7 identifikacija gljiva antimikogram
DESCRIPTION
identifikacija gljivaTRANSCRIPT
1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva
1. Principi LDg PGI: dlake nokta kože sluzokože oka uva
Cilj nastave:
2. Principi LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija
2. Principi LDg IGI:
aglutinacija, precipitacija, ELISA, PCR, PH
invazivna aspergiloza (IA) invazivna kandidijaza (IC) zigomikoze Pneumocystis pneumonija
3. Metode identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest
3. Metode identifikacije gljiva
Metode ispitivanja
osetljivosti gljiva na AM Difuzija Dilucija Etest
4. Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze
4. Epidemiologija GI
Rizične grupe pacijenata Endemske GI
(bifazne i subkutane mikoze)
Mikoalergeni i mikoalergoze Mikotoksini i mikotoksikoze
Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vrši se na osnovu:
Makroskopskih kulturalnih karakteristika
Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA)
Specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA)
Fizioloških karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...)
Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...)
Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA)
Odredjivanja DNK sekvenci karakterističnih za vrstu (npr. PCR)
Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)
Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)
Identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva vrši se na osnovu:
Makroskopskih kulturalnih karakteristika
Mikroskopskih kulturelnih karakteristika (preparat sa SDA, HA, PDA, DTM, MSIA)
Specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama (GACA)
Fizioloških karakteristika (germinacija, produkcija ureaze, kapsule...)
Biohemijske identifikacije (API, Candida Chrom Agar...)
Odredjivanja antigenske gradje izolovanih gljiva (npr. LA)
Odredjivanja DNK sekvenci karakterističnih za vrstu (npr. PCR)
Odredjivanja faktora virulencije (detekcija enzima, mikotoksina...)
Odredjivanja rezistencije na AM (rezistotipija)
Metode identifikacije gljiva:
Na osnovu specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama
(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)
Na osnovu fizioloških karakteristika
(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)
Na osnovu biohemijskih karakteristika
(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)
Na osnovu specifičnosti rasta na diferencijalnim podlogama
(GACA razlikovanje C. neoformans od Candida; kukuruzni agar hlamidospore formira samo C. albicans)
Na osnovu fizioloških karakteristika
(germinacija karakterstika C. albicans; produkcija kapsule karakteristika C. neoformans)
Na osnovu biohemijskih karakteristika
(API sistemi za fermentaciju i asimilaciju; podloge sa hromogenim suptancama Chrom-agar)
Hrom agar – IDENTIFIKACIJA kvasnica
C. tropicalisC. tropicalis
C. glabrataC. glabrata C. kruseiC. krusei
C. albicansC. albicans
Biohemijska karakterizacija IDENTIFIKACIJA kvasnica
Identifikacija i ispitivanje njihove osetljivosti Candida
Biohemijska serija ID32 (bioMerieux, Paris) UNI-YEAST-TEC PLATE
Biohemijska identifikacija kvasnica
API ZYM - enzimska karakterizacija gljiva
C. parapsilosis C. dubliniensis
ANTIMIKOGRAM I ANTIMIKOTICI
• Ozbiljan i često loš klinički tok i prognoza IGI, RVVK i sl.
• Promenjen empirijski koncept lečenja gljivičnih infekcija zasnivan na pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM)
• Toksičnost i druga neželjena dejstva AM i ograničena primena
• Veći izbor AM, posebno za parenteralnu primenu
• Ozbiljan i često loš klinički tok i prognoza IGI, RVVK i sl.
• Promenjen empirijski koncept lečenja gljivičnih infekcija zasnivan na pretpostavci da su gljive generalno osetljive na antimikotike (AM)
• Toksičnost i druga neželjena dejstva AM i ograničena primena
• Veći izbor AM, posebno za parenteralnu primenu
Zbog čega antimikogram?
Metode ANTIMIKOGRAMA: Difuzija Dilucija Etest
Metode ANTIMIKOGRAMA: Difuzija Dilucija Etest
UPOTREBA AM: Profilaksa Empirujska th “Pre-emptive” th Specifična th
UPOTREBA AM: Profilaksa Empirujska th “Pre-emptive” th Specifična th
Geo
rgop
apad
akou
NH
, Wa l
s h T
. Nat
u re
1994
; 264
: 371Membrane function:
Amphotericin BCellwall synthesis:
Echinocandins
Ergosterol synthesis:Azoles
Ciljne strukture gljiva i mehanizmi dejstva AM
Nys
tatin
Am
phot
eric
in B
(195
8)
Gris
eofu
lvin
5-FCMiconazole
KetoconazoleFluconazole
Itraconazole
L-AmB ABCD ABLC
Terbinafine
VoriconPosacon
XM
P
Sordarins
Cas
po
fun
gin
MicafunRavucon
Ani
du
lafu
ngi
n
# broj lekova
0
2
4
6
8
10
12
14
1950 1960 1970 1980 1990 2000
Razvoj AM
Kombinovani metod (E test)48 h48 h
Difuzioni metod24-48 h24-48 h
Dilucioni metod48 - 72 h48 - 72 h
Automatski sistemi – identifikacija i AM>> 2 24 h4 h
Metode antimikograma
Disk difuzija, Etest i mikrodilucioni metod
100 µl100 µl
suspenzijasuspenzija
AM (µg/ml)AM (µg/ml)
BujonBujon
MFK = 0,5 µg/mlMFK = 0,5 µg/mlMFKMFK
MIKMIK MIK = 0,25 µg/mlMIK = 0,25 µg/ml
++
24 h24 h37°C37°C
2424 hh37°C37°C
0,030,030,060,060,1250,1250,250,250,50,5
MIKMIK: najmanja : najmanja koncentracija AM koja koncentracija AM koja inhibira porast gljiva inhibira porast gljiva (bujon ostaje bistar)(bujon ostaje bistar)
MFKMFK: presejavanjem svih : presejavanjem svih razblaženja koja inhibiraju porast razblaženja koja inhibiraju porast gljiva gljiva
Bujon dilucioni metod
24 h24 h
37°C37°C
111.51.5
.75.75
.50.50
.35.35
.25.25
.10.10
.05.05
.02.02
.01.01
223344881212
Plastična traka impregniranaPlastična traka impregniranaAM u gradijentuAM u gradijentu
koncentracijekoncentracije
11
1.51.5
.75.75
.50.50
.35.35
.25.25
.10.10
.05.05
.02.02.01.01
22
334488
1212
• Zasniva se na principu difuzije AM kroz čvrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom kulturom• Opadajući gradijent koncentracije AM na traci E testa
Zona inhibicijeZona inhibicije
elipsaelipsa
MIKMIK
Kombinovani metod - E test
REZISTENCIJA GLJIVA NA AM
Klinička rezistencija
Primarna (unutrašnja) prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa AM (genetski predodredjena -spontatne mutacije)
Sekundarna (stečena) - razvila se u toku/ posle primene terapije - rezultat genotipskih i fenotipskih promena indukovanih antimikotikomOtpornost na doze hemioterapeutika koje se postižu pri optimalnim/ maksimalno dozvoljenim terapijskim dozama (toksičnost!)
Klinička rezistencija
Primarna (unutrašnja) prisutna i pre izlaganja tj. kontakta gljive sa AM (genetski predodredjena -spontatne mutacije)
Sekundarna (stečena) - razvila se u toku/ posle primene terapije - rezultat genotipskih i fenotipskih promena indukovanih antimikotikomOtpornost na doze hemioterapeutika koje se postižu pri optimalnim/ maksimalno dozvoljenim terapijskim dozama (toksičnost!)
REZISTENCIJA: odsustvo terapijskog efekta primenom odgovarajućih terapijskih doza AM
Za sve izolate gljiva iz primarno sterilnih regija – OBAVEZAN je antimikogram
MEHANIZMI REZISTENCIJE GLJIVA
1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima
2. Izmena ciljnog mesta
3. Efluksne pumpe
4. Sprečen ulazak 5. Zaobilazni metabolički putevi
6. Inhibicija enzima aktivatora leka
7. Degradacija leka EC enzimima
1. Prekomerna produkcija ciljnog enzima
2. Izmena ciljnog mesta
3. Efluksne pumpe
4. Sprečen ulazak 5. Zaobilazni metabolički putevi
6. Inhibicija enzima aktivatora leka
7. Degradacija leka EC enzimima
█ > 75% senzitivnost, █ 50%, █ < 5%; (O'Brien et al., ASH Edu 2003)
Vrste gljiva AmB Fluconazol Itrakonazol Vorikonazol Caspofungin 5-FC
C. albicans
C. parapsilosis
C. tropicalis
C. glabrata
C. krusei
A. fumigatus
A. flavus
A. terreus
Zygomycetes
Fusarium spp.
NAJČEŠĆE VRSTE GLJIVA I OSETLJIVOST NA AM
00
3636
3737
3838
3939
4040
4411
Tem
per
atu
re (
°C)
Tem
per
atu
re (
°C)
KKulturulturaaKKulturulturaa +TTkivokivoTTkivokivo +
AntigeniAntigeniAntigeniAntigeni +
PCRPCRPCRPCR +
Terapija
Verovatnoća IGI
-7-7 00 77 1414 2121 2828 3535 4242 4949 5656 6363-14-14
0.10.1
11
1010
DaDani posle ni posle transplant transplantacijeacije
Gra
nu
locy
tes
(lo
gG
ran
ulo
cyte
s (l
og
1010x
10x1099 /
L)
/L)
EmpiriEmpirijskajska
MogucaMoguca
ProProfifilalaktickakticka
RRizikizik
SpecifiSpecificnacna
DokazanaDokazana
Pre-emptivePre-emptive
VerovatnaVerovatna
CT
Savremena terapija i značaj laboratorijske dijagnoze