -d u c e d H c h a i n p r o t e i n , w h e r e a s M8 , M1 0 , a n d K 4 0 F . 1 d i dn o t . Ou r R N A P C R a s s a y s f a i l e d t o r e v e a l a d i f f e r e n c e i ng e r m l i n e V o r DJ t r a n s c r i p t i o n a m o n g t h e s e c e l l l i n e s ( F i g .6 ) . M o r e o v e r , H c h a i n - p r o d u c i n g c e l l l i n e s c o n t i n u e d t o r e a r -r a n g e t h e H c h a i n l o c u s ( F i g s . 7 a n d * 8 ) . We c o n c l u d e t h a t

7 1 8 R e g u l a t i o n o f I g G e n e R e a r r a n g e me n t i n V i r u s - t r a n s f o r me d P r e - B C e l l s


9/10

H c h a i n p r o t e i n d o e s n o t r e g u l a t e u n r e a r r a n g e d H c h a i n g e n et r a n s c r i p t i o n o r r e a r r a n g e m e n t i n A b e l s o n v i r u s - t r a n s f o r me dp r e - B c e l l s . T h e r o l e o f H c h a i n p r o t e i n i n t h e r e g u l a t i o no f I g g e n e r e a r r a n g e me n t i n n o n t r a n s f o r me d c e l l s r e ma i n st o b e e l u c i d a t e d .

T h e s e r e s u l t s a r e i n a p p a r e n t c o n t r a d i c t i o n wi t h t h o s e o b -t a i n e d f r o m s e v e r a l s e t s o f e x p e r i me n t s i n v o l v i n g I g H c h a i nt r a n s g e n i c mi c e w h e r e i n h i b i t i o n ( a l b e i t i n c o mp l e t e ) o f e n -d o g e n o u s H c h a i n g e n e r e a r r a n g e m e n t w a s o b s e r v e d ( r e v i e we di n r e f e r e n c e 3 5 ) . T h e t r a n s g e n i c e x p e r i me n t s we r e a n a l y z e de i t h e r b y u s i n g A b e l s o n v i r u s o r h y b r i d o ma t e c h n o l o g y t o

Re f e r e n c e s

g e n e r a t e p r e - B a n d B c e l l c l o n e s a n d b y d e t e r mi n i n g t h e i rg e n o t y p e s b y b l o t t i n g o r b y a s s e s s i n g e n d o g e n o u s a n t i b o d yp r o d u c t i o n i mmu n o l o g i c a l l y . T h e y c l e a r l y i n d i c a t e d t h a t t r a n s -g e n i c e x p r e s s i o n o f o n e c o mp l e t e H c h a i n g e n e c a n p a r t i a l l yi n h i b i t r e a r r a n g e m e n t o f t h e e n d o g e n o u s H c h a i n g e n e s e g -me n t s . Wh i l e a v a r i e t y o f i n t e r p r e t a t i o ns o f b o t h o u r e x p e r i -me n t s a n d t h e H c h a i n t r a n s g e n i c e x p e r i me n t s a r e p o s s i b l e ,t h e t r a n s g e n i c r e s u l t s a r e p a r t i c u l a r l y c l e a r , a n d i t r e ma i n st o b e s h o w n w h y t h e A b e l s o n v i r u s t r a n s f o r m a n t s d o n o tb e h a v e a s mi g h t h a v e b e e n p r e d i c t e d f r o m t h e m .

We t h a n k Dr s . P e t e r J a c k s o n a n d T o n y D e F r a n c o f o r c o mme n t s o n t h e ma n u s c r i p t a n d f o r m a n y h e l p f u ld i s c u s s i o n s . We a l s o t h a n k Dr s . N . R o s e n b e r g a n d T De F r a n c o , a n d Mr . A . Sh a p i r o f o r p r o v i d i n g c e l l l i n e s .T h i s wo r k wa s s u p p o r t e d b y U . S . P u b l i c He a l t h Se r v i c e g r a n t GM- 3 9 4 5 8 . M . S . S c h l i s s e l i s s u p p o r t e db y a B r i s t o l - My e r s C a n c e r R e s e a r c h F e l l o ws h i p . L . M. C o r c o r a n i s a L i f e S c i e n c e s R e s e a r c h F o u n d a t i o n F e l l o wA d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o Da v i d B a l t i mo r e , T h e Ro c k e f e l l e r Un i v e r s i t y , 1 2 3 0 Y o r k A v e n u e , N e w Y o r k ,N Y 1 0 0 2 1 .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 9 Oc t o b e r 1 99 0 a nd i n r e v i s e d f o r m 1 7 D e c e m b e r 1 9 9 0 .

