การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3...

9
3 การตรวจเอกสาร องุนและโรคขององุ1. ลักษณะทั่วไปขององุในปจจุบัน องุนนับวาเปนผลไมที่ไดรับความนิยมอยางมาก มีการปลูกอยางแพรหลายทั่วทุก มุมของโลก เพราะสามารถใชประโยชนไดหลายอยาง ทั้งรับประทานผลสด หรือใชทําผลิตภัณฑอื่นๆ เชน ไวน น้ําองุแยม องุนอบแหง (ลูกเกด) เปนตน องุนมีชื่อวิทยาศาสตรวา Vitis vinifera Linn. จัดอยูใน วงศ Vitaceae มีชื่อสกุลวา Vitis เปนไมเลื ้อยประเภทไมยืนตน มีเถาขนาดใหญทําหนาที่ค้ําจุน มีความ สูงประมาณ 1.50 เมตร มีมือสําหรับเกาะหรือพยุงกิ่ง ใบขององุนประกอบดวย 5 แฉก ดอกออกเปนชอ กลมและโต เปนดอกสมบูรณเพศ ชอดอกจะมีขนาดเล็กหรือใหญตางกันไปขึ้นอยูกับชนิดของพันธุและ ความอุดมสมบูรณของตน ผลออกเปนพวง ผลยอยรูปกลมรี ฉ่ําน้ํา ผิวมีนวลเกาะ รสหวาน มีสีเขียว มวง แดง และมวงดําแลวแตพันธุ มี 1-4 เมล็ดและมีระยะการเก็บเกี่ยวประมาณ 100-135 วัน รากขององุนมี ทั้งรากแกวและรากฝอยขึ้นอยูกับการขยายพันธุ ระบบรากของแตละชนิดจะมีขอแตกตางกันอยูหลาย ประการในเรื่องลักษณะและคุณสมบัติในการตานทานโรคและแมลง (ปวิณ, 2504) องุนสามารถปลูกได ในดินทั่วไป ดินที่เหมาะสมที่สุดควรเปนดินเหนียวที่มีธาตุอาหารพืชมาก มีหนาดินลึก มีน้ําเพียงพอตอ ความตองการของตนองุ(อุดม, 2530 ) การปลูกองุนจะแบงตามประโยชนที่ใช ออกเปน 6 ประเภท คือ 1. องุนที่ใชรับประทานสด 2. องุนที่ใชทําเหลา, ไวน 3. องุนที่ใชตากแหง (ลูกเกด) 4. องุนที่ใชคั้นน้ํา 5. องุนที่ใชบรรจุกระปอง 6. องุนที่ใชเปนตนตอ (กลุมเกษตรสัญจร, 2531) 2. การปลูกองุนในประเทศไทย กรมวิชาการเกษตร รายงานวา เริ่มมีการปลูกองุนในสมัยรัชกาลที7 แตยังไมแพรหลาย ในป 2506 อาจารยปวิณ ปุญญศรี และคณะ ไดนําองุนหลายสายพันธุมาทดลองปลูกในแปลงของเกษตรกร ซึ่งใหผลเปนที่นาพอใจ จึงขยายผลเชิงการคาออกไปอยางกวางขวาง (ปวิณ, 2504 และนันทกร, 2544) โดยในระยะแรกทําการผลิตในจังหวัดราชบุรี และนครปฐม ปจจุบันไดมีการขยายผลผลิตไปเกือบทั่ว ภูมิภาค

