สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

มการวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนและความสามารถในการ

เปนสารตานอนมลอสระของมนเลอดไกDetermination of Anthocyanin and Antioxidant Capacity of

Dioscorea alata Linn.

1. นาง หวหนาโครงการ สดสวน 60%2. นางสาวกาญจนา พศาภาค ผรวมโครงการ สดสวน 20%3. นางสาวดารานย รบเมอง ผรวมโครงการ สดสวน 10%4. นา ผรวมโครงการ สดสวน 10%

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

จากเงนกองทนสงเสรมงานวจยปงบประมาณ พ.ศ. 2555

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

[1]

บทคดยอ (ไทย)

การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนและความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระของมนเลอดไก

บทคดยอ

ใน ไดศกษาการวเคราะหปรมาณสารแอนโธไซยานนและความสามารถในการ

ผลการทดลองพบวาเหมาะสมในการสกดสารแอนโธไซยานนจาก สงสด ไดแก ตวทาละลายกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตร ใชเวลา 180 นาท และอตราสวนของวตถดบตอตวทาละลาย คอ 1:75 ในเปลอกมนเลอดไกมสารแอนโธไซยานนมากก (ในเปลอก 664.671+0.337 mg/100g

289.642+0.250 mg/100g )

จากการศกษาความสามารถในการตานอนมลอสระดวยวธ DPPH พบวา สารสกดจากเปลอกมนเลอดไกมเปอรเซนตการตานอนมลอสระ DPPH 94.71 %เลอดไก DPPH ได 91.75 %มอย

คาสาคญ : แอนโธไซยานน มนเลอดไก สารตานอนมลอสระ

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

[2]

บทคดยอ (องกฤษ)Determination of Anthocyanin and Antioxidant Capacity of Dioscorea alata Linn.

Abstract

This research is aimed to determine anthocyanin and antioxidant capacity from peeland flesh of Dioscorea alata Linn. Optimum conditions, i.e. solvent, timing and ratio of rawmaterial to solvent were studied for anthocyanin extraction. The result revealed that thehighest anthocyanin was achieved by using 1%(v/v) HCl in methanol as solvent. In regard totiming effect, the optimum timing to obtain the highest anthocyanin content was 3 hrs. Forratio of raw material to solvent effect, 1:75 gave the highest anthocyanin content. In optimumcondition, anthocyanin content of peel and flesh of Dioscorea alata Linn. were 664.671+0.337 mg/100g fresh weight and 289.642+0.250 mg/100g fresh weight respectively.

The study of antioxidant capacity by DPPH method found that antioxidantpercentage from peel and flesh of Dioscorea alata Linn. were 94.71 and 91.75 respectively.Antioxidant capacity was correlated with anthocyanin contents.

Key word : Anthocyanin, Dioscorea alata Linn., Antioxidant

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญ

หนา

1. บทคดยอ (ไทย) [1]2. บทคดยอ (องกฤษ) [2]3. 1 บทนา 14. 2 45. 3 วธดาเนนการทดลอง 156. 4 ผลการทดลอง 197. 5 สรปผลการทดลอง 278. บรรณานกรม 309. ภาคผนวก 33

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญรป

หนา

2.1 โครงสรางของแอนโธไซยานน 42.2 6 ชนด 52.3 โครงสรางอนมลอสระ DPPH 112.4 เลอดไก 122.5 ลกษณะตนออนของมนเลอดไก 134.1 น 20

จากเปลอกมนเลอดไก4.2 21

4.3 22จากเปลอกมนเลอดไก

4.4 ยานน 23

4.5 ในการสกด 24สารแอนโธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไก

4.6 ในการสกด 25สารแอนโธไซยานน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญตาราง

หนา

2.1 Flavonoids 62.2 ความสมพนธของ pH 74.1 ปรมาณสารแอนโธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไกในตวทาละลายตาง ๆ 204.2 214.3 224.4 ๆ 234.5 24

ของวตถดบตอตวทาละลายตางๆ4.6 25

ของวตถดบตอตวทาละลายตางๆ4.7 รอยละของการตานอนมลอสระ DPPH ของสารสกดจากเปลอกมนเลอดไก 264.8 รอยละของการตานอนมลอสระ DPPH 26

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

1บทนา

1. หลกการและเหตผลแอนโธไซยานน เปนรงควตถ (pigment) (pH>7)

(pH 7) (pH<7) ปกตสารแอนโท

ตวอยางผลไม เชน blueberry, cherry, raspberry, mulberrycranberry เปนตน สวนในดอกไม เชน ดอก pansy, dandelion อญชน เปนตน หรอในพชใบ เชน redcabbage, red radishสจากดอกอญชนทาขนมจนใชสของเปลอกไมและใบไมบางชนดในการยอมผาใหมสตาง ๆ ดวยการใชยางไมและปนขาวในการแตงส ยโรปใชผลไมปา (wild berry)

(Sullivan, 1998)

ลดโอกาสการเปนโรคมะเรงโรคหลอดเลอดหวใจอดตน (Lazze et al., 2004) ชวยเสรมใหรางกาย

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

2

มนเลอดไก หรอมนตบแรด (Dioscorea alata )พมา สวนใหญเปนหวขนาดใหญ จงเรยกวา greater yamรปทรงแตก ๆ ตางกนออกไป กลมร ตวย ฯลฯ เคยมผคนพบถง72 แบบ จงเรยกไปตามลกษณะหว เชน มนง มนมะพราว มนมอหม มนเหลอง มนเขาวว มนหวาย ฯลฯมากหนกเปนสบ ๆ กโลกรม ขนาดกลางและขนาดเลก รปทรงตาง ๆ กนออกไป สวนใหญเปลอกหนา ไมเรยบ และออกสดน บางทมรากตดรงรง วงกระจายเปนหยอม ๆ

