ปญหาพเศษปรญญาตร

สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การทดสอบความสมพนธทางสายพนธของพชวงศขงบางชนดโดยใชเทคนคอารเอพด

Detection of species relationship among some Zingiberaceae by RAPD technique

โดย

นางสาวเสาวลกษณ เรองนาม

ควบคมและอนมตโดย

_____________________________ วนท........เดอน มนาคม พ.ศ. 2548

(ผศ. ดร. สนธชย จนทรเปรม)

____________________________ วนท........เดอน มนาคม พ.ศ. 2548

(ดร. เสรมศร จนทรเปรม)

การตรวจสอบความสมพนธทางสายพนธของพชวงศขงบางชนดโดยใชเทคนคอารเอพด

นางสาวเสาวลกษณ เรองนาม

บทคดยอ

นาพชวงศขง 5 ชนด ซงมชอเรยกตามทองถนดงน วานมหากาลง วานกนผ วานเพชรมา ขมนดา และ

วานเอนเหลอง มาตรวจสอบความใกลเคยงกนทางสายพนธ โดยใชเทคนคอารเอพด เรมจากการนาใบพชทง 5

ชนดมาสกดดเอนเอโดยการประยกตใชวธของ Lambrides และ คณะ (2000) รวมกบ CTAB จากนนนามาทา

ปฏกรยาอารเอพด ดวยไพรเมอร 11 ชนด แลวนาลายพมพดเอนเอทไดมาวเคราะหดวยโปรแกรมสาเรจรป NTSys

pc 2.01 สามารถแบงกลมพชทง 5 ชนดไดเปน 2 กลมใหญ คอ กลมท 1 ไดแก วานมหากาลง วานเพชรมา และ

ขมนดาโดยทกลมท 1 แบงเปน 2 กลมยอย กลมยอยท 1 คอ วานมหากาลง กลมยอยท 2 ประกอบดวย วานเพชรมา

และ ขมนดา กลมท 2 ไดแก วานกนผ และ วานเอนเหลอง ซงมคาดชนความเหมอนประมาณ 0.75 มความ

ใกลเคยงทางสายพนธมากทสด

คาสาคญ : พชวงศขง, อารเอพด

ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กาแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

อาจารยทปรกษา : ผศ.ดร.สนธชย จนทรเปรม

ปทพมพ : 2548

จานวนหนา : 18 หนา

Detection of species relationship among some Zingiberaceae by RAPD technique

Miss Saowalak Ruangnam

Abstract

5 plant samples of Zingiberaceae namely Wanmahakamlung, Wankanpee, Wanpedma, Khamindam

and Wanenluang were examined for their relationship by RAPD technique. Genomic DNA was extracted from

leaves using modified Lambrides et al.’s method with CTAB. 11 primer sets were used in RAPD reaction. The

DNA fingerprints were analyzed by NTSys pc 2.01 program. It was found that the plants could classified into 2

groups. The first group consisted of 2 subgroups. Wanmahakamlung belonged to the first subgroup. Wanpedma

and Khamindam belonged to the second subgroup. The second group contained 2 plant samples, Wankanpee

and Wanenluang, with similarity index of 0.75.

Key words : Zingiberaceae, RAPD

Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture

Kamphaeng saen, Kasetsart University

Advisor : Sontichai Chanprame, Ph.D.

Year : 2548

Pages : 18

คานยม

กราบขอบพระคณ ผศ.ดร. สนธชย จนทรเปรม ทปรกษาปญหาพเศษเปนอยางสงทกรณาใหความร

คาปรกษา แนะนา ชวยเหลอ ตลอดจนชวยในการตรวจสอบแกไขปญหาพเศษฉบบน ขอบพระคณอาจารยทกทาน

ทอบรมสงสอน ประสทธประสาทวชาความรจนประสบความสาเรจในการศกษาครงน

ขอขอบพระคณ พวารณ โสมนส, พนงลกษณ เทยนเสร, พฐตาภรณ ชาล และพ ๆ ในหองปฏบตการทก

ทานทไดใหความชวยเหลอ อานวยความสะดวก และ ใหคาปรกษาตลอดการทาการทดลอง ขอบคณศนย

เทคโนโลยชวภาพทางการเกษตรทเออเฟอสถานท และอปกรณ ในการทาการทดลอง

สดทายนขอกราบขอบพระคณ คณพอ คณแม สมาชกทกคนในครอบครว และ เพอน ๆ ทใหกาลงใจ

เสมอมา รวมไปถงสงศกดสทธทงหลายททาใหปญหาพเศษเลมนเสรจสมบรณ

เสาวลกษณ เรองนาม

มนาคม 2548

สารบญ

หนา

สารบญ (1)

สารบญภาพ (2)

สารบญตาราง (3)

คานา 1

อปกรณและวธการ 7

ผลการทดลอง 12

วจารณการทดลอง 15

สรปผลการทดลอง 16

เอกสารอางอง 17

(2)

