activités biologiques des extraits de fruits et de...

DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIE

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MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

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MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MASTER

PARCOURS : BIOCHIMIE, BIODIVERSITE ET SANTE

Activités biologiques des extraits de fruits et de

feuilles de Momordica charantia L.

(Cucurbitaceae) ou Margose de Madagascar :

importance de la qualité du sol

Présenté par : FAZNAT Djoumoi

Maître es-sciences

Soutenu publiquement le 13 février 2018, devant les membres de jury :

Président : Professeur RAKOTO RANOROMALALA Doll

Rapporteur : Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana

Examinateurs: Docteur ANDRIAMBELOSON Onja

Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE ................................................................................ i

LISTE DES ABREVIATIONS .................................................. ii

LISTE DES FIGURES .............................................................. iii

LISTE DES PHOTOS ............................................................... iv

LISTE DES TABLEAUX ............................................................v

INTRODUCTION ........................................................................1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ..........................................3

I. Généralité sur la Margose .................................................................................................. 3

I.1. Description ...................................................................................................................... 3

I.2. Distribution ...................................................................................................................... 3

I.3. Variétés ............................................................................................................................. 3

I.4. Utilisation ......................................................................................................................... 4

II. Les métabolites secondaires .............................................................................................. 5

II.1. Généralités ...................................................................................................................... 5

II.2 Les grandes familles chimiques ...................................................................................... 5

II.2.1. Les composés phénoliques ou polyphénols .................................................................. 5

II.2.2. Les alcaloïdes ............................................................................................................... 5

II.2.3. Les terpènoïdes ............................................................................................................ 6

II.2.4. Les stéroïdes ................................................................................................................. 6

III. La rhizosphère ................................................................................................................. 7

III.1. Définition ....................................................................................................................... 7

III.2. Interactions Sols-Plantes-microorganismes ................................................................ 8

III.2.1. Les microorganismes rhizosphériques ....................................................................... 8

III.2.2. La qualité du sol et la production des métabolites par les plantes ............................. 8

MATERIELS ET METHODES ...............................................10

I. Présentation du site d’étude ............................................................................................. 10

II. Matériels d’étude ............................................................................................................. 10

II.1. Matériel végétal : Margose (Momordica charantia) ................................................... 10

II.2. Les sols .......................................................................................................................... 11

II.3. Les germes tests ............................................................................................................ 11

III. Méthodes ........................................................................................................................ 12

III.1 Extraction des composés à partir des échantillons de feuilles et de fruits ............... 12

III.1.1. Lyophilisation ........................................................................................................... 12

III.1.2. Macération à chaud .................................................................................................. 12

III.1.3. Criblage phytochimique ............................................................................................ 13

III.2.Tests d’activités biologiques ........................................................................................ 18

III.2.1.Test d’activité antimicrobienne.................................................................................. 18

III.3. Test de l’activité antioxydante ................................................................................... 20

III.3. Analyses des échantillons des sols sous Margose ...................................................... 23

III.3.1. Analyses chimiques ................................................................................................... 23

III.3.2. Dénombrement des microorganismes bénéfiques pour les plantes.......................... 23

RESULTATS ..............................................................................25

I. Rendements d’extraction hydro-alcoolique ................................................................ 25

II. Caractéristiques des extraits hydro-alcooliques ..................................................... 25

III. Résultats des criblages phytochimiques .................................................................. 26

• Les alcaloïdes ............................................................................................................ 26

• Les flavonoïdes, les leucoanthocyanes et les anthocyanes ...................................... 27

• Les stérols et les triterpènes ..................................................................................... 29

• Les saponosides ......................................................................................................... 29

• Les hétérosides cyanogénétiques ............................................................................. 30

• Les coumarines ......................................................................................................... 30

• Les anthraquinones .................................................................................................. 31

• Tanins et composés poly-phénoliques ..................................................................... 32

• Résultats récapitulatifs du criblage phytochimique ............................................... 32

IV. Résultats du test antimicrobien des extraits de deux organes de M. charantia .... 34

V. Activité antioxydante des extraits ............................................................................... 34

VI. Nombre des microorganismes contenus dans les deux échantillons de sol rhizosphérique de Momordica charantia......................................................................... 36

VII. Résultats de l’analyse physico-chimiques de deux échantillons du sol E1 et E2 37

DISCUSSION .............................................................................39

CONCLUSION ET PERSPECTIVES .....................................44

REMERCIEMENTS

Louange à notre seigneur le tout puissant, le clément, le très miséricordieux, qui m’a

donnée la force, la santé et le courage de réaliser ce précieux travail.

Au terme de cette aventure, il m’est agréable d’exprimer mes remerciements à tous ceux

qui ont contribué de près ou de loin à l’élaboration de ce mémoire.

Nos vifs remerciements à Madame le Professeur RAKOTO RANOROMALALA Doll,

d’avoir accepté de présider cette séance.

Toutes nos gratitudes à Madame le Docteur ANDRIAMBELOSON Onja et Monsieur le

Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna, qui, malgré leur temps et leurs

nombreuses occupations, ont accepté d’évaluer ce travail.

Ma plus profonde gratitude est destinée à :

Madame le Docteur RANDRIANIERENANA Ando, Chef de la Mention « Biochimie

Fondamentale et Appliquée » de l’Université d’Antananarivo, d’avoir accepté mon

intégration au sein de cette institution.

Monsieur le Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna, Chef du Parcours

« Biochimie, Biodiversité et Santé», de m’avoir autorisé à continuer mon chemin au sein

de son parcours.

Monsieur le Professeur RAMANANKIERANA Heriniaina, Directeur du Centre National

de Recherches sur l’Environnement, de m’avoir accueillie au sein de cette institution.

Monsieur le Docteur RANDRIAMBANONA Herizo, Chef du Département

«Ecosystèmes Terrestres» au sein du CNRE, Monsieur le Professeur

RASOLOMAMPIANINA Rado, Chef du Laboratoire de Microbiologie de

l’Environnement, Madame le Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana, responsable

du l’unité de recherches « Ecologie Microbienne du Sol », encadreur et rapporteur de ce

mémoire, dont la rigueur et l'exigence ont permis d'améliorer la qualité de ce mémoire,

merci également pour votre encadrement, votre disponibilité et votre gentillesse.

Monsieur RALAMBONDRAHETY Rahanira, qui m’a accueillie au sein de son unité de

recherche «Chimie des Substances Naturelles», et m’a autorisé à réaliser la partie chimie

du présent travail sous son encadrement scientifique. Je remercie tout particulièrement

Monsieur le Docteur ANDRIANANDRASANA Doret Martial et le Docteur

ANDRIAMANANTENA Rigobert, dont les conseils donnés et les enseignements m’ont

été d’une aide précieuse.

Je tiens également à remercier toute l'équipe du Laboratoire de Microbiologie de

l’Environnement du CNRE : chercheurs, techniciens et stagiaires, pour leurs conseils,

leur soutien et surtout leur amitié.

Enfin, je ne sais comment remercier toute ma famille surtout mes deux oncles : ALI

Hassani Ali et MOHAMED Hassani Ali, qui m’ont guidés et suivies durant mes années

d’études, moralement et financièrement, je vous dois ma réussite, mon éducation et ma

fierté.

i

GLOSSAIRE

Abiotique : ensemble des facteurs physico-chimiques et pédoclimatiques d’un

écosystème influençant une biocénose donnée.

Antibiotique : substance d’origine naturelle ou synthétique capable d’empêcher la

multiplication de certains microorganismes ou de les détruire.

Astringence : capacité à diminuer la sécrétion des muqueuses et des glandes afin de

faciliter une cicatrisation.

Antioxydant : substance qui a une faible concentration par rapport à celle du substrat

oxydable qui, de manière significative retarde ou empêche l’oxydation de ce substrat.

Biotique : ensemble des facteurs biologiques liés à l’activité des êtres vivants et agissant

sur la distribution des espèces animales et végétales au sein d’un biotope donné.

Cycle biogéochimique : processus de transport et de transformation cyclique d’un

élément ou composé chimique entre les grands réservoirs que sont la géosphère,

l’atmosphère, l’hydrosphère, dans lesquels se trouve la biosphère

Endophytes : organismes qui accomplissent tout ou une partie de leur vie à l’intérieure

d’une plante de manière symbiotique.

Enzyme : molécule organique constituée essentiellement de protéines et catalysant une

réaction biochimique.

Humus : ensemble des matières organiques se trouvant dans la couche superficielle d’un

sol.

Mycorhize : organe résultant de l’association symbiotique entre une racine d’espèce

vasculaire et d’un champignon.

Plante monoïque : plante qui porte des fleurs mâles et des fleurs femelles séparées les

unes des autres mais sur un même pied.

Sidérophores : métabolites secondaires qui jouent un rôle dans l’homéostasie du fer chez

les microorganismes.

ii

LISTE DES ABREVIATIONS

AG : Acide gallique

CCM : Chromatographie sur couche mince

CNRE : Centre National de Recherches sur l’Environnement

DMSO : Diméthylsulfoxide

DPPH : 2,2-Diphenyl-1- picrylhydrazyl

E1 : Sol rhizosphérique d’Ankorabe

E2 : Sol rhizosphérique d’Ampahitrosy

FeK : Extrait de feuilles de la margose récolté à Ankorabe

FeM : Extrait de feuilles de la margose récolté à Ampahitrosy

FOFIFA : Foibe Fikarohana ampiharina amin’ny Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra

ou Centre National de Recherches Appliquées au Développement Rural.