Upload: others

Post on 06-Nov-2019

4 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

3

การตรวจเอกสาร

องุนและโรคขององุน

1. ลักษณะทั่วไปขององุน ในปจจุบัน องุนนับวาเปนผลไมที่ไดรับความนิยมอยางมาก มีการปลกูอยางแพรหลายทั่วทุกมุมของโลก เพราะสามารถใชประโยชนไดหลายอยาง ทั้งรับประทานผลสด หรือใชทําผลิตภัณฑอื่นๆ เชน ไวน น้ําองุน แยม องุนอบแหง (ลูกเกด) เปนตน องุนมีชือ่วิทยาศาสตรวา Vitis vinifera Linn. จัดอยูในวงศ Vitaceae มีชื่อสกุลวา Vitis เปนไมเล้ือยประเภทไมยืนตน มีเถาขนาดใหญทําหนาที่ค้ําจุน มีความสูงประมาณ 1.50 เมตร มีมอืสําหรับเกาะหรือพยุงกิ่ง ใบขององุนประกอบดวย 5 แฉก ดอกออกเปนชอกลมและโต เปนดอกสมบูรณเพศ ชอดอกจะมีขนาดเล็กหรือใหญตางกันไปขึ้นอยูกับชนิดของพันธุและความอุดมสมบรูณของตน ผลออกเปนพวง ผลยอยรูปกลมรี ฉํ่าน้ํา ผิวมีนวลเกาะ รสหวาน มีสีเขียว มวงแดง และมวงดําแลวแตพันธุ มี 1-4 เมล็ดและมีระยะการเก็บเกี่ยวประมาณ 100-135 วัน รากขององุนมีทั้งรากแกวและรากฝอยขึ้นอยูกับการขยายพนัธุ ระบบรากของแตละชนิดจะมีขอแตกตางกันอยูหลายประการในเรื่องลักษณะและคุณสมบัติในการตานทานโรคและแมลง (ปวณิ, 2504) องุนสามารถปลูกไดในดินทั่วไป ดนิที่เหมาะสมที่สุดควรเปนดินเหนียวที่มีธาตุอาหารพืชมาก มีหนาดินลึก มีน้ําเพียงพอตอความตองการของตนองุน (อุดม, 2530 ) การปลูกองุนจะแบงตามประโยชนที่ใช ออกเปน 6 ประเภท คือ 1. องุนที่ใชรับประทานสด 2. องุนที่ใชทําเหลา, ไวน 3. องุนที่ใชตากแหง (ลูกเกด) 4. องุนที่ใชคั้นน้ํา 5. องุนที่ใชบรรจุกระปอง 6. องุนที่ใชเปนตนตอ (กลุมเกษตรสัญจร, 2531) 2. การปลูกองุนในประเทศไทย กรมวิชาการเกษตร รายงานวา เร่ิมมีการปลกูองุนในสมัยรัชกาลที่ 7 แตยังไมแพรหลาย ในป 2506 อาจารยปวิณ ปุญญศรี และคณะ ไดนําองุนหลายสายพันธุมาทดลองปลูกในแปลงของเกษตรกร ซึ่งใหผลเปนที่นาพอใจ จึงขยายผลเชิงการคาออกไปอยางกวางขวาง (ปวิณ, 2504 และนันทกร, 2544) โดยในระยะแรกทําการผลิตในจังหวัดราชบุรี และนครปฐม ปจจบุันไดมีการขยายผลผลิตไปเกือบท่ัวภูมิภาค

Page 2: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

4

องุนเปนพืชที่เจริญไดดีทั้งในเขตหนาว และเขตรอน สําหรับองุนที่ปลูกในประเทศไทยนั้น จะเปนสายพันธุเขตรอน มีลักษณะใบเขียวตลอดป ไมมีการพักตวัตามธรรมชาตซิึ่งตองมีการตดัแตงกิ่งเพื่อใหตนไดพักตัว แตกตาดอกและตาใบได พันธุองุนที่นิยมปลูกในประเทศไทยและสามารถใหผลผลิดที่ดี คือ พันธุ White Malaga พันธุ Cardinal พันธุ Loose Perlette พันธุ Beauty Seedless และพันธุ Ruby Seedless (สุรศักดิ์ และเสกสรร, 2542) 3. โรคขององุน องุนมีโรคเขาทําลายหลายชนิด ตั้งแตเปนตนเล็กๆ จนถึงระยะผลิดอกออกผล ทําใหเกษตรกรตองเสียคาใชจายในการปองกันกําจัดโรคในแตละรอบของการเก็บเกี่ยวเปนจํานวนเงินที่ไมนอยเลย ซึง่การที่ประเทศไทยมีการระบาดของโรคอยางรุนแรง อาจมีสาเหตุเนื่องมาจากการที่ประเทศไทยตั้งอยูในเขตรอน มีสภาพอากาศที่รอนชื้น นับเปนปจจัยที่สงเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อไดอยางดี