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 การเพมปรมาณดเอนเอโดยเทคนคอารเอพด 6

2 พชจากการเพาะเลยงเนอเยอทนาใบมาสกดดเอนเอ 8

3 ลายพมพดเอนเอทไดจากการทาปฏกรยาอารเอพดเมอใชไพรเมอร (ก) Q-05

(ข) AG-14 (ค) AK-04 (ง) AO-18 (จ) AT-07 (ฉ) C09 (ช) C11 (ซ) C14

(ฌ) C15 (ญ) C18 (ฎ) C20 13

4 dendrogram ของการจดกลม วานมหากาลง วานกนผ วานเพชรมา ขมนดา

และ วานเอนเหลอง โดยใช โปรแกรม NTSys pc 2.01 14

(3)

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ปรมาตรและความเขมขนของสารตาง ๆ ทใชในการทาปฏกรยาอารเอพด 9

2 ชนดของไพรเมอรทใชในการทดลอง 10

3 อณหภมและเวลาทกาหนดสาหรบปฏกรยาอารเอพด 10

คานา

พชวงศขง (Zingiberaceae) นบวาเปนพชใบเลยงเดยวทมความหลากหลายมากวงศหนง มความสาคญ

โดยใชเปนยาสมนไพรรกษาโรค เปนอาหารและเครองเทศสาหรบปรงแตงรสอาหาร การนาไปปลกเปนไมดอก

ไมประดบ และการนาไปใชในธรกจเสรมความงาม ในการเรยกชอของพชวงศนบางครงพชชนดเดยวกนกมการ

เรยกชอแตกตางกนไปหลาย ๆ ชอ อาจจะเรยกตามแตละทองถนหรอเนองจากการนาเขาพนธจากตางประเทศแลว

ตงชอขนมาใหมเพอประโยชนทางการคา การจาแนกสกล และชนดของพชวงศน ยงไมมขอสรปทแนนอน ยงม

ปญหาในเรองของวธการจาแนก เนองจากมการศกษาวจยกนหลายสถาบน ทาใหเกดชอพองซ าซอนกนหลายชอ

เกดความยงยากสบสน ในการเรยกชอวทยาศาสตร

เทคนคอารเอพด เปนวธวเคราะหลายพมพดเอนเอวธหนงทไมจาเปนตองทราบขอมลเกยวกบลาดบเบส

ของดเอนเอเปาหมาย เนองจากไพรเมอรทใชเปนแบบสม ไมจาเพาะตอดเอนเอบรเวณใด ๆ ซงผลการวเคราะห

ลายพมพดเอนเอดวยเทคนคอารเอพดน สามารถบอกไดวา พชชนดนเปนชนดเดยวกนหรอมความใกลเคยงกนกบ

อกชนดหนงทอาจจะสนนษฐานไดวาเปนพชชนดเดยวกน อกทงอารเอพดยงเปนวธททาไดงาย สะดวก รวดเรว

ใหขอมลไดมาก นาเชอถอ และมราคาถกกวาวธอน ๆ

การทดลองนจงไดใชเทคนคอารเอพดในการทดสอบความสมพนธทางพนธกรรมของพชวงศขง 5 ชนด

ไดแก วานมหากาลง วานกนผ วานเพชรมา ขมนดา และ วานเอนเหลอง เพอดความใกลชดและแนวโนม

ความเปนไปไดทบางพชใน 5 ชนดนอาจจะเปนชนดเดยวกน

การตรวจเอกสาร

พชวงศขงมการกระจายพนธทวไปในเขตรอนชน และกงรอน (Core, 1955) โดยกระจายพนธอยแถบ

เอเชยตะวนออกเฉยงใต พบหนาแนนบรเวณมาเลเซย สมาตรา ชวา บอรเนยว และไทย เปนตน (พวงเพญ, 2536)

การจาแนกหมวดหม

ณพพร (2530) ไดจาแนกหมวดหมพชวงศขงในอาณาจกรพช ดงน Kingdom Plantae, Subkingdom

Embryophayta, Division Tracheophyta, Class Angiosperme (Magnoliophtina), Subclass Monocotyledonae

Order Zingiberales, Family Zingiberaceae

1

ลกษณะทางพฤกษศาสตร

ณพพร (2530) ไดใหลกษณะทางพฤกษศาสตรของพชวงศขง ดงน

นเวศวสย เปนพชลมลกมอายหลายป มลาตนใตดนเปนแบบแงง (rhizome) หรอ tuber ขนาดใหญ

มกลนน ามนหอมระเหยตลอดตน กลนหอมแรง มกใชเปนยาหรอเครองเทศ เจรญงอกงามดในเขตรอนชนและเขต

กงรอน

ลาตน เปนลาตนใตดนแบบ rhizome หรอ tuber หรอ fascicular ขนาดใหญ แตกหนอไดงาย

ใบ เปนใบเดยว ขนาดใหญปานกลาง กานใบยาว โคนกานใบแผออกเปนกาบหมกนเปนลา ชวงตอ

ระหวางกานใบกบแผนใบจะมเยอบางรปสามเหลยมชายธง ตดเปนตงอยขางกานใบหรอขวางกานใบไว เยอบางน