FrK : Extrait de fruits de la margose récolté à Ankorabe

FrM : Extrait de fruits de la margose récolté à Ampahitrosy

IC50 : Inhibitory Concentration 50 ou Concentration inhibitrice à 50%

LME : Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement

M. charantia : Momordica charantia

pH : Potentiel Hydrogène

R2 : Coefficient de détermination

UFC : Unité Formant Colonies

iii

LISTE DES FIGURES

Figure1 : Interaction dans la rhizosphère

Figure 2 : Forme libre et réduite de DPPH

Figure 3 : Activité de piégeage des radicaux libres du DPPH des extraits de feuilles et de

fruits de M. charantia

iv

LISTE DES PHOTOS

Photo1: Momordica charantia

Photo 2 : Fruits de Momordica charantia

Photo 3 : Feuilles de Momordica charantia

Photo 4 : Sol rhizosphèrique de la margose d’Ankorabe

Photo 5 : Sol rhizosphèrique de la margose d’Ampahitrosy

Photo 7 : Equipements pour une macération à chaud

Photo 9 : Spectrophotomètre à 517nm

v

LISTE DES TABLEAUX

Tableau n°1 : Caractéristiques des germes pathogènes

Tableau n°2 : Normes utilisées pour la méthode des disques

Tableau n°3 : Rendement des extraits de feuilles et de fruits des deux sites (Ankorabe et

Ampahitrosy)

Tableau n°4 : Caractéristiques (nature) des extraits hydro-alcooliques de deux organes

Tableau n°5: Résultats du test des alcaloïdes

Tableau n°6 : Résultats du test pour la confirmation des alcaloïdes

Tableau n°7 : Résultats du test des flavonoïdes, des leucoanthocyanes et des anthocyanes.

Tableau n°8 : Résultats du test des stérols et des Triterpènes

Tableau n°9 : Résultats du test des saponosides

Tableau n°10 : Résultats du test des hétérosides cyanogénétiques

Tableau n°11 : Résultats du test des coumarines

Tableau n°12: Résultats du test des anthraquinones

Tableau n°13 : Résultats du test des polyphénols et des tanins

Tableau n°14 : Résumé des résultats des tests des grandes familles chimiques dans les

extraits des deux organes de M. charantia

Tableau n°15 : Résultats du test antimicrobien des extraits de feuilles et de fruits de la

margose

Tableau n°16 : Valeurs des CI50 des extraits bruts et témoin déterminées par test de DPPH

Tableau n°17 : Nombre de souches de Pseudomonas fluorescens

Tableau n°18 : Qualités physico-chimiques des sols rhizosphériques de la margose

d’Ankorabe et d’Ampahitrosy

INTRODUCTION

1

INTRODUCTION

A Madagascar, la majorité des plantes, notamment les endémiques, possèdent des

nombreuses vertus thérapeutiques. Il existe au moins une vingtaine de publications dans

ce domaine en ne citant que celle de Heckel (1910) sur « Les plantes utiles de

Madagascar » qui a décrit plus de 700 espèces et leurs divers usages, celle de Terrac

(1947) qui a recensé 830 espèces de plantes médicinales et du côté Malagasy, Rakoto-

Ratsimamanga et al. (1969) qui ont beaucoup travaillé sur les plantes médicinales de

Madagascar avec leurs différentes propriétés curatives. Ces plantes sont pour la plupart

utilisées traditionnellement pour soigner les maladies comme la malaria, la diarrhée, le

toux, la grippe, et plus récemment le diabète ou même le cancer (Rasoanaivo et al., 2004).

En effet, les plantes médicinales sont considérées comme parmi les principales

sources de molécules bioactives dans le monde médical et pharmaceutique (Marin et

Chrestin, 2007). Il devient donc logique de continuer ou même d’intensifier les recherches

dans ce domaine étant donné que depuis quelques années le phénomène de résistance

limite l’action des certains antibiotiques de synthèse (García-Ruiz et al., 2008 ; Kempf et

Zeitouni, 2009). C’est la raison pour laquelle, actuellement, une attention particulière est

portée sur les médicaments et les produits d’origines naturelles auxquels 80% de la

population mondiale et plus de 90% dans les pays en voie de développement ont recours

pour les soins de santé primaire (Jiofack et al., 2010 ; Biswas et al., 2013).

Or, il est bien connu que les plantes puisent les principaux éléments indispensables

à leur croissance dans le sol (Sourdat, 1998) et que ces éléments contribuent

essentiellement à l’organisation interne (croissance, productivité…) et externe (défense

contre les agents phytopathogènes, adaptation aux conditions environnantes tels que le

type de sol, la disponibilité en eau…), etc. (Tripathi et Dubey, 2004). C’est d’ailleurs,

dans le contexte de cette organisation externe que la production des métabolites

secondaires entre en jeu. Ce mécanisme se manifeste lorsque la plante se retrouve dans

une (des) condition(s) particulière(s) qui l’incite à produire des substances qui n’entrent

pas directement en jeu dans son développement mais qui lui sont nécessaires pour assurer

sa survie dans son environnement, ce sont les métabolites secondaires (Mansour, 2009).

Le sol joue donc un rôle non négligeable dans ce mécanisme étant donné qu’il

constitue une interface vivante entre la plante et les autres organismes (macro et

microorganismes) qui vivent en dessous de la surface (Bardgett et Griffiths, 1997). Par

ailleurs, la qualité du sol (fertilité) a été décrite comme étant directement liée à la

2

dynamique (diversité, densité et fonctionnement) de ces organismes (Morel, 1989a), à la

disponibilité des éléments chimiques indispensables pour les plantes en considérant les

multitudes d’interactions biogéochimiques qui s’y déroulent et enfin à sa structure

physique (Lavelle et Spain, 2001).

Cette étude s’est focalisée principalement sur une plante, la margose (Momordica

charantia), très prisée par la population rurale à Madagascar à cause de ses vertus. Les

enquêtes non formelles réalisées par l’équipe sur le terrain ont montré que cette plante

(feuilles, fruits ou racines) est utilisée, en fonction des régions, comme médicament

contre la constipation, la malaria, la fatigue musculaire, le diabète. C’est dans ce contexte

que le présent thème de mémoire, intitulé : « Activités biologiques des extraits de fruits

et de feuilles de Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) ou Margose de Madagascar :

importance de la qualité des sols » a été choisi. L’hypothèse sur laquelle repose cette

étude stipulait que les vertus thérapeutiques attribués à M. charantia pourraient être

nombreuses mais que leur expression serait étroitement liée à la qualité du sol sur lequel

la plante se développe.

Pour cela l’objectif principal de ce travail a été d’évaluer les propriétés

médicinales des organes (feuilles et fruits) de Momordica charantia issus de deux

localités dont l’une sur le haut plateau (Ampahitrosy) et l’autre sur la côte Est de la

grande ile (Ankorabe) avec une attention particulière sur la qualité des sols de

culture.

Les objectifs spécifiques ont été de :

▪ Décrire les propriétés chimiques et microbiologiques des sols rhizosphériques de

M. charantia.

▪ D’extraire et de décrire la diversité des composés chimiques contenus dans les

extraits de feuilles et de fruits de M. charantia

▪ D’évaluer les propriétés antimicrobiennes et antioxydantes de ces extraits de

feuilles et de fruits

En se basant sur ces approches, les résultats attendus pour cette étude nous

permettront d’identifier les propriétés médicinales de M. charantia en se basant sur les

types de sols propices à son développement.

Pour se faire, ce manuscrit sera composé de quatre parties dont les données

bibliographiques relatives au thème de l’étude, les matériels et les méthodes adoptés, les

résultats obtenus avec les interprétations, la partie discussion et enfin la conclusion et les

perspectives.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

3

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Généralité sur la Margose

I.1. Description

M. charantia L. (Cucurbitaceae) appelée aussi Margose, concombre amer ou

pomme de merveille en Français, est une herbacée annuelle à croissance rapide qui rampe

sur le sol ou grimpe sur n’importe quel support grâce à ces vrilles axillaires (Cogniaux,

1881). Il s’agit d’une espèce monoïque caractérisée par des fleurs jaunes pentamères qui

alternent 5 à 7 palmes (3 à 8cm) et présentent des lobes grossièrement dentés (Smith,

1977). De couleur vert clair intense, les feuilles ainsi que les tiges sont poilues et dégagent

une forte odeur amère lorsqu’elles sont écrasées ou coupées. Les fruits ellipsoïdes à 3

valves de 5 à 15 cm de diamètre, sont de couleur verte qui vire au jaune orangé, à maturité

et contiennent des graines à pulpe rouge de 10 à 16mm (Germosen et al., 1999).

I.2. Distribution

M. charantia est une espèce largement répandue dans toutes les zones tropicales

(Duquesne, 2006), notamment en Afrique de l’ouest, en Asie et en Océanie (Chakravarty,

1959). Des variétés originaires d’Asie sont cultivées en Amérique tropical, et également

dans le sud des Etats unis pour la cuisine asiatique. A Madagascar, le genre Momordica

est représenté par deux espèces M. charantia L et M. trifoliolata.

