aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de colombia para la producción de...

Aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de Colombia para la producción de etanolPedro F. B. Brandão1, Adelina del Pilar Melendez2 y Mario E. Velásquez-Lozano3

1 Grupo de Estudios para la Remediación y Mitigación de Impactos Negativos al Ambiente (G.E.R.M.I.N.A.), Laboratorio de Microbiología Ambiental y Aplicada, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA.2 Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA3 Grupo de Investigación de Procesos Químicos y Bioquímicos, Laboratorio de Ingeniería Bioquímica, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá – COLOMBIA

1

Trabajo perteneciente al Proyecto:“Aislamiento, caracterización y evaluación de

levaduras nativas del municipio de Puerto López (Meta) para la producción de

etanol”

Ejecutado por: Universidad Nacional de ColombiaFinanciado y Evaluado por: Colciencias y Ecopetrol

Apoyo y interés comercial de: Ecopetrol y Bioenergy

2

Pedro Brito Facultad Quimica

Colocar imágenes con mejr resolución

Bioetanol en Colombia• Alcohol carburante de Colombia

• caña de azúcar• valle geográfico del Río Cauca• región con 13 ingenios azucareros y 5

destilerías de alcohol• Otros puntos de interés objeto de estudio

• Costa Atlántica• Hoya del río Suarez (Boyacá-Santander)• Llanos Orientales (hasta el Tolima)

• Proceso general de obtención de alcohol carburante• fermentación con levaduras empleando como

sustrato los azúcares extraídos de la caña de azúcar

3

Biocombustibles en Colombia, 2009. Consultada en: http://www.upme.gov.co/Docs/Biocombustibles_Colombia.pdf

Fermentación con levaduras

4

• Metabolismo etanol• Conversión de hexosas

Proceso industrial de producción de bioetanol

5

• Levadura comercial• Proceso controlado• Reutilización levaduras

Levaduras Autóctonas vs. Comerciales• Potencial para mejorar rendimientos

de fermentación• Mejor adaptación a los jugos de caña• Mayor competencia contra otras

levaduras autóctonas

Importante recuperar levaduras de las zonas de cultivo y proceso de la caña para obtener las que puedan contribuir a un mejoramiento del proceso local de fermentación

6

Kosaric, N. and F. Vardar-Sukan, Potential source of energy and chemical products, in The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. 2001, M. Roehr ed. Wiley-VCH:: New York.

Potencial levaduras autóctonas en la producción de bioetanol

7

Basso L. C. et al (2008) Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res 8 (2008) 1155–1163

• Aparente baja diferencia en el rendimiento de etanol entre levaduras corresponde a un aumento de 2,1 millones de litros de etanol por temporada de cosecha en una destilaría de mediana capacidad.

Recuperación de Levaduras Ambientales• Muestras ambientales usadas

para encontrar levaduras de interés

• Extenso proceso de aislamiento

• Posible presencia de réplicas de una misma cepa

Técnicas de diferenciación permiten discriminar réplicas y así utilizar cepas únicas en la fermentación

8

Métodos moleculares para diferenciar levaduras• Análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de

restricción de regiones ITS (ITS-RFLP)

9

• Regiones ITS (Internal Transcribed Spacer)• RNA no-funcional

situado entre rRNA’s estructurales

• usado en taxonomía y filogenia microbiana

• alta variabilidad entre especies relacionadas

• fácil de amplificar por PCR (alto numero de copias de genes rRNA)

http://www.studyblue.com/#flashcard/view/9823159

Enzimas restricción

10

Métodos moleculares para diferenciar levaduras• Análisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de

restricción de ADN mitocondrial (mtDNA-RFLP)


• Alto poder de diferenciación de levaduras

• Método rápido y relativamente sencillo

• Digestión con HinfI o RsaI permite obtener polimorfismo con alto poder discriminativo

11


• Separación del cromosoma de levadura por electroforesis de campo pulsado (Cariotipado)

• Útil para identificación de cepas de levaduras

• Revela gran variabilidad de la composición del cromosoma

• Complejo, laborioso, consume tiempo cuando se requiere analizar muchas cepas

Métodos moleculares para diferenciar levaduras

Objetivo general investigación desarrollada

• Recuperación y aislamiento de levaduras autóctonas

de Puerto López (Meta), Colombia, con potencial para

la producción de etanol, y el establecimiento de

metodologías moleculares para su identificación.

