Introduccin

En la naturaleza, la mayora de los microorganis-

mos no se encuentran aislados, sino integrados

en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estu-

dio de estos microorganismos y de sus propieda-

des, es necesario separar unos de otros y trabajar

con especies aisladas, obteniendo cultivos axni-

cos o puros.

Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene

un slo tipo de microorganismo y que procede

generalmente de una sola clula; el crecimiento

de sta origina, en medio slido, una masa de

clulas fcilmente visible que recibe el nombre de

colonia.

Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de

una poblacin microbiana mixta, se utilizan las

denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron

desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,

Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido

con esta finalidad, pero la presencia de contami-

nacin, es decir, de microorganismos no desea-

dos, dificult el aislamiento. La escuela de Robert

Koch introdujo los medios slidos, complementa-

dos con agar, y las placas de Petri en

Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica

de las colonias sobre la superficie del medio de

cultivo o en el interior del mismo.

El aspecto de las colonias sirve para diferenciar

distintas especies microbianas.

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganis-

mos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri.

- Obtener colonias separadas, utilizando uno o

ms mtodos.

- Estudiar la morfologa de cada colonia.

Material

Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas

de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de

microorganismos.

Tcnicas

Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse:

a) Extensin en superficie con cayado

Depositar sobre la superficie de una placa con

agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determina-

da dilucin del cultivo de microorganismos proble-

ma y extenderlo con ayuda del cayado, previa-

mente esterilizado, en todas las direcciones hasta

Cayado

Serie de

diluciones

conocidas de

la muestra

Figura 5.1. Siembra por extensin en

superficie para recuento.

Carga (1 Primera diseminacin(2 estra)

Segunda diseminacin

(3 estra) ltima diseminacin

(4 estra)

Figura 5.2. Tcnica de aislamiento por estra en superficie.

estra)

PRCTICA 5

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

23

que est completamente seco. Incubar la placa,

en posicin invertida, a la temperatura deseada

(durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de micro-

organismo. La posicin invertida evitar que el

agua de condensacin se deposite sobre la super-

ficie del medio, dificultando la obtencin de colo-

nias aisladas.

Es una tcnica usada para el aislamiento de colo-

nias, que permite igualmente el recuento de bac-

terias viables en la muestra, si conocemos exac-

tamente el volumen de muestra sembrado.

b) Estra mltiple en superficieCon un asa de siembra, previamente esterilizada,

se toma una muestra del cultivo de microorganis-

mos y se extiende sobre un rea pequea de la

superficie de la placa con agar nutritivo, en forma

de estras muy juntas, pero sin hacer presin para

no daar el agar.

Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la

siembra realizada previamente, se extiende de

nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas

estras. Este proceso se repite sucesivamente, fla-

meando y enfriando el asa al comienzo de las

sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a

incubar, a la temperatura adecuada, siempre en

posicin invertida.

Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisla-

das a partir de una muestra que contenga un ele-

vado nmero de bacterias.

c) Dilucin en masaEn una placa de Petri vaca se deposita un

pequeo volumen conocido de muestra y a conti-

nuacin se aade el medio de cultivo (agar nutriti-

vo) fundido y atemperado aproximadamente a

45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la

placa. De esta forma los microorganismos se dis-

tribuirn de forma homognea en el medio de cul-

tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separa-

das por todo el agar.

Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular

el medio de cultivo, fundido y atemperado, conte-

nido en un tubo, con un determinado volumen de

la muestra. La homogeneizacin de la muestra y

el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo

entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.

En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan

enfriar las placas hasta que se solidifique el medio

y posteriormente se incuban a la temperatura ade-

cuada (siempre en posicin invertida).

Aunque con esta tcnica se obtienen colonias ais-

ladas, generalmente slo se utiliza para determi-

nar el nmero de microorganismos viables en una

muestra, cuando stos son anaerobios facultati-

vos o microaerfilos.