I.3. Variétés

Momordica charantia appartient aux Angiospermes dicotylédones violales, elle fait

partie de la famille des cucurbitacées. Il existe plusieurs variétés au sein même de l’espèce

dont :

• M. charantia L. var. abbreviata: c’est la forme sauvage de l’espèce, ses

fruits et ses feuilles sont plus petits et les lobes sont plus étroits.

• M. charantia L. var. muricata: est caractérisé par des petits fruits ronds.

• M. charantia L. var. charantia : est caractérisé par des grands fruits,

fusiformes et moins amers par rapport aux autres espèces.

4

Ces variétés se différencient surtout par les caractéristiques physiques des fruits

dont, la taille, la forme et leurs amertumes.

L’espèce végétale étudiée durant ce travail est celle au grand fruit (M. charantia

L.var. charantia).

Position systématique de M. charantia

Règne : Plantea

Sous règne : Tracheobionta

Division : Magnoliophyta

Classe : Magnoliospida

Ordre : Violales

Famille : Cucurbitaceae

Genre : Momordica

Espèce : Momordica charantia

Photo1: Momordica charantia

Source : auteur

I.4. Utilisation

M. charantia est utilisée dans plusieurs pays à cause de ses diverses propriétés

médicinales. Les fruits et les feuilles sont les plus utilisés par rapport aux graines et aux

racines. Les fruits immatures sont utilisés en médecines traditionnelles et en

alimentations.

A Madagascar, la plante est présente dans toute l’île, notamment près des champs

de culture. Les fruits sont vendus sur les marchés et très prisés surtout par les asiatiques

pour la confection des mets traditionnelles tandis que pour les Malagasy, on les utilise

comme infusion (tambavy).

Dans la médecine traditionnelle, M. charantia est utilisée comme antipaludique

(Montcho, 2012), contre les inflammations, particulièrement les hémorroïdes (Stimson,

1971 ; Ayensu, 1978 ; Girόn et al., 1991). Selon Duquesne (2006), la plante est utilisée

comme anticancéreux, antiparasitaire, antioxydante et même antidiabétique car sa

consommation entraine la baisse du taux de sucre dans le sang. Les feuilles, les fruits et

les racines de M. charantia sont souvent utilisés pour provoquer l’avortement et /ou

contrôler les naissances (Howard, 1952 ; West et al., 1981 ; Burkill, 1985 ; Mossa, 1985),

atténuer les menstruations douloureuses ou faciliter l’accouchement (Descourtilz, 1829).

5

II. Les métabolites secondaires

II.1. Généralités

Les métabolites secondaires des végétaux peuvent être définis comme des

molécules qui ne sont pas directement impliquées dans leur croissance, par opposition

aux métabolismes primaires qui, eux, sont indispensables dans les synthèses des

biomolécules telles que les protéines, les lipides, et les glucides, nécessaires pour les

constructions cellulaires et les réactions biochimiques (Mansour, 2009 ; Raven et al.,

2000). Ces molécules secondaires sont plutôt utilisées par les plantes pour diverses

fonctions adaptatives, notamment en réponse aux stress biotiques et abiotiques qu’ils

peuvent subir (Thomas, 2011). Elles possèdent des principes actifs qui s’expriment chez

les plantes médicinales qui les produisent lorsque les conditions du milieu environnant le

requièrent (Mansour, 2009).

II.2 Les grandes familles chimiques

Globalement, les métabolites secondaires sont repartis en trois grandes familles

chimiques : les composés phénoliques, les terpénoïdes et les alcaloïdes (Badiaga, 2011).

II.2.1. Les composés phénoliques ou polyphénols

Les polyphénols constituent un groupe largement distribué parmi les métabolites

secondaires dans le royaume des végétaux, avec plus de 8000 structures phénoliques

présents dans tous les organes de la plante (Lugasi et al., 2003). Ils sont caractérisés par

la présence d’un cycle aromatique (benzoïque), et certains d’entre eux sont responsables

de l’amertume et de l’astringence (Hopkins, 2003). Les polyphénols sont répartis en

plusieurs classes : les acides phénoliques, les flavonoïdes, les tanins, les stilbènes, les

lignanes et les coumarines (Hopkins, 2003).

II.2.2. Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des composés organiques azotés, à caractère alcalin, et

présentant une structure moléculaire hétérocyclique (Badiaga, 2011). Ils sont synthétisés

au niveau des sites spécifiques (racine en croissance, cellules spécialisées de la laticifère,

chloroplastes), avant d’être transportés dans leur site de stockage (Rakotonanahary,

2012).

6

Il existe trois principales classes d’alcaloïdes (Badiaga, 2011) :

✓ Les alcaloïdes vrais : ils dérivent des acides aminés et comportent un

atome d’azote dans le système hétérocyclique. Ils sont présents dans les

plantes, soit sous formes libres, soit sous forme de sels, soit comme les N-

Oxydes.

✓ Les pseudo-alcaloïdes : ils présentent le plus souvent tous les

caractéristiques des alcaloïdes vrais, mais ils ne sont pas des dérivés des

acides aminés.

✓ Les proto-alcaloïdes : ce sont des aminés simples dont l’azote n’est pas

inclus dans un hétérocycle. Ils sont souvent appelés « amines biologiques

».

II.2.3. Les terpènoïdes

Le terme terpène vient de l’arbre de térébinthe : « Pistacia Terebinthus » (Ayad,

2008) et est spécifique aux hydrocarbures terpénoïdes qui dérivent d’unités isoprèniques

à 5 atomes de carbones. Selon leur nombre d’unités isoprèniques, il y a les monoterpènes

en C10, les sesquiterpènes en C15, les diterpènenes en C20, les triterpènes en C30, les

tetraterpènes en C40 et les polyterpènes qui comportent plus de 40 carbones (Belbache,

2003). Ces composés sont synthétisés par les plantes, les organismes marins, des

champignons et même les animaux (Benaissa, 2011).

II.2.4. Les stéroïdes

Les stéroïdes sont parmi les plus importantes catégories des lipides. Ils sont

présents dans le règne animal et végétal à ne citer que le cholestérol, les vitamines D, les

hormones sexuelles comme les

œstrogènes et progestérones, testostérone et androstérone. Des centaines de stéroïdes

distincts sont présents dans les plantes, les animaux et les champignons. Il existe deux

grands groupes de stéroïdes : les stéroïdes non hormonaux, comme les stérols et les

stéroïdes hormonaux dont les hormones corticosurrénales et gonadiques, vitamines D,

ecdystéroïdes (Rohmer, 1999 ; Schwarz and Arigoni, 1999).

Le noyau d’un stéroïde est composé de dix-sept atomes carbone liés entre eux qui

prennent la forme de quatre cycles condensés : trois anneaux de cyclohexane (désignés

comme les cycles A, B et C dans le schéma) et un anneau de cyclopentane (l'anneau D)

https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-lipide-184/https://www.futura-sciences.com/sante/dossiers/medecine-cholesterol-a-z-886/https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-vitamine-d-6124/https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-hormone-751/https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-oestrogene-2786/https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-progesterone-2820/https://www.futura-sciences.com/sante/definitions/medecine-testosterone-2855/https://www.futura-sciences.com/sciences/definitions/chimie-androsterone-3533/

7

(Rohmer, 2008). Les stéroïdes varient selon les groupes fonctionnels attachés à ce noyau

de quatre plaques et par l'état d'oxydation des anneaux.

Les stérols sont des formes particulières de stéroïdes, avec un groupe hydroxyle

en position 3 et un squelette dérivé de cholestane (Rohmer, 2008 ; 2010).

III. La rhizosphère

III.1. Définition

La rhizosphère est défini comme le volume de sol entourant les racines qui est

directement soumis à l’activité racinaire (Figure 1) (Darrah, 1993 ; Hinsinger, 1998). Elle

entre en interaction avec les principales composantes du sol à savoir la racine, le sol, les

organismes telluriques ou les flores du sol (micro ou macro) (Guckert, 2009).

Dans cet ensemble, les microorganismes du sol jouent deux rôles essentiels. D’une

part, ils sont responsables des principales transformations biogéochimiques qui se

déroulent dans les sols, et d’autre part, ils agissent directement ou indirectement sur la

nutrition des plantes. Or, la rhizosphère du fait de ses compositions chimiques et

biologiques représente un environnement unique favorisant la croissance et l'activité de

ces microorganismes, couramment appelés microorganismes rhizosphériques qui

influencent des diverses manières (favorable ou non) le développement des plantes (Klein

et al., 1988 ; Merbach et al., 1999 ; Benizri et al., 2002 ; 2007).

Figure1: Interactions dans la rhizosphère

Source: Armand G., INRA, 2009

8

III.2. Interactions Sols-Plantes-microorganismes

III.2.1. Les microorganismes rhizosphériques

Les microorganismes rhizosphériques sont constitués de 5 principaux groupes :

les protozoaires, les bactéries, les actinomycètes, les champignons et les algues

(Alexandre, 1977 ; Paul et Clark, 1989). Ils peuvent être considérés comme des acteurs

clés dans le cycle des éléments nutritifs (Gobat et al., 2004), et sont impliqués dans

différents processus écosystémiques tels que la décomposition de la matière organique,

la formation de l’humus, l’agrégation des sols, la conservation et le recyclage des

éléments nutritifs, la régulation de la diversité des végétaux et des organismes (Jeffries et

al., 2003).

