อิทธิพลของโครงสร้างลิแกนด์ใน...

บทความวจย

วารสารวทยาศาสตรบรพา ปท 21 (ฉบบท 3) กนยายน – ธนวาคม พ.ศ. 2559 108

อทธพลของโครงสรางลแกนดในการตรวจวดกรดอะมโนฮสทดน ดวยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร โดยใชสารประกอบไดนวเคลยรคอปเปอร (II)

กบลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซน Effect of Ligand Structures for Determination of Histidine Using Dinuclear Copper (II)

Complexes with Anthracene Derivative Ligands by Indicator Displacement Assay Approach

สรายทธ เวชสทธ1 ธวชชย ตนฑลาน1* และ จอมใจ สกใส2*

Sarayut Watchasit1 Thawatchai Tuntulani1* and Chomchai Suksai2* 1 ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

2 ศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา 1Department of Chemistry, Faculty of Science, Chulalongkorn University

2Department of Chemistry and Center for Innovation in Chemistry, Faculty of Science, Burapha University Received : 13 September 2016

Accepted : 29 September 2016 Published online : 10 October 2016

บทคดยอ ในงานวจยนไดศกษาการน าเอนเซมเบลทเตรยมจากสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรคอปเปอร (II)

กบลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซน Cu2L1 และ Cu2L2 กบฟลออเรสเซนตอนดเคเตอร Eosin Y มาใชในการตรวจวดกรดอะมโนฮสทดน (His) ดวยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร โดยใชสารละลาย 0.01 M HEPES บฟเฟอร pH 7.4 ใน 80/20 (%v/v) MeCN/H2O เปนตวท าละลาย จากการทดลองพบวาคาคงทความเสถยรของการเกดสารเชงซอนระหวางสารประกอบ Cu2L1 และ Cu2L2 กบอนดเคเตอร Eosin Y มคา log K เทากบ 3.82 ± 0.25 และ 4.91 ± 0.33 ตามล าดบ จากการศกษาความเปนไปไดในการน าเอนเซมเบลทงสองมาใชในการเปนฟลออเรสเซนตเซนเซอรส าหรบการตรวจวด กรดอะมโนฮสทดน พบวามเพยงเอนเซมเบลทเตรยมจากสารประกอบ Cu2L2 และอนดเคเตอร Eosin Y เทานนทสามารถน าไปใชในการตรวจวด His ไดอยางจ าเพาะเจาะจง ในขณะทเอนเซมเบลทเตรยมจากสารประกอบ Cu2L1 นนสามารถ ถกรบกวนไดจากกรดอะมโนชนดอนๆ ดงนนจงสามารถสรปไดวาสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรคอปเปอร ( II) Cu2L2 สามารถใชเปนรเซปเตอรส าหรบตรวจวด His โดยใชฟลออเรสเซนตอนดเคเตอร Eosin Y เปนหนวยใหสญญาน ดวยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร

ค าส าคญ : สารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรคอปเปอร เทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร ลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซน กรดอะมโนฮสทดน ฟลออเรสเซนตเซนเซอร *Corresponding author. E-mail : [email protected]; [email protected]

mailto:[email protected]



Abstract The formation of the ensembles between dinuclear copper (II) complexes of anthracene derivative ligands, Cu2L1 and Cu2L2, with fluorescence indicator Eosin Y was studied, aiming to employ the ensembles to detect histidine (His) by using an indicator displacement assay approach ( IDAs) . Experiments were carried out in 80/20 (%v/v) MeCN/H2O in the presence of 0.01 M HEPES buffer at pH 7.4. The ensemble formation constants (log K) of Cu2L1 and Cu2L2 with Eosin Y were calculated to be 3.82 ± 0.25 and 4.91 ± 0.33, respectively. Interestingly, it was found that only Cu2L2 ensemble could detect His selectively, whereas the Cu2L1 ensemble could respond to other amino acids. Thus, Cu2L2 can be used as a receptor to determine His with fluorescence indicator Eosin Y as a signaling unit under an indicator displacement assay approach.

Keywords : dinuclear copper (II) complexes, indicator displacement assay, anthracene derivative ligands, histidine amino acid, fluorescence sensor