3.1 โรคราน้ําคาง เชื้อสาเหตุ Plasmopora viticola 3.2 โรคราแปง เชื้อสาเหตุ Oidium tuckeri 3.3 โรคกิ่งแหง เชื้อสาเหตุ Greeneria uvicola 3.4 โรคชอผลเนา เชื้อสาเหตุ Diplodia natalensis Pole Evans., 3.5 โรคแอนแทรคโนส เชื้อสาเหตุ Collectotrichim gloeosporioides 3.6 โรคราสนิม เชื้อสาเหตุ Physopella ampelopsidis Cumm. 3.7 โรค Fanleaf degeneration เชื้อสาเหตุ เชื้อไวรัส Grape Vine Fan Leaf Virus (GFLV) 3.8 โรคใบมวน เชื้อสาเหตุ เชือ้ไวรัส Grapvine Leaf Roll Virus-closterovirus

นอกจากนี้ยังมโีรคที่เกิดจากแบคทีเรีย ไสเดือนฝอย ไฟโตพลาสมา รวมทั้งโรคที่เกิดจากการขาดสารอาหาร (นิพนธ, 2542) และนอกจากนีใ้นตางประเทศยังมีการรายงานวา พบเชื้อสาเหตุโรคอีกชนิดหนึ่งที่สามารถทําใหเกิดโรคในองุน คือ เชื้อไวรอยด โดยทําใหองุนเกิดอาการ Yellow Speckle (YS) และ Vein-banding (VB) (Mink and Parson, 1975; Szychowski, 1998)

เชื้อไวรอยด

ในชวงตนป 1922 ไดมีการศึกษาเชื้อสาเหตุของโรค Potato spindle tuber ซึ่งเชื่อกันวาเกดิจากเชื้อไวรัส (Diener and Raymer, 1969) แตหลังจากทําการศึกษา พบวาแทจริงแลวเชื้อสาเหตุที่ทําใหเกิดโรค Potato spindle tuber มีลักษณะแตกตางจากเชื้อไวรัสหลายประการ ทําใหทราบวาเชือ้ดังกลาวไมใชไวรัส จึงไดเรียกชื่อเชื้อสาเหตุนั้นวา ไวรอยด (viroid = virus + oid = like) (บัญญัติ, 2522; Diener,

Page 3: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

5

1987; Keese and Symons, 1986) ตอมาไดมกีารพบเชื้อไวรอยดสาเหตุโรคพืชตางๆ อีกมากมายตามมา และในปจจบุัน พบวามีเชื้อไวรอยดอยูทั้งหมด 35 ชนิด 4. ลักษณะทั่วไปของเชื้อไวรอยด โมเลกุลของเชื้อไวรอยด มีลักษณะเปนอารเอ็นเอสายเดี่ยววงปด (Single-stranded circular RNA) มีขนาดประมาณ 246-375 นิวคลีโอไทด มีน้ําหนักโมเลกุลอยูระหวาง 1.1-1.3 x 105 ดาลตัน ซึ่งโมเลกุลของไวรอยดจะไมมีโปรตีนหอหุม ไมมีการทํางานของ mRNA (Diener, 1987; Owens and Hammond, 1990) เชื้อไวรอยดมักอยูในนิวเคลียสของเซลล โดยเฉพาะในนิวคลีโอลัส เชน Potato spindle tuber viroid (PSTVD) ประมาณ 