En effet, les microorganismes rhizosphériques entrent, directement ou

indirectement, en interactions avec les plantes à travers le système racinaire. Ces

interactions reposent surtout sur des liens trophiques (Morgan et al., 2005). De ce fait, les

microorganismes rhizosphériques peuvent être classés en deux groupes principaux : ceux

qui agissent pour le bénéfice des plantes, comme les mycorhizes et les endophytes

fixatrices d’azote, les stimulateurs de croissance des plantes, et ceux dont les activités

sont plutôt défavorables pour les plantes, comme de nombreuses bactéries et

champignons pathogènes (Ma et al., 2011).

Parmi les activités favorables des microorganismes qui se manifestent dans la

rhizosphère, il y a la sécrétion d’enzymes hydrolytiques, la production de sidérophores

qui sont impliquées dans la libération des éléments minéraux peu mobiles comme le

phosphore, le fer, etc., et la production d’antibiotiques contre les agents pathogènes

(Amarger, 2002). Ces composés servent à la fois aux microorganismes producteurs mais

également aux plantes qui interagissent avec eux (Bever et al., 2009 ; Denison et Kiers,

2004a). L’ensemble de ces interactions est affecté par la teneur en matières organiques,

le pH du sol, la température, la disponibilité des nutriments ainsi que le niveau des

pollutions (Bais et al., 2006 ; Glick, 2003).

III.2.2. La qualité du sol et la production des métabolites par les plantes

La production de métabolites secondaires par les plantes est conditionnée par

l’environnement, y compris le sol, au sein duquel la plante se développe (Beloin, 1998).

En fonction de ses besoins, elles vont sélectionner, parmi les composés qui sont contenus

9

dans le sol, les éléments qui lui sont nécessaires et entament les processus de

transformations plus ou moins complexes (Herms et Mattson, 1992). Des études ont déjà

rapporté que la teneur en métabolites secondaires dans les tissus d’une plante varie en

fonction de la disponibilité des ressources nutritives contenues dans le sol (Coley et al.,

1985). Tels sont les cas des proanthocyanidines dont la production augmente lorsque la

teneur en phosphore disponible diminue (Kouki and Manetas, 2002) et des composés

phénoliques qui sont synthétisés en masse lorsque le plante se développe sur sol pauvre

en Fer (Dixon and Paiva, 1995). L'équilibre des éléments nutritifs dans le sol influence

cette production de composés secondaires au niveau de de la régulation des mécanismes

métaboliques. Une hypothèse émise par Bryant et al. (1983) stipulait que la fertilisation

du sol avec des nutriments majeurs comme le phosphore ou l’azote conduira à une

diminution des concentrations des métabolites secondaires à base de carbone au profit

des métabolites secondaires (Ncube et al., 2012).

MATERIELS ET METHODES

10

MATERIELS ET METHODES

I. Présentation du site d’étude

Les échantillons (feuilles, fruits, sols) utilisés dans le cadre de cette étude ont été récoltés

dans deux sites différents dont Ankorabe et Ampahitrosy.

• Ankorabe est un village situé dans la commune de Ranomafana-Est, District de

Brickaville (Région Atsinanana) (18°56’37’’S ,48°46’30’’E, 284m).

• Ampahitrosy est situé à 14km de la capitale, dans le Sud d’Antananarivo, District

d’Antananarivo-Atsimondrano (Région Analamanga) (19°01’23,8’’S,

47°28’58,8’’E, 1272 m).

II. Matériels d’étude

II.1. Matériel végétal : Margose (Momordica charantia)

Les échantillons de feuilles et de fruits ont été récoltés au mois de mars 2017 durant

la période de fructification, dans les deux sites : Ampahitrosy (04- mars 2017) et

Ankorabe (22 mars 2017).

Carte1 : Lieu de récolte des échantillons

Source: Google Earth 2017

11

Les feuilles ont été séchées à l’étuve à 60°C pendant deux semaines, puis réduites

en poudre à l’aide d’un mixeur de marque Moulinex Super blender. La poudre de feuilles

obtenue a été pesée à l’aide d’une balance de précision, Précisa XT 220A, puis conservée

à la température ambiante dans un bocal hermétique jusqu’à l’extraction.

Les fruits ont été découpés en petits morceaux puis congelés avant d’être

lyophilisés. Le matériel obtenu a été broyé et conservé au réfrigérateur afin de faciliter

les travaux ultérieurs

Photo 2 : Fruits de Momordica charantia Photo 3 : Feuilles de Momordica charantia

II.2. Les sols

Les échantillons de sol rhizosphérique au niveau de chaque site (100g), à

Ampahitrosy (climat du haut plateau de Madagascar) et à Ankorabe (climat humide du

littoral Est de Madagascar) ont été prélevés à 25 cm de profondeur. Ils ont été conservés

à +4°C jusqu’à l’utilisation au laboratoire.

Photo 4 : Sol rhizosphèrique de la

margose d’Ankorabe

Photo 5 : Sol rhizosphèrique de la

margose d’Ampahitrosy

II.3. Les germes tests

Tous les germes pathogènes utilisés lors de cette étude sont issus de la collection

du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (CNRE). Ce sont des bactéries et

des levures pathogènes de l’homme. Leurs caractéristiques sont données ci-après

(Tableau 1).

12

Tableau n°1 : Caractéristiques des germes pathogènes

Souches Coloration

de Gram

Formes Maladies provoquées

BACTERIES

Bacillus cereus

ATCC 13061 +

Bacille Intoxication

alimentaire caractérisé

par des nausées, des

vomissements, de

diarrhées et des

douleurs abdominales

Staphylococcus

aureus ATCC

11632

+

Coque Infections cutanées ou

muqueuses

Escherichia

coli

ATTC25922

-

Bacille Diarrhée infectieuse,

infection urinaire

LEVURE Candida

albicans

Levure

filamenteuse

(ovoïde avec

bourgeonnement)

Mycose au niveau de

la peau, des appareils

génitaux, urinaires et

respiratoires

III. Méthodes

III.1 Extraction des composés à partir des échantillons de feuilles et de fruits

III.1.1. Lyophilisation

La lyophilisation est une méthode de dessiccation sous vide, à basse température,

de produit liquide, solide ou pâteux préalablement congelé. Elle consiste à éliminer

progressivement l’eau du produit préalablement congelé (phase solide), par passage à

l’état vapeur sans passer par la phase liquide. Ce changement d’état s’appelle la

sublimation. Pendant la lyophilisation, l’eau passe donc par les changements d’états

suivants :

III.1.2. Macération à chaud

Pour le procédé de macération à chaud, vingt-cinq grammes (25g) de poudre de

feuilles ou de fruits pulvérisés ont été placés dans un Erlenmeyer à col rodé de 500 ml et

13

mélangé avec 500ml d’éthanol 80°. Le mélange a été par la suite chauffé au bain-marie,

à une température de 70°C pendant une heure.

Après, le mélange a été refroidi puis filtré sur Buchner avec un papier filtre et

rincé avec de l’éthanol 80°. Ce processus a été répété plusieurs fois jusqu’à épuisement

des extraits (en générale trois fois).

Ainsi, chaque extrait obtenu a été évaporé, pour obtenir un extrait sec. Le

dispositif de ce procédé est représenté dans la photo N°7.

Photo 7 : Equipements pour une macération à chaud

III.1.3. Méthode de calcul du rendement

Le rendement après l’extraction a été exprimé en pourcentage. Il a été déterminé

par la relation suivante :

R = (ME×100)/Q

Avec :

R : rendement (en %),

ME : Poids des extraits (en g) obtenus après macération

Q : Poids de l’échantillon du départ (en g)

III.1.3. Criblage phytochimique

Le criblage des différentes familles chimiques a été réalisé sur des extraits hydro-

alcooliques, préparés à partir de la poudre de feuilles et de fruits de M. charantia, récoltés

sur les deux sites, afin de comparer la composition des familles chimiques de la plante

selon leur site de collecte. Pour se faire, treize grandes familles chimiques ont été testés

14

dont les alcaloïdes, les saponosides, les flavonoïdes, les leucoanthocyanes, les

anthocyanes, les hétérosides cyanogénétiques, les coumarines, les tanins, les polyphénols,

les stéroïdes, les terpénoïdes et les anthraquinones. La méthode utilisée est celle décrite

par Fong et al. (1974 ; 1977), à l’exception du test de polysaccharides qui a été réalisé

selon la méthode décrite par Benjamin (2016).

Au final, 4 extraits dont un (1) extrait de feuilles et un (1) extrait de fruits de margose par

site ont été obtenus et codés comme suit :

- FeK : extraits de feuilles de la margose récolté à Ankorabe,

- FrK : extraits de fruits de la margose récolté à Ankorabe,

- FeM : extraits de feuilles de la margose récolté à Ampahitrosy

- FrM : extraits de fruits de la margose récolté à Ampahitrosy

III.1.3.1. Test des alcaloïdes Les alcaloïdes sont des composés qui peuvent être

détectés par leur précipitation ou leur floculation en présence de métaux lourds tels que :

le bismuth, le mercure, le tungstène

, le magnésium ainsi que par l’intermédiaire de l’un des trois réactifs

suivants : WAGNER, MAYER et DRAGENDORFF. Pour se faire, l’extrait hydro-

alcoolique a été distribué dans trois tubes différents. Dans chaque tube, 5 gouttes de

chaque réactif correspondant y sont versés. Un test positif est traduit par l’apparition des

précipités, des floculations et/ou des troubles.