ดแปลกตา (taro ;Colocasia esculenta) (sweet potato ; Ayamurasaki ; Ipomoea batatas)แปงอนนามากนเปนอาหารได คนไทยกเรยกเปน “มน”

มนเลอด มนมอเสอ มนตะขาบ ฯลฯ

นานแลว

นา และนาไปสการผลตเชงพาณชยตอไป

2. วตถประสงคของโครงการ1.2.3.

3. ขอบเขตของโครงการวจย1.2.3.4. หาความสามารถในก DPPH

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

3

4.1.2. ทราบปรมาณแอนโธไซยานนจากมนเลอดไก3.4. สามารถนาผลงานวจยไปใชพฒนาเชงพาณชยตอไปได

5. ระยะเวลาและแผนดาเนนโครงการวจยระยะเวลา

2554 2555

แผนดาเนนโครงการวจยพ.ศ.2554-2555

พ.ศ.2554 พ.ศ.2555ต.ค. พ.ย. ธ.ค. ม.ค. ก.พ. ม.ค. เม.ย พ.ค. ม.ย. ก.ค. ส.ค. ก.ย.

1. ศกษาขอมลการสกดแอนโธไซยานน2. เตรยมวตถดบ สารเคม และอปกรณ3. ในการสกดแอนโธไซยานนเลอดไก4. วเคราะหและเปรยบเทยบปรมาณแอนโธไซยานนเลอดไก5. หาความสามารถในการตานอนมล

โดยวธ DPPH5. วเคราะหผลการทดลอง6. สรปผลและวเคราะหขอมล

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

2แนวคด ทฤษฎ และงานวจย ของ

การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนและความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระของมนเลอดไก

1. สารแอนโทไซยานน2. อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ3. มนเลอดไก4.

1. สารแอนโธไซยานนแอนโธไซยานน เปนสารในกลมฟลาโวนอยด

วงแหวนเบนซน 2 3 อะตอม เรยกวา flavan บนวงแหวนเบนซนรอกซลเกาะอยไดในหลายรปแบบ ฟลาโวนอยดจงจดเปนสารประกอบฟนอลกชนด

เพราะมสวนของฟนอลเปนองคประกอบ (จรงแท, 2549)อรษา เชาวนลขต (2554) 2.1

2.1 โครงสรางของแอนโธไซยานน: อรษา (2554)

C

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

5

6 ชนด คอ pelargonidin, cyaniding, peonidin,delphinidin, petunidin และ malvidin 2.2

2.2 6 ชนด: ทพวด (2550)

จดอยในกลมของรงควตถพวกฟลาโวนอยด แอนโธไซยานนพบอยใน organelleSup-epidermal tissue ของใบ ดอก และผลของพช โดยแอนโธไซยานนมการ

(pH) pHเทากบ 1 (เปนกรด) มสสมแดง ถา pH นอยกวา 6ไมมส ถา pH มากกวา 6 (เปนเบส)ถา pH เปนเบสมากเกนไป จะทาใหแอนโธไซยานนเสยโครงสราง แอนโทไซยานนจะละลายไดดใน

non-hydroxyl เชนอะซโตน เบนซน คลอโรฟอรม อเทอร เปนตน (ยทธนา, 2550)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

6

2.1 Flavonoids

ชนดของสาร คณสมบตทางชววทยาAnthocyanins 250Chalcone 60 รงควตถสเหลองFlavones 350 รงควตถสครม พบในดอกไมFlavonols 350 พบในใบพชDihydrochalcone 10 บางชนดมรสขมProanthocyanidins 50 astringent substances

Catechins 40บางชนดมคณสมบตคลายแทนนน (tannins)

Isoflavonoids 15 estrogen

คณสมบตของสารประกอบแอนโธไซยานน2.1 ยานนดดกลนแสงในชวงส

465-550 นาโนเมตรโดยวงแหวน C270-280 นาโนเมตรโดยวงแหวน A

hydroxylationhydroxyl glycosylation

acylation หรอมหม acyl ของกรดในกลม cinnamic310-335 นาโนเมตร แตการ methylation หรอการม

หม methylไซยานนดงกลาวขางตนจงทาใหแอนโธไซยานนทาเหมอนตว indicator ในสารละลาย กลาวคอ

pH

: (2550)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

7

ไซยานนจะใหสคอนขางแดงของ flavylium pH ะคอยๆจางลงจนไมมสของ pseudobase anhydrobase

(จรงแท, 2549)

2.2 ความสมพนธของ pH

pH คา absorption maximum (nm) ฏ4 520 แดง (red)

4-6 525-550มวงแดง (violet red)

(violet blue)6-8 570-575 (blue)9 590-600 (blue)

การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานน(Total Antrocyanins) ทาไดโดยแบงตามลกษณะ

ของตวอยางออกเปน 2 กลม คอ1.

เลกนอยหรอไมมเลย

สงในชวงเดยวกบแอนโธไซยานนคอ 460-550 นาโนเมตร อยนอยประกอบกบสารประกอบ phenolic

ในการศกษาปรมาณการม

กบคาการดดกลน2.