1 . A l t , F . , N . R o s e n b e r g , S . L e wi s , E . T h o m a s , a n d D . B a l t i -mo r e . 1 9 8 1 . Or g a n i z a t i o n a n d r e o r g a n i z a t i o n o f i mmu n o g l o b -u l i n g e n e s i n A - Mu L V t r a n s f o r me d c e l l s : r e a r r a n g e m e n t o fh e a v y b u t n o t l i g h t c h a i n g e n e s . C e l l . 2 7 : 3 8 1 .2 . A l t , F . , G Y a n c o p o u l o s , T . B l a c k we l l , C . W o o d , E . T h o m a s ,M . B o s s , R . C o f f ma n , N . R o s e n b e r g , S . T o n e g a w a , a n d D .B a l t i mo r e . 1 9 8 4 . O r d e r e d r e a r r a n g e m e n t o f i mmu n o g l o b u l i nh e a v y c h a i n v a r i a b l e r e g i o n s e g me n t s . E M B O ( E u r Mo l . B i o l .Or g a n ) J . 3 : 1 2 0 9 .3 . A l t , F . , T B l a c k we l l , a n d G . Y a n c o p o u l o s . 1 9 8 7 . D e v e l o p me n to f t h e p r i ma r y a n t i b o d y r e p e r t o i r e . S c i e n c e ( Wa s h . D C ) . 2 3 8 :1 0 7 9 .4 . P a l a c i o s , R . , H . K a r a s u y a ma , a n d A . R o l i n k . 1 9 8 7 . L y l +P R O - B l y mp h o c y t e c l o n e s . P h e n o t y p e , g r o wt h r e q u i r e me n t sa n d d i f f e r e n t i a t i o n i n v i t r o a n d i n v i v o . E M B O ( E u r . Mo t . B i o l .Or g a n ) J . 6 : 3 6 8 7 .

5 . A l e s s a nd r i n i , A . , J . H . P i e r c e , D . Ba l t i mo r e , a n d S . V. De s i d e r i o .1 9 8 7 . C o n t i n u i n g r e a r r a n g e m e n t o f i mmu n o g l o b u l i n a n d T - c e l lr e c e p t o r g e n e s i n a H a - r a s - t r a n s f o r m e d l y mp h o i d p r o g e n i t o rc e l l l i n e . P r o c . Na t l . A c a d . S c i . US A . 8 4 : 1 7 9 9 .

6 . R e t h , M . , P . A mmi r a t i , S . J a c k s o n , a n d F . A l t . 1 9 8 5 . R e g u -l a t e d p r o g r e s s i o n o f a c u l t u r e d p r e - B - c e l l l i n e t o t h e B - c e l l s t a g e .N a t u r e ( L o n d . ) 3 1 7 : 3 5 3 .7 . L e wi s , S . , N . R o s e n b e r g , F . A l t , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 2 . C o n -t i n u i n g k a p p a - g e n e r e a r r a n g e me n t i n a c e l l l i n e t r a n s f o r m e db y A b e l s o n mu r i n e l e u k emi a v i r u s . C e l l . 3 0 : 8 0 7 .8 . Re t h , M . , E . P e t r a c , P . Wi e s e , L . L o b e l , a n d F . A l t . 1 9 8 7 .A c t i v a t i o n o f V K g e n e r e a r r a n g e m e n t i n p r e - B c e l l s f o l l o w s t h ee x p r e s s i o n o f me mb r a n e - b o u n d i mmu n o g l o b u l i n h e a v y c h a i n s .E M B O ( E u r . Mo l . B i o l . O r g a n ) J . 6 : 3 2 9 9 .9 . S c h l i s s e l , M . , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 9 . A c t i v a t i o n o f i mmu n o -

g l o b u l i n k a p p a g e n e r e a r r a n g e m e n t c o r r e l a t e s w i t h i n d u c t i o no f g e r ml i n e k a p p a g e n e t r a n s c r i p t i o n . C e l l . 5 8 : 1 0 0 1 .1 0 . Ce b r a , J . , J . E . Co l b e r g , a n d S . D r y . 1 9 6 6 . Ra b b i t l y mp h o i d7 1 9 S c h l i s s e l e t a l .