บทน า ในระยะเวลาประมาณสองทศวรรษทผานมานกวจยพบวามการอบตใหมของภาวะผดปกตทมสาเหตมาจากความผดปกตของระดบสารเคมในรางกายของมนษยมากขน อาทเชนฮอรโมน แอนไอออน และกรดอะมโน ท าใหนกวทยาศาสตร ในปจจบนใหความสนใจในการพฒนาเทคนคทจะใชส าหรบตรวจวดปรมาณสารเคมในเซลลเหลานมากขน ในกลมของ กรดอะมโนทจ าเปน 20 ชนด พบวากรดอะมโนฮสทดน (His) มบทบาทตอกระบวนการตางๆ ในรางกายของมนษย เชน มบทบาทในกระบวนการน าสงกระแสประสาท (Sulliva Jr et al., 1996) ในผ ปวยโรคพารคนสนพบวามปรมาณฮสทดนในระดบต ากวาปกต (Nan et al., 1999) ในขณะทผ ปวยภาวะบวมน า (histidinemia) จะมปรมาณ His สงกวาปกต (Kovach & Meyerhoff, 1982) นอกจากนยงมรายงานการวจยพบวาวากรดอะมโนฮสทดนไดถกน ามาใชเปนตวบงชทางชวภาพในรางกายของสตรทมภาวะความดนโลหตสงขณะตงครรภ ซงภาวะดงกลาวนนจะมปรมาณของไกลโคโปรตนทมกรดอะมโนฮสทดนเปนองคประกอบหลก (Histidine-Rich Glycoprotein หรอ HRG) (Bolinl et al., 2011) อยในสภาวะทต ากวาปกต วธทใชในการตรวจวดกรดอะมโนฮสทดนทใชในปจจบนไดแก Gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) (Kaspar et al., 2008) และ Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) (Tang et al., 2008) แตปญหาทพบคอวธดงกลาวนน มขอจ ากดทตองอาศยเครองมอทมราคาแพงและตองอาศยผวเคราะหทมความเชยวชาญ ดงนนในงานวจยนจงเสนอวธการตรวจวดกรดอะมโนฮสทดนดวยโมเลกลเซนเซอรทางเคมเชงแสงโดยอาศยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร ( Indicator displacement assay) (Wiskur et al., 2001) โดยใชสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรของคอปเปอร (II) กบลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซนทมหมไดพโคลลแอมน (Cu2L1) และลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซนทมหมไทรโพดล แอมน (Cu2L2) เปนโมเลกลรเซปเตอร และใชฟลออเรสเซนตอนดเคเตอร Eosin Y เปนหนวยใหสญญาณในการตรวจวด ซงโครงสรางของโมเลกลทใชในงานวจยนแสดงไดดงภาพท 1



N

NN

HN

CuN

N N

NH

Cu

Cu2L2

N

N

N

Cu

Cu2L1

N

N

N

Cu

HOOC

Br Br

O

BrBr

-O O

Eosin Y

NH2HN

N

O

OH

Histidine

ภาพท 1 โครงสรางของสารประกอบโคออรดเนชนไดนวเคลยรของคอปเปอร (II) กบลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซน ทมหมไดพโคลลแอมน (Cu2L1) และไทรโพดลแอมน (Cu2L2) อนดเคเตอร Eosin Y และกรดอะมโนฮสทดน (His)

วธด าเนนการวจย 1. สารเคม กรดอะมโนทจ าเปนชนดแอลฟา 20 ชนดและ HEPES บฟเฟอร จากบรษท Aldrich, EtOH, MeOH, MeCN และ CH2Cl2 จากบรษท Fluka, Eosin Y จากบรษท Aldrich, น ากลน จากบรษท General Hospital Products Public Co., Ltd, 2. อปกรณและเครองมอ นวเคลยรแมกเนตกเรโซแนนซสเปกโตรมเตอร ยหอ Bruker รน AVANCE 400 และฟลออเรสเซนตสเปกโตรโฟโตมเตอร ยหอ Agilent รน Cary Eclipse 3. วธการทดลอง 3.1 การสงเคราะหลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซนทมหมไดพโคลลแอมน

ละลาย 9,10-bis(chloromethyl)anthracene 3.01 กรม กบ Dipicolylamine (Incarvito et al., 2001) และ K2CO3 5.05 กรม ใน DMF 30 มลลลตร แลวคอย ๆ หยดสารละลาย KI 1.80 กรม ใน DMF 10 มลลลตร แลวคนเปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตม 1 M HCl จนกระทงสารละลายเปนกรด แลวสกดดวย Ethyl acetate น าชนน ามาเตม 4 M NaOH จนกระทง มคา pH เปนกลาง แลวท าการสกดตอดวยสารละลายผสม Ethyl acetate : THF (1:1 v/v) แลวน าเอาชนตวท าละลายอนทรยมาลางน า และก าจดน าออกดวย MgSO4ทปราศจากน า น าสารละลายไประเหยตวท าละลายโดยเครองระเหยตวท าละลายแบบลดความดนจะไดผลตภณฑเปนของเหลวสน าตาล ท าการตกผลกดวย CH2Cl2 : diethyl ether : MeOH (1:1:1 v/v) จะไดผลตภณฑผลกสเหลองรอยละของผลตภณฑเทากบ 82



1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 8.43 (d, J = 5.2 Hz, 4H, ArH), 8.40 (dd, J = 3.2, 3.6 Hz, 4H, ArH), 7.49-7.52 (m, 4H, ArH), 7.43 (dd, J = 3.2, 7.4 Hz, 4H, ArH), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 4H, ArH), 7.03 (dd, J = 5.2, 6.0 Hz, 4H, ArH), 4.64 (s, 4H, -CH2-), 3.87 (s, 8H, -CH2-)