เรยกวา ligule

ชอดอก เปนแบบ spike หรอ raceme มกลบประดบเปนกระพงโคงรองรบดอกยอยแตละดอกไว

บางชนดเปนดอกเดยว ดอกยอยเปนดอกสมบรณเพศ รปทรงดอกเปนแบบ irregular

กลบรอง ม 3 กลบ เชอมตดกบกลบดอก สเขยว

กลบดอก ม 3 กลบ มสขาวหรอสอน ๆ

เกสรตวผ ม 5 อน แตสมบรณเพยง 1 อน ทเหลอมกแปรรปเปน petaloid staminode ซงมกมอย 2 อน ท

แปรรปไปเปนแผนแบนกวางหอยลงมา เรยกวา labellum

เกสรตวเมย รงไขเปนแบบ inferior ภายในม 3 หองเชอมตดกน แตละหองมเมดไขมาก

การตดของไข เปนแบบ axile placentation หรอ parietal placentation

ผล เปนแบบ capsule หรอ berry

เมลด ขนาดปานกลาง มกมเยอหม ตนออนตรง

ฤดออกดอก – ผล ระหวางมถนายน - กนยายน

2

วานมหากาลง

ลกษณะ หว ลาตน ใบ เหมอนกบขมนออย ตางกนทเนอในหวเปนสขาว กบมรสขมขน และ ฉนจด

(เลอน, 2523)

ประโยชน ใชตาเปนผงกนกบสราหรอน าผง เปนยาชกมดลกเขาอในรายคลอดบตรใหม ๆ และเปนยา

บารงกาลง (เลอน, 2523)

วานเพชรมา

ลกษณะ ขนเปนกอเหมอนขมนหรอกระชาย ไมมลาตนเหนอดน สวนเหนอดนเปนกาบใบ โคนกานใบ

เปนกาบเรยงซอนกน กานใบสเขยวออน ใบยาวมสเขยวรปใบหอกปลายแหลม กลางใบมสแดงคลาจาง ๆ ชอดอก

เกดจากในดน กานดอกยาวคลายดอกกระเจยว กลบเลยงสวนบนเปนสเลอดหม สวนลางเปนสเหลองอมเขยว

(กองบรรณาธการบานและสวน, 2525) หวเลกและงอกกลบเหมอนคอมา หวมสเหลองออน (เลอน, 2523)

ประโยชน ใชหววานฝนกบสราทาเขาตลอดลาแขงแกอาการเมอยลา (กองบรรณาธการบานและสวน,

2525) ใชหวตาเปนผงผสมกบน าผงเปนยาอายวฒนะ (เลอน, 2523)

วานกนผ

เกบตวอยางพชมาจากจงหวดสรนทร ซงเปนชอทเรยกในทองถนนน ลกษณะ ใบคลายขมน เนอในหวม

สขาวอมเหลอง

วานเอนเหลอง

ลกษณะ ตนและใบมสเขยวเขม กานใบยาว ลาตนสงกวาตนขมนออย เนอในหวมสเหลองออนมกลน

หอมเยน หวมกขนตดกนเปนแผงขนาดใหญ (เชษฐา, 2522) หวใหญกวาขมนออย คลายวานนางคา (เลอน, 2523)

ประโยชน ใชหวตมกนแกเสนเอนแขง และแกอมพาต (เลอน, 2523) แกโรคเหนบชา แกปวด เคลด ยอก

ใชบาบดโรคเบาหวาน ไตพการ (เชษฐา, 2522)

3

ขมนดา

ลกษณะ ตนและใบคลายขมน หวโตกวาขมนธรรมดา 2 – 3 เทา สภายนอกมองดเปนสฟาออน ทปลาย

หววานมลกษณะแหลมเปนสชมพเรอ ๆ เนอในหวมสเขยวครามออน ๆ รสและกลนเหมอนขมน (เชษฐา, 2522)

กานใบมสเขยวดานในเปนรองแคบและลกมาก ดานนอกกลมนน ยาว 15 – 20 เซนตเมตร กาบใบสแดงเรอ ๆ อม

เขยวโอบหมเปนลาสง 50 – 80 เซนตเมตร ใบรปรยาว ขนาดกวาง 15 – 20 เซนตเมตร ยาว 60 – 75 เซนตเมตร

ปลายใบแหลมเปนตงโคนใบท ทางดานบนเสนกลางใบเปนรองลกสเขยว ขอบรองมสแดงเรอ ๆ เฉพาะตอนกลาง

ของแผนใบ ดานลางเสนกลางใบนนเปนสนสเขยว (บญคา, 2537)

ประโยชน ใชเปนยาแกปวดทอง ลงทอง จกเสยด (บญคา, 2537) ใชเปนยาถายพยาธ (เชษฐา, 2522)