1 4 .1 5 .

c e l l s d i f f e r e n t i a t e d w i t h r e s p e c t t o a , t i a n d u - h e a v y p o l y p e p -t i d e c h a i n s a n d t o a l l o t y p i c m a r k e r s A A 1 a n d A A 2 . J . E x pMe d . 1 2 3 : 5 4 7 .P e r n i s , B . G . , G . Ch i a p p i n o , A . S . K e l u s , a n d P . G . H . Ge l l . 1 9 6 5 .C e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f i mmu n o g l o b u l i n s w i t h d i f f e r e n t a l l o -t y p e s pe c i f i c i t i e s i n r a b b i t l y mp h o i d t i s s u e ] E x p Me d . 1 2 2 : 8 5 3 .R o s e n b e r g , N . , D . B a l t i mo r e , a n d C . D . S c h e r . 1 9 7 5 . I n v i t r ot r a n s f o r ma t i o n o f l y mp h o i d c e l l s b y A b e l s o n mu r i n e l e u k e mi av i r u s . P r o c . Na t l . A c a d . S c i . US A . 7 2 : 1 9 3 2 .A us u b e l , F . M . , R . B r e n t , R . K i n g s t o n , D . M o o r e , J . G .S e i d ma n , J . A . S mi t h , a n d K . S t r u h l . 1 9 8 7 . C u r r e n t P r o t o c o l si n Mo l e c u l a r B i o l o g y . J o h n W l e y & S o n s , I n c . , N e w Y o r k .4 . 2 . 1 - 4 . 2 . 3 .I n n i s , M . A . , D. H . Ge l f a n d , J . J . Sn i n s k y , a n d T . J . Wh i t e . 1 9 9 0 .P C R P r o t o c o l s . A c a d e mi c P r e s s , I n c . , S a n D i e g o , C A . 2 1 - 2 7 .F e i n b e r g , A . P . , a n d B . Vo g e l s t e i n . 1 9 8 3 . A t e c h n i q u e f o r r a d i o -l a b e l i n g D N A r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e f r a g me n t s t o h i g hs p e c i f i c a c t i v i t y . A n a l . B i o c h e m 1 3 2 : 6 .Or l a n d i , R. , D . H . G u s s o w , P . T . J o n e s , a n d G . Wi n t e r . 1 9 8 9 .C l o n i n g i mmu n o g l o b u l i n v a r i a b l e d o ma i n s f o r e x p r e s s i o n b yt h e p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A .8 6 : 3 8 3 3 .C l e r c , R . G . , L . M . C o r c o r a n , J . H . L e b o wi t z , D . Ba l t i mo r e ,a n d P. A . S h a r p . 1 9 8 8 . T h e B - c e l l s p e c i f i c O c t - 2 p r o t e i n c o n -t a i n s P O U b o x - a n d h o m e o b o x - t y p e d o ma i n s . G e n e s & De v .2 : 1 5 7 0 .S p o l s k i , R . , G . Mi e s c h e r , R. E r a r d , R . R i s s e r , H . R . Ma c -D o n a l d , a n d T . W Ma k . 1 9 8 8 . R e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n o f Tc e l l g a m m a c h a i n , L 3 T 4 a n d L y - 2 me s s a g e s i n A b e l s o n /Mo l o n e y v i r u s - t r a n s f o r me d T c e l l l i n e s . E u r . . J . I mmu n o l . 1 8 : 2 9 5 .Y a n c o p o u l o s , G . , S . De s i d e r i o , M . P as k i n , J . K e a r n e y , D . B a l -t i mo r e , a n d F . A l t . 1 9 8 4 . P r e f e r e n t i a l u t i l i z a t i o n o f t h e mo s tJ p r o x i ma l V g e n e s e g me n t s i n p r e - B - c e l l l i n e s . N a t u r e( L o n d . ) . 3 1 1 : 7 2 7 .