N

HN

N

CH2Cl

CH2Cl

+

N

N

N

N

N

N

L1

82 %

K2CO3, KI

DMF

ภาพท 2 แผนภาพแสดงวธการสงเคราะหลแกนด L1

3.2 การสงเคราะหลแกนดทเปนอนพนธของแอนทราซนทมหมไทรโพดลแอมน ละลายสารประกอบไทรโพดลแอมน 1.93 กรม ดวย MeCN ทปราศจากน า 50 มลลลตร จากนนจงเตม 9,10-

diformylanthracene 0.64 กรม ลงในสารละลายดงกลาว ท าการรฟลกซสารละลายผสมภายใตบรรยากาศแกสไนโตรเจน เปนเวลา 12 ชวโมง หลงจากนนน าไประเหยตวท าละลายโดยเครองเครองระเหยตวท าละลายแบบลดความดน ไดผลตภณฑเปนของเหลวสน าตาลแดง ท าการละลายสารผลตภณฑดงกลาวดวย MeOH 100 มลลลตร น าสารละลายผสมมาท าให เยนลงทอณหภม -5 oC จากนนคอยๆเตม NaBH4 4.18 กรม ลงในสารละลายผสม ท าการรฟลกซสารละลายผสมภายใตบรรยากาศแกสไนโตรเจนเปนเวลา 12 ชวโมง เมอครบเวลานาสารละลายมาทาใหเยนลงทอณหภมหองและเตมน า 150 มลลลตร

ลงในสารละลายดงกลาว นาสารละลายผสมมาระเหย MeOH โดยเครองเครองระเหยตวท าละลายแบบลดความดน จากนน น าสวนทเหลอมาสกดดวย CH2Cl2 ลางดวยน าครงละ 100 มลลลตร 3 ครง และน าชน CH2Cl2 มาก าจดน าดวย MgSO4 ทปราศจากน า นาสารละลายผสมทไดมาระเหย CH2Cl2 โดยเครองเครองระเหยตวท าละลายแบบลดความดน และท าการ ตกผลกดวย CH3OH : diethyl ether (1:1 v/v) จะไดผลตภณฑเปนของแขงสเหลอง รอยละของผลตภณฑเทากบ 41 (Watchasit et al., 2014)



1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): 8.45 (q, J = 3.6 Hz, 4H, ArH), 8.03 (d, J = 4.4 Hz, 4H, ArH), 7.58 (q, J = 3.6 Hz, 4H, ArH), 7.38 (t, J = 8 Hz, 2H, ArH), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 2H, ArH), 7.10 (d, J = 8 Hz, 2H, ArH), 6.73 (m, 10H, ArH), 6.51 (d, J = 7.6 Hz, 4H, ArH), 6.33 (s, 2H, -NH-), 5.28 (s, 4H, -CH2-), 3.59 (s, 4H, -CH2-), 3.52 (s, 8H, -CH2-). ESI-MS (positive mode); 811.4281 [M+H]+.

NN

N

H2N

CHO

CHO

dry CH3CN, reflux

N

N

N

N

N

N

N

N

NaBH4

dry MeOH, reflux

HN

HN

N

N

N

N

N

N

L2

+

41%

ภาพท 3 แผนภาพแสดงวธการสงเคราะหลแกนด L2

3.3 การสงเคราะหสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรของ Cu(II) กบลแกนดทเปนอนพนธของ แอนทราซนทมหมไดพโคลลแอมน (Cu2L1)

ท าการละลายสารประกอบลแกนด L1 ปรมาณ 0.5 กรม ใน EtOH 20 มลลลตร จากนนคอยๆ หยดสารละลาย Cu(ClO4)2.6H2O ทละลายใน EtOH 20 มลลลตร ลงในสารละลายดงกลาว น าสารละลายผสมทไดไปท าการรฟลกซภายใตบรรยากาศแกสไนโตรเจนเปนเวลา 12 ชวโมง เมอสารละลายเยนลงทอณหภมหองจะไดผลตภณฑเปนตะกอนสเขยว ท าการกรองผลตภณฑทไดและลางดวย CH2Cl2 และ EtOH จะไดของแขงสเขยวรอยละของผลตภณฑเทากบ 78 ESI-MS (positive mode); 1025.39 [M+3ClO4]+.