On note qu’un test préliminaire positif est suivi d’un test de confirmation.

Test de confirmation

Un volume de l’extrait hydro-alcoolique équivalent à 5g de la poudre de

feuilles et de fruits de M. charantia a été évaporé à sec dans un cristallisoir au bain marie

bouillant jusqu’à obtention d’un résidu de consistance sirupeuse, ensuite 10ml de HCl à

5% ont été additionnés, puis le mélange a été de nouveau porté au bain-marie pendant

5min, tout en agitant avec une baguette de verre. Après refroidissement, 0,25g de NaCl a

été additionné dans le mélange, puis le tout a été agité et filtré. Le filtrat a été ramené à

10ml avec du HCl et divisée dans 4 tubes à essai. Les mêmes tests comme le précédant

ont été répétés.

15

III.1.3.2. Test des saponosides

Les saponosides ont la capacité de former une solution moussante en

présence de l’eau et sont généralement utilisés dans la fabrication des savons. Ainsi,

100mg de poudre de feuilles ou de fruits de M. charantia ont été mise dans un tube à

essai. Pour se faire 10ml d’eau distillée ont été additionné et agité vigoureusement en

bouchant avec le pouce le tube pendant 30 secondes. Une hauteur supérieure ou égale à

3 cm après une durée de 30min indique la présence des saponosides.

III.1.3.3. Test des polysaccharides

Les polysaccharides sont des sucres complexes constitués par la

polymérisation d’ose. Ainsi cinq-cents milligramme (500mg) de la poudre de feuilles ou

de fruits de M. charantia ont été placés dans un tube à essai, puis versé d’eau distillée

jusqu’à la moitié du tube, agité pendant quelques secondes et porté le tout à l’ébullition

pendant 30min. Le filtrat obtenu a été précipité avec de l’éthanol à 95°. La formation d’un

précipité indique la présence des polysaccharides.

III.1.3.4. Test des tanins et des polyphénols

Les tanins ont la propriété de précipiter en présence de gélatine. Ils

réagissent aussi avec le chlorure ferrique (FeCl3) en donnant une concentration bleu-noir

ou vert-noir aux tanins «catéchiques» et une concentration noir-bleuâtre en présence de

tanins « pyrogalliques ». Une solution hydro-alcoolique équivalente à 10 g de poudre de

feuilles ou de fruits a été évaporée à sec dans un cristallisoir. Pour cela 25ml d’eau

distillée chaude a été ajouté dans le résidu obtenu ainsi que 3 à 4 gouttes de NaCl 10%.

Après filtration, le filtrat a été réparti en fractions égales dans quatre tubes à essais.

• Tube n°1 : témoin

• Test à la gélatine : 4 à 5 gouttes de gélatine à 1% ont été ajoutées dans le Tube

n°2 et l’apparition d’un précipité éventuel indique la présence des polyphénols.

• Test à la gélatine salée : 4 à 5 gouttes de gélatine salée (1% de gélatine +NaCl

10%) ont été ajoutées dans le tube n°3 et la formation d’un précipité montre la présence

de tanins.

16

• Test au FeCl3 : le dernier tube (tube n°4) reçoit 4 à 5 gouttes de chlorure ferrique

(FeCl3) en solution méthanolique, une réaction négative à la gélatine salée accompagnée

d’une coloration verte ou bleu noir avec FeCl3, sont dues à la présence d’autre types des

composés phénoliques.

III.1.3.5.Test des Flavonoïdes, des Leucoanthocyanes et des Anthocyanes

Deux tests ont été mis en évidence pour détecter la présence de plusieurs

classes de flavonoïdes : le test de Cyanidine (Test de wilstater) et celui de Bate-Smith.

✓ Test de willstätter (Cyanidine) :

Une solution hydro-alcoolique équivalente à 3g de la poudre de feuille ou de fruits de

M. charantia a été portée à l’évaporation au bain marie. Après refroidissement à la

température ambiante, le résidu a été dépigmenté avec n- hexane puis filtré. Ainsi,

l’opération a été répété plusieurs fois jusqu’à élimination des pigments. Le résidu ainsi

obtenus a été dissouts dans 30ml d’éthanol 80° puis filtré à nouveau et placer 3ml de

filtrat respectivement dans 5 tubes à essais.

- Tube n°1 : a servi de témoin

- Tube n °2 : remplit avec 0,5ml de HCl concentré avec 3 à 4 tournures de

magnésium y ont été ajoutées.

Après 10min, le changement de coloration a été observé, le virage de l’extrait testé :

▪ au rouge montre la présence des flavones

▪ au rouge pourpre marque la présence de flavonols

▪ au rouge violacé indique la présence des flavones et flavonols

- Tube n° 3 : 0,5ml de HCl concentré, 1 ml d’eau distillé, 1ml d’alcool isoamilique

et 3 à 4 tournures de magnésium ont été ajoutés. Après, 10min si la coloration de

la phase supérieure est rouge, cela indique la présence des flavones et si c’est

rouge pourpre présence des flavonols.

✓ Leucoanthocyanes : Tests de Bate Smith

- Tube n°4 : un volume de 0,5ml de HCL concentré a été porté au bain marie

pendant 30 min puis laissé refroidir, une coloration rouge violet dénote la

présence de leucoanthocyanes.

17

- Tube n°5 : 0,5 ml de HCl concentré a été versé, le tout a été laissé à une

température ambiante pendant 30min. L’apparition d’une coloration rouge-

violacé indique la présence d’anthocyane.

III.1.3.6. Test des hétérosides cyanogénétiques

Le test de Grignard ou test de l’acide picrique a été mis en évidence pour

détecter la présence de ces composés. Pour se faire 10g de la poudre de feuilles ou de

fruits de M. charantia ont été humectés avec de l’eau distillée, puis ajouté 2ml de

chloroforme. Ensuite, une bande de papier wattman a été trempée dans la solution de

picrate de sodium préparée préalablement. Après, la bande déjà séchée à l’air libre, a été

suspendue juste au-dessus de la poudre en pliant sa partie supérieure sur le bord du

récipient de manière à ce qu’il ne touche pas la poudre puis le récipient a été fermé et

placé dans un plaque chauffante pendant 3heure. Le changement de coloration du papier

du jaune au rouge, indique la présence des hétérosides cyanogénétiques.

III.1.3.7. Test des coumarines

Le test de coumarine se fait par observation sous UV (à λ =254nm) de la

présence de la fluorescence jaune-vert sur le papier Whatman imbibé de la soude (NaOH)

10%. Un extrait hydro-alcoolique équivalent à 100mg de la poudre de feuilles ou de fruits

de M. charantia a été évaporé à sec dans un cristallisoir au bain-marie. En suite 3ml de

méthanol ont été ajoutés dans le résidu, puis le contenu a été versé dans un tube à essai :

ainsi le tube a été recouvert d’un morceau de papier Whatman imbibé d’une solution de

soude (NaOH) 10%. Après 30min au repos, l’observation sous sur une lampe à UV de λ

= 254 nm a été effectuée. Une fluorescence jaune-vert sur le morceau du papier indique

la présence des coumarines.

III.1.3.8.Tests des Anthraquinones : Bornträger

Une solution hydro-alcoolique équivalente à 1g de la poudre de feuilles ou

de fruits a été évaporée à sec dans un cristallisoir sur bain marie. Le résidu obtenu a été

dissout dans 30ml de benzène (petite ampoule décanter) puis l’extrait benzénique (phase

alcalin) a été transféré dans un tube à essai et 5ml de NaOH ont été ajoutés puis agité.

L’observation du changement de coloration de la phase alcalin (phase inferieure) en

coloration rouge indique la présence d’anthraquinones.

18

III.1.3.9. Test des stéroïdes et tritérpènes

Les triterpènes sont des polymères isopréniques à partir desquelles

dérivent les stérols (cholestérols, squalènes…). Une solution hydro-alcoolique

équivalente de 10 g de la poudre des deux organes a été évaporée à sec. Le produit obtenu

a été traité plusieurs fois avec n-hexane jusqu’élimination des pigments, puis 10ml de

chloroforme ont été ajoutés dans le résidu obtenu et en agitant pendent 5 à 10min, Après

la décantation, la solution a été séchée avec le sulfate de sodium (No₂So₄), Après

filtration, le filtrat a été divisé à parts égale dans trois tubes à essais.

▪ Tube n° 1 : témoin

Test de Liebermann-Burchard

▪ Tube n°2: 3 gouttes d’anhydride acétique ont été ajoutés dans le deuxième tube.

Après une agitation légère, une goutte de H2SO4 concentré a été additionnée dans

le mélange. Au bout d’une heure, si la coloration de la solution vire en bleu-vert,

des stérols sont présents, tandis que l’apparition d’une coloration rouge-violé ou

rose indique la présence de triterpènes. Les deux phénomènes peuvent être

observés simultanément.

Test de Salkowski pour les stérols insaturés

▪ Tube n°3 : Le tube contenant le filtrat à tester a été tout de suite incliné en donnant

un angle de 45°.puis 1 à 2 ml d’acide sulfurique (H2SO4) a été versé sur sa paroi

en évitant d’agiter. Après 1h, un changement de coloration a été observé ainsi que

l’apparition d’un anneau rouge à la surface qui indique la présence de stérols

insaturés.