10/10

2 0 . K u r o s a w a , Y . , H . v o n B o e h me r , W H a a s , H . S a k a n o , A .T r a u n e k e r , a n d S . T o n e g a w a . 1 9 8 1 . I d e n t i f i c a t i o n o f D s e g me n t so f i mmu n o g l o b u l i n h e a v y - c h a i n g e n e s a n d t h e i r r e a r r a n g e m e n ti n T l y mp h o c y t e s . N a t u r e ( L o n d . ) . 2 9 0 : 5 6 5 .2 1 . T o n e g a w a , S . 1 9 8 3 . S o ma t i c g e n e r a t i o n o f a n t i b o d y d i v e r s i t y .N a t u r e ( L o n d. ) . 3 0 2 : 5 7 5 .2 2 . H e s s e , J . , M . L i e b e r , M . G e l l e r t , a n d K . Mi z u u c h i . 1 9 8 7 . E x -t r a c h r o mo s o ma l D N A s u b s t r a t e s i n p r e - B c e l l s u n d e r g o i n v e r -s i o n o r d e l e t i o n a t i mmu n o g l o b u l i n V ( D ) J j o i n i n g s i g n a l s .C e l l . 4 9 : 7 7 5 .2 3 . L e wi s , S . , A . G i f f o r d , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 5 . D N A e l e me n t sa r e a s y mme t r i c a l l y j o i n e d d u r i n g t h e s i t e - s p e c i f i c r e c o mb i n a -t i o n o f k a p p a i mmu n o g l o b u l i n g e n e s . S c i e n c e ( W a s h . DC ) .2 2 8 : 6 7 7 .2 4 . Re t h , M . , a n d F . A l t . 1 9 8 4 . N o v e l i mmu n o g l o b u l i n h e a v yc h a i n s a r e p r o d u c e d f r o m DJ g e n e s e g m e n t r e a r r a n g e m e n t si n l y mp h o i d c e l l s . Na t u r e ( L o n d . ) . 3 1 2 : 4 1 8 .2 5 . K e l l e y , D . , B . P o l l o k , M. A t c h i s o n , a n d R . P e r r y . 1 9 8 8 . T h ec o u p l i n g b e t w e e n e n h a n c e r a c t i v i t y a n d h y p ome t h y l a t i o n o fK i mmu n o g l o b u l i n g e n e s i s d e v e l o p me n t a l l y r e g u l a t e d . Mo tCe l l . B i o l . 8 : 9 3 0 .

2 6 . P e r r y , R . , D . K e l l e y , C . Co l e c l o u g h , J . S e i d ma n , P . L e d e r , S .T o n e g a w a , G . M a t t h y s s e n s , a n d M . We i g e r t . 1 9 8 0 . T r a ns c r i p -t i o n o f m o u s e u c h a i n g e n e s : I m p l i c a t i o n s f o r a l l e l i c e x c l u s i o n .P r o c Na d . A c a d . S c i . U S A . 7 7 : 1 9 3 7 .2 7 . Ne l s o n , K . , D . K e l l e y , a n d R . P e r r y . 1 9 8 5 . I n d u c i b l e t r a n s c r i p -t i o n o f t h e u n r e a r r a n g e d K c o n s t a n t r e g i o n l o c us i s a c o m m o nf e a t u r e o f p r e - B c e l l s a n d d o e s n o t r e q u i r e D N A o r p r o t e i ns y n t h e s i s . P r o c . Na d . A c a d . S c i . U S A . 8 2 : 5 3 0 5 .2 8 . P i e r c e , J . W , M . L e n a r d o , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 8 . Ol i g o n u -c l e o t i d e t h a t b i n d s n u c l e a r f a c t o r N F K B a c t s a s a l y mp h o i d -s p e c i f i c a n d i n d u c i b l e e n h a n c e r e l e me n t . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .US A . 8 5 : 1 4 8 2 .2 9 . Y a n c o po u l o s , G , a n d F . A l t . 1 9 8 5 . De v e l o p me n t a l l y c o n t r o l l e da n d t i s s u e - s p e c i f i c e x p r e s s i o n o f u n r e a r r a n g e d V g e n e s e g -me n t s . C e l l . 4 0 : 2 7 1 .3 0 . P ar s l o w, T G . , W J . B l a i r , WJ . M u r p h y , a n d D . K . G r a n n e r .1 9 8 4 . S t r u c t u r e o f t h e 5 ' e n d s o f i mmu n o g l o b u l i n g e n e s : an o v e l c o n s e r v e d s e q u e n c e . P r o c . Na t l . A c a d . S c i . U S A . 8 1 : 2 6 5 0 .3 1 . S t a u d t , L . M . , R. G . C l e r c , H . S i n g h , J . H . L e Bo w i t z , P A . S h a r p ,