3.4 การสงเคราะหสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรของ Cu(II) กบลแกนดทเปนอนพนธของ แอนทราซนทมหมไทรโพดลแอมน (Cu2L2)

ท าการละลายสารประกอบลแกนด L2 ปรมาณ 0.5 กรม ใน MeOH 20 มลลลตร จากนนคอยๆ หยดสารละลาย Cu(ClO4)2.6H2O ทละลายใน MeOH 20 มลลลตร ลงในสารละลายดงกลาว น าสารละลายผสมทไดไปท าการรฟลกซภายใตบรรยากาศแกสไนโตรเจนเปนเวลา 12 ชวโมง เมอสารละลายเยนลงทอณหภมหองจะไดผลตภณฑเปนของแขงสเขยว ท าการกรองผลตภณฑทไดและลางดวย CH2Cl2 และ MeOH ไดของแขงสเขยวรอยละของผลตภณฑเทากบ 62

ESI-MS (positive mode, m/z): [M + 3ClO4]+ = 1235.0554

3.5 การหาคาคงทความเสถยรของการเกดเอนเซมเบลระหวางอนดเคเตอร Eosin Y กบสารประกอบ

โคออรดเนชน Cu2L1 และ Cu2L2 ดวยเทคนคฟลออเรสเซนตไทเทรชน ปเปตสารละลายอนดเคเตอร Eosin Y ความเขมขน 1 µM ปรมาตร 2 มลลลตร ใสลงในควเวท จากนนคอยๆ ไทเทรต

สารละลายของสารประกอบโคออรดเนชนแตละชนด ความเขมขน 20 µM ลงในควเวทดงกลาวดวยไมโครไซรงค หลงจากนนคนสารละลายใหเขากน น าสารละลายเอนเซมเบลทไดไปวดคาความเขมแสง โดยเครองฟลออเรสเซนตสเปกโตรโฟโตมเตอร ท าการไทเทรตจนกระทงคาความเขมของสญญานฟลออเรสเซนตคงท น าขอมลทไดมาสรางกราฟแสดงความสมพนธระหวางคาความเขมของสญญานฟลออเรสเซนตกบความยาวคลน และค านวณหาคาคงทของการเกดเอนเซมเบลโดยใชโปรแกรม SPECFIT (Binstead et al., 2000)

3.6 การศกษาความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกบกรดอะมโนชนดตางๆ ของเอนเซมเบล ปเปตสารละลายอนดเคเตอร Eosin Y ความเขมขน 1 µM ปรมาตร 2 มลลลตร ใสลงในควเวท จากนนใสสารละลาย

โคออรดเนชนแตละชนดทมความเขมขน 20 µM ปรมาตร 200 ไมโครลตร คนสารละลายใหเขากนและน าสารละลาย เอนเซมเบลดงกลาวไปวดคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนต จากนนใสกรดอะมโนทมความเขมขน 0.1 mM ปรมาตร 400 ไมโครลตร ลงในควเวททมสารละลายเอนเซมเบลอยหลงจากนนคนสารละลายใหเขากนแลวน าไปวดคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนต และท าการทดลองซ าเชนนกบกรดอะมโนชนดอนๆ จากนนน าขอมลทไดมาสรางกราฟแสดงความสมพนธระหวางคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตกบความยาวคลน การพจารณาวากรดอะมโนชนดใดสามารถแทนท Eosin Y และการพจารณาวาเอนเซมเบลใดมความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกบกรดอะมโนชนดใดนน สามารถท าไดโดยสงเกตวากรดอะมโนชนดใดท าใหเกดการเปลยนแปลงของคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตทความยาวคล น 545 nm ซงเปนคาสญญานฟลออเรสเซนตของ Eosin Y ในรปอสระ

3.7 การศกษาอนตรกรยาข นตอนการแทนท ของ His กบสารประกอบของเอนเซมเบลท เกดจาก

สารประกอบโคออรดเนชน Cu2L2 กบอนดเคเตอร Eosin Y ปเปตสารละลายอนดเคเตอร Eosin Y ความเขมขน 1 µM ปรมาตร 2 มลลลตร ใสลงในควเวท จากนนปเปต

สารประกอบโคออรดเนชน Cu2L2 ความเขมขน 20 µM ปรมาตร 200 ไมโครลตร ใสลงในควเวทดงกลาว คนสารละลายให เขากน น าสารละลายดงกลาวไปวดคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนต หลงจากนนเตมสารละลายของ His ความเขมขน



0.1 mM ครงละ 10 ไมโครลตร ลงในควเวทดงกลาว คนสารละลายใหเขากน และน าไปวดคาความเขมของสญญาณ ฟลออเรสเซนต และน าขอมลทไดมาสรางกราฟแสดงความสมพนธระหวางคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซ นต กบความยาวคลน และค านวณหาคาคงทการเกดของสารประกอบโคออรดเนชนโดยใชโปรแกรม SPECFIT ผลการวจยและวจารณผล 1. การหาคาคงทความเสถยรของการเกดเอนเซมเบลระหวางอนดเคเตอร Eosin Y กบสารประกอบ Cu2L1 และ Cu2L2 ดวยเทคนคฟลออเรสเซนตไทเทรชน จากการทดลองพบวาสารละลายอนดเคเตอร Eosin Y มคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตสงสดทความ

ยาวคลน 545 nm (λex = 525 nm) และเมอท าการไทเทรตสารละลายของสารประกอบโคออรดเนชนของคอปเปอร (II) ททราบความเขมขนทแนนอนลงไปยงสารละลายอนดเคเตอรดงกลาว พบวาคาความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตของอนดเคเตอร ในรปอสระจะมคาลดลงเนองจากคอปเปอร (II) ไอออนเปนตว quencher ทด (Liu et al., 2011) ดงนนเมออนดเคเตอร Eosin