Resultados

a) Extensin en superficie: Tras el perodo de

incubacin se examinarn las placas. Las colonias

aparecen sobre la superficie, distribuidas unifor-

memente si la siembra se ha realizado de forma

correcta. Podrn diferenciarse las colonias de

acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.

Esta tcnica de siembra, adems de permitir que

se distingan las colonias por su morfologa, permi-

te el recuento de microorganismos viables. La

expresin de este recuento se hace en "unidades

formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una

procede de un slo microorganismo (o de un

grupo de microorganismos, pues en algunos

casos stos tienden a formar agregados). A partir

de las colonias aisladas, los microorganismos

pueden transferirse a otros medios de cultivo para

su estudio.

b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incuba-

cin, se observarn las colonias aisladas en algu-

na regin de la placa inoculada. Con esta tcnica

se logra la separacin de los microorganismos

que se encuentran

en un cultivo

mixto, o bien que

proceden de

m u e s t r a s

h o m o g n e a s ,

pero en las que

existe un elevado

nmero.

En las zonas

donde existen

colonias aisladas

se puede estudiar

la morfologa colo-

nial.

c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distri-

buidas por toda la masa del agar. Aquellas que

estn en la superficie tendrn distintas caracters-

Inculo calibrado

Mediofundidoatempera

HomogeneizHomogeneizar

Medio fundido

atemperado

Inculo

calibrado

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masa

o inclusin en agar.

Figura 5.4. Aislamiento

por estra en superficie.

24

ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras

que las colonias que se desarrollan en el interior,

bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,

aunque los microorganismos que formen las dis-

tintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las

colonias que aparecen en la profundidad del agar

son siempre biconvexas y no se diferencian unas

de otras por su morfologa.

Figura 5.5.

Aislamiento por dilucin en masa.

Puntifor

me

Forma

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentos

a

Entero

Borde

Ondulad

o

Lobulad

o

Filamentoso

Elevacin Superficie

Plana

Elevad

Convex

Crateriform

Acumina

d

Lisa o

Mate o

Seca o

Invasiva o

Figura 5.6.

Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio

slido.

Puntiforme

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Ondulado

Lobulado

Filamentoso

Plana

Elevada

Convexa

Crateriforme

Acuminada

Lisa o rugosa

Mate o brillante

Seca o cremosa

Invasiva o superficial

25

Objetivos

- Aprender a inocular distintos medios de cultivo

contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio

semislido sembrado en profundidad.

- Observar el crecimiento bacteriano en los distin-

tos medios de cultivo.

- Comprobar la movilidad de determinados micro-

organismos.

Material

Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur

o pipetas graduadas, suspensin de microorganis-

mos y tubos con medio de cultivo lquido, slido

inclinado y semislido.

Tcnica

a) En medio lquido con asa: Transferir asptica-mente, con el asa de siembra, una pequea mues-

tra de los microorganismos, desde el tubo que

contiene el material problema al tubo con medio

de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y

agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar

el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48

horas a la temperatura ptima de crecimiento.

b) En medio lquido con pipeta: Introducir asp-ticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada

en el medio lquido que contiene los microorganis-

mos y, aspirando de forma adecuada, sacar una

cantidad establecida de material que se transfiere

al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en

estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms

adecuada.

c) En medio slido (agar inclinado): Con el asade siembra estril tomar los microorganismos de

la muestra e inocular el tubo realizando un movi-

miento de zig-zag en la superficie. El proceso se

inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba

por el rea inclinada.

Incubar en estufa durante 28-48 horas a la tempe-

ratura ms adecuada.

d) En medio semislido: La siembra en este tipode medio, que contiene una proporcin menor de

agar que los medios slidos y que se envasa en

tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra este-

rilizado, con el cual se toma la muestra. El medio

queda inoculado al introducir el hilo en profundi-

dad hasta el fondo del tubo, retirndolo posterior-

mente por la misma trayectoria utilizada al realizar

Muestra Inoculaci IncubaciMuestra Inoculacin Incubacin

FlameadoFlameado

Figura 6.1.

Inoculacin de un caldo de cultivo (ver tambin figura III, pg. 4).

Muestra Medio (agar

Asa desiembra

Siembra en zig-zag en la

Siembra en

zig-zag

Muestra Medio (agar inclinado)

Figura 6.2.

Siembra en un tubo de agar inclinado.

Muestra Medio (agar

Filamento

Puncinlimpia

Filamento

Puncin

limpia

Muestra Medio (agar semislido)

Figura 6.3.

Inoculacin de un medio semislido por

picadura con hilo de siembra.

PRCTICA 6

SIEMBRAS

27

la picadura. Una siembra con asa o con un cierto

movimiento de vaivn podra originar un patrn de

crecimiento que se interpretara errneamente

como movilidad bacteriana.

Incubar durante 24-48 horas a la temperatura pti-

ma de crecimiento.

Resultados

a y b) En los cultivos lquidos

no tiene lugar la formacin

de colonias, por lo tanto se

examinar la existencia de

enturbiamiento ms o menos

intenso, la formacin de una

pelcula o velo sobre la

superficie, la aparicin de

sedimento en el fondo del

tubo, etc. La utilizacin de

medios de cultivo lquidos

permite la obtencin de una

poblacin microbiana gran-

de, con un elevado nmero

de microorganismos, para

ser utilizados posteriormen-

te.

c) En medio slido (agar

inclinado) se observar el

aspecto general del medio y

la aparicin de crecimiento

sobre su superficie. Este tipo de siembra permite

el cultivo de microorganismos aerobios o anaero-

bios facultativos. Adems, se utiliza para almace-

nar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a

temperaturas de 4C.

d) En medio semislido se podr comprobar si el

microorganismo es o no mvil, ya que en el primer

caso se observar que el crecimiento difunde alre-

dedor de la zona donde se hizo la picadura,

detectndose turbidez. Por eso es tan importante

que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se

distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por

el mismo sitio de inoculacin. Los microorganis-

mos inmviles crecern nicamente a lo largo de

la picadura.

Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin,

como otro de mtodo de conservacin de microor-

ganismos anaerobios facultativos.

Figura 6.4.

Aspecto de cul-

tivos en agar

inclinado (A) y

semislido (B)

tras la

incubacin.

A B

Figura 6.5.

Prueba de movilidad en agar semislido.1. Microorganismo mvil.

2. Microorganismo inmvil.

3. Tubo control sin inocular.

1 32

28

Objetivo

Conseguir el crecimiento de microorganismos

anaerobios, en ausencia de oxgeno, utilizando

diversas tcnicas.

Material

Asa de siembra, medios de cultivo (segn la tcni-

ca utilizada), parafina estril, jarra de anaerobiosis

y suspensin de Clostridium. Para comparar el

tipo respiratorio, se emplearn tambin otros

microorganismos que no sean anaerobios estric-

tos, como Escherichia coli y Micrococcus luteus.

Tcnicas

a) Siembra en profundidad

En tubo con medio slido vertical o semislido: Se

utilizan los medios V.L. (Viande et levures,

Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, que

deben ser hervidos en un bao Mara durante 15

20 minutos, antes de ser inoculados, para elimi-

nar el oxgeno disuelto. Sembrar los medios, una

vez atemperados a 45-50C. Con el asa de siem-

bra o con una pipeta Pasteur estril, con el extre-

mo cerrado, se realiza un movimiento en espiral

de arriba a abajo y de abajo a arriba, para distri-

buir la muestra homogneamente, sin agitar el

tubo durante la siembra para evitar la entrada de

aire. Con la misma finalidad, solidificar rpidamen-

te el medio de cultivo sumergiendo el tubo en agua

fra.

Estos medios pueden utilizarse tambin para

determinar el tipo respiratorio, como se describe

en los resultados.

Si el medio utilizado es lquido, agregar una capa

de parafina estril para impedir la difusin del O2

al medio.

Incubar en estufa durante 24-48 horas a la tempe-

ratura ms adecuada.

En placa: Transferir 1 ml del inculo a una placa

de Petri estril vaca y aadir el medio de cultivo

fundido y atemperado a 45-50C, homogeneizan-

do mediante giros repetidos de la placa, hasta que

el inculo se haya distribuido uniformemente. Una

vez solidificado el agar, aadir una segunda capa

de medio de cultivo.

b) Siembra en superficie

Estra mltiple: La siembra por estra en superficie

tambin puede hacerse con microorganismos

anaerobios, pero en este caso, las placas no se

llevan a incubar directamente, sino que se introdu-

cen en una jarra especial en la que exista un

ambiente libre de oxgeno, denominada jarra de

anaerobiosis.

Para crear un ambiente

de anaerobiosis en el

interior de estas jarras,

se utiliza una prepara-

cin comercial que elimi-

na el O2 y desprende

CO2. La atmsfera va

reducindose y, para

verificar que el ambiente

es anaerbico, se coloca

dentro de la jarra una tira

de papel impregnada en

un indicador que vira de

color en presencia de

CO2. El indicador suele

ser azul de metileno, que es de color azul cuando

se expone al aire y se vuelve incoloro cuando est

totalmente reducido.

Incubar las placas dentro de la jarra de anaerobio-

sis durante 48 horas a la temperatura ms ade-

cuada.

Resultados

a) En medio semislido vertical (V.L.) o fluido (tio-

glicolato) los microorganismos pueden crecer en

la parte superior del medio si son aerobios estric-

tos, en la zona inferior del medio si son anaerobios

estrictos y a lo largo de todo el medio, en el caso

de anaerobios aerotolerantes. Los anaerobios

facultativos crecern tambin por todo el tubo,

aunque preferentemente en superficie. Por ltimo,

si se trata de microorganismos microaerfilos,

aparecer crecimiento en una pequea zona inter-

media, prxima a la superficie (ver Fig. 7.2).

Observar tambin el aspecto de las colonias y el

desprendimiento de gas.

En la siembra en placa en profundidad, se debe

anotar si ha habido crecimiento de colonias en

toda la masa del agar.

Figura 7.1. Jarra

de anaerobiosis.

PRCTICA 7

CULTIVO DE ANAEROBIOS

29

b) Estra mltiple en superficie observar el creci-

miento, teniendo en cuenta que la placa ha sido

incubada en ambiente de anaerobiosis. En las

zonas donde se hayan obtenido colonias aisladas

estudiar su morfologa.

1 2 3 4 5

Figura 7.2. Comportamiento de los microor-

ganismos en tubos VL.

1. Aerobios estrictos

2. Anaerobios estrictos

3. Anaerobios facultativos

4. Anaerobios aerotolerantes

5. Microaerfilos

30

El control microbiolgico es necesario para la eva-

luacin de la calidad microbiolgica de zonas

estriles en la industria farmacutica y en estudios

de la microbiota en ambientes naturales. El aire

contiene en suspensin diferentes tipos de micro-

organismos, especialmente bacterias y hongos.

La presencia de uno u otro tipo depende del ori-

gen, de la direccin e intensidad de las corrientes

de aire y de la permanencia y supervivencia de los

microorganismos. Algunos se encuentran en

forma de clulas vegetativas, pero lo mas fre-

cuente son las formas esporuladas debido a que

sobreviven mejor en atmsferas secas. En el aire

se aislan bacterias esporuladas de los gneros

Bacillus y Clostridium, as como actinomicetos.

Adems son frecuentes los bacilos pleomrficos

Gram positivos de los gneros Corynebacterium,

Arthrobacter y otros. Los bacilos y cocos Gram

negativos se encuentran en escasa proporcin

debido a que no sobreviven a la desecacin.

Respecto a los hongos, los que ms frecuente-

mente se aslan son hongos filamentosos como

Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria

o Mucor y levaduras como Rhodotorula o Candida

La tcnica que se emplea rutinariamente en anli-

sis microbiolgico ambiental es la sedimentacinpor gravedad. Este mtodo permite determinar lacarga microbiana de un ambiente problema. Los

microorganismos suspendidos en el polvo o

aerosoles sedimentan sobre la superficie de un

medio rico, no selectivo o bien en medios selec-

tivos contenidos en placas de Petri. Una vez toma-

da de muestra mediante la apertura de las placas

en el ambiente deseado, stas se incubarn en

las condiciones que favorezcan el crecimiento del

tipo de microorganismos que deseemos estudiar,

normalmente a temperatura ambiente y en aero-

biosis.

Objetivo

Observar y caracterizar someramente, mediante

observacin macroscpica y microscpica, la

diversidad microbiana de un ambiente elegido por

el alumno.

Material

Asa de siembra, una placa de Petri con agar trip-

tona soja, portaobjetos, colorantes para tincin

simple y de Gram, solucin de azul de lactofenol,

cinta adhesiva transparente, microscopio y aceite

de inmersin.

Tcnica

Llevar la placa cerrada, con cuidado de que no se

abra durante el transporte, al ambiente cuya carga

microbiolgica se desee evaluar. Retirar la tapa y

dejar la placa abierta, durante 30 minutos, en un

lugar representativo de dicho ambiente. Pasado

este tiempo, cerrar la placa e incubarla a tempe-

ratura de 25-30C. La placa se incuba durante 2 a

5 das.

Resultados

Se observar la aparicin paulatina de diversos

tipos de colonias. Aparecern en primer lugar

colonias bacterianas y al cabo del segundo o ter-

cer da de incubacin se observarn las colonias

de levaduras, que se asemejan a las bacterianas,

as como las caractersticas colonias algodonosas

de los hongos filamentosos. Se anotarn las

caractersticas ms importantes de las colonias,

segn la descripcin que aparece en la figura 5.6

PRCTICA 8

CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL

Figura. 8.1.

Control microbiolgico ambiental. Aspecto tpico de una placa de gravedad

mostrando la diversidad microbiana de un ambiente.

31

y se realizar un estudio microscpico de cada

una de ellas. Tras la tincin de Gram de las distin-

tas colonias bacterianas que aparezcan en la

placa, se observar todo tipo de microorganismos,

con predominio de cocos y bacilos esporulados

Gram positivos, frecuentemente dispuestos res-

pectivamente en sarcinas y en cadenas. Los baci-

los irregulares que se observaran, tienen pared de

Gram positivos, pero se decoloran fcilmente y en

las preparaciones aparecern como Gram negati-

vos o teidos de forma irregular, en bandas o en

los extremos. Estos bacilos son muy pleomrficos:

unos tienen forma de maza, se agrupan en empa-

lizada o recordando letras chinas; otros poseen un

ciclo de crecimiento de bacilo a coco y algunos ori-

ginan filamentos. La observacin microscpica de

hongos filamentosos se realizar mediante tincin

con azul de lactofenol. Para ello, se pone una tira

de cinta adhesiva transparente sobre el micelio,

con el fin de que las hifas y esporas queden adhe-

ridas. Se aade una gota de azul de lactofenol en

el centro y se adhiere al portaobjetos. El color azul

facilita la visualizacin del micelio en fresco.

Figura 8.3.

Morfologa de hongos al microscopio ptico.A. Levaduras en tincin con cristal violeta (obj. 100x). B. Penicillium. Tincin con azul de lactofenol

(obj. 40x). C. Cladosporium. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). D. Mucor. Tincin con azul de

lactofenol (obj. 40x). E. Aspergillus. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). F. Alternaria. Tincin

con azul de lactofenol (obj. 40x).

32

A B C

D E F

Figura 8.2.

Morfologa de algunas bacterias comunes en el aire al microscopio ptico.A. Micrococcus. Tincin de Gram (obj. 100x). B. Bacilos regulares (Bacillus) en tincin Gram (obj.

100x). C y D. Bacilos irregulares: Corineformes (C) y Arthrobacter (D). Tincin de Gram (obj. 100x). E.

Actinomiceto. Tincin de azul de lactofenol (obj. 40x).

A B C D E