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

8

ใหคาการดดกลนแสงสงสด วธในขอ 1(interfere) ของ degradation products

degradation products จะมา

ประสทธภาพในการสกด การใชเอทานอลและเมทานอลเปนตวทาละลายจะมประสทธภาพในการสกด

ละลายในเอทานอลความเขมขนรอยละ 0.03สกดไดมเสถยรภาพด า กรด (จารวรรณ

, 2547)

2. อนมลอสระ (Free radical)อนมลอสระคอ กตรอนไมเปนคอยในวงอเลกตรอนวงนอกสด (outer

orbital) (unpaired electron) อยในวงโคจรของโมเลกลทาใหไมเสถย โดย อนมล

นดใหม(chain reaction)ตอกน

(Halliwell, 1991)ลงไดตามอณหภม ความเปนกรดดาง (pH)

เปนตน

คอแสดงดวยจดในตาแหนงขางบนของสญลกษณทางเคม เชน อนมล R• แทนอะตอม

(R+•) เชน อนมลpyridinyl (NAD+•) และประจลบ (R-•) เชน อนมล superoxide (O2

-•) หรอเปนกลาง เชน อนมล peroxyl(ROO•) หรออนมล thiyl (RS•) เปนตน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

9

หลายชนดถกจดเปนอนมลอสระดวย เชน คลอรนอะตอม (Cl•) และซลเวอรอะตอม (Ag•) เปนตน(Roberfroid and Calderon, 1995)

ชวภาพ ไดแก Hydroxyl radical (HO•), Superoxide anionradical (O2

-• ) เปนตน

สารตานออกซเดชน (Antioxidant)สารตานออกซเดชน คอ

สามารถขจดอนมลอสระออกจากรางกาย รางกายมระบบตานออกซเดชน แบงไดเปน 2 กลมใหญๆ คอประเภทแรกปองกนการเกดสารอนมลอสระไดแก เอนไซม superoxide dismutase, glutathioneperoxidase, catalase, peroxidase, cytochromeC peroxidase ทองแดง สงกะส ซเลเนยมมทองแดงอยในโมเลกล (ceruloplasmin)

วตามนอ เบตา-แคโรทน วตามนซ ubiquinone, uric acid, bilirubin, albumin,sulfhydryl groups ในกรดอะมโน cysteine เชนสารประกอบฟโนลก (phenolic compounds) และสารกลม flavanoidsนาสนใจอกดวย (มลศร, 2540)

สารตานออกซเดชน 3 ชนด1. Preventive antioxidant ปองกนการเกดอนมลอสระ2. Scavenging antioxidant3. Chain breaking antioxidant

ตวอยางสารตานออกซเดชนบางชนด1. สารประกอบฟนอลก (phenolic compounds)

สารประกอบไกลโคไซด (glycosides) และพบไดในสวนของชองวางภายในเซลล (cell vacuole) มลกษณะสตร

เชน simple monocyclic phenol, phenyl propanoid,phenolic

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

10

quinine และ polyphenolic lignin, tannin เปนตนกลมฟนอล (phenolic unit) รวมอยในโมเลกลของโปรตนอลคาลอยด (alkaloid) และเทอรพนอยด(terpenoid) เปนตน (อญชนา, 2544)

2. ฟลาโวนอยด (ไบโอฟลาโวนอยด)ฟลาโวนอยด จะพบมากในพชผกและผลไม

เปนสารตานออกซเดชน ความสามารถของการตานออกซ ยงสามารถชวยลดการอกเสบ ชวยใหหลอดเลอดแขงตวลดโคเลสเตอรอลและชวยเสรมการทางานของวตามนซ พบไดในพชหลายชนด เชน สม พรกไทย และพ เปนตน ฟลาโวนอยดแบงไดเปน 4 ประเภทใหญๆ คอ

1. แอนโธไซยานดน (anthocyanidin) แอนโธคลอรส (anthochlors) และออโรนส(auronus) แอนโธไซยานดน (red-blue) คอ

พบใน องนแดง หวหอม เปนตน แอนโธคลอรสเปนพบมากในดอกไม

2. (minor flavonoid) ไดแกฟลาโวโนน (flavonones) ฟลาวา-3-ออล (flava-3-ols) ไดไฮโดรฟลาโวน (dihydroflavone) และไดไฮโดรชาลโคน (dihydrochalcones) (citrus) ไดแก สม องน แตจะพบใน

3. ฟลาโวน (flavone) และฟลาโวนอล (flavonols)ฟลาโวนอยด พบใน วาน หวหอม ชาดา ชาเขยว ไวนแดงมะเขอเทศ แครอท ผกขม สม ลกแพร องน เปนตน

4. ไอโซฟลาโวนอยด (isoflavonoid) (Leguminosae; Legume)(isoflavone) เทอโรคารแปนส (terocarpans) ไอโซฟลาวาน

(isoflavans) และโรทนอยด (rotenoid) เจนสทน (genistein) ไบโอชานน เอ(biochanin a) และไดดซน (daidzein)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

11

การวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยวธ DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)อนมล DPPH• เปนอนมลไนโ มสมวง อยในรปอนมลอยแลว โดยไมตองทา