เทคนคทางชวโมเลกล

Polymerase Chain Reaction (PCR)

ปฏกรยาลกโซ หรอพซอาร เปนการเพมขยายดเอนเอใหมจานวนมากขนกวาเดมหลายลานเทา หรอเพม

ปรมาณจนทสนใจในหลอดทดลอง ดงนนเทคนคนเรยกอกชอหนงวา in vitro enzymatic gene amplification

(บรษทกบไทยจากด, 2545) โดยอาศยหลกการของการเกด DNA replication โดยทาใหเกดในหลอดทดลองแบบ

ซ า ๆ กนหลายรอบ (repeated cycles) ในชวงเรมแรกของเทศนคพซอาร ใชเอนไซม Klenow fragment แตตอมาม

การคนพบเอนไซม DNA polymerases ชนดททนความรอนสงได แยกสกดจาก thermophillic bacteria Thermus

aquaticus (Taq) ทาใหไดเอนไซม Taq DNA polymerase จงนามาใชในปฏกรยาพซอารแทน Klenow fragment

(วชร, 2536) ปรมาณดเอนเอจะเพมมากขนไดนนตองอาศยปฏกรยาทตอเนองกนหลาย ๆ รอบ ซงแตละรอบจะ

ประกอบดวย 3 ขนตอน คอ

1. ขนตอน denaturation เปนขนตอนการทาใหดเอนเอสายคแยกเปนสายเดยว โดยอาศยความรอนท

อณหภมประมาณ 90 – 950 ซ.

2. ขนตอน primer annealing เปนขนตอนทมการลดอณหภมลงมาทประมาณ 45 – 600 ซ. เพอให

ไพรเมอรสามารถเกาะตดกบดเอนเอตนแบบสายเดยวตรงบรเวณลาดบเบสคสม

3. ขนตอน primer extension เปนขนตอนการขยายสายดเอนเอโดยการตอลาดบนวคลโอไทดเขาท

ปลาย 3’ ของไพรเมอรแลวมการขยายสายดเอนเอสายใหมจากทศทาง 5’ ไป 3’ โดยอาศยเอนไซม Taq DNA

polymerase ซงปกตใชอณหภมอยในชวง 70 – 750 ซ.

4

ถาพจารณาสายดเอนเอทเพมขน โดยเรมจากสายดเอนตนแบบ 1 ค เมอสนสดรอบท 1 จะไดสายดเอนเอ

เปน 2 ค เมอทาเชนนหลาย ๆ รอบของพซอาร ดเอนเอกจะเพมขนเปน 2 เทาของทก ๆ รอบลกษณะทวคณเปน 2n

เมอ n เปนจานวนรอบของปฏกรยา ถาปฏกรยาพซอารมประสทธภาพ 100%

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

อารเอพดเปนวธวเคราะหลายพมพดเอนเอโดยใชเทคนคพซอารอกแบบหนง โดยไมจาเปนตองทราบ

ขอมลเกยวกบลาดบเบสของดเอนเอเปาหมาย เนองจากไพรเมอรทใชไมจาเพาะเจาะจงกบดเอนเอบรเวณใด มการ

พฒนาขนโดย William และคณะ (1990) ซงใชไพรเมอรเพยงชนดเดยวขนาด 10 นวคลโอไทดในการเพมปรมาณ

ดเอนเอ

หลกการของอารเอพดโดยทวไปกเปนการทาปฏกรยาพซอารเพยงแตอารเอพด จะใชไพรเมอรเพยงชนด

เดยวทมขนาดสน ๆ เพยง 8 – 10 เบส โดยทพซอารปกตจะใชไพรเมอร 2 ชนดทออกแบบมาใหจาเพาะเจาะจงกบ

ดเอนเอเปาหมายในบรเวณทตองการ และจากไพรเมอรทมขนาดสนนจงตองมการลดอณหภมในชวง annealing

ใหตาลง เพอใหเสนไพรเมอรสามารถเกาะไดโดยสมมากทสด ลกษณะทศทางทไพรเมอรเกาะกบเสนแมพมพ

แตละเสนตองอยในลกษณะตรงกนขามแบบทศชปลาย 3’ เขาหากนจงจะสามารถเกดเปนเสนดเอนเอเสนใหมท

สามารถมองเหนไดเมอเกดปฏกรยาลกโซหลาย ๆ รอบ แตถาไพรเมอรเกาะกบเสนดเอนเอสายเดยวกนในทศทาง

เดยวกน หรอเกาะกบดเอนเอคนละสายแตทศทางแยกออกจากกน หรอเกาะไดใน 2 สายทหางกนมาก แมทศทาง

จะเขาหากนกไมสามารถเกดผลผลตได (ภาพท 1)