12

Procedimiento experimental

Análisismolecular

Discriminación por huella molecular

Selección de cepas para análisis de

fermentación

Formación cepario

Secuenciación para

identificación

Muestreo Puerto López

(Meta)

Aislamiento levaduras autóctonas

Selección morfológica levaduras

Aplicación industrial

Análisis de diversidad

Zonas de muestreo - Puerto López (Meta)• Cultivo Caña• Agua de irrigación• Trapiche• Productos fermentados

(guarapo)

Se realizaron muestreos en época seca y de lluvias con el objetivo de recolectar diferente carga microbiológica

14

Muestras Ambientales• Agua riego• Suelo cultivo• Caña de azúcar• Jugos de caña• Mieles• Melaza• Bagazo• Suelo con jugo de

caña del trapiche panelero con olor a fermentado

15

Aislamientos• Técnicas dependientes de cultivo• Worten Agar• Potato Dextrose Agar• Yeast Glucose

Chloramphenicol Agar

16

Cepario

17Primer cepario (epoca seca)

Segundo cepario (epoca de lluvias)

105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ 112-10/112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-

1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2No encontrado

107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ 109-12/110-1/110-6/112-4/120-6/120-8

Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843)Cepas patrón: A, B, Sucromiles

202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-

1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4

103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-3/108-2/ 108-3/112-2/113-3

No encontrado

106-1/107-2 No encontrado105-2/105-4/105-7/115-1 No encontrado

112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 No encontrado109-10 No encontrado109-7 No encontrado109-6 No encontrado109-4 No encontrado

120-12/120-14 No encontrado120-5/120-9/120-10/120-13 No encontrado

120-11 No encontrado120-1 No encontrado108-5 No encontrado114-1 No encontrado

116-2/116-3/116-5 No encontradoNo encontrado 202-1/202-2No encontrado 203-1/203-2No encontrado 203-4No encontrado 204-3/206-1/206-4/209-3No encontrado 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3No encontrado 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5No encontrado 205-8No encontrado 208-6No encontrado 210-3/215-1No encontrado 212-2/212-5No encontrado 212-4No encontrado 212-6/212-7No encontrado 213-9No encontrado 213-10No encontrado 215-3

• Se recuperaron 239 cepas de levaduras autóctonas de Colombia

Junto con diferentes cepas patrón de Saccharomyces cerevisiae se llevó a cabo el análisis molecular

Amplificación de la región ITS

(PCR)

Purificación de los productos

de amplificación

Secuenciación de las regiones

ITS

Análisis bioinformático

de las secuencias

(Blastn)

Identificación Molecular Levaduras

Extracción de ADN levaduras

Método mecánico (bead-

beater)

Método enzimático (Liticasa)

Análisis región ITS Levaduras Autóctonas• Diferentes tamaños de fragmentos ITS entre levaduras• Varias cepas mostraron ITS con el mismo tamaño baja discriminación

19

Diferenciación Molecular de regiones ITS• Diferenciación por huella molecular: Análisis ITS-SSCP

Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)• variaciones en secuencia de ADN desnaturalizado se detecta por

alteraciones en conformación secundaria de ADN de cadena sencilla (ssADN) en gel de poliacrilamida

• Conformación secundaria de ADN es dependiente de la secuencia de bases del fragmento

• Separación en el gel es dependiente de la conformación secundaria enrollada del ADN

20

Muestra A Muestra B

Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante

Single-Strand Conformation Polymorphism

Desnaturalización del DNA (95°C, 5 min.)

Muestra A Muestra B


Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante

Carga de muestras en gel

Muestra A Muestra B


Doblamiento de cadenas sencillas de

ADN

Muestra A Muestra B


Separación en el gel de las

distintas conformaciones

de cadenas sencillas de

ADN

Muestra A Muestra B


Posición final de las

cadenas sencillas de

ADN en el gel

Muestra A Muestra B


Perfiles de SSCP

Muestra A Muestra B


Análisis ITS-SSCP

28

Se encontraron 39 perfiles ITS-SSCP únicos entre las 239 cepas aisladas

Entre paréntesis se encuentran los códigos de las cepas nativas. La Cepa A y Sc son controles positivos de Saccharomyces cerevisiae, las letras A hasta Q designan los perfiles obtenidos para las muestras del primer cepario (recolectado en epoca seca) y las muestras 1-40 corresponden a las primeras amplificaciones del segundo cepario (recolectado en epoca de lluvias).Condiciones del gel de SSCP: 0.50X MDE, 17h corrida a 5W.