ABTS+• การวเคราะหเปนการวดความสามารถของสารทดสอบในการกาจดอนมลอสระ โดยวธใหไฮโดรเจนอะตอมดดกลนแสง (spectrophotometer) วดการลดลงของส โดยวดการ

517 นาโนเมตรDPPH radical ใชในการทดสอบความสามารถในการทาลายอนมลอสระของสารตวอยาง(scavenging activity) สารละลายของ DPPH• มสมวงในเอทานอล

H เปนสารละลายสเหลองDPPH• + RH DPPH-H + R•

สมวง ตวอยาง สเหลองทดสอบ

อกซเดชนออกมาในคา % inhibition% inhibition = [(A517 control – A517 test sample)/ A517 control)] x 100

2.3 โครงสรางอนมลอสระ DPPH: ประภสรา (2551)

ออกซเดชนจากธรรมชาตอนมล DPPH•

เซลลหรอรางกาย

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

12

3. มนเลอดไกDioscorea alata Linn.DioscoreaceaeGreater yam หรอ Winged yam

น มนเลอดไก , มนตบแรด , มนเขาวว , มนเสา , มนหวาย

2.4 เลอดไก

มนเลอดไก น

อยางไร มนเลอดไก มนเลอดไกลกษณะของลาตนใตดนแบบหว (tuber) สวนใหญมรปรางเปนแผนคอนขางแบน

แตกตางกนออกไป เชน รปรางคลายหวมนเทศ รปรางคอนขางกลม ฯลฯลกษณะทางพฤกษศาสตร

มนเลอดไก10

(wings) 4 มมตามความยาวของลาตน มหวยอย (bulbils) ตามซอกใบเปนจานวนมาก ปลายใบเรยวแหลม ฐานใบเปนรปหวใจ ใบและลาไปเปนสเขยว มเสนใบหลก 7-9 เสน ครบสชมพอมมวง กานใบยาว 10 - 15

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

13

2.5 ลกษณะตนออนของมนเลอดไก

การเจรญเตบโตโดยตามธรรมชาตแลวมนเลอดไก

อย

มนเลอดไก10 กโลกรม

4บศรารตน. (2547)

พบวา ชนดตวทาละลายและความเปนกรด- คอ : เอทานอล (1:1) ปรบความเปนกรด-ดาง เปน 2.5 ดวยกรดไฮโดรคลอรค 1:4

เหมาะสม คอ อณหภม 55 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท โดยปรมาตรสารละลายสกด230 มลลลตร ระเหยจนไดสารละลายสกดแอนโธไซยานนเขมขนเทากบ

70 มลลลตร

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

14

สภาพรรณ และ อรไท. (2549) ไดศกษาการสกดแอนโธไซยานนจากเปลอกมงคดโดยใชตวทาละลายตางกน ไดแก 1%HCl ใน methanol, 1%HCl ใน ethanol และ1%HCl ใน buthanol พบวา การใช 1%HCl ในสารละลาย Alcohol 3 ชนด จะมประสทธภาพการสกดดกวาการใช 1%HCl

Alcohol 3 ชนด พบวา 1%HCl ใน methanol จะมประส 1%HCl ใน ethanol และ 1%HCl ใน buthanolตามลาดบ

มนตวด และศศธร. (2550) ไดศกษาความคงตวของแอนโธไซยานนตออณหภม (70-90oC)และความเปนกรด-ดาง(pH 2.5-8.0) -ดวยสารละลายซเตรทฟอสเฟตบฟเฟอร ผลการทดลองแสดงใหเหนวาการสลายตวของแอนโธไซยานน

(t1/2) ลดลง แอนโธ-ดางเทากบ 2.5 70, 80

และ 90 oC (t1/2)เทากบ 13.7, 8.4 และ 4.6 ตามลาดบ สวนคาความเปนกรด-ดางมผลตอความคงตวตอแอนโธไซยานนโด -

(t1/2)ลดลง-ดาง 2.5 รองลงมาคอ 4.0, 6.0 และ 8.0 ตามลาดบ

อรษา. (2554) ไดศกษาการสกดและวธวเคราะหแอนโธไซยานน พบวาสกดแอนโธไซยานน ไดแก เอทานอล เมทานอล และอะซโตน วธการสกดดวยตวดดซบของแขง(SolidPhase Extraction) การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานน สามารถแบงเปน 2 แบบ คอ เชน วธพเอช-ดฟเฟอเรนเชยล (pH-Differential) ดวยสเปคโตรมเตอร และการวเคราะหชนดและปรมาณของแอนโธไซยานน (High Performance LiquidChromatography) การยอยดว

HPLC

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

3วธดาเนนการทดลอง

1. การเตรยมอปกรณ และสารเคม2.3. การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนในสารสกดจาก มนเลอดไกโดยวธ

pH – differential4.

ดวยวธ DPPH

1. การเตรยมอปกรณ และสารเคม1.1 อปกรณ

1. -วสเบล สเปกโทรโฟโตมเตอร (UV-Visiblen SpectrophotometerThermo Scientific Evolution 300)

2. ระบบสญญากาศ (Vacuum rotary evaporator )3. 4 ตาแหนง4. 2 ตาแหนง5. (pH meter)6.