7 2 0

a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 8 . C l o n i n g o f a l y mp h o i d - s p ec i f i c c D NAe n c o d i n g a p r o t e i n b i n d i n g t h e r e g u l a t o r y o c t a me r D N A mo t i f .S c i e n c e ( Wa s h . DC ) . 2 4 1 : 5 7 7 .3 2 . Re t h , M , P Ge h r ma n n , E . P e t r a c , a n d P W e s e . 1 9 8 6 . A n o v e lV t o V DJ j o i n i n g me c h a n i s m i n h e a v y - c h a i n - n e g a t i v e ( n u l l )p r e - B c e l l s r e s u l t s i n h e a v y - c h a i n p r o d u c t i o n . N a t u r e ( L o n d. ) .3 2 2 : 8 4 0 .3 3 . S t r a s s e r , A . , A . Ro l i n k , a n d F . Me l c h e r s . 1 9 8 9 . On e s y n -c h r o n o u s w a v e o f B c e l l d e v e l o p me n t i n m o u s e f e t a l l i v e r c h a n g e sa t d a y 1 6 o f g e s t a t i o n f r o m d e p e n d e n c e t o i n d e p e n d e n c e o fa s t r o ma l c e l l e n v i r o n me n t . J . E x p . Me d . 1 7 0 : 1 9 7 3 .3 4 . B l a c k we l l , T , M . M o o r e , G . Y a nc o p o u l o s , H . S u h , S . L u t z k e r ,E . S e l s i n g , a n d F . A l t . 1 9 8 6 . R e c o mb i n a t i o n b e t w e e n i mmu -n o g l o b u l i n v a r i a b l e r e g i o n g e n e s e g me n t s i s e n h a n c e d b y t r a n -s c r i p t i o n . N a t u r e ( L o n d. ) . 3 2 4 : 5 8 5 .3 5 . S t o r b , U . 1 9 8 7 . T r a n s g en i c mi c e w i t h i mmu n o g l o b u l i n g e n e s .A n n u . Re v . I mmu n o l . 5 : 1 5 1 .3 6 . A t c h i s o n , M , a n d R. P e r r y . 1 9 8 7 . T h e r o l e o f t h e K e n h a n c e ra n d i t s b i n d i n g f a c t o r NF - K B i n t h e d e v e l o p me n t a l r e g u l a t i o no f K g e n e t r a n s c r i p t i o n . C e l l . 4 8 : 1 2 1 .3 7 . L e n a r d o , M . , J . W P i e r c e , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 7 . P r o t e i n -b i n d i n g s i t e s i n I g g e n e e n h a n c e r s d e t e r m i n e t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y a n d i n d u c i b i l i t y . S c i e n c e ( Wa s h . DC ) . 2 3 6 : 1 5 7 3 .

3 8 . P i e r c e , J . W , M . L e n a r d o , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 8 . O l i g o n u -c l e o t i d e t h a t b i n d s n u c l e a r f a c t o r NF - K B a c t s a s a l y mp h o i d -s p e c i f i c a n d i n d u c i b l e e n h a n c e r e l e me n t . P r o c . Na t l . A c a d S c i .U S A . 8 5 : 1 4 8 2 .3 9 . S e n , R . , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 6 . I n d u c i b i l i t y o f K i mmu n o -g l o b u l i n e n ha n c e r - b i n d i n g p r o t e i n NF - K B b y a p o s t t r a n s l a t i o n a lme c h a n i s m . C e l l . 4 7 : 9 2 1 .4 0 . S e n , R . , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 6 . Mu l t i p l e n u c l e a r f a c t o r s i n -t e r a c t w i t h t h e i mmu n o g l o b u l i n e n h a n c e r s e q u e n c e s . C e l l .4 6 : 7 0 5 .

4 1 . S e n , R . , a n d D . B a l t i mo r e . 1 9 8 6 . Nu c l e a r f a c t o r s i n t e r a c t i n gw i t h t h e i mmu n o g l o b u l i n h e a v y a n d K e n h a n c e r s . I n T r a n s c r i p -t i o n a l C o n t r o l Me c h a n i s ms . U C L A S y mp o s i a o n Mo l e c u l a ra n d Ce l l u l a r B i o l o g y , N e w S e r i e s . V o l . 5 2 . D . K . G r a n n e r , GRo s en f i e l d , a n d S . C h a n g , e d i t o r s . A l a n R . L i s s , I n c . , N e wY o r k .

Re g u l a t i o n o f I g Ge n e Re a r r a n g eme n t i n V i r u s - t r a n s f o r me d P r e - B C e l l s

1984 schlissel virus-transformed pre-b cells show ordered activation but not inactivation of...

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