ขอดของอารเอพดคอ ใชปรมาณดเอนเอเรมตนนอย ไมจาเปนตองทราบขอมลลาดบเบส ทาไดงาย

รวดเรว และเสยคาใชจายนอย แตขอจากดคอ ในบางกรณททาซ าแลวอาจจะไดผลทแตกตางไปจากเดม

สรนทร (2545) บอกถงความเปนไปไดในการเกดความแตกตางของแถบอารเอพดหรอโพลมอรฟซมท

เกดขนระหวางแตละตวอยาง ดงน

1. มชนสวนดเอนเอขนาดใหญมาสอดแทรกในระหวางตาแหนง 2 ตาแหนงทไพรเมอรเกาะทาให

ไพรเมอรทงสองโมเลกลอยหางกนเกนกวาทจะเพมปรมาณดเอนเอไดจงไมเกดแถบดเอนเอ

2. ชนสวนดเอนเอสวนทเปนทเกาะกบไพรเมอรหายไปหนงตาแหนงหรอทง 2 ตาแหนงทาใหไมเกด

แถบดเอนเอจากบรเวณดงกลาว

3. มการแทนทหรอเปลยนแปลงบรเวณทเปนทเกาะของไพรเมอรทาใหไพรเมอรเกาะกบดเอนเอ

เปาหมายไมไดจงไมเกดแถบดเอนเอ

4. มชนสวนดเอนเอขนาดเลกสอดแทรกเขามาหรอหายไป ทาใหขนาดของแถบดเอนเอทเกดขน

เปลยนแปลงไป

5

ไมไดผลผลตพซอาร

ไดผลผลตพซอาร

5’

3’ : ไพรเมอร

มการใชเทคนคอารเอพดในการจาแนกพชวงศขงในหลาย ๆ สปชส เชน Zingiber officinales (Rout et

al., 1998), Curcuma aeruginosa (Prathepha, 2000), Alpinia spp., Curcuma spp. (Wangsomnuk et al., 2002).

ภาพท 1 การเพมปรมาณดเอนเอโดยเทคนคอารเอพด

6

อปกรณและวธการ

การสกดดเอนเอ (DNA extraction)

สกดดเอนเอ โดยการประยกตใชวธของ Lambrides และ คณะ (2000) รวมกบ CTAB เรมจากนาใบพช

ทง 5 ชนด คอ วานมหากาลง วานกนผ วานเพชรมา ขมนดา และ วานเอนเหลอง ซงเปนตนทไดจากการเพาะเลยง

เนอเยอ (ภาพท 2) มาประมาณ 0.3 – 0.5 กรม ใสลงในโกรงทนงฆาเชอและแชเยนแลว ใส PVP ลงไปเลกนอย

เตมไนโตรเจนเหลวลงไป บดใหละเอยดจนกลายเปนผงแปง ระหวางการบดถาไนโตรเจนเหลวระเหยหมดใหเตม

ลงไปเรอย ๆ จากนนตกใสหลอดขนาด 1.5 มลลลตร ทแชในไนโตรเจนเหลว เตม extraction buffer ลงไป

ประมาณ 500 – 600 ไมโครลตร ผสมกนใหทวถง นาไปบมท 65 0ซ. 15 นาท แลวเตม 5M Potassium acetate

ลงไป 0.5 เทาของปรมาตร extraction buffer ทเตมลงไปในแตละหลอด บมในน าแขง 1 ชวโมง จากนนนาไป

ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 30 นาท ดดเฉพาะสวนใสใสลงในหลอดใหม จากนนเตม chloroform :

isoamyl (24:1) ลงไปปรมาตรเทากบสวนใสทดดได นาไปวางบนเครองเขยา 10 นาท ดดเฉพาะสวนใสใสลงใน

หลอดใหม จากนนเตม absolute ethanol ปรมาตรเทากบสวนใสทดดได จากนนเขยาขนลงเบา ๆ แลวนาไปแชใน

ต -20 0ซ. ประมาณ 5 – 10 นาท นาไปปนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท เทสวนทเปนของเหลวทง

เกบตะกอนไว ลางดวย 70% ethanol ประมาณ 500 - 600 ไมโครลตร นาไปปนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปน

เวลา 2 นาท ลาง 2 ครง เปนการทาความสะอาดดเอนเอ เทของเหลวทง คว าหลอดจนตะกอนดเอนเอแหง ละลาย

ดเอนเอใน TE buffer

การตรวจสอบความเขมขนของดเอนเอทสกดได

ตรวจสอบความเขมขนของดเอนเอทสกดได โดยวธอเลกโทรโฟรซสในอะกาโรสเจล เปรยบเทยบกบ

Lamda DNA ททราบความเขมขน ใชอะกาโรสเจลเขมขน 0.8 เปอรเซนต ใน 0.5X TBE buffer ใชความตางศกย

ของไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท นาเจลไปยอมดวยเอธเดยมโบรไมด เปนเวลา 15 นาท ลางในน าประมาณ

5 นาท นาแผนเจลไปสองดภายใตแสง UV ในต gel documentation บนทกภาพแลวเปรยบเทยบความเรองแสง