1.2 สารเคม

1. กรดไฮโดรคลอรกเขมขน 36.5 % (conc.Hydrochloric acid ; conc.HCl), Merck, AR2. เมธานอล 95 % (Methanol ; CH3OH), Merck, AR3. เอธานอล 95 % (Ethanol ; CH3CH2OH), Merck, AR

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

16

4. โพแทสเซยมคลอไรด (Potassium chloride ; KCl), Merck, AR5. โซเดยมแอซเตท (Sodium acetate ; CH3COONa), Merck, AR6. แอมโมเนยมไฮดรอกไซดเขมขน28 % (conc.Ammonium hydroxide ; conc.NH4OH),

Merck,AR7. 2,2 -ไดฟนล-1-ไพครล-ไฮดราซล (2,2-diphenyl-1-picry-hydrazyl ; DPPH), Sigma

2.2.1 ตวทาละลาย

2.1.1 5 กรม ลงในขวดรปชมพขนาด250 มลลลตร เตมกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 25 มลลลตร เขยาแรงๆ

4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1นามากรองดวยกระดาษกรอง 4 องศาเซลเซยส

2.1.2 514 นาโนเมตรถาคาการดดกลนแสงของสารสกดมคามากกวา 0.1

0.12.1.3

สญญาก 40 องศาเซลเซยส2.1.4 กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1

10 4วเคราะหตอไป ทาการสกดดวยวธเดยวกน 3 ง

กรดไฮโดรคลอรกเขมขน 1 M กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเอทานอลโดยปรมาตร และกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตร ตามลาดบ โดยในแตละตวทาละลาย ทาการสกดจานวน 3

2.2ทาการสกดวธเดยวกบขอ 2.1 ไดจาก

การทดลอง 2.1 6 ชวงคอ 30, 60, 120, 180 และ 240 นาทตามลาดบ โดยในแตละชวงเวลาทาการสกดจานวน 3

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

17

2.3ทาการสกดวธเดยวกบขอ 2.1

2.1 และ 2.2ในการสกดตางๆ คอ 1:25 1:50 1:75 และ 1:100 ตามลาดบ โดยในแตละอตราสวนทาการสกดจานวน 3

3. การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนในสารสกดจากมนเลอดไกโดยวธ pH – differential3.1 มาตวอยางละ 5 มลลลตร มาเจอจางดวยสารละลาย

บฟเฟอรพเอช 1.0 จนมปรมาตรเปน 50 มลลลตร3.2 510 และ700 นาโนเมตร

ตามลาดบ3.3 มาตวอยางละ 5 มลลลตร มาเจอจางดวยสารละลาย

บฟเฟอรพเอช 4.5 จนมปรมาตรเปน 50 มลลลตร3.4 นาสารละลายไปว 510 และ700 นาโนเมตร

ตามลาดบ3.5

A = ( A510nm – A 700nm )pH1.0 - (A510nm – A700nm)pH4.5

3.6 คานวณหาปรมาณแอนโธไซยานนจากสตรปรมาณแอนโธไซยานน ( mg/L ) = ( A x MW x DF x 1000 )

ɛ x l

A = คาการดดกลนแสงของสารละลายเจอจางMW = 449.2 (ใชคามวลโมเลกลของ Cyadinin 3-glucoside ) g / mol

ɛ = 26,900 L/mol/cm-1

l = 1 cmDF = diluton factor

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

18

4.ดวยวธ DPPH

0.1 มลลลตรลงในหลอดทดลองขนาดใหญ เตมสารละลาย2.0 mM DPPH ในเมธานอล 95% ปรมาตร 2.930 นาท 517 นาโนเมตร (เปน Asample) โดยทาการทดลองตวอยางละ 3 0.1 มลลลตร ทาปฏกรยากบ2.0 mM DPPH ในเมธานอล 95% ปรมาตร 2.9 มลลลตร เขยมด 30 นาท 517 นาโนเมตร (เปน Acontrol)จงนามาคานวณหาเปอรเซนตการตาน DPPH ของ สารสกดจากสตร

เปอรเซนตการตาน DPPH ของสารสกด = Acontrol - Asample x 100Acontrol

Acontrol คอ คาการดดกลนแสงของสารละลาย DPPH ในเมธานอลAsample คอ คาการดด DPPH

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

4ผลการทดลอง

การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนและความสามารถในการเปนสารตานอนมลอสระของมนเลอดไก มผลการวจย ดงตอไป

1.2. การวเคราะหปรมาณแอนโธไซยานนในสารสกดจาก มนเลอดไกโดยวธ

pH – differential3.

ไกดวยวธ DPPH

1. การหา เหมาะสมในการสกดสารแอนโธไซยานนจาก มนเลอดไก1.1 ผลของตว

4 ชนดไดแก กรดไฮโดรคลอรกเขมขน 1 โมลาร กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเอทานอลโดยปรมาตรและกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1

4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1ตวอยางละ 3 pH-differentialประสทธภาพในการสกดสารแอนโธไซย

4.1 และ4.2

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

20

4.1 ปรมาณสารแอนโธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไกในตวทาละลายตาง ๆ

ตวทาละลาย ดดกลนแสง + SD( A)

จากเปลอกมนเลอดไก

(มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

HCl เขมขนรอยละ 1 0.4548+0.0062 75.947+ 1.027 379.733+ 5.135HCl เขมขน 1โมลาร 0.4969+0.0033 82.977+0.544 414.884+2.722HClเขมขนรอยละ1ในเอทานอล 0.5221+0.0013 87.190+0.217 435.952+1.086HCl เขมขนรอยละ1ในเมทานอล 0.5793+0.0004 96.731+0.067 483.655+0.337