Y เกดพนธะโคออรดเนชนกบคอปเปอร (II) ในสารประกอบโคออรดเนชน จงท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนต ของอนดเคเตอร Eosin Y มคาลดลง หลงจากนนน าขอมลทไดจากการท าฟลออเรสเซนตไทเทรชนมาค านวณหาคาคงทความเสถยร (log K) ของการเกดเอนเซมเบลโดยใชโปรแกรม SPECFIT จากภาพท 4-ก จะเหนไดวา เมอคอย ๆ เตมสารละลายของสารประกอบ Cu2L1 ลงไปยงสารละลายของอนดเคเตอร Eosin Y ในรปอสระจะท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตทความยาวคลน 545 nm มคาลดลงและเมอน าขอมลทไดไปค านวณหาคา log K พบวามคาเทากบ 3.82 ± 0.25 ซงสอดคลองกบการเกดของสปชส [Cu2L1·Eosin Y] ในท านองเดยวกนจากภาพท 4-ข จะเหนไดวา เมอคอย ๆ เตมสารละลายของสารประกอบ Cu2L2 ลงไปยงสารละลายของอนดเคเตอร Eosin Y จะท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตทความยาวคลน 545 nm มคาลดลงเชนเดยวกนและเมอน าขอมลทไดไปค านวณหาคา log K พบวามคาเทากบ 4.91 ± 0.33 ซงสอดคลองกบการเกดของสปชส [Cu2L2·Eosin Y]

(ก) (ข)

ภาพท 4 ฟลออเรสเซนตไทเทรชนสเปกตรมระหวางอนดเคเตอร Eosin Y และ (ก) สารประกอบ Cu2L1 (ข) สารประกอบ

Cu2L2 ในสารละลาย 0.01 M HEPES pH 7.4 ใน 80/20 (%v/v) CH3CN/H2O (λex = 525 nm)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

530 555 580 605 630 655 680

Inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

Eosin Y

Cu2L1 0 eq.

Cu2L1 3.5 eq.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

530 555 580 605 630 655 680

Inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

Eosin Y

Cu2L2 0 eq.

Cu2L2 3.5 eq.



โครงสรางทเปนไปไดของเอนเซมเบลทงสองแสดงไดในภาพท 5 จะเหนไดวาอนดเคเตอร Eosin Y ใชออกซเจน 2 อะตอมของหมคโตนและหมแอลกอฮอล ในการสรางพนธะโคออรดเนตโควาเลนตกบ Cu2+ แตละอะตอมในโครงสรางของสารประกอบโคออรดเนชน (Zhang & Yoshida, 2011)

N

NN

HN

Cu

N

N N

NH

Cu

NN

N

Cu

N

N

N

Cu

-OOC

Br Br

O

BrBr

O- O

-OOC

Br Br

O

BrBr

O- O

(ก) (ข) ภาพท 5 โครงสรางทเปนไปไดของเอนเซมเบลระหวาง (ก) Cu2L1 และ Eosin Y กบ (ข) Cu2L2 และ Eosin Y 2. การศกษาความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกบกรดอะมโนชนดตางๆ ของเอนเซมเบล จากการศกษาความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกรดอะมโนชนดตาง ๆ ของเอนเซมเบล [Cu2L1·Eosin Y] และ [Cu2L2·Eosin Y] ดงแสดงในภาพท 6 พบวามเพยงเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] เทานนทมความจ าเพาะเจาะจงในการตรวจวด His ไดเปนอยางด โดยผลการทดลองแสดงใหเหนวาเมอมกรดอะมโน His อยในระบบจะท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตของอนดเคเตอร Eosin Y ในรปอสระทความยาวคลน 545 nm มคาเพมขนอยางเหนไดชดเจน ในขณะทระบบของเอนเซมเบล [Cu2L1·Eosin Y] ไมมความจ าเพาะเจาะจงในการตรวจวดกรดอะมโนแตอยางใด เนองจากมกรดอะมโน ชนดอน ๆ นนสามารถท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตทระบบของเอนเซมเบล [Cu2L1·Eosin Y] ทความยาวคลนดงกลาวมคาเพมขนดวย

(ก) (ข)

ภาพท 6 (ก) ฟลออเรสเซนตสเปกตรมของสารละลายเอนเซมเบล [Cu2L1·Eosin Y] ในสภาวะทมกรดอะมโนชนดตาง ๆ 2 equivalents อยในระบบ (ข) ฟลออเรสเซนตสเปกตรมของสารละลายเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] ในสภาวะทมกรดอะมโนชนดตาง ๆ 4 equivalents อยในระบบ

0

100

200

300

400

500

600

530 555 580 605 630 655 680

Inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

Ens. + His

Ens. + กรดอะมโนชนดอนๆ

0

100

200

300

400

500

600

530 555 580 605 630 655 680

Inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

Ens. + His

Ens. + กรดอะมโนชนดอนๆ



จากภาพท 7 จะเหนไดวา เมอคอย ๆ เตม His ลงไปยงสารละลายเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] จะสงผลใหความเขมขนของสญญาณฟลออเรสเซนตทความยาวคลน 545 nm มเพมขน ทงนคาดวาเปนผลเนองมาจาก His อยในระบบไดเขาไปแทนท Eosin Y ในโครงสรางเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] และท าใหอนดเคเตอร Eosin Y หลดออกมาอยในรปอสระ สงผลใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตของอนดเคเตอร Eosin Y ในรปอสระทความยาวคลน 545 nm มคาเพมขน

(ก) (ข)

ภาพท 7 (ก) ฟลออเรสเซนตไทเทรชน และ (ข) กราฟแสดงความสมพนธระหวางความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนต ทความยาวคลน 545 nm กบจ านวน equivalent ของ His

3. การศกษาอนตรกรยาขนตอนการแทนทของ His กบสารประกอบของเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] จากงานวจยของ Folmer-Andersen และคณะ (Folmer-Andersen et al., 2005) ทพบวา His สามารถแทนท อนดเคเตอร 5(6)-carboxyfluorescein และลแกนดทเปนอนพนธของไพรดน เกดเปนสารประกอบ [Cu•His2] ในสารละลาย ซงในงานวจยนพบวาเมอคอย ๆ เตมสารละลาย His ลงไปยงสารละลายของสารประกอบโคออรดเนชน Cu2L2 เขมขน 1 mM พบวามของแขงสเหลองเกดขนในสารละลาย หลงจากนนกรองของแขงทไดและน าไปพสจนโครงสรางดวยเทคนค 1H-NMR พบวา 1H-NMR สเปกตรมของของแขงทกรองไดมลกษณะเหมอนกบ 1H-NMR สเปกตรมของลแกนด L2 ในรปอสระ โดยทคา

ท 3.52 ppm เปนโปรตอนของหมเมทลลน ทต าแหนงโปรตอน 1 คา ท 3.59 ppm เปนโปรตอนของหมเมทลลน ทต าแหนง

โปรตอน 2 คา ท 5.28 ppm เปนโปรตอนของหมเมทลลน ทต าแหนงโปรตอน 3 และคา ท 6.33 ppm เปนโปรตอนของหมแอมนทต าแหนงโปรตอน 4 ผลการทดลองดงกลาวแสดงวา His สามารถเขาไปแทนท Eosin Y ลแกนด L2 และไดสารประกอบ [Cu•His2] (log K = 18.1) เกดขนในสารละลายเชนเดยวกบงานวจยของ Anderson นอกจากนยงพบวาเมอน าสารละลายทไดจากการกรองเอาของแขงสเหลองออกไปมาตงทงไว 1 คนจะไดของแขงสฟา หลงจากนนจงกรองของแขงดงกลาวและน าไปพสจนเอกลกษณดวยเทคนคแมสสเปกโตรเมทรพบวาพกทมคา m/z สงสดคอพกทต าแหนง 404.1112 ซงเปนน าหนกโมเลกลของสปชส [Cu•His2 + H+] ดงแสดงในภาพท 9-ก

0

100

200

300

400

500

600

530 555 580 605 630 655 680

Inte

nsity

(a.u

.)

Wavelength (nm)

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25In

tens

ity @

545

nm

Equiv. of His

Ens. + His 22.5 eq.

Ens. + His 0 eq.



ภาพท 8 1H-NMR สเปกตรมของ (ก) ลแกนด L2 ในรปอสระและ (ข) ของแขงทเกดขนจากการท าปฏกรยาระหวาง สารประกอบ Cu2L2 และกรดอะมโน His ดงนนจงสามารถสรปไดวากลไกในการตรวจวด His โดยใชเอนเซมเบล [Cu2L2·Eosin Y] นน His จะเขาไปแทนทอนดเคเตอร Eosin Y ท าใหสญญาณฟลออเรสเซนตของอนดเคเตอรในรปอสระมคาเพมขนและนอกจากน His ยงเขาไปแทนทลแกนด L2 และเกดเปนสารประกอบโคออรดเนชน [Cu•His2] ทละลายน าไดอยในสารละลาย ดงนนจงสามารถสรปการเกดปฏกรยาการแทนทของ His ดงแสดงไดในภาพท 10

N

HN

H2N

O

-O

N

NH

NH2

O

O-Cu

ภาพท 9 (ก) แมสสเปกตรมของสปชส [Cu•His2 + H]+ และ (ข) โครงสรางทเปนไปไดของสารประกอบ [Cu•His2]

400 450 500 550 350 300 250 200

[CuHis2 + H]+

(ก)

(ข)

HN

HN

N

N

N

N

N

N

1

2

1

2

3

3

4

4

(ก)

(ข)



จากโครงสรางของสารประกอบ [Cu•His2] จะเหนไดวาเมอ His สรางพนธะโคออรดเนตโควาเลนตกบไอออน คอปเปอร (II) แลวจะท าใหไดโครงสรางคเลตทมลกษณะเปนวง 6 เหลยม (six-membered rings) จงสงผลใหสารประกอบ โคออรดเนชนทเกดขนมความเสถยรสง (Wada & Fernando, 1971) จากเหตผลดงกลาวจงท าให His สามารถเขาไปแทนท อนดเคเตอร Eosin Y และลแกนด L2 ในโครงสรางของเอนเซมเบล [CuL2·Eosin Y] ได

N

NN

HN

Cu

N

NN

NH

Cu

HOOC

Br Br

O

BrBr

O- O

N

HN

H NH2

OH

O

N

HN

H2N

O

-O

N

NH

NH2

O

O-

Cu ++

HOOC

Br Br

O

BrBr

-O OHN

N

NN

HN

N

N

N

ภาพท 10 ขนตอนการแทนทของ His กบสารประกอบของเอนเซมเบลทเกดจากสารประกอบโคออรดเนชน Cu2L2 กบอนดเคเตอร Eosin Y สรปผลการวจย จากการศกษาความเปนไปไดในการตรวจวดกรดอะมโนฮสทดน (His) ดวยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร โดยใชเอนเซมเบลทเตรยมจากสารประกอบโคออรดเนชนชนดไดนวเคลยรของคอปเปอร (II) กบลแกนดทมหมไดพโคลลแอมน Cu2L1 และหมไทรโพดลแอมน Cu2L2 เปนองคประกอบกบอนดเคเตอร Eosin Y ในสารละลายบฟเฟอร 80/20 (%v/v) CH3CN/H2O ใน 0.01 M HEPES pH 7.4 จากการศกษาการเกดเอนเซมเบลของสารประกอบโคออรดเนชนทงสองชนดดวยเทคนคฟลออเรสเซนตไทเทรชน พบวาเมอท าการไทเทรตสารละลายสารประกอบโคออรดเนชนไดนวเคลยรของคอปเปอร (II) ลงไปยงสารละลาย Eosin Y จะท าใหสญญาณฟลออเรสเซนตทความยาวคลน 545 nm มคาลงลดเนองจากคอปเปอร (II) ไอออนเปนตว quencher ทด ดงนนเมออนดเคเตอร Eosin Y เกดพนธะโคออรดเนชนกบคอปเปอร ( II) ในสารประกอบ จงท าใหความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนตของอนดเคเตอร Eosin Y มคาลงลด โดยสารละลายเอนเซมเบลระหวางสารประกอบโคออรดเนชน Cu2L1 กบ Eosin Y มคาคงทความเสถยรของการเกดเอนเซมเบล ( log K) [Cu2L1•Eosin Y] มคาเทากบ 3.82 0.25 สวนสารละลายเอนเซมเบลระหวางสารประกอบโคออรดเนชน Cu2L2 กบ Eosin Y มคา log K ของการเกดเอนเซมเบล [Cu2L2•Eosin Y] เทากบ 4.91 0.33 จากคา log K ของการเกดเอนเซมเบลทงสองจะเหนไดวาอนดเคเตอร



Eosin Y เกดอนตรกรยากบไอออนของ Cu2+ ในโครงสรางของสารประกอบ Cu2L2 ไดแขงแรงกวาสารประกอบ Cu2L1 เนองจากในโครงสรางของ Cu2L1 นนมความยดหยนของโครงสรางมากกวา Cu2L2 ซงเปนผลมาจากการทหมไดพโคลลแอมนมความเกะกะนอยกวา (steric effect) หมไทรโพดลแอมน จงท าใหโครงสรางของสารประกอบ Cu2L2 มความแขงแรงของโครงสรางมากกวาสารประกอบ Cu2L1 สงผลใหสามารถควบคมระยะหางระหวางไอออนคอปเปอร ( II) ไดดกวา ในสารประกอบ Cu2L1 และสงผลใหอนดเคเตอร Eosin Y สรางพนธะโคออรดเนตโควาเลนตกบไอออนคอปเปอร ( II) ในโครงสรางของสารประกอบ Cu2L2 ไดอยางแขงแรง เมอน าเอนเซมเบลท เตรยมจากสารประกอบโคออรดเนชน Cu2L1 และ Cu2L2 กบอนดเคเตอร Eosin Y มาท าการศกษาความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกบกรดอะมโนชนดตาง ๆ พบวาเอนเซมเบลทเตรยมจากสารประกอบ โคออรดเนชน Cu2L2 กบ Eosin Y มความจ าเพาะเจาะจงในการเลอกจบกบกรดอะมโนฮสทดนไดเปนอยางด ซงจากผลการทดลองแสดงใหเหนวากลไกการตรวจวด His นนเกดผานปฏกรยาการแทนท โดยท His เขาไปแทนทอนดเคเตอร Eosin Y และลแกนด L2 ในสารประกอบ Cu2L2 เกดเปนสารประกอบโคออรดเนชน [Cu•His2] และลแกนด L2 กบอนดเคเตอร Eosin Y ในรปอสระ ดงนนจงสามารถสรปไดวา สารประกอบโคออรดเนชนของคอปเปอร ( II) (Cu2L2) สามารถใชเปนรเซปเตอร ในการตรวจวดกรดอะมโน His ดวยเทคนคการถกแทนทของอนดเคเตอร โดยใชอนดเคเตอร Eosin Y เปนหนวยใหสญญาณ กตตกรรมประกาศ