III.2.Tests d’activités biologiques

III.2.1.Test d’activité antimicrobienne

III.2.1.1. Stérilisation des matériels d’étude

Tous les matériels ont été stérilisés afin de minimiser les sources de

contamination. Les verreries, les milieux de culture, l’eau distillée et les disques pour

l’antibiogramme ont été stérilisés à l’autoclave à 121°C pendant 20 min. Les mains et les

paillasses ont été nettoyés avec de l’alcool 70°C. Toutes les manipulations

19

microbiologiques ont été effectuées dans des conditions stériles (autour de la flamme d’un

bec bunsen) et sous hotte à flux laminaire.

III.2.1.2. Revivification des souches et rajeunissement des germes tests

Chaque souche microbienne (germe test) a été revivifiée dans du bouillon nutritif

puis incubée à 37°C pendant 24 heures. La turbidité du bouillon nutritif indique le

développement des souches cultivées. Ensuite, chaque souche a été respectivement

repiquée dans une boite de Pétri contenant du milieu gélosé nutritif (Annexe 1) en

réalisant des stries serrées par la méthode de quadrant. Les cultures ont été incubées à

37°C pendant 24 heures afin d’obtenir des colonies jeunes.

Deux colonies bien isolées de chaque souche bactérienne ou de levure ont été

prélevées à l’aide d’une anse stérile et diluées dans 10ml d’eau distillée stérilisée. Après

agitation, à l’aide d’un vortex, la turbidité de l’ensemble a été mesurée au

spectrophotomètre à une longueur d’onde de 550 nm de manière à obtenir une densité

optique égale à 0,125 (DO= 0,125) qui correspond à 106UFC.ml-1.

III.2.1.3. Ensemencement

La technique d'inondation ou culture en nappe a été utilisée. Pour cela, 10ml de

chaque suspension bactérienne de 106 UFC/ml de germes ont été inoculés dans des boîtes

de Pétri contenant préalablement du milieu Mueller Hinton solide (Annexe1) pour mettre

en évidence l’activité des extraits vis-à-vis des germes pathogènes. Les cultures ont été

incubées dans une étuve à 37°C pendant 15min afin que les germes puissent s’adhérer au

milieu. Après15min d’incubation, l’excès de liquide a été aspiré avec précaution à l’aide

d’une pipette à cône stérile et le milieu de culture a été séché dans l’étuve à 37°C pendant

15min.

III.2.1.4. Dépôt des disques

Chacun des quatre extraits a été tout d’abord dilué dans de l’éthanol 80° pour

obtenir une concentration de 10mg/ml. Ensuite, des disques de 6mm de diamètres

préalablement stérilisés ont été imbibés de 20µl de ces extraits à l’aide d’une micropipette

à cône stérile avec trois répétitions par extrait (trois disques par extrait). Les disques ont

été ensuite séchés à l’étuve à 37°C pendant 15min et déposés sur les cultures qui ont été

préparées précédemment à l’aide d’une pince stérile.

20

Afin d’évaluer l’efficacité des extraits testés sur les souches pathogènes, quatre

antibiotiques de référence ont été utilisés dont l’acide nalidique (30µg), la nystatine

(100UI), l’acide fusidique (10µg) et le netilmicine (30µg). Les boites contenants les

cultures ont été ensuite incubées dans l’étuve à 37°C pendant 24h.

III.2.1.5. Lecture des résultats

La présence ou non des halos d’inhibition autour des disques a été évaluée après

24 heures d’incubation. La mesure du diamètre du halo d’inhibition a été effectuée à l’aide

d’une règle graduée millimétrée. Les résultats ont étés exprimés suivant les normes ci-

après (tableau n°2).

Tableau n°2 : Normes utilisées par la méthode des disques (Leipzig, 1996)

Diamètre du halo d’inhibition (X) Sensibilité du germe Résultat

X˂7mm Insensible -

7mm˂X˂8mm Assez sensible +

8mm˂X˂9mm Sensible ++

X>9mm Très sensible +++

III.3. Test de l’activité antioxydante

Principe de la méthode de DPPH

L’activité antioxydante des différents extraits de feuilles et de fruits de M.

charantia a été évaluée selon la méthode de réduction de DPPH, développée par Blois en

1958. Elle est caractérisée par la concentration inhibitrice 50% (CI50) ou la

concentration de l’extrait qui réduit 50% du radical libre (DPPH).

En effet, lorsqu’une solution ayant des propriétés antioxydantes est mise en

contact avec une solution contenant un radical libre, dont le DPPH ici, il s’ensuit alors

une réaction de réduction de ce dernier par fixation d’un atome d’hydrogène sur le radical

qui devient alors DPPH-H. Cette réaction est témoignée par le virage de la coloration de

la solution qui passe du violet à jaune dont l’intensité peut être dosée par

spectrophotométrie. L’absorbance lue permet de calculer le pourcentage d’inhibition du

radical DPPH qui est proportionnel au pouvoir anti-radicalaire (antioxydant) de

l’échantillon (Figure N°9) (Parejo et al., 2003).

21

Diphényle picryl hydrazyle

(DPPH, radical libre)

Diphényle picryl hydrazine

(DPPH-H, non radical)

Figure 2 : Forme libre et réduite de DPPH.

Source : Molyneux (2004)

Mesure de l’activité antioxydant par la méthode de DPPH

Test préliminaire (test qualitatif)

Afin d’évaluer la potentialité antioxydante des extraits, un test préliminaire (test

qualitatif) a été réalisé en utilisant un antioxydant de référence, l’acide gallique, comme

témoin.

Pour se faire, une chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée avec

les extraits bruts de margose et l’acide gallique (témoin), 10 µl de chaque extrait de M.

charantia ont été déposés sur une plaque CCM, introduite dans une cuve à

chromatographie et laissés éluer dans du BAW (butanol, acide acétique glacial et eau ;

145 v/v/v) pendant une heure.

Après 1h, les plaques ont été séchées puis révélées par pulvérisation avec la

solution de DPPH 0,004%. L’intensité des couleurs (jaune) ainsi que la taille de la bande

d’élution en comparaison avec celle de l’acide gallique témoignent l’existence d’activité

antioxydante.

22

Test quantitatif de l’activité antioxydante

Suite à ce test de confirmation de l’existence des composés actifs, l’activité

antioxydante des extraits a été évaluée quantitativement suivant la méthode décrite par

Kivrak et al. (2009).

Le test a été réalisé dans une microplaque à 96 puits à fond plat en utilisant

différentes concentrations des extraits à savoir 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml, 1000

µg/ml, 2000 µg/ml et en utilisant le méthanol comme solvant de dilution. Ainsi, 25µl de

chaque extrait ont été ensuite mélangés avec 175µl de solution « DPPH-méthanol »

(0,004%). Un témoin négatif a été préparé avec 25 µl de solution de méthanol et 175μl

de solution méthanoïque de DPPH à 0,004%. L’acide gallique a été utilisé comme témoin

positif en adoptant les mêmes approches qu’avec les extraits.

Après 30min d’incubation à l’obscurité et à température ambiante, l’absorbance a

été lue à 517 nm avec un spectrophotomètre. Le blanc a été constitué de méthanol 100%.

Pour chaque concentration, le test est répété 3 fois. L’activité antioxydante qui exprime

la capacité des composés contenus dans les extraits à piéger le radical libre est estimé par

le pourcentage de décoloration (pourcentage d’inhibition) du DPPH. Elle est donnée par

la formule suivante (Yoo et al., 2008).

Où

Abs: désigne l’absorbance à la longueur d’onde de 517 nm.

Témoin : solution de DPPH

Les résultats ont été exprimés par la moyenne de 3 mesures ± écart type et la valeur de le

CI50 a été mesurée pour chaque extrait.

Le CI50 est calculée à partir des équations y = ax + b issue des courbes de tendance des

pourcentages d’inhibition en fonction des concentrations (Annexe 3)

Inhibition (%) = (Abs témoin – Abs test /Abs témoin) x 100

23

Photo 9 : Spectrophotomètre à 517nm

III.3. Analyses des échantillons des sols sous Margose

III.3.1. Analyses chimiques

Les échantillons de sol rhizosphérique des margoses, collectés dans les deux sites

d’étude, ont été respectivement analysés dans le laboratoire de pédologie du FOFIFA

(Foibem-pirenena momba ny Fikarohana ampiharina amin'ny Fampandrosoana ny

Ambanivohitra ou Centre National de Recherches Appliquées au Développement Rural).

L’analyse a été focalisée sur la détermination des 4 éléments nutritifs essentiels pour les

plantes à savoir l’azote total déterminer par la méthode de Kjeldahl, le phosphore

disponible par la Méthode de Bray II, le carbone organique par la méthode de Walkley

and Black, le potassium par la méthode d’Ammonium Acétate pour l’évaluation de la

capacité d’échange cationique (CEC) et enfin le pHeau de chaque type du sol.

Les détails des méthodes d’analyses sont donnés en annexe 2

III.3.2. Dénombrement des microorganismes bénéfiques pour les plantes

Pour chaque échantillon de sol, deux types de microorganismes ont été dénombrés

: les Actinomycètes et les Pseudomonas fluorescens. En effet, ces deux groupes de

microorganismes sont principalement impliqués dans les mécanismes de production de

métabolites secondaires dont les rôles dans la protection des plantes contre les agents

phytopathogènes sont bien connus (Lemaceau et al., 2009 ; Mukesh, 2014).