ของแถบดเอนเอกบ Lamda DNA ททราบความเขมขน จากนนปรบความเขมขนใหไดประมาณ 25 นาโนกรมตอ

ไมโครลตร เกบดเอนเอทอณหภม -20 0ซ. จนกวาจะนามาทาปฏกรยาอารเอพด

7

ภาพท 2 พชจากการเพาะเลยงเนอเยอทนาใบมาสกดดเอนเอ : (ก) วานมหากาลง (ข) วานกนผ (ค) วานเพชรมา

(ง) ขมนดา (จ) วานเอนเหลอง

(ก) (ข) (ค)

(ง) (จ)

8

การทาปฏกรยาอารเอพด

เตรยมสวนผสมของปฏกรยาอารเอพด ตามตารางท 1 โดยใสเฉพาะดเอนเอแตละตวอยางลงในถาดหลม

กอน จากนนเตรยมสวนผสมทเหลอรวมกนเปน master mix แยกแตละไพรเมอร ลงในหลอดไมโครทวบ แลว

แบงลงในแตละหลมปฏกรยา ทาทงหมด 11 ไพรเมอร ตามตารางท 2 นาถาดหลมทมสวนผสมครบทกอยาง

ไปปนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 30 วนาท หยด mineral oil 1 หยด ทบลงบนสารละลาย

ทผสมแลว เพอปองกนการระเหยของน า จากนนนาไปใสในเครอง Thermal Cycle โดยกาหนดอณหภมและเวลา

ของแตละขนตอนตามตารางท 3 เมอครบรอบสดทายแลว นาถาดหลมออกจากเครอง Thermal Cycle แลวเตม

สารละลายส (sequencing dye) ทมคณสมบตในการหยดการทางานของเอนไซม Taq DNA polymerase ปรมาตร

15 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลว นาไปปนเหวยงทความเรวรอบ 10,000 รอบตอนาท นาน 30 วนาท เพอให

สวนผสม ตกลงมาทกนหลอด เกบไวท 4 0 ซ. จนกวาจะนามาทาอเลกโทรโพรซส

ตารางท 1 ปรมาตรและความเขมขนของสารตาง ๆ ทใชในการทาปฏกรยาอารเอพด

สวนผสม ความเขมขนเรมตน ความเขมขนสดทาย ปรมาตร (ไมโครลตร)

DNA template 25 นาโนกรม/ไมโครลตร 25 นาโนกรม 1

PCR buffer 10X 1X 2.5

MgCl2 25 มลลโมลาร 3 มลลโมลาร 3

dNTP 1 มลลโมลาร 0.24 มลลโมลาร 6

primer 2 ไมโครโมลาร 0.3 ไมโครโมลาร 3.75

Taq DNA polymerase 5 ยนต/ไมโครลตร 2 ยนต 0.4

BSA 0.01 มลลกรม/ไมโครลตร 0.01 มลลกรม 1

dH2O 7.35

ปรมาตรรวม 25

9

ตารางท 2 ชนดของไพรเมอรทใชในการทดลอง

ไพรเมอร ลาดบเบส

AG-14 5’-CTCTCGGCGA-3’

AK-04 5’-AGGGTCGGTC-3’

AO-18 5’-GGGAGCGCTT-3’

AT-07 5’-ACTGCGACCA-3’

C-09 5’-CTCACCGTCC-3’

C-11 5’-AAAGCTGCGG-3’

C-14 5’-TGCGTGCTTG-3’

C-15 5’-GACGGATCAG-3’

C-18 5’-TGAGTGGGTG-3’

C-20 5’-ACTTCGCCAC-3’

Q-05 5’-CCGCGTCTTG-3’

ตารางท 3 อณหภมและเวลาทกาหนดสาหรบปฏกรยาอารเอพด

ขนตอน อณหภม เวลา

pre denature 94 0ซ. 1 นาท

denature 94 0ซ. 30 วนาท

annealing 37 0ซ. 30 วนาท

extention 72 0ซ. 1 นาท

ทาปฏกรยาลกโซจานวนทงสน 35 รอบ

last extention 72 0ซ. 5 นาท

10

การตรวจสอบผลโดยวธอเลกโทรโฟรซสในอะกาโรสเจล

ตรวจสอบผลผลตของปฏกรยาอารเอพด โดยใชอะกาโรสเจลเขมขน 1 เปอรเซนต ใน 1X TBE และใช

ความตางศกยของไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 60 นาท นาเจลไปยอมดวยเอธเดยมโบรไมด เปนเวลา 15 นาท

ลางในน าประมาณ 5 นาท นาแผนเจลไปสองดภายใตแสง UV ในต gel documentation บนทกภาพ จากนนทาการ

เปรยบเทยบความเหมอนและแตกตางของแถบดเอนเอทเกดขน แลวนาขอมลทไดไปวเคราะหโดยใชโปรแกรม

NTSys pc 2.01

การวเคราะหขอมลลายพมพดเอนเอ

วเคราะหโดยใชโปรแกรม NTSys pc 2.01 จดกลมโดยใช SHAN Clustering และสราง dendrogram

โดยใชวธ UPGMA (unweighted pair-group method with averages)