0.4% ของ RNA ที่มีน้ําหนักโมเลกุลต่ํา และมีเพียง 0.08% ของ RNA ทั้งหมดที่สกัดได เชื้อไวรอยดจะอาศัยน้ําเลี้ยงในลําตนพืช จึงเปนสาเหตุใหแพรระบาดไดงาย และมีการดํารงชีวิตแบบพาราไซนที่แทจริงซึ่งเชื้อสามารถเพิม่ปริมาณไดในพืชอาศัย โดยไมพบโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงตอการเพิ่มปริมาณตอเชือ้ไวรอยด (บัญญัติ, 2522; Owens and Hammond, 1990) ทั้งนี้การเพิ่มปริมาณของเชื้อไวรอยดขึ้นกับสภาพแวดลอม ความเขมแสง หรือ ความสมบูรณของธาตุอาหาร จากการศึกษาที่ผานมาพบเชือ้ไวรอยดในพชืชั้นสูงเทานั้น ยังไมมีรายงานวา พบเชือ้ไวรอยดในสัตวหรือส่ิงมีชีวิตอื่นๆ (Hammond, 1999) 5. โครงสรางของเชื้อไวรอยด ประกอบไปดวย 5 domain ไดแก 5.1 Conserved central domain (C domain) : ประกอบไปดวยนิวคลีโอไทดประมาณ 95 เบส ซึ่งมีลักษณะอนุรักษสูง พบวาบริเวณดังกลาวจะเปนบริเวณที่เกี่ยวของกับการเพิ่มปริมาณอารเอ็นเอของไวรอยดเพื่อสรางไวรอยดรุนลูก (Baumstank and Riesner, 1995) 5.2 Pathogenicity domain (P domain) : เปนบริเวณที่มีบทบาทเกี่ยวกับการทําใหพืชเปนโรค และการแสดงอาการที่รุนแรงในการทําใหเกิดโรคของเชื้อไวรอยด (Keese and Symons, 1987) P domain เปนบริเวณที่ทําใหเกิดความแตกตางของลักษณะอาการของโรคที่เกิดจากเชื้อ PSTVd เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงลําดับเบส ทําใหลักษณะอาการของโรคเปลี่ยนไป (Owens et al., 1995) 5.3 Variable domain (V domain) : เปนบริเวณที่มีความแปรผันของลําดับเบสมากที่สุด โดยมีระดับความเหมือนกันของบรเิวณ V domain ของเชื้อท่ีมีความใกลชิดกันนอยกวา 50% (Diener, 1987) 5.4 Terminal domains (T domain) : เปนบริเวณปลายทั้งสองดานของโครงสรางไวรอยด มีลักษณะเปนเบสที่อนุรักษในไวรอยดกลุม PSTVd (Keese and Symons, 1987) Owens และคณะ (1990) รายงานวา เชื้อไวรอยดที่ไดทําการศึกษาลําดับเบสตั้งแตที่คนพบครั้งแรกจนถึงปจจบุัน มีขนาดของนิวคลีโอไทดระหวาง 246-375 นิวคลีโอไทด โดยอาศัยความเหมือนกันของลําดับเบส (Sequence homology) และโครงสรางของเชื้อไวรอยด สามารถแบงไวรอยดไดเปน 2 กลุม