Pour se faire, 5g de chaque échantillon de sol ont été dilués dans 45ml d’eau

distillée stérilisée de manière à obtenir une série de dilution de 10-1 à 10- 4 selon la

technique appelée classiquement « dilution en cascade ». Ainsi, 100 µl de chaque dilution

ont été prélevés et étalés dans des boites de Pétri stériles contenant préalablement un

milieu de culture solide (Annexe1) qui est spécifique de chaque groupe microbien : le

milieu AS1 pour la population d’actinomycètes et le milieu King B pour celle de

24

Pseudomonas fluorescens. Afin d’inhibé la croissance des certaines germes indésirables

dans le milieu AS1 pour les actinomycètes, trois antibiotiques ont été ajoutées dont le

cycloheximide (0,025g/5ml), le triméthroprime (0,01g/5ml) et l’acide nalidixique

(0,025g/5ml). La composition et la méthode de préparation de ces milieux de culture sont

détaillées dans l’annexe 3. Pour chaque groupe microbien et chaque dilution, 3 répétitions

ont été réalisées.

Le dénombrement des colonies de Pseudomonas fluorescens a été réalisé après

48h d’incubation à 28°C, sous une lampe UV à une longueur d’onde de 365 nm car les

colonies de Pseudomonas émettent une fluorescence caractéristique sous UV à cette

longueur d’onde. Pour les colonies d’aspects poudreux ou dures caractéristiques des

actinomycètes, l’observation et le comptage ont été effectués à l’œil nu après 24, 48 et

72h d’incubation à 28°C. Seules les boites ayant le nombre de colonies comprises entre

30 et 300 ont été considérées pour le calcul de l’Unité Formant Colonie ou UFC, en

utilisant la formule suivante :

𝐍 =∑ 𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐞𝐬

𝐕 × (𝐧𝟏 + 𝟎, 𝟏 𝐧𝟐) × 𝐝𝟏

N : Nombre d’UFC par g de sol

∑colonies : Somme des colonies des boites interprétables (3 boîtes par dilutions)

V : Volume de solution du produit déposé dans les boîtes

n1 : Nombre de boites considérées à la première dilution retenue (3 boîtes)

n2 : Nombre de boites considérées à la seconde dilution retenue (3 boîtes)

d1 : Facteur de dilution de la première dilution retenue

RESULTATS ET

INTERPRETATIONS

25

RESULTATS

I. Rendements d’extraction hydro-alcoolique

Le tableau 3 ci-après montre les rendements obtenus lors de l’extraction hydro-

alcoolique de feuilles et de fruits de M. charantia pour les deux sites. Les résultats ont

permis de constater que les feuilles collectées à Ankorabe (FeK) donnent un bon

rendement d’extraction de l’ordre de 23,2%, par rapport aux feuilles récoltées à

Ampahitrosy dont le rendement d’extraction a été seulement de 18,5%. En ce qui

concerne les fruits, ceux collectés à Ampahitrosy (FrM) ont permis d’obtenir un bon

rendement qui a été de l’ordre de 18.75% en comparaison avec ceux du site Ankorabe qui

n’ont eu que 9.9% seulement comme rendement. Cela pourrait être due au fait que les

fruits d’Ampahitrosy étaient dans un stade de maturité plus avancé par rapport à ceux

récoltés à Ankorabe. Cependant, la technique d’extraction ou encore l’origine des

échantillons pourraient également être les causes de ces différences.

Tableau n°3 : Rendement des extraits de feuilles et de fruits des deux sites (Ankorabe

et Ampahitrosy)

Extrait Masse du matériel en g Masse d’extrait final en g Rendement en %

FeK 25 5.802 23,2

FrK 22.50 2,244 9,9

FeM 25 4,636 18,5

FrM 32.40 6,044 18,75

(FeK: extraits de feuilles de la margose récoltée à Ankorabe, FrK: extraits de fruits de

la margose récoltée à Ankorabe, FeM: extraits de feuilles de la margose récoltée à

Ampahitrosy et FrM : extraits de fruits de la margose récoltée à Ampahitrosy).

II. Caractéristiques des extraits hydro-alcooliques

Pour chaque spécimen collecté dans les deux sites, des différences de couleurs et

d’odeurs ont été observées au niveau des extraits (Tableau 4) : une couleur vert foncé

pour les fruits récoltés à Ampahitrosy et une couleur vert-clair pour les fruits récoltés à

Ankorabe. De plus, lors des manipulations, il a été constaté que l’odeur de ces extraits

varie également en fonction de la partie de plante (tableau n°4) (appréciation personnelle

de l’auteur mais mérite toutefois une étude plus approfondie). En effet, les feuilles

possèdent une forte odeur par rapport aux fruits. Ce phénomène pourrait être lié aux

26

facteurs environnementaux (sol, climat, eau…) ou à la nature des composés chimiques

qu’ils contiennent.

Tableau n°4 : Caractéristiques (nature) des extraits hydro-alcooliques des deux organes




III. Résultats des criblages phytochimiques

Les criblages phytochimiques ont été réalisés à partir des extraits hydro-

alcooliques de feuilles et de fruits de M. charantia récoltés dans les deux sites. Les tests

ont permis de déterminer la présence des grandes familles chimiques suivantes :

• Les alcaloïdes

Le tableau n°5 présente les résultats comparatifs du test préliminaire des

alcaloïdes pour les extraits de feuilles et de fruits de M. charantia pour les deux sites. Les

résultats ont montré que les alcaloïdes vrais sont présents en de très faibles quantités dans

les fruits des plantes collectés dans les deux sites d’étude. A la suite des études plus

approfondies, il a été remarqué que les extraits de fruits de M. charantia contiennent des

alcaloïdes de type primaires, tertiaires, ammonium quaternaire et N oxydes, que soit pour

le spécimen d’Ankorabe ou Ampahitrosy (tableau N°5).

Tableau n°5 : Résultats du test d’alcaloïdes

Echantillons Test Observation Résultats Conclusion

FeM et FeK

Mayer

Pas de changement

_ Absence

d’alcaloïdes Wagner _

Dragendoff _

FrM et FrK Mayer

Faible précipitation

+ Présence

d’alcaloïdes mais en

très faible quantité Wagner +

Dragendoff +

Extrait Couleur Odeur Aspect Volume de

l’extrait

Gout

FeK Vert- noir Très piquant Visqueux 460ml Amer

FrK Vert Piquant Visqueux 450ml Amer

FeM Vert-noir Très piquant Visqueux 460ml Amer

FrM Vert –foncé Piquant Visqueux 460ml Amer

27

Tableau n°6 : Résultats du test pour la confirmation des alcaloïdes

Echantillon Phase Tests Observation Résultats Conclusion

FrM et FrA

Phase

chloroformi

que

(organique)

Mayer Faible

précipitation

+ Présence

d’alcaloïdes

primaire,

secondaire

et tertiaire

Wagner Précipitation ++

Dragendoff Précipitation ++

FrM et FrA

Phase

aqueuse

(alcaline)

Mayer Précipitation

abondante

+++ Présence

d’ammonium

quaternaires et

des N-oxydes Wagner Précipitation

abondante

+++

Dragendoff Précipitation

abondante

+++

(- : Absence ; + : Teneur faible; ++ : Teneur modérée; +++ : Teneur élevée)




• Les flavonoïdes, les leucoanthocyanes et les anthocyanes

Le tableau n°7 montre les résultats comparatifs pour le test des flavonoïdes, des

leucoanthocyanes et des anthocyanes dans les extraits de feuilles et de fruits de M.

charantia collectés dans les deux sites.

D’après le test, les flavonoïdes de type flavones et flavonols sont présents dans les

extraits de fruits pour les deux sites et principalement pour les fruits d’Ampahitrosy. Par

contre, pour les feuilles, seuls les extraits de feuilles de M. charantia d’Ampahitrosy

(FeM) contiennent des flavonoïdes de type flavonols et des leucoanthocyanes en faible

quantité, tandis que ceux d’Ankorabe (FeK) en sont totalement dépourvus.

28

Tableau n°7 : Résultats du test des flavonoïdes, des leucoanthocyanes et des

anthocyanes.

Echantillon Tests Observation Résultats Conclusion

FeM

willstätter Coloration rouge pourpre (témoin : verte noire)

++ Présence des

flavonols

willstätter modifié

La phase supérieure est de

couleur rouge pourpre

++

Bate-smith Coloration rouge

violacée

++ Présence de

leucoanthocya

nes

Bate–

smiith

modifié

Pas de changement de

coloration

_ Absence

d’anthocyanes

FrM

willstätter couleur rouge à l’état de trace (témoin : jaune)

+

Présence des

flavones a

l’état de trace willstätter modifié

Phase supérieure reflète

la couleur rouge

+

Bate-smith Coloration rouge pourpre +++

Présence de

flavonols

Bate-smith

modifié


coloration

_ Absence

d’anthocyane

FeK

willstätter Coloration marron (témoin : vert bouteille)

_

Absence des

flavonoïdes willstätter modifié

Coloration marron _

Bate-smith Coloration marron et

rouge à l’état de trace

_ Absence de

leucoanthocya

nes

Bate-smith

modifié

Coloration en vert noire _ Absence

d’anthocyane

FrK

willstätter Couleur rouge à l’état de trace (témoin jaune)

+

Présence des

flavones Wilstater

modifié

Phase supérieure reflète

la couleur rouge

+

Bate-smith coloration rouge pourpre ++ Présence de

flavonols

Bate-smith

modifié


coloration

_ Absence

d’anthocyanes





29

• Les stérols et les triterpènes

Le tableau n°8 montre le résultat des tests stérols réalisés sur les extraits de feuilles

et de fruits de M. charantia collectés dans les deux sites d’études. Il a été constaté que les

deux organes (feuilles et fruits) de la plante collectés dans les deux sites contiennent une

forte quantité en stéroïdes de type stérols insaturés.