Compilación de perfiles ITS-SSCP únicos obtenidos para las cepas autóctonas de levaduras presentes en el cepario establecido

Perfil ITS-SSCP

Primer cepario (Verano)

Segundo cepario (Invierno)

A105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ 112-10/112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-

1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2No encontrado

BS. cerevisiae

107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ 109-12/110-1/110-6/112-4/120-6/120-8

Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843)Cepas patrón: A, B, Sucromiles

202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-

1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4

C103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-

3/108-2/ 108-3/112-2/113-3No encontrado

D 106-1/107-2 No encontradoE 105-2/105-4/105-7/115-1 No encontradoF 112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 No encontradoG 109-10 No encontradoH 109-7 No encontradoI 109-6 No encontradoJ 109-4 No encontradoK 120-12/120-14 No encontradoL 120-5/120-9/120-10/120-13 No encontradoM 120-11 No encontradoN 120-1 No encontradoO 108-5 No encontradoP 114-1 No encontradoQ 116-2/116-3/116-5 No encontradoR No encontrado 202-1/202-2S No encontrado 203-1/203-2T No encontrado 203-4U No encontrado 204-3/206-1/206-4/209-3V No encontrado 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3W No encontrado 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5X No encontrado 205-8Y No encontrado 208-6Z No encontrado 210-3/215-1

2A No encontrado 212-2/212-52B No encontrado 212-42C No encontrado 212-6/212-72D No encontrado 213-92E No encontrado 213-102F No encontrado 215-3

S. cerevisiae fue la única levadura recuperada en ambas épocas seca y lluviosa

Fragmentos de ADN correspondientes a perfiles ITS-SSCP únicos fueran secuenciados para su identificación

PerfilITS-SSCP

Especie identificada% Identidad

GenBank

A Hanseniaspora guillermondii 99B Saccharomyces cerevisiae 99

C, S, 2F Meyerozyma caribbica 100D, 2J Issatchenkia orientalis 100

E Rhodotorula mucilaginosa 99F, U, 2C Wickerhamomyces anomalus 99

H, J, WPichia sp. CBS 241 (Zygopichia chevalieri var. Fermentati)

100

I Candida parapsilopsis 99M Dekkera bruxellensis 95

NTorulaspora sp. XZ-46A (Torulaspora quercuum)

99

O Candida intermedia 100Q Candida tropicalis 99R Toluraspora delbruekii 100

V, 2B Pichia sp. YS110 (Pichia garciniae) 95Z, 2E, 2H Candida berthetii 100

2D Candida laemsonensis 982A Candida stellimalicola 1002G Candida cf. sorbosivorans 99X Hanseniaspora opuntiae 99T Secuencia no reportada en bases de datos 86

G, K, L, P, Y, 2I, 2K, 2L, 2M

Pendiente resultado -

Identificación Levaduras Autóctonas• Varias cepas han sido

reportadas como contaminantes en plantas de producción de etanol ( )

• S. cerevisiae 51 cepas entre las 239

levaduras analizadas mostraron distintos

perfiles metabólicos de fermentación indicando posible variabilidad intra-específica

Basílio A. C. M. (2008) Detection and Identification of Wild Yeast

Contaminants of the Industrial Fuel Ethanol Fermentation Process.

Curr Microbiol (2008) 56:322–326.

*

**

*

**

*

*

**

*

Diferenciación de subespecies de S. cerevisiae

• Análisis de regiones inter-delta

permite discriminación por debajo del nivel de especie

31

Ness F. et al (1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62, 89-94.