4.1จากเปลอกมนเลอดไก

379.733 414.884 435.952483.655

0

100

200

300

400

500

600

HCl เขมขนรอยละ 1 HCl เขมขน 1 โมลาร HCl เขมขนรอยละ 1ในเอทานอล

HCl เขมขนรอยละ 1ในเมทานอล

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

21

4.2 ดไกในตวทาละลายตาง ๆ

ตวทาละลาย ดดกลนแสง + SD( A) (มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

HCl เขมขนรอยละ 1 0.1289+0.0002 21.530+0.026 107.652+0.128HCl เขมขน 1โมลาร 0.1772+0.0059 29.596+0.983 147.980+4.916HCl เขมขนรอยละ1ในเอทานอล 0.2033+0.0055 33.954+0.922 169.772+4.608HCl เขมขนรอยละ1ในเมทานอล 0.2446+0.0092 40.840+1.529 204.200+7.646

4.2 กราฟแสดงผลของตวทาจาก

1.2

กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตร 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา30 - 240 นาท โดยทาการสกดตวอยางละ 3

107.652147.980

169.772204.200

0

50

100

150

200

250

HCl เขมขนรอยละ 1 HCl เขมขน 1 โมลาร HCl เขมขนรอยละ 1ในเอทานอล

HCl เขมขนรอยละ 1ในเมทานอล

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

22

0100200300400500600700

0 50 100 150 200 250 300

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

เวลา (นาท)

pH-differentialมนเลอดไก 4.3 และ4.4

4.3 ปรม

เวลา (นาท) ดดกลนแสง + SD( A)

จากเปลอกมนเลอดไก

(มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

30 0.2917+0.0002 48.716+0.035 243.581+0.17460 0.4339+0.0002 72.456+0.029 362.282+0.145120 0.6274+0.0003 104.769+0.044 523.844+0.221180 0.6995+0.0004 116.803+0.063 584.016+0.316240 0.6285+0.0059 104.952+0.983 524.762+4.917

4.3 โธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไก

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

23

0

50

100

150

200

250

0 50 100 150 200 250 300

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

เวลา (นาท)

4.4

เวลา (นาท) ดดกลนแสง + SD( A) (มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

30 0.1137+0.0014 18.992+0.237 94.961+1.18560 0.1846+0.0002 30.832+0.039 154.159+0.193120 0.2497+0.0002 41.692+0.035 208.653+0.174180 0.2778+0.0004 46.395+0.063 231.975+0.316240 0.1921+0.0002 32.073+0.026 160.365+0.128

4.4

1.3การสกดสารแอนโธไซยานนจาก ดวยตวทาละลายของกรด

ไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตรในอตราสวน 1:25, 1:50, 1:75, 1:100อณหภม 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 180 นาท โดยทาการสกดตวอยางละ 3

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

24

ปรมาณสารแอนโธไซยานนโดยวธ pH-differential ไดผลการทดลองดงแสดงในตาราง 4.5 และ4.6

4.5 แสดงปรมาณสารแอนโธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไตอตวทาละลายตางๆ

อตราสวนของวตถดบตอตวทาละลาย

ดดกลนแสง + SD( A)

จากเปลอกมนเลอดไก

(มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

1:25 0.7184+0.0012 119.970+0.196 599.852+0.9781:50 0.7524+0.0004 125.637+0.059 628.184+0.2931:75 0.7961+0.0004 132.934+0.067 664.671+0.3371:100 0.5854+0.0003 97.755+0.044 488.776+0.221

4.5 ในการสกดสารแอนโธไซยานนจากเปลอกมนเลอดไก

599.852 628.184664.671

488.776

0

100

200

300

400

500

600

700

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

อตราสวนของวตถดบตอตวทาละลาย

1:50 1:751:25 1:100

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

25

4.6ตอตวทาละลายตางๆ

อตราสวนของวตถดบตอตวทาละลาย

ดดกลนแสง + SD( A) (มลลกรม/ลตร) (มลลกรม/100 กรม)

1:25 0.2781+0.0002 46.440+0.033 232.198+0.1671:50 0.3165+0.0008 52.852+0.133 264.260+0.6631:75 0.3469+0.0003 57.928+0.050 289.642+0.2501:100 0.2966+0.0011 49.529+0.176 247.644+0.880

4.6 ในการสกดสารแอนโธไซยานน อมนเลอดไก

232.198264.260

289.642

247.644

0

50

100

150

200

250

300

350

ปรมาณแอนโธไซยานน(mg/100g)

อตราสวนของวตถดบตอตวทาละลาย

1:50 1:751:25 1:100

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

26

4.ไกดวยวธ DPPH

คลอรกเขมขนรอยละ 1 1:75อณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 3 DPPH