11

ผลการทดลอง

การตรวจสอบผลโดยวธอเลกโทรโฟรซสในอะกาโรสเจล

จากการนาดเอนเอทสกดไดไปทาปฏกรยาอารเอพด แลวนามาตรวจสอบผล โดยวธอเลกโทรโฟรซส

ในอะกาโรสเจล จะไดภาพลายพมพดเอนเอจาก 11 ไพรเมอร ดงภาพท 3 ซงทก ๆ ภาพนนจะนามาทาการ

เปรยบเทยบความเหมอนและความแตกตางของแถบดเอนเอทเกดขน โดยจะพจารณาจากแถบทมความชดเจน

ตวอยางทพบแถบดเอนเอทตาแหนงหนง ๆ ใหคะแนนเปน 1 สวนตวอยางทไมพบแถบดเอนเอทตาแหนงเดยวกน

นน ใหคะแนนเปน 0 ตวอยางเชน ในภาพถายเจลของไพรเมอร Q-05 ภาพท 3 (ก) จะพจารณาแถบดเอนเอ 2

ตาแหนง (ทลกศรช) โดยตาแหนงแรก พบวาปรากฏแถบดเอนเอในทกตวอยาง ใหคะแนนเปน 1 1 1 1 1 สาหรบ

แถบดเอนเอในตาแหนงท 2 พบวา ในตวอยางท 1, 3, 4 และ 5 ปรากฏแถบดเอนเอ สวนในตวอยางท 2 ไมปรากฏ

แถบดเอนเอ จะใหคะแนนเปน 1 0 1 1 1 เปนตน

การวเคราะหขอมลลายพมพดเอนเอ

จากการนาขอมลการเปรยบเทยบแถบดเอนเอมาวเคราะหโดยใชโปรแกรม NTSys pc 2.01 จะได

dendrogram ดงภาพท 4 พบวา สามารถแยกพชออกไดเปน 2 กลม กลมทหนงประกอบดวยสองกลมยอย โดยกลม

ยอยทหนงประกอบดวย วานมหากาลง มความแตกตางจากกลมอนประมาณ 48% กลมยอยทสองประกอบดวย

วานเพชรมา และขมนดา มคาดชนความเหมอน 0.72 และกลมทสองประกอบดวย วานกนผ และวานเอนเหลอง

โดยมคาดชนความเหมอน 0.75

12

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

(ก) (ข) (ค) (ง)

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

(จ) (ฉ) (ช) (ซ)

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5

(ฌ) (ญ) (ฎ)

ภาพท 3 ลายพมพดเอนเอทไดจากการทาปฏกรยาอารเอพดเมอใชไพรเมอร (ก) Q-05 (ข) AG-14 (ค) AK-04

(ง) AO-18 (จ) AT-07 (ฉ) C09 (ช) C11 (ซ) C14 (ฌ) C15 (ญ) C18 (ฎ) C20 โดย M คอ ดเอนเอมาตรฐาน

1 คอ วานมหากาลง 2 คอ วานกนผ 3 คอ วานเพชรมา 4 คอ ขมนดา 5 คอ วานเอนเหลอง

13

ภาพท 4 dendrogram ของการจดกลม วานมหากาลง วานกนผ วานเพชรมา ขมนดา และ วานเอนเหลอง โดยใช

โปรแกรม NTSys pc 2.01

วานมหากาลง

วานเพชรมา

ขมนดา

วานกนผ

วานเอนเหลอง

14

วจารณการทดลอง

ในการสกดดเอนเอพชทง 5 ชนดนน มการใช chloroform : isoamyl (24:1) ในการลางดเอนเอ ซงจะชวย

ตกตะกอน pigment และกาจด phenolic compound จงทาใหไดดเอนเอทมคณภาพดพอสมควร เหมาะในการทา

ปฏกรยาอารเอพด สาหรบการทดลองนไดใชไพรเมอรทงหมด 11 ชนดในการทาปฏกรยาอารเอพด ซงจะเลอกใช

ไพรเมอรทม %GC ประมาณ 70% เนองจากเปนไพรเมอรแบบสมจงทาใหการเกดแถบดเอนเอไดตางกน ในบาง

ไพรเมอรกจะทาใหเกดแถบดเอนเอมาก บางไพรเมอรกเกดแถบดเอนเอนอย สาหรบการเปรยบเทยบความเหมอน