Page 4: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

6

(ตารางที่ 1) คือ Pospiviroidae เปนกลุมที่โครงสรางมีสวนที่เรียกวา C domain ซึ่งม ีPotato spindle tuber viroid (PSTVd) เปนตนแบบ (Diener, 1971 ; Gross และคณะ, 1978) (ภาพที่ 1; A) และ Avsunviroidae เปนกลุมที่โครงสรางไมมีสวน C domain ซึ่งมี Avocado sunblotch viroid (ASBVd) เปนตนแบบ (Symons, 1981) (ภาพที ่1; B) ตารางที่ 1 การจําแนกชนิดของเชื้อไวรอยด (Flores และคณะ, 1998)

Page 5: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

7

ภาพที่ 1 แบบจําลองโครงสรางของเชื้อไวรอยดและกระบวนการเพิ่มปริมาณของเชือ้ไวรอยด ที่มา: EMBO reports (http://www.nature.com/embor/journal/v7/n6/fig_tab/7400706_f1.html)

Page 6: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

8

6. กระบวนการเพิ่มปริมาณของเชื้อไวรอยด เชื้อไวรอยดมีการเพิ่มปริมาณแบบ Rolling cycle โดยการเพิ่มปริมาณของเชื้อ จะเกิดขึ้นโดยไมผานการเปนดีเอ็นเอและไมมีการแปลรหัสไปเปนโปรตีน ซึง่แบงการเพิ่มปริมาณเปน 2 แบบ คอื (ภาพที่ 1) 6.1 Asymmetric cycle : เปนการเพิ่มปริมาณที่มีการตรวจพบอารเอ็นเอสายลบเปนจาํนวนมาก และมีความยาวมากกวาจีโนมที่เปนตนแบบ ที่เปนเชนนี้อาจเนื่องมาจากสาเหตุดังนี้ กระบวนการสังเคราะหอารเอ็นเอไมมีการหยุดเนื่องจากเอ็นไซม Polymerase ซึ่งจะเกิดขึ้นในแตละรอบของการเพิม่ปริมาณ ในทางตรงกันขาม การตัดของเอ็นไซม จะมีขึ้นบนอารเอ็นเอสายยาวเทานั้น ซึ่งการศึกษาดาน Kinetic พบวา การเพิ่มปริมาณของอารเอ็นเอสายลบ (Multimeric negative strain) พบในอัตราใกลเคียงกับการเพิ่มปริมาณของอารเอ็นเอสายบวกรุนลูกที่เพิ่มมากขึ้น อาจเนื่องมาจากอารเอ็นเอสายลบเปนองคประกอบสําคัญตอการเพิ่มปริมาณของเชื้อไวรอยด ซึ่งการเพิ่มปริมาณแบบนี้เปนการเพิ่มปริมาณของเชื้อไวรอยดในกลุม Pospiviroidae (ภาพที่ 1; C) 6.2 Symmetric cycle : เปนการสรางอารเอ็นเอสายลบสายยาวในการเพิ่มปริมาณ ขณะเดียวกันพบวามีการสรางอารเอ็นเอสายบวกไดเปนสายยาวเชนเดียวกัน และจะมกีารตัดใหไดขนาดยาวเทากับอารเอ็นเอตนแบบ ในขณะที่มีการสรางอารเอ็นเอสายบวกรุนลกู พบอารเอ็นเอสายบวกสายยาวในปรมิาณต่ํา ซึ่งการเพิ่มปริมาณแบบนี้เปนการเพิ่มปริมาณของเชือ้ไวรอยดในกลุม Avsunviroidae (ภาพที่ 1; C) 7. เชื้อไวรอยดในกลุม Pospiviroidae (ปริเชษฐ, 2548)

เชื้อไวรอยด 6 ชนิด ในกลุม Pospiviroidae มีรายงานวา เปนเชื้อสาเหตุโรคที่สําคัญของมะเขือเทศ ไดแก Columnea latent viroid (CLVd), Mexican papita viroid (MPVd), Potato spindle tuber viroid (PSTVd), Tomato apical stunt viroid (TASVd), Tomato chlorotic dwarf viroid (TCDVd) และ Tomato planta macho viroid (TPMVd)

CLVd : ถูกคนพบโดยการนําสารพันธุกรรมที่เตรียมไดจากใบที่ไมแสดงอาการเปนโรคของ Colunea erythrophea ถายทอดไปยังมะเขอืเทศสายพันธุ Rutgers โดยอาการที่แสดงออกในมะเขือเทศมีความคลายคลึงกับการแสดงออกของ PSTVd แตรุนแรงนอยกวา PSTVd ที่เปนสายพันธุรุนแรงนอกจากนี้ CLVd ยังสามารถกอใหเกิดโรคไดในมันฝรั่ง พืชในวงศ Cucurbitaceae และ Gynura auraniaca

MPVd : ทําการแยกเชื้อไดจากพืช Solanum cardiophyllum Lindl. พบวาลําดับนิวคลีโอไทดของ MPVd มีความใกลเคียงกับ TPMVd และ PSTVd

PSTVd : กอใหเกิดโรคในมะเขือเทศ ลักษณะอาการที่สําคัญคือ จะทาํใหผลมีขนาดเล็กลง เปอรเซ็นตความงอกลดลง 24-25 % (Benson and Singh, 1964) ใบหงิกยนโคงลง มีอาการใบเหลืองและมวง เกิดอาการเซลลตายและตนเตี้ยแคระแกร็น (Fernow et al., 1969) ในมันฝรั่งพบวา มีการแตก

Page 7: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

9

พุมของตาขาง ผลมีขนาดเล็กลง บิดยาว มีรูปรางเหมือน dumb-bell นอกจากนี ้ PSTVd ยังทําใหผลผลิตของมันฝรั่งลดลง ซึ่งจะขึ้นกับชนิดพันธุของมันฝรั่ง ความรุนแรงของเชื้อ และชวงระยะเวลาที่มันฝรั่งไดรับเชื้อ (Pfannenstiel and Slack, 1980) ไวรอยดชนิดนี้สามารถถายทอดโรคไดทั้งทางเมล็ดและละอองเกสร ทั้งในมะเขือเทศและมันฝรั่ง (Benson and Singh,1964; Hunter et al., 1969; Singh, 1970)

TASVd : พบระบาดครั้งแรกใน Ivary Coast และอินโดนีเซีย ลักษณะอาการที่สําคัญคือ ลําตน ขอส้ัน ในเปลี่ยนเปนสีเหลือง หดยนและเสียรูปราง ขนาดผลลดลง สีผลซีด ทําใหผลผลิตลดลงอยางมาก การแพรระบาดของโรคผานทางการตอกิ่งและวิธีกล (Antignus et al., 2002)

TCDVd : ลักษณะอาการที่สําคัญของโรคคือ เกิดอาการใบเหลืองอยางฉับพลัน การเจริญลดลง ตนเตี้ยแคระแกร็น ใบแสดงอาการเปนยอดพุม (Singhet et al., 1999)

TPMVd : ลักษณะอาการที่สําคัญของโรค จะทําใหตนมะเขือเทศเตี้ยแคระแกร็นอยางรุนแรง มักมีการแตกใบยอดและใบขางจํานวนมาก สวนใบลางแสดงอาการเหลือง แหงและรวง พบอาการเนื้อเยื่อตายบริเวณเสนใบและกาน มะขอืเทศที่ติดเชื้อน้ี จะมกีารออกดอกตดิผลมากกวาปกติ แตผลผลิตที่ไดมีขนาดเล็ก สามารถถายทอดโรคโดยมีเพลี้ยออนเปนพาหะ (Galindo et al., 1982)

8. วิธีการตรวจสอบเชือ้ไวรอยด มี 5 วิธี 1. Indicator plants การตรวจสอบเชื้อสาเหตุโรคพืชโดยใชพืชทดสอบ โดยพืชดงักลาวจะแสดงอาการได 2 แบบ คือ เปนแผลแบบจดุ และการกระจายทั่วลําตน เชื้อไวรอยดสวนมากไมสามารถจําแนกชนิดออกจากกันไดโดยดูจากอาการที่แสดงบนพืชอาศัยตามธรรมชาติ ซึ่งอาจจะมอีาการคลายคลึงกันกับโรคที่เกิดจากเชื้ออื่นๆ ดังนั้นจะตองทําการตรวจสอบเชือ้บนพืชที่ใชในการวนิิจฉัยโรคเพื่อหาสาเหตุที่แนนอน (Diener, 1979) 2. Nucleic acid based method 2.1 Gel elecrophoresis ความเขมขนของ Agarose gel ที่ใชแยกขนาดดีเอ็นเอของผลผลิตของเชื้อ หลังจากผานเทคนิค RT-PCR โดยแยกขนาดดีเอ็นเอใน TBE buffer หรือ TAE buffer และทําการตรวจหาขนาดของเชื้อโดยการยอมเจลดวย Ethydium bromide และเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอมาตรฐานที่ทราบขนาดแลว (Hanold, 1993) 2.2 Nucleic acid hybridization เปนวิธีการตรวจวินิจฉัยโรคที่มีความละเอียด แมนยํา และรวดเร็วตอเชื้อไวรอยด โดยใช Probe ที่มีความจําเพาะตอเชื้อไวรอยดนั้นๆ Dot Blot Hybridization เปนวิธีที่นิยมมากวธิีหนึ่ง เนื่องจากมีขอดีหลายประการ คือ มีความจําเพาะเจาะจงและมีความ Sensitive ตอเชื้อไวรอยดที่แนนอน ใชตัวอยางพืชในปริมาณนอย ประหยัดเวลาและทําไดงาย ตรวจผลการ Hybridization ดวย Autoradiogragh หรือดู

Page 8: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

10

ปฏิกิริยาการเกิดสีจากเอนไซม หรือตรวจโดย Chemiluminescence แตมีขอจาํกัดคือ ไมสามารถแยกขนาดของดีเอ็นเอนั้นได หากตองการแยกความแตกตางของขนาดอารเอ็นเอเพื่อทราบความจําเพาะเจาะจงของเชือ้ไวรอยดแตละชนิดนั้นจะตองทําการตัดอารเอ็นเอนั้นดวยเอ็นไซมตัดจําเพาะ แลวแยกขนาดบน Agarose gel กอน จึงจะนําไปทํา Hybridization (Maramorosch, 1991) 2.3 Polymerase chain reaction เทคนิคนี้ใชเพื่อเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิคใหมีปริมาณเพิ่มมากขึ้นในระยะเวลาอันสั้น ซึ่งปฏิกิริยาทั้งหมดเกิดขึ้นภายในหลอดทดลอง โมเลกุลของเชื้อไวรอยดเปนอารเอ็นเอสายเดี่ยว จึงตองทาํ Reverse Transcription เพื่อใหได cDNA ของเชื้อไวรอยดกอน แลวจงึทําการเพิ่มปริมาณดวยเทคนิค PCR โดยใชไพรเมอรที่มีความจําเพาะเจาะจงสูง ซึ่งไพรเมอรที่นํามาใชมักจะออกแบบจากสวนที่เรียกวา C domain ของโมเลกุลเชื้อไวรอยดนั้นๆ ซึง่มีความเหมือนกันระหวางเชื้อไวรอยดในกลุมตางๆ สูงมาก เมื่อนํามาใชเพิม่ปริมาณเชื้อไวรอยดจึงมปีระสิทธิภาพในการตรวจหาโมเลกุลของเชื้อไวรอยดไดมากชนดิ (สุพัฒน, 2540) 3. Sequence analysis การหาลําดับเบสของเชื้อไวรอยดมี 2 วิธี ทีน่ิยมใชกันมาก คือ การวิเคราะหลําดับเบสโดยตรงจากอารเอ็นเอของเชื้อไวรอยด และการหาลําดับเบสจาก cDNA ของเชื้อไวรอยดที่โคลนได (Singh, 1989; Visvader and Symons, 1985) แลวนําลําดับเบสที่หาไดมาทําการเปรียบเทียบกับขอมูลของเชื้อที่มีรายงานมากอน 4. การตรวจหาดวยกลองจุลทรรศนอิเล็กตรอน การตรวจหาเชื้อไวรอยดดวยกลองจุลทรรศนอิเล็กตรอน เพื่อดูขนาดและลักษณะโครงสรางของเชื้อไวรอยด ทําไดโดยการสกัดเพื่อใหไดเชื้อไวรอยดที่บริสุทธิ์ และนําไปทําใหเสียสภาพธรรมชาติ (denature) แตวิธีการนี้ก็มีขอจํากัด กลาวคือ ไมสามารถตรวจสอบเชือ้ท่ีอยูในเนื้อเยื่อ หรือสภาพที่เปนน้ําคั้นไดโดยตรง เนื่องจากเชื้อไวรอยดมีขนาดเล็กมากทําใหไมสามารถแยกความแตกตางระหวางเชื้อ ไวรอยดกับองคประกอบภายในเซลลพืชได (Hanold, 1993) 9. การแพรระบาดของเชือ้ไวรอยด (วราลักษณ, 2545) เชื้อไวรอยดสวนใหญแพรระบาดโดยวิธีกล (Mechanical transmission) เชน การปนเปอนสูพืชปกติจากพชืที่เปนโรค ผานทางการเพาะปลูกวิธีตาง ๆ เชน การขยายพันธุ การดูแลรักษา การตัดแตงกิ่ง ฯลฯ โดยเชื้อไวรอยดสามารถติดไปไดกับคน เครื่องมือท่ีใชในการเกษตร และชิ้นสวนของพืชที่เปนโรค อีกทั้งยังสามารถติดไปกับละอองเกสรเมื่อมีการผสมขามของเพืช ทําใหเกิดการแพรกระจายของเชื้อจากตนที่เปนโรคไปยังตนปกติได สวนแมลงพาหะที่มีรายงานคือ เพลี้ยออน สามารถถายทอด TPMVd และ PSTVdได แตการถายทอดโดยแมลงพาหะเกิดขึ้นนอยมากเมื่อเปรียบเทียบกับการถายทอดโรคโดยวิธีกล (Diener, 1987)

Page 9: การตรวจเอกสาร - lib.kps.ku.ac.th file3 การตรวจเอกสาร องุ นและโรคขององ ุ น 1. ลักษณะท

11

Agarwal และ Sinclair (1997) รายงานวา เชือ้ไวรอยดบางชนิดสามารถถายทอดผานทางเมล็ดได เชน Avocado sunblotch viroid ในอโวกาโด Apple scar skin viroid ในแอปเปล Coconut cadang-cadang viroid ในมะพราว และ Potato spindle tuber viroid ในมะเขือเทศ เปนตน