30 517 นาโนเมตร โดยใหเปน Asampleโดยใชเมธานอลเขมขนรอยละ

95 DPPH 30 นาท แลวนาไปวดคาการ

517 นาโนเมตร โดยใหเปน Acontrol 4.7 และ4.8

4.7 รอยละของการตานอนมลอสระ DPPH ของสารสกดจากเปลอกมนเลอดไก

ตวอยาง517 นาโนเมตร + SD

รอยละของการตานอนมลอสระ+ SDAcontrol = 5.5221

Asampleเปลอกมนเลอดไก 0.2924+0.000 94.71+0.006

4.8 รอยละของการตานอนมลอสระ DPPH อมนเลอดไก

ตวอยาง517 นาโนเมตร + SD

รอยละของการตานอนมลอสระ+ SDAcontrol = 5.5223

Asample0.4556+ 0.001 91.75+ 0.026

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

5สรปผลการทดลอง

pH-differential แลววดคา

–กลาวคอสารแอนโธไซยานน

จากการวเคราะหหาปรมาณสารแอนโธไซยานน และความสามารถในการตานอนมลอสระ

1. การหาสภาวะ าะสมในการสกดสารแอนโธไซยานน มนเลอดไก1.1

เลอดไกการวเคราะหปรมาณสารแอนโธไซยานนจาก โดยการนาสารสกด

ดวยตวทาละลายชนดตางๆ แลววดคาการดดกลนแ – วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร พบวา สารสกดในตวทาละลายของกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ1 ในเมทานอลโดย

(ในเปลอก 483.655±0.337 mg/100g สวน204.200±7.646 mg/100g) ตวทา เปลอกมนเลอดไกคอ กรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตร

1.2การวเคราะหปรมาณสารแอนโธไซยานนจาก มนเลอดไกดวยตวทาละลาย

ของกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 - 240 นาท และนาไปหาปรมาณสารแอนโธไซยานนโดยวธ pH-differential แลววด

–วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร พบวา ในการสกดปรมาณสารแอนโธไซยาน 30 นาท จนไดปรมาณสงสดจากการสกด 180 นาท คอ(ในเปลอก 584.016 ±0.316 mg/100g 231.975 ±0.316 mg/100g)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

28

ในการสกดมากกวา 180เหมาะสมในการสกดสารแอนโธไซยานนจากมนเลอดไกคอ 180 นาท

1.3 อตราสวนของ ใน

การวเคราะหสารแอนโธไซยานนจาก มนเลอดไกดวยตวทาละลายของกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 ในเมทานอลโดยปรมาตร และใชอตราสวนของวตถดบตอตวทาละลายคอ 1:25, 1:50, 1:75, 1:100 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 3ปรมาณสารแอนโธไซยานนโดยวธ pH-differential –วสเบลสเปกโทรโฟโตมเตอร พบวา 1:75(ในเปลอก 664.671± 0.337 mg/100g 289.642±0.250 mg/100g)

2. การวเคราะหและมนเลอดไก

ตวทาละลาย เวลาและอตราสวนวตถดบตอตวทาละลาย พบวา ในเปลอกจะมปรมาณ (ในเปลอก 664.671±0.337 mg/100g289.642±0.250 mg/100g)

3. การหาความสามารถในการไกดวยวธ DPPH

การวเคราะหความสามารถในการตานอนมลอสระดวยวธ DPPH โดยการนาสารสกดจาก1 ในเมทานอลโ 1:75 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3มนเลอดไกได มาทาปฏกรยากบ DPPH 517 นาโนเมตรดวย

ยว –วสเบล สเปกโทรโฟโตมเตอร พบวา เปลอกมนเลอดไกสามารถตานอนมลอสระ DPPHได 94.71 % DPPH ได 91.75 %เหนวา ในเปลอก จงสามารถตานอนมลอสระ DPPH ไดมากตามไปดวย

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

29

ขอเสนอแนะ1. มนเลอดไกแลวควรทาการวดหา

ปรมาณแอนโธไซยานนทนท เพราะสารแอนโธไซยานนไมคอยเสถยร2. pH-meter การใช

เทคนค pH-differential จะตองมการใชสารละลายบฟเฟอรในการวเคราะห จงตองมการปรบสารละลายบฟเฟอร เพราะผลของ pH จะมผลตอความคงตวของแอนโธไซยานน

3.แอนโตอไป

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

บรรณานกรม

ดวงมาลย, วรรณา ตลยธญรศ และชยยทธ ธญพทยากล. 2534. การสกดแอนโธไซยานนจากดอกอญชน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวทยาศาสตร (เทคโนโลยทางอาหาร) บณฑตวทยาลย จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

เตม สมตนนทน. 2544. อพรรณไมแหงประเทศไทย. สวนพฤกษศาสตรปาไม สานกวชาการปาไม กรมปาไม, กรงเทพฯ.

ทรงศร วงศจตตภญโญ, ชนตา โชตรสเวคน และศศธร ตรงจตภกด. 2551. ผลของชนดตวทา

และสมบตการตานอนมลอสระของเปลอกและเมลดองน. ภาควชาวทยาศาสตร และเทคโนโลยการอาหาร คณะอตสาหกรรมเกษตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

, ศศธร จนทนวรางกร และวรรณ จรภาคยกล. 2551. ผลของตวทาละลายตอปรมาณสารประกอบฟนอลกและความสามารถตานออกซเดชนของกระชายเหลอง. ภาควชาวทยาศาสตรและเทคโนโลยการอาหาร คณะอตสาหกรรมเกษตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

ธระพงษ ขนทเจรญ, อรพน และณฎฐา เลาหกลจตต. 2553. ประสทธภาพการเปนสารตานอนมลอสระจากสารสกดเปลอกและเมลดขององนพนธคารดนล.คณะทรพยากรชวภาพและเทคโนโลย มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร.

นนทวน บณยะประภศร. 2539. “ ” 1. กรงเทพฯ: คณะเภสชศาสตรมหาวทยาลยมหดล.