และแตกตางของแถบดเอนเอ จะเลอกจากแถบทมความคมชด เหนความแตกตางอยางชดเจนในการใหคะแนน

dendrogram ทไดจากการวเคราะหโดยใชโปรแกรม NTSys pc 2.01 นนจะพบวา วานกนผซงเปนพชท

เรยกชอตามทองถนในจงหวดสรนทรนน มคาดชนความเหมอนกบวานเอนเหลองถง 0.75 นนคอ มความ

เหมอนกนประมาณ 75% จงอาจเปนไปไดวาพชทงสองชนดนเปนพชชนดเดยวกน ทงนผลการทดลองนเปนเพยง

แนวโนมหรอความเปนไปไดเทานน ยงไมสามารถบอกไดวาเปนชนดเดยวกนจรง ๆ เนองจากมการใชไพรเมอร

เพยง 11 ชนด และใชตวอยางพชเพยง 5 ชนดเทานนในการเปรยบเทยบ ตองมการเพมไพรเมอรและเพมจานวน

ตวอยางใหมากขน จงจะไดผลทดกวาน และตองมการทาซ าเพอเปนการยนยน แตขอจากดของอารเอพดคอผลท

ไดอาจแตกตางกนเมอมการทาซ า

อยางไรกตามเทคนคการสกดดเอนเอและปฏกรยาอารเอพดในการทดลองน ไดมการปรบสภาพใหม

ความเหมาะสมกบพชวงศขงทง 5 ชนดใหแสดงแถบดเอนเอขนมาได จงหวงวาจะเปนขอมลพนฐาน หรอเปน

ประโยชนกบงานวจยอน ตอไป

15

สรปผลการทดลอง

จากการวเคราะหความสมพนธของพชวงศขงทง 5 ชนดสามารถแบงพชทง 5 ชนด ไดเปน 2 กลมใหญ

คอ กลมท 1 ไดแก วานมหากาลง วานเพชรมาและขมนดา โดยทกลมท 1 แบงเปน 2 กลมยอย กลมยอยท 1 คอ

วานมหากาลง กลมยอยท 2 ประกอบดวย วานเพชรมาและขมนดา กลมท 2 ไดแก วานกนผ และ วานเอนเหลอง

16

เอกสารอางอง

กองบรรณาธการบานและสวน. 2525. สารานกรมไมประดบในประเทศไทยเลม 2. พมพครงท 2, อมรนทรการ

พมพ, กรงเทพฯ.

เชษฐา พยากรณ. 2522. อภนหารวานศกดสทธเลม 2. โรงพมพรงเรองรตน, กรงเทพฯ. 129 น.

ณพพร ดารงศร. 2530. พฤกษอนกรมวธาน. พมพครงท 2, มหาวทยาลยรามคาแหง, กรงเทพฯ. 768 น.

บรษทกบไทยจากด. 2546. การอบรมเชงปฏบตการเรอง Basic Techniques in Nucleic Acid Analysis. 92 น.

บญคา ไชยพรหมวงศา. 2537. คมอเซยนวาน. สานกพมพอนทรย, กรงเทพฯ. 175 น.

พวงเพญ ศรรกษ. 2536. พรรณพชวงศขง (Zingiberaceae) : Tribe Hedychieae ในประเทศไทย. สมมนาวชาการ

พนธศาสตรครงท 8. นวธรรมดาการพมพ, กรงเทพฯ.

เลอน กณหะกาญจนะ. 2523. ตาราคณลกษณะวานและวธการปลกวานของสมาคมพฤกษชาตแหงประเทศไทย

ในพระบรมราชปถมภ. พมพครงท 5, สานกพมพแพรพทยา, กรงเทพฯ. 446 น.

วชร อตถทพพหลคณ. 2536. ทฤษฎการประยกตใชประโยชน PCR Technology. โรงพมพเรอนแกว, กรงเทพฯ.

208 น.

สรนทร ปยะโชคณากล. 2545. จโนมและเครองหมายดเอนเอ : ปฏบตการอารเอพดและเอเอฟแอลพ.

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 116 น.

Core, E.L. 1955. Plant Taxonomy. Prentice Hall Inc., New York. 495 p.

Lambrides, C.J., R.J. Lawn, I.D. Godwin, J. Manners and D.C. Imrie. 2000. Two genetic linkage maps of

mungbean using RFLP and RAPD markers. Aust. J. Agric. Res. 51 : 415-425.

Prathepha, P. 2000. Screening of random primer to evaluate DNA diversity in Thai Curcuma using random

amplified polymorphic DNAs. Songklanakarin J. Sci. Technol. 22 : 7–13.

17

Rout, G.R., P. Das, S. Goel and S.N. Raina. 1998. Determination of genetic stability of micropropagated

plants of ginger using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Bot. Bull. Acad. Sin.

39 : 23–27.

Wangsomnuk, P., P. Wangsomnuk and B. Muza. 2002. Biodiversity and molecular aspects of Curcuma

species from the North-East of Thailand. Proceeding of the Third Symposium on the Family

Zingiberacea. Khon Kean University, Thailand. 109–119.

Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, J.A. Rafalski and S.V. Tingy. 1990. DNA polymorphisms amplified by

arbitrary primers are useful as genetic markers. Nulc. Acids Res. 18 : 6531-6535.

18