Código de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae

Primer cepario Segundo cepario

107-3 202-3* 209-2** 214-3

107-4 203-7 209-5 214-4

109-5 203-8 210-1 215-2

109-8 204-1* 210-2 215-4

109-9 204-2 212-1 215-5**

109-11 205-3 212-8 216-1

109-12 205-4 213-1 216-4

110-1 206-3 213-2 216-5

110-6 206-6 213-4 -

112-4* 206-7 213-6 Cepas patrón

119-1 206-9* 213-7 AH22

119-3* 207-2 213-8 A

120-6 207-3 214-1 B

120-8* 208-1 214-2 Sucromiles

Las cepas indicadas con el símbolo * corresponden a las que pueden ser de mayor interés a futuro debido a su perfil de fermentación de acuerdo a los resultados de la actividades 3 y 7 del proyecto de investigación. Las cepas con el símbolo ** corresponden a cepas que son S. cerevisiae pero que por problemas de crecimiento en el momento de inocular en el medio YPG no se incluyen en los resultados obtenidos.

S. cerevisiae evaluadas por análisis inter-delta

Análisis inter-delta de S. cerevisiae

33

20 perfiles inter-delta únicos grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación

Cepa de levadura S. cerevisiae

Perfil interdelta

Cepa de levadura S. cerevisiae

Perfil interdelta

212-1, 213-1 a A, SC ñ

216-1, 216-4, 107-4 b 209-2, 212-1 o

213-4, 214-3 b(I) 205-3 o(I)

215-4, 109-5 b(II) 206-3, 210-1, 210-2 p

213-7, 214-4 b(III) 207-2 p(I)

110-6, 110-1 c 206-6 p(II)

208-1, 109-8 c(I) 205-4 q

109-11 c(II) 215-2 q(I)

213-8 d B r

214-2 e AH22 s

107-3 f 120-6 t

109-9 g 206-9 u

112-4 i 202-3 v

119-1 j 207-3 w

119-3 k 209-5 x

204-1 l 213-6 y

204-2 m 214-1 z

206-7 n 213-2, 120-8, 203-7, 203-8, 216-5

No Amplificó

20 perfiles inter-delta únicos entre 51 cepas de S. cerevisiae

grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación

Compilación de perfiles inter-delta únicos obtenidos para las cepas de S. cerevisiae autóctonas

Fermentación con levaduras autóctonas

35

• Varias levaduras autóctonas mostraron nivel de producción de etanol similar a cepa control

- Densidad celular: 1x107 células viables/ml- Temperatura fermentación: 30°C- Sacarosa: 10% p/v- Incubación: 24h

Conclusiones

Secuenciación de las 39

regiones ITS únicas

Fermentaciones con S. cerevisiae

únicas

Amplificación de región ITS

Análisis SSCP

39 perfilesITS-SSCP

únicos

Identificación a nivel de especie

1 de los 39 perfiles corresponde al perfil

de una cepa referencia

S. cerevisiae

Varias de las 50 cepas nativas S. cerevisiae mostraron perfiles

metabólicos distintos

Amplificación y análisis de

regiones inter-delta

20 perfilesinter-delta únicos S. cerevisiae

50 levaduras autóctonas con perfil

ITS-SSCP igual a cepa referencia S.

cerevisiae

Diferenciación por debajo del

nivel de especie

Aislamiento levaduras autóctonas

Muestreo Puerto López

(Meta)

Cepario(239 cepas)

Investigaciones en desarrollo• Segunda fase del proyecto:

“Producción de etanol de segunda generación a partir de hidrolizado de bagazo de caña por levaduras y bacterias autóctonas”• Mejoramiento molecular de levadura autóctona

• Transformación de pentosas

• Resistencia a inhibidores

• Aislamiento de bacterias fermentadoras de pentosas

• Probar posible implementación de microorganismos aislados a nivel industrial (Bioenergy)

37

http://www.bioenergy.com.co/Espanol/Paginas/Video-Corporativo.aspx

Agradecimientos• Integrantes grupo ECOLEVUN

• Astrid Acevedo, Ángela Otálora, Alis Pataquiva, Luisa Gómez, Sandra Rodríguez, Juan Pablo Ortiz, Helver Lesmes

• Estudiantes integrantes grupo GERMINA• Diana Vela, Iván López (2010-2)• Jaime Sánchez (2011-1)• L. Tatiana Morales, Aida Ramírez (2011-2)• Yina Cifuentes (2012-1)• Vivian Covo (2012-2)

• Entidades financiadoras

38

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Reacción en Cadena de la Polimerasa

40

Polymerase Chain Reaction (PCR)• Reacción en Cadena de la Polimerasa

41

aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de colombia para la producción de...

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