นภาดา ประสมทอง, มาระตร ศรชย มงคล, ประภสสร และวรภทรลคนทนวงศ. 2553.

. ภาควชาเทคโนโลยการเกษตร คณะเทคโนโลย มหาวทยาลยมหาสารคาม.

. 2545.Hibiscus sabdariffa.L. . วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวทยาศาสตร (เทคโนโลยทางอาหาร) บณฑตวทยาลย จฬาลงกรณมหาวทยาลย.

ประภสรา ศรขนธแสง. 2551. คณสมบตและฤทธการตานออกซเดชนของไวนกระชายดา.วทยานพนธปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเคม มหาวทยาลยขอนแกน.

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

31

, . 2553. สารตานอนมลอสระ และ. คณะทรพยากรชวภาพ

และเทคโนโลย มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร.. 2550. ปรมาณแอนโธไซยานนและปรมาณฟนอลก

. 23 1.อรษา เชาวลขต, ศโรรตน อภชยารกษ, สรารตน คงทอง และ สชนา ชประทม. 2552.

ผลกระทบของ pHและอญชน. 40 3 (พเศษ)

Harris, D.C. 2003. “Quantitative Chemical Analysis 6th ed.” [Online] เขาถงไดจาก:http://www_bgsu_edu-departments-chem-faculity-endres-ch128-phenantholine_jpg.htm. ( 2 ธนวาคม 2554)

Iman A. Al-Saleh_, Grisellhi Billedo, Inaam I. El-Doush. 2006. Levels of selenium, DL-a-tocopherol, DL-g-tocopherol, all-trans-retinol, thymoquinone and thymol indifferent brands of Nigella sativa seeds. Journal of Food Composition andAnalysis. 19:167-175.

Kim, D.O., and C.Y. Lee. 2002. Extraction and isolation of polyphenolics. Currentprotocols Food Analytical Chemistry. R.E. Wrolsted, New York.

Larrauri, J.A., P. Ruqe’rez and F. Saura-Calixto. 1997. Mango peel fibres withantioxidant activity. Eur. Food. Res. Technol. 205:39-42.

Lazze, M.C., Savio,M., Pizzala, R., Cazzalini, O., Perucca, P., Scovassi,A.I., Stivala, L.A.and Bianchi,L. 2004. Anthocyanins induce cell cycle perturbations andapoptosis in different human cell lines. Carcinogenesis, 25:1427-1433.

Milardovic, S., Ivekovic, D. and Grabaric, B.S. 2005. Anovel amperometric method forantioxidant activity determination using DPPH free radical.Bioelectrochemistry, 8,180-185.

Rodriguez, D.S., D. Hadley, M. and E. T. Holm. 1994. Potato peel waste stability anyand antioxidant activity of freeze dried extrac. J. Food. Sci. 59: 1031-1033.

Singleton, V.L., Orthofer L.R. Lamuela-Raventos, R.M. 1999. Analysis of total phenolsand other oxidation substrates and antioxidations by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods of Enzymology. 299: 152-178.

Sullivan J. 1998. Anthocyanins. Canivorous Plants Newsletter. Sep.

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

32

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

มภาคผนวก

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

การคานวณหาปรมาณสารแอนโธไซยานน โดยวธ pH – differential และการตานอนมลอสระ

1. การคานวณหาปรมาณสารแอนโธไซยานน

ตวอยางการคานวณ

สารสกดจากมนเลอดไก 3.5.1 และคานวณหาคาการดดกลนแสงของสารละลายตว

A = ( A510nm – A700nm )pH1.0 - ( A510nm – A700nm )pH4.5

เชน ในตวทาละลายกรดไฮโดรคลอรกเขมขนรอยละ 1 จากเปลอกมนเลอดไก 1

วธทา ∆A = (0.5501– 0.0163)pH1.0 – (0.2147 – 0.1320)pH4.5

= (0.5338) – (0.0827)

∆A = 0.4511

คานวณหาปรมาณแอนโธไซยานนจากสตร

ปรมาณแอนโธไซยานน ( mg/L ) =

A = คาการดดกลนแสงของสารละลายเจอจาง

MW = 449.2 ( ใชคามวลโมเลกลของ cyadinin 3-glucoside ) g/mol

ɛ = 26900 L/mol/cm-1

l = 1

DF = diluton factor คอ 10 มลลลตร

วธทา ปรมาณแอนโธไซยานน (mg/L) =

= 75.329 มลลกรมตอลตร

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

ปรมาณแอนโธไซยานน (mg/100 g )

ถาสารละลายตวอยาง 1000 มลลลตร จะมแอนโธไซนน = 75.329 มลลกรม

ถาสารละลายตวอยาง 50 มลลลตร จะมแอนโธไซนน = 75.329 × 50/1000 = 3.76643 มลลกรม

มนเลอดไก 1 3.76643 มลลกรม

มนเลอดไก 100 376.643 มลลกรม

2. การคานวณหารอยละของความสามารถในการตานอนมลอสระดวยวธ DPPH

รอยละของสารตานอนมลอสระ DPPH = (Acontrol-Asample/Acontrol) × 100

Acontrol = DPPH

Asample = DPPH

Acontrol = 5.5224

Asample = 0.2922

รอยละของการตาน DPPH = (5.5224 –0.2922/ 5.5224) × 100

= 94.71

3.

สวน =

X คอ ขอมล ( I = 1, 2, 3……)คอ

N

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม