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LAS LEVADURAS DELLAS LEVADURAS DEL TERROIR
Dra. Laura MERCADOLaboratorio de MICROBIOLOGÍALaboratorio de MICROBIOLOGÍACentro de Estudios de Enología
Estación Experimental Agropecuaria Mendoza-INTAEstación Experimental Agropecuaria Mendoza-INTA
INTRODUCCIÓN
LEVADURAS:
h i l l R i F iModelo de estudio
hongos unicelulares - Reino Fungi
Saccharomyces cerevisiae
INTRODUCCIÓN
LEVADURAS:
h i l l R i F i
MODELO de estudio
P i i i dhongos unicelulares - Reino Fungi Primer eucariota secuenciado
Saccharomyces cerevisiae
BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA:
Producción alimentos y bebidas
VINO
VINO f t ió t d
INTRODUCCIÓN
VINO: fermentación mosto de uva Fermentación
alcohólicaalcohólica
C6H12O6 → 2 CO2 + 2 CH3CH2OH
NICHO ECOLÓGICO Fermentación inoculada
Saccharomyces Fermentación espontánea
INTRODUCCIÓN
Fermentación inoculada Adición inóculo (LSA)
Fermentación espontánea “Flora nativa”
Origen:g
• UVA
• BODEGA
INTRODUCCIÓN
MENDOZA Principal provincia productora de vid y vinoMENDOZA Principal provincia productora de vid y vino
ECOSISTEMAECOSISTEMA
LEVADURAS (biota)
Catania y col. (2007). MALBEC
¿Interrogantes….?INTRODUCCIÓN
Falta de información procesos microbiológicos:• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por
i i t l t bié t ib i imicroorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?,
• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo ¿ g qde las fermentaciones, incluso en años sucesivos?,
• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarseen la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica y cuál es
en la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
una determinada región geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?•¿Existen levaduras propias de una zona iti i í l d t i d T i ?vitivinícola determinada o Terroir?,
•¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?
OBJETIVO GENERALConocer la diversidad poblacional de cepas de Saccharomyces cerevisiae
b d i d l ió i í l Z Al d l Rípresentes en bodegas, uvas y vinos de la región vitícola Zona Alta del Río Mendoza.
PARTE 1
O i d l l d bl
PARTE 2
BIODIVERSIDAD DE SaccharomycesOrigen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos.
BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”Mendoza
PARTE 1
Origen de las levaduras responsables de la fermentación g pespontánea de los mostos
OBJETIVOSHIPOTESIS OBJETIVOS-Conocer la distribución de cepas de Saccharomyces cerevisiae sobre equipamientos de una bodega
población de levaduras
HIPOTESIS
equipamientos de una bodega.Saccharomyces cerevisiae.
PERMANENCIA
- Determinar la contribución a la fermentación espontánea de cepas de S. cerevisiae aisladas desde
i i t d b dPARTICIPACION DE FERMENTACIÓN
equipamientos de una bodega
- Evaluar el grado de relación genética entre las cepas de S. cerevisiae aisladas desde equipamientos de bodega y
FERMENTACIÓN
RELACIÓN É fermentación, y su relación a cultivos
comerciales.GENÉTICA
PARTE 1 Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos
MATERIALES Y MÉTODOS
MUESTRAS
2 etapas
IDENTIFICACIÓN
Saccharomyces
AISLAMIENTOEQUIPOS BODEGA
2 etapas
-AV
DV
ycerevisiaeAEM + RB
WL-DV
A i
SelMedUVA
Arrivo a bodega Recuentos
AislamientosCARACTERIZACIÓN
Fermentación espontánea
Conservación FERMENTACIÓN
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
PCR interdeltap
3 etapasRFLP ADNmit
“CEPAS”
Patrones de PCR interdelta (arriba) y RFLP ADNmit (abajo) obtenidos paraS h i i i l d d i d b d iñ d Saccharomyces cerevisiae aislados de equipos de bodega, viñedos y fermentaciones espontáneas
PARTE 1 Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos
RESULTADOS POBLACIONES TOTALESRESULTADOS POBLACIONES TOTALES
-Equipos población levaduras
-Población residente
-Incremento durante vendimia
Equipamientos de Número de levaduras totales (Log ufc/cm2 ± SD)
Temporada 2001 Temporada 2002q pbodega
p pAntes de vendimia
Durante vendimia
Antes de vendimia
Durante vendimia
Lagar 0.7 ± 0.1 6.7 ± 5.7 1.9 ± 1.0 5.7 ± 5.1 Moledora 2.7 ± 2.1 4.7 ± 4.1 2.0 ± 1.3 4.4 ± 4.2 Caño de traslado 4.8 ± 3.9 4.3 ± 3.7 4.0 ± 3.9 nmCaño de llenado nm 3.7 ± 3.2 1.7 ± 1.3 nmTanque (interior) 2.2 ± 1.6 2.3 ± 1.3 < 1 3.0 ± 2.9 Tanque 2.1 ± 1.3 4.2 ± 3.7 < 1 5.1 ± 4.6
PARTE 1
Resultados S. cerevisiae - diferenciación intraespecífica
PARTE 1 Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos
2002ANTES VENDIMIA DURANTE VENDIMIA FERMENTACIÓN
PatrónLagar Moledora Caño
trasladoCaño
llenado ACaño
llenado B Lagar Moledora Tanque interior
Tanque salidas
Uva Mosto Principio Medio Final
I02 18.75II02 42.8 7.14 5III02 8.33IV 8 33 5 5IV02 8.33 5.5V02 20 21.4 5VI 02 12.5 14.3VII 02 20VIII02 5
XLII 12.5 7.14 5.5 10XLIII 5XLIII 5LII 5LV 33LVI 5.5 7.7LXIV 14.3 11 15.4 5LXV 5LXVII 20
Cepas perennes
LXVIII 7.7LXIX 7.7LXX 7.7LXXII 8.33 5LXXIII 8.33LXXIV 7.14 7.7
Patrones únicos
LXXV 5.5LXXVI 7.14LXXIX 7.14 23.1 7.7LXXX 5.5 7.7LXXXI 7.7LXXII 7.7LXXXIV 67
Diferente diversidad en cada equipo y etapa
LXXXIV 67LXXXV 20LXXXVI 20LXXXVIII 11 7.7 10LXXXIX 15.4 7.7XCI 23.1 5XCIII 5
Participación en fermentación Cepas comerciales (13)
Perfiles únicos*XCVI 5XCVIII 5IX02 5.5 20C 8.33 5.5 15.4CI 10CII 5
coincidencias
¿Interrogantes….?INTRODUCCIÓN
• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?
ÁFERMENTACIONES ESPONTÁNEAS EN BODEGA:Muy polimórficas
ió d dif t S i i P
NO hallaron cepas de uva (límites de muestreo y aislamiento)30 % 60% l fi l d lsucesión de diferentes cepas S. cerevisiae. Pocos
patrones en más de una etapa de la fermentación. incremento en la diversidad a lo largo del proceso
30 % y 60% al final de la fermentación: origen bodega
• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?sucesivos?
• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en la bodega y participar en otrasla bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
¿Interrogantes….?INTRODUCCIÓN
• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?
• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?
•Población de S. cerevisiae residentescarácter dinámico: fluctuando año a año y a lo largo de la temporadacepas estables a lo largo de la temporada y en años consecutivoscepas estables, a lo largo de la temporada y en años consecutivos. 30 - 60% cepas al final de la fermentación
• población de levaduras de bodega fue diversa y numéricamente importante : sólo algunas de estas cepas participaron en la p g p p pfermentación.
• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
¿Interrogantes….?INTRODUCCIÓN
• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?
• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años
i ?sucesivos?
• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en co e c a es ¿puede és as s a a se ela bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?
Cepas comerciales:
•No parte de biota “perenne”•No parte de biota perenne
•Coincidencias cepas fermentación y bodega
RESULTADOS
PARTE 1 Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos
f f ?
INTERROGANTE
• ¿la no-identidad significa que son totalmente diferentes?• ¿hay algún tipo de relación entre ellas?
C ál l d d l ió l i l• ¿Cuál es el grado de relación con las cepas comerciales que masivamente se han utilizado desde hace aproximadamente 25 años en nuestra zona?p
ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES
ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES
PCR
Diferente agrupamiento por marcador
Tres clusters fueroninterdelta
SSR
Tres clusters fueron conservados (cepas bodega)
SSR
RFLP ADNmit
cepas comerciales mayoría separó, cierta relación cepas fermentación
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
HIPOTESIS POBLACIÓN de S cerevisiae
OBJETIVOS
S. cerevisiaepropia y característica.
-Caracterizar las poblaciones de S.
cerevisiae en los viñedos ubicados
en la región vitícola Zona Alta del Río
Mendoza (ZARM).
-Determinar la contribución de las
cepas de S. cerevisiae de viñedos a PERMANENCIAla población levuriana responsable de
la fermentación espontánea de los
t di i i d t i l
PARTICIPACION DE FERMENTACIÓN mostos en condiciones industriales.
-Evaluar el grado de relación
FERMENTACIÓN
RELACIÓN É genética entre estas poblaciones y
en relación con su origen geográfico.
GENÉTICA
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
MATERIALES Y MÉTODOS
8 viñedos -6 Bodegas
Bodega N: viñedos NL y NPC: viñedos CB y CR
VIÑEDO
PanquehuaC: viñedos CB y CRT: viñedo TS: viñedo SI: viñedo ID
800
9001000 MaipúCarrodilla
CZ: viñedo CZ
1000 p
Luján
Barrancas
Carrodilla
Vistalba NL
CR
TID
FERMENTACIONES Barrancas
PerdrielCB
NPINDUSTRIALES
Agrelos
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
MATERIALES Y MÉTODOS
VIÑEDO
10 sectores autoenriquecimiento
aislamientoFERMENTACIONES
Identificación1 tanque (cada 3 etapas
FERMENTACIONES INDUSTRIALES
Caracterización molecular
1 tanque (cada parcela)
3 etapas
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOSCB
CR
ab
b
Nº levaduras uva de cada viñedo fue muy diferente
Viñe
do
CR
CZ
ID
NL
b
b
c
b
POBLACIÓN
diferente NP
S
T
0 1 2 3 4 5 6
a
c
b
6
POBLACIÓN TOTAL DE LEVADURAS
log ufc/mL
distribución no homogénea dentro de los mismos
ufc/
mL
3
4
5
Log
u
0
1
2
3
Viñedo
CB CR CZ ID NL NP S T0
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS
10
11
12
6
7
8
9
atro
nes
S cerevisiae 2
3
4
5nº p
a
S. cerevisiae
1020 aislados 0
1
P L T CB CR CZ S ID
DISTRIBUCIÓN NO HOMOGÉNEA:
-nº diferente cada sector,
Caracterización:
-PCR Interdelta
-1 a 12 patrones en cada sitio
-4 viñedos no S. cerevisiae en algún punto
DIFERENTE DIVERSIDAD 9 h t 36 t dif t
-RFLP ADNmit
Patrón: combinación -DIFERENTE DIVERSIDAD: 9 hasta 36 patrones diferentes por viñedo
DOS TIPOS: Alto / Bajo polimorfismo
Patrón: combinación patrones amplificación + restricción
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS Sector del viñedo
P t ó 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
viñedoTRESULTADOS
S. cerevisiae
Patrón 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 75 2 25 3 7,14 4 7,14 5 7 14
VIÑEDOS DE ALTO POLIMORFISMO
5 7,146 14,3 7 7,14 8 7,14 9 7,14 25,3 75
10 7 14
•distintas poblaciones de S cerevisiae
• 6 viñedos (CR, L, P, ID, CZ y T) población muy variada: + 20 patrones.
10 7,1411 7,14 12 14,3 7,14 13 7,14 14 7,14 15 7,14 14,3 •distintas poblaciones de S. cerevisiae
cada viñedo
• una distribución irregular
16 21,43 8,3 50 17 21,43 25 37,5 NS1 18 21,43 19 8,3 37,5 20 8,3 21 8 3
g• Sitios + o - polimorficos
Algunos patrones más distribuidos
21 8,322 16,6 23 8,3 24 16,6 25 12,5 26 50
90 % patrones únicos: sólo presentes en un único sector en toda la región evaluada
26 5027 12,5 28 12,5 29 25 30 25 31 12,5 32 12,5 33 12,5 34 33,3 35 66,7 36 7,14
Participación en fermentación
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS S. cerevisiae
VIÑEDOS DE BAJO POLIMORFISMO
Punto de muestreo en viñedo
drástica disminución en la biodiversidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Patrón1 Viñedo S
1 49,9
2
16,7 100
3 16,7 100 61,5 85,7 60
•drástica disminución en la biodiversidad → 10 y 9 patrones
4 23,1 NS1 16,76 NS1 NS1
5
7,7
6 16,7 7,7
7 14,3
8
33 34
• sectores no aisló S.cerevisiae
•Algunos patrones estuvieron muy distribuidos
8 33,34
9
33,3 20
11
16,76 20
Punto de muestreo en viñedo
•Presencia diferentes sectores
•Población única por sector
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Patrón Viñedo CB
1
100 80
2
55,6 100 100 100
3
11,1
•presencia de cepas comerciales
4 11,1 NS1 NS1 1
5
22,2
6
42,9
7
57,1
8
208 20
9
100
• próximos a bodega
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
S
RESULTADOS S. cerevisiae
VIÑEDOS BAJO POLIMORFISMO
CB
C S
S
BAJO POLIMORFISMO
Transferencia de cepas de Sbodega a viñedos:
disminuyen la biodiversidad
EfluentesAlmacenamiento de orujos fuera de la bodega A d i ( i )Agua de riego (acequias)Abono con orujosVectores: moscas - vientos
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”
S
RESULTADOS
CB
C S
S
Transferencia de cepas de bodega a viñedos: afecta la biodiversidad Safecta la biodiversidad
P bl ió i d ióPoblación propia de región:
Viñedos cercanos CZNL
RESULTADOS
Viñedo Patrón P M F 13 5 9
FERMENTACIONES 13 5,9
20 33 26 33 27 33 28 11
C O SINDUSTRIALES
poblaciones diferentes en su mayoría carácter altamente polimórfico y variable
29 22 17,5 30 11 31 11 32 11
NL 33 34 11 75p y
5 a 21 patrones en cada una de ellas.
En cada etapa: 1 a 13 patrones diferentes.
NL 33 34 11,75 34 5,9 35c 5,9 36 5,9 37 5,9
sustitución de poblaciones
dinámica diferente en cada fermentación
38 5,9 39 11,75 40 5,9 41 5,9 42 5,9
no predominios: fermentaciones múltiples cepas
, 43 5,9 3 20 71,4 37,5 9b 60 14,3 12,5
S 10 20 14,3 12,5 11 25
La participación de las cepas del viñedo: escasa .
11 25 12 12,5
Presencia cepas comerciales: transferencia bodega Relaciones
moleculares
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS PCR
RELACIONES
interdelta
MOLECULARES
Agrupan diferente de acuerdo al marcador
RFLP ADNmit
RELACIONES COMPLEJAS
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS RELACIONES MOLECULARES
Agrupan diferente 1-4 clusters mantienen: =
sector o contiguo)
La mayor relación genética entre aislados de un
mismo sector o sectores contiguos de un mismo
viñedo.
Clusters viñedo/fermentación
Mayoría clusters combinados
Cepa de viñedo en fermentación: asocian a
viñedo o fermentación
Cepa comercial: separada /no
Se observó una estrecha relación molecular con
aisladas de viñedo y/o fermentación.
PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN “Zona Alta del Río Mendoza”
RESULTADOS
RELACIONES MOLECULARES
Población de POBLACIONES MUY RELACIONADAS la ZARM
¿Interrogantes….?•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada regiónCuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?
Los viñedos de la ZARM presentaron diferentes poblaciones de S. cerevisiae, tanto en número como en diversidad de patrones aislados, evidenciándose la existencia de viñedos de alto y bajo polimorfismoDentro de un mismo viñedo se observó una distribución muy heterogénea de l d
•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,
levaduras
N d id i l i t i dNo pudo evidenciarse la existencia de cepas distribuidas representativas de la región vitivinícola estudiada
Sólo población común a nivel área más pequeña
Población de MUCHAS cepas diferentes estrechamente relacionadasestrechamente relacionadas
¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad decolonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?
¿Interrogantes….?•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica c ál es la relación con s origen geográfico?geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?
•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,
•¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?
En general se evidenció una escasa presencia de levaduras comerciales en los viñedos, las cuales fueron más frecuentes en las fermentacionesfueron más frecuentes en las fermentaciones espontáneas conducidas en bodega.
Se evidenció una drástica disminución de la diversidad de levaduras en viñedos ubicados muy próximos a bodegas y una elevada y distribuida presencia de cepas comerciales en los mismos.p p
CONCLUSIONES
Las superficies de la bodega
albergan una población de S. cerevisiae tanto antes del inicio de las actividades de la temporada de vendimia como durante el transcurso de la misma y en temporadas consecutivas.
muestra una amplia diversidad y un comportamiento dinámico.
estas levaduras de bodega participan en las fermentaciones, siendo la contribución dependiente de las condiciones del mosto
CONCLUSIONES
Los viñedos de la ZARM presentan una población de S. cerevisiae muy polimórfica y p p y p y
aleatoriamente distribuida dentro de cada viñedo.
Cada viñedo alberga una población de S. cerevisiae única, sin
di t ib ió bi d t d t ió ló iuna distribución ubicua dentro de esta región agroecológica.
Los viñedos muy próximos a bodegas presentan una reducción
en la diversidad de las cepas de S. cerevisiae encontradas y
presencia de levaduras comerciales.
CONCLUSIONES
Las fermentaciones espontáneas conducidas en bodega se
d ll ú i bl d di á i ddesarrollan con un número variable de cepas y una dinámica de
sustitución de las mismas a lo largo de todo el proceso.
Sól l d l iñ d ti i d lSólo algunas cepas del viñedo participaron del proceso
fermentativo en diferentes proporciones.
Las poblaciones de S. cerevisiae presentes en cada viñedo
mostraron una estrecha relación genética.
Carrera de Doctorado en Ciencias Biológicas PROBIOLUniversidad Nacional de Cuyo
2009
Biodiversidad deBiodiversidad de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae en viñedos yen viñedos yBiodiversidad de Biodiversidad de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae en viñedos y en viñedos y bodegas de la región vitícola “Zona Alta del Río bodegas de la región vitícola “Zona Alta del Río
Mendoza”Mendoza”
Doctorando: Lic Laura Analía Mercado
MendozaMendoza
Doctorando: Lic. Laura Analía Mercado
Director: Dra. Mariana Combina
Co-Director: Dr. Ricardo W. MasuelliCo Director: Dr. Ricardo W. Masuelli