งานวจยนประสบความส าเรจไดดวยดเนองจากไดรบการสนบสนนทนวจยจากโครงการปรญญาเอกกาญจนาภเษก (PHD/0236/2552) ศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม และส านกงานกองทนสนบสนนการวจย (RSA5580031 และ RTA5380003) คณะผวจยตระหนกถงความมงหวงของทนวจยทตองการสรางองคความรเพอพฒนาประเทศไทยเปนอยางยง และขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ ทน เอกสารอางอง Binstead, R. A. , Jung, B. , Zuberbühler, A. D. , SPECFIT/32 Global analysis System, 3.0, Spectrum Software

Associates, Marlborough, MA, 2000. Bolinl, M. , Akerud, P. , Hansson, A. , & Akerud, H. , ( 2011 ) . Histidine-Rich Glycoprotein as an Early Biomarker of

Preeclampsia. American Journal of Hypertension, 24, 496-501. Folmer-Andersen, J. F. , Lynch, V. M. Anslyn, E. V. (2005) . “Naked-Eye” Detection of Histidine by Regulation of

Cu(II) Coordination Modes. Chemistry - A European Journal, 11, 5319–5326. Incarvito, C. , Lam, M. , Rhatigan, B. , Rheingold, A. L. , Qin, C. J. , Gavrilova, A. L. , Bosnich, B. (2001) . Bimetallic

Reactivity. Preparations, Properties and Structures of Complexes Formed by Unsymmetrical Binucleating Ligands Bearing 4 - and 6 -Coordinate Sites Supported by Alkoxide Bridges. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions, 23, 3478-3488.

Kaspar, H., Dettmer, K., Gronwald, W., and Oefner P.J. (2008). Automated GC–MS Analysis of Free Amino Acids in Biological Fluids. Journal of Chromatography B, 870, 222-232.



Kovach, P. M. , Meyerhoff, M. E. (1982) . Development and Application of a Histidine-Selective Biomembrane Electrode. Analytical Chemistry. 54(2), 217-220.

Liu, Z. , Yang, Z. , Li, T. , Wang, B. , Li, Y. , Qin, D. Wang, M. Yana, M. (2011) . An Effective Cu( II) Quenching Fluorescence Sensor in Aqueous Solution and 1D Chain Coordination Polymer Framework. Dalton Transactions, 40, 9370-9373.

Nan, C. G., Ping, W. X., Ping, D. J., Qing, C. H. (1999). A Study on Electrochemistry of Histidine and Its Metabolites based on the Diazo Coupling Reaction. Talanta, 49, 319-330.

Sulliva Jr, D. J., Gluzman, I. Y., Goldberg, D. E. (1996). Plasmodium Hemozoin Formation Mediated by Histidine-Rich Proteins. Science, 271, 219-222.

Tang, F., Wu, K. K., Nie, Z., Ding, L., Liu, Q., Yuan, J., Guo, M., Yao, S. (2008). Quantification of Amino Acid Ionic Liquids Using Liquid Chromatography–Mass Spectrometry. Journal of Chromatography A, 1208, 175-181.

Wada, H. & Fernando, Q. ( 1971) . Determination of Formation Constants of Copper( II) Complexes of ( Hydroxyethylidene) diphosphonic Acid with Solid State Cupric Ion- Selective Electrode. Analytical Chemistry, 43(6), 751–755.

Watchasit, S. , Suktanarak, P. , Suksai, C. , Ruangpornvisuti, V. , Tuntulani, T. (2014) . Discriminate Sensing of Pyrophosphate Using a New Tripodal Tetramine-Based Dinuclear Zn( II) Complex Under an Indicator Displacement Assay Approach. Dalton Transactions, 43, 14701-14709.

Wiskur, S.L., Ait-Haddou, H., Lavigne, J.J., Anslyn, E.V. (2001). Teaching Old Indicators New Tricks. Accounts of Chemical Research, 34(12), 963-972.

Zhang, J. , Sun L. , Yoshida T. ( 2011 ) . Spectroelectrochemical Studies on Redox Reactions of Eosin Y and Its Polymerization with Zn2+ Ions. Journal of Electroanalytical Chemistry, 662, 384-395.

อิทธิพลของโครงสร้างลิแกนด์ใน...

Documents