Tableau n°8 : Résultats du test de stérols et de Triterpènes

Echantillon Test Observation

Résultats Conclusion

FrK

Libermann

Burschard

rouge à l’état de trace

(Témoin : jaune pâle)

+

Présence de

stéroïdes

Salkowski Apparition d’anneau de

séparation de couleur

rouge

+++

Présence de

stérols insaturés

FeK

Libermann

Burschard

Coloration bleu vert

(Témoin orange)

+++

Présence de

stérols insaturés Salkowski Anneau de séparation de

couleur rouge

+++

FeM

Libermann

Burschard

Coloration bleu vert

++

Présence de

stéroïdes

Salkowski

Apparition d’anneau de


rouge

+++

Présence de

stérols insaturés

FrM

Libermann

Burschard

Coloration en vert olive

et un reflet de rouge

+

Présence des

stéroïdes

Salkowski

Apparition d’anneau de


rouge

+++

Présence de

stérols insaturés


(FeK : extraits de feuilles de la margose récoltée à Ankorabe, FrK : extraits de fruits de

la margose récoltée à Ankorabe, FeM : extraits de feuilles de la margose récoltée à

Ampahitrosy et FrM : extraits de fruits de la margose récoltée à Ampahitrosy)

• Les saponosides

Le tableau N° 9 présente les résultats du test des saponosides pour les extraits de

feuilles et de fruits de M. charantia collectés dans deux sites d’études.

Les résultats ont montré que les deux organes de la plante M. charantia ne

contiennent pas des saponosides.

30

Tableau n°9 : Résultats du test des saponosides

Echantillon Hauteur de la

mousse t=0mn

Hauteur de la

mousse T=30mn


FeK 5cm 0,5 cm _ Absence de

saponosides FrK 2cm 0,3cm _

FeM 5cm 0,5cm _

Absence des

saponosides FrM 2,5cm 0,3cm _




Ampahitrosy et FrM : extraits de fruits de la margose récoltée à Ampahitrosy)

• Les hétérosides cyanogénétiques

Le tableau n°10 montre les résultats du test d’hétérosides cyanogènes des deux

organes collectés dans le plateau d’Ampahitrosy et dans la région humide d’Ankorabe.

Les hétérosides ont été présents dans les fruits de la plante collectée dans les deux sites.

Tableau n°10 : Résultats du test des hétérosides cyanogénétiques

Echantillon Observation


FeK et FeM Pas de changement de

coloration

_ Absence d’hétérosides

cyanogènes dans les 2

feuilles

FrK et FrM Coloration rouge

++

Présence d’hétérosides

cyanogènes dans les 2

fruits





• Les coumarines

Le tableau n°11 présente les résultats comparatifs du test de coumarines, dans les

extraits des deux organes collectés dans les deux sites.

Il a été constaté que la teneur en coumarines dans l’extrait de fruits d’Ampahitrosy

a été moyennement élevée contrairement à celui de fruits d’Ankorabe qui en est

totalement dépourvus. Ces composés ont été présents en faible quantité dans les extraits

31

des feuilles d’Ampahitrosy tandis que les plantes d’Ankorabe ont été totalement

dépourvues.

Tableau n°11 : Résultats du test de coumarines

Echantillons Observation Observation

pour un test

positive


FeK et FrK Aucune fluorescence

Fluorescence

jaune-verte sous

l’UV λ=366nm

_ Absence des

coumarines

FeM Apparition d’une légère

fluorescence jaune

+ Présence de

coumarine à

l’état de trace

FrM Fluorescence jaune -

verte

++ Présence de

coumarine à

moyenne

quantité





• Les anthraquinones

Le tableau n°12 présente les résultats du test d’anthraquinones, pour les extraits

des deux organes collectés dans les deux sites.

Les anthraquinones ont été absentes dans les extraits des deux organes (feuilles et

fruits) de M. charantia pour les deux sites.

Tableau n°12: Résultats du test d’anthraquinones

Echantillons Observation Observation positif :

test de Bornträger

Résultat Conclusion

FeK et FrK

Pas de

changement de

coloration

Coloration rouge sur la

phase supérieure

_

Absence

d’anthraquinone

s FeM et FrM

Pas de

changement de

coloration

Coloration rouge sur la

phase supérieure

_





32

• Tanins et composés poly-phénoliques

Après les tests, il a été observé que les feuilles collectées dans les deux sites

contiennent en grande quantités des composés polyphénols de type catéchique (tableau

n°13). Par contre, les fruits ne contiennent ni des tanins ni des composés polyphénols.

Tableau n°13 : Résultats du test de polyphénols et de tanins

Echantillons Test

Observation Résultats Conclusion

FeK et FeM

Gélatine 1% Aucune précipitation _

Absence de

polyphénols

Gélatine salée Aucune précipitation _

Absence de tanins

FeCl₃ Changement de coloration en vert-noir (témoin vert)

+++

Présence de

composés

phénolique de type

catéchique

FrM et FrK

Gélatine 1% Aucune précipitation -

Absence de

polyphénols et de

tanins

Gélatine salée Aucune précipitation -

FeCl₃ Coloration rouge (témoin : jaune pâle)

-





• Résultats récapitulatifs du criblage phytochimique

Le criblage phytochimique a permis de déterminer les grandes familles chimiques

dans les extraits des deux organes (fruits et feuilles) de M. charantia. Les résultats obtenus

sont résumés dans le tableau n°14. Parmi les 13 familles chimiques testés, 8 familles ont

été présentes dans les extraits de feuilles et de fruits de M. charantia dont les alcaloïdes,

les flavonoïdes, les leucoanthocyanes, les stéroïdes, les polyphénols, les hétérosides

cyanogénétiques, les polysaccharides et les coumarines. Cependant, dans certains cas,

leur quantité varie d’un organe à un autre et aussi d’un site de collecte à un autre.

Par exemple, une proportion très élevée en stéroïdes de types stérols insaturés et

en polysaccharides a été enregistrée pour les deux organes de la plante, les polyphénols

sont présents en forte quantité dans les feuilles des plantes issues des deux sites d’études.

De plus, une forte quantité d’alcaloïdes et une quantité moyenne d’hétérosides

cyanogénétiques ont été observées dans les extraits de fruits de M. charantia, mais pas

33

sur les feuilles. La présence de coumarine à une quantité moyenne dans les fruits et à une

quantité faible dans les feuilles de M. charantia collectées en Ampahitrosy a été notée.

Pour les deux sites, les flavonoïdes de type flavone et flavonol ont été présents dans les

fruits. Par contre, seules les feuilles de M. charantia collectées à Ampahitrosy contiennent

des composés tels que les flavonoïdes de type flavonol et leucoanthocyane. Le fait que

les extraits diffèrent au niveau de leurs compositions chimiques pourrait être dû au fait

qu’ils ont été synthétisés dans des parties spécifiques de la plante et aussi en fonction du

stade de développement (par exemple durant le développement de la plantule, de la fleur,

du fruit, de la graine, ou de la racine).

Tableau n°14 : Résumé des résultats des tests des grandes familles chimiques

dans les extraits des deux organes de M. charantia





GRANDES FAMILLES

CHIMIQUES

Ankorabe Ampahitrosy

Feuilles Fruits Feuilles Fruits

Alcaloïdes - +++ - +++

Flavonols - + ++ +++

Flavones - ++ - ++

Anthocyanes - - - -

Leucoanthocyanes - - ++ -

Triterpènes - - - -

Stérols insaturés +++ +++ ++ +++

Saponosides - - - -

Tanins - - - -

Polyphénols +++ - +++ -

Hétérosides

cyanogénétiques

- ++ - ++

Polysaccharides +++ ++ +++ ++

Anthraquinones - - - -

Coumarines - - + ++

34

IV. Résultats du test antimicrobien des extraits de deux organes de M.

charantia

Après 24h d’incubation, les quatre souches utilisées lors du test antimicrobien

dont trois bactéries (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) et une

souche de levure (Candida albicans) n’ont présenté aucune sensibilité (diamètre d’halo

d’inhibition inférieure à 7mm) vis-à-vis de tous les extraits d’organes de M. charantia par

rapport aux antibiotiques de référence.

o Pour l’acide nalidixique, le diamètre du halo d’inhibition de la croissance

d’E. coli a été de 18mm.

o Pour l’acide fusidique, le halo a été de 25 mm sur Staphylococcus aureus.

o Pour Netimycine le halo a été de 27mm sur Bacillus cereus.

o Et pour la nystatine le halo a été de 25 mm sur Candida

activités biologiques des extraits de fruits et de...

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