PENCARIAN ZAT ANTIMIKROBA BARUTiana Milanda

SUMBER ANTIMIKROBA1. Mikroorganisme yang diisolasi dari tanah, air atau udara, contoh : Streptomyces yang memproduksistreptomisin dan tetrasiklin.Semisintesis : molekul prekursor diproduksi melalui fermentasi mikroorganisme, lalu dimodifikasi secara kimia, contoh : penisilin dan sefalosporinSintesis, contoh : kloramfenikolBakteriofagaMetabolit sekunder dari tumbuhan atau hewan yang berkhasiat sebagai zat antimikroba

INFORMASI SUMBER ANTIMIKROBAPenggunaan secara empiris oleh masyarakatBuku/pustaka pengobatan tradisionalMedia massa : cetak dan elektronikPenelitian lanjutan yang disarankan

Seleksi Zat Antimikroba dari Tanah/Air/Udara

ISOLASI ANTIMIROBA BARU DARI MIKROBA TANAHSeleksi/skrining antimikrobaPembuatan kurva pertumbuhanUji aktivitas antimikrobaPemisahan antimikrobaPemurnian antimikrobaIdentifikasi antimikrobaUji banding antimikroba

SELEKSI ZAT ANTIMIKROBA DARI TANAH

PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHANBiakan murni diinokulasikan ke medium cair (fermentasi) tiap satu jam disamplingSampel-sampel disentrifugasi dan ditentukan PMV (Packed Mycelia Volume) dengan menentukan % volume endapan/volume sampel (v/v %)Plot PMV terhadap waktu pengambilan sampel (t) dalam suatu kurva pertumbuhan

KURVA PERTUMBUHANPMV

UJI AKTIVITAS ANTIMIROBASupernatan dari berbagai sampel disaring dengan filter bakteri diuji aktivitas antimikrobanya untuk menentukan titik maksimum untuk panen zat antimikroba PMV

UJI AKTIVITAS ANTIMIROBAUji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri dan metode difusi agar seperti penentuan potensi antibiotika

Perbedaannya :Uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahanUji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama

PEMISAHAN ANTIMIROBABiakan murni difermentasi dalam volume medium cair yang lebih banyak sampai titik maks fermentasi disentrifugasiSupernatan diekstraksi dengan berbagai pelarut organik dalam corong pisahBerbagai ekstrak diuji aktivitas antimikrobanya kembaliSetelah diperoleh pelarut yang cocok, supernatan diekstraksi dengan pelarut tersebut dipekatkan dengan rotary evaporator/freeze drying EKSTRAK KENTAL

Tumbuh-tumbuhanDan lain-lain.

ISOLASI ANTIMIROBA BARU DARI TUMBUHANSeleksi/skrining antimikrobaUji aktivitas antimikrobaPemisahan & pemurnian antimikrobaIdentifikasi antimikrobaUji banding antimikroba

SELEKSI/SKRINING ANTIMIROBATumbuhan dideterminasi, bagian tumbuhan diambil dan dibuat simplisiaSimplisia dihaluskan dan diayak sampai derajat kehalusan tertentuSerbuk simplisia diekstraksi dengan berbagai pelarut organikEkstrak dipekatkan dengan rotary eveporator/freeze drying EKSTRAK KENTAL

UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBAEkstrak kental diuji aktivitas antimikrobanya terhadap mikroba tertentu

Skrining fitokimia dilakukan terhadap konsentrat untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak

PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBAUji kemurnian kristalPenentuan struktur

PEMISAHAN & PEMURNIAN ANTIMIROBAEkstrak ditutulkan pada KLT dipisahkan menggunakan berbagai pengembang disemprot penampak noda diperoleh pengembang yang dapat memisahkan berbagai noda pada ekstrak pengelusi pada kromatografi kolomEkstrak dikromatografi kolom tiap fraksi ditampung KLT kembali fraksi2 dengan Rf sama digabungkan, dipekatkan dan diuji aktivitas antimikrobanya fraksi di KLT preparatif

PEMURNIAN ZAT ANTIMIKROBAUji kemurnian kristalPenentuan struktur

PEMISAHAN & PEMURNIAN ANTIMIROBAFraksi prospektif di KLT preparatif tutup sebagian KLT dengan kaca, lalu semprot dengan penampak noda pita-pita yang tertutup kaca dikerok & dimasukkan dalam vial tambah pelarut organik yang mengendapkan silika gelSupernatan diuji aktivitas antimikrobanya yang terbaik dipekatkanKonsentrat di KLT 2 dimensi untuk mengetahui kemurniannya jika belum murni (terbentuk ekor), dimurnikan dengan KLT preparatif 2 dimensi

PEMISAHAN & PEMURNIAN ANTIMIROBAHasil pemurnian diuji aktivitas antimikrobanya dipekatkan untuk memperoleh kristalKemurnian kristal diuji melalui penentuan TL (titik lelehnya) jika rentang TL lebar, dilakukan rekristalisasi

IDENTIFIKASI ANTIMIKROBAKristal antimikroba di KLT bersama dengan zat-zat antimikroba lain yang telah ada dilihat kesamaan Rf nyaJika tidak ada yang sama, dilakukan elusidasi struktur

PENENTUAN MIC DAN MBCMIC dan MBC digunakan untuk menghitung dosis minimal/MEC zat antimikroba dalam suatu sediaanPenentuan MIC dan MBC sebaiknya dilakukan terhadap fraksi atau kristal murni, setelah uji aktivitas antimikrobaVariasi konsentrasi yang digunakan untuk penentuan MIC dan MBC dimulai dari konsentrasi yang dipakai untuk uji aktivitas antimikroba

Antimicrobial Susceptibility Testing Broth Dilution MethodMacro dilution Method Using test tube Media : 1-5 mL/tube

Micro dilution Method Using 96-wells microtiter plates Media : 0.1 0.2 mL/well

Antimicrobial susceptibilitytesting using micro-broth dilutions96 well microtiter plateug/ml64 32 16 8 4 2

UJI MIKROBIOLOGI LAIN PADA SEDIAAN FARMASIUji stabilitas mikrobiologi perhitungan koloni mikroba. Uji ini dilakukan pada rentang waktu tertentu utk mengetahui pengaruh waktu penyimpanan thd stabilitas mikrobiologi sediaan atau mengetahui efektivitas zat pengawet dalam sediaanUji aktivitas antimikroba dari sediaan aktivitas antimikroba sediaan dibandingkan aktivitas zat aktif saja utk mengetahui pengaruh formulasi sediaan thd aktivitas antimikroba zat aktifnyaPenentuan koefisien fenol dilakukan terhadap sediaan antiseptika atau desinfektan

UJI BANDING ANTIMIROBAUntuk mendapatkan uji aktivitas mikroba yang bernilai semi kuantitatif, maka dilakukan uji banding fraksi atau kristal murni zat antimikroba terhadap antibiotika pembanding dari jenis berbeda seperti uji potensi antibiotikaPerbedaannya :Uji banding antimikroba bersifat semi kuantitatif, artinya perhitungan matematis yang dihasilkan harus duji kebenarannya kembali secara mikrobiologiUji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentasi kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama

PROSEDUR UJI BANDING AKTIVITAS

UJI BANDING ANTIMIKROBAZat uji maupun antibiotika pembanding diencerkan dalam berbagai konsentrasi (yang sama), lalu diujikan ke mikroba uji yang sama dalam cawan petri berukuran besar diameter hambat diukurData diameter hambat antibiotika pembanding (mm) diplot ke sumbu y dan logaritma konsentrasinya (ppm) diplot ke sumbu x buat grafik hitung persamaan garis nyaLakukan hal yang sama terhadap zat uji

UJI BANDING ANTIMIROBADengan menggunakan persamaan garis antibiotika pembanding, tentukan diameter hambat antibiotika pembanding pada suatu konsentrasi ttt. Contoh : y = 7,4561x -2,1559, maka pada 10 ppm (x = 1) diperoleh diameter hambat y = 5,3 mmMasukkan nilai y tsb ke dalam persamaan garis zat uji. Contoh : y = 4,8588x -12,99, maka jika y = 5,3 mm, diperoleh nilai x = 3,674. Antilog 3,674 adalah 5812 ppm konsentrasi zat uji

UJI BANDING ANTIMIROBANilai banding : konsentrasi zat uji/konsentrasi zat pembanding Pada contoh : 5812/10 = 1 : 0,00172 Artinya : kekuatan 1 ppm zat uji sebanding dengan 0,00172 ppm antibiotika pembanding

Preservation of Microbial CulturesPeriodic Transfer and RefrigerationMineral Oil SlantFreezing in Growth MediumDryingLyophilizationUltracold Freezing

Preservation of Microbial Cultures:Periodic Transfer and RefrigerationMany labs use agar slants; care has to be taken to avoid contaminationStock cultures are aseptically transferred at appropriate intervals to fresh medium and incubated, then stored at 4C until they are transferred againMajor problem with possible genetic changes in strains; most labs need a way to keep long term storage of original genetic stocks

Preservation of Microbial Cultures:Mineral Oil SlantSterile mineral oil placed over growth on agar slants to preserve cultures for longer period of time in the refrigeratorContamination problems; messy; many organisms are sensitive to this; generally it is a poor technique and sometimes doesnt work well

Preservation of Microbial Cultures:Freezing in Growth MediumUsed as a long term storage strategyBroth cultures of the organisms are frozen at -20COften, sterile glycerin (glycerol) is added at a 25 50% final concentration; this helps to prevent ice crystal formation and increases viability of many organisms

Preservation of Microbial Cultures:DryingSuitable for some bacterial speciesSamples are grown on sterile paper disks saturated with nutrient, then the disks are allowed to air dry and stored asepticallyReconstituted by dropping disk into nutrient broth medium

Preservation of Microbial Cultures:LyophilizationSuitable for many bacterial species as well as fungi and virusesBroth cultures are placed in special ampules and attached to a vacuum pump; the vacuum removes all of the water from the cells leaving a freeze-dried powderThe culture is reconstituted by adding broth to the lyophilized powder and incubating itConsidered the best method of long-term storage for most bacterial species

Preservation of Microbial Cultures:Ultracold FreezingSimilar to freezing, but at very cold temperatureAt about -70 to -80C, in liquid nitrogen or in an ultracold freezer unit