aislamiento de levaduras

AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE

MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE

FÚQUENE

MELISSA VANEGAS

MONICA ZAPATA PINEDA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTA DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá D.C



FÚQUENE

MELISSA VANEGAS

MONICA ZAPATA PINEDA

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al titulo de

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL



NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.



FÚQUENE

MELISSA VANEGAS MONICA ZAPATA PINEDA

APROBADO

Patricia Martínez Nieto Jorge Robles Camargo Directora Codirector Fundación Humedales Pontificia Universidad Javeriana

Henry Córdoba Erika Patricia MartínezPontificia Universidad Javeriana CORPOICA





FÚQUENE

MELISSA VANEGAS MONICA ZAPATA PINEDA

APROBADO

Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias Palacios MSc Decana Académica Directora de Carrera



AGRADECIMIENTOS

A nuestros padres por su apoyo

A la Fundación Humedales por permitirnos realizar el proyecto

A la Pontificia Universidad Javeriana en especial a la facultad de química por permitirnos el uso de los laboratorios y los reactivos necesarios para el desarrollo del proyecto.

A nuestra directora Patricia Martínez y codirector Jorge Robles por la colaboración durante la realización de esta investigación.

A Elizabeth Gil por la colaboración prestada en algunos ensayos realizados.

Al Dr. Jaime Bernal por su asesoría.

Al Hospital San Ignacio por permitirnos realizar la prueba de identificación de levaduras.

Y a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte de este proyecto y lograron su realización.

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

1. Introducción 1

2. Justificación y planteamiento del problema 2

3. Marco teórico 3

3.1. Laguna de Fúquene 3

3.2. Problema ambiental 3

3.3. Macrófitas contaminantes de la Laguna de Fúquene 3

3.3.1 Elodea (Egeria Densa) 3

3.3.2 Buchón de Agua (Eichhornia Crassipes) 4

3.3.3 Alternativas de disposición de las macrófitas 4

3.4 .Bioetanol 5

2.4.1. Producción de bioetanol 5

3.5. Hidrólisis 5

3.5.1. Hidrólisis química 6

3.5.1.1. Hidrólisis con ácidos concentrados 6

3.5.1.2. Hidrolisis con ácidos diluidos 6

3.6.1.3. Hidrólisis enzimática 6

3.6. Fermentación de los azúcares 7

3.7. Cuantificación de etanol 7

4. Objetivos 8

4.1. Objetivo general 8

4.2. Objetivos específicos 8

5. Metodología 9

5.1. Muestreo 9

5.2 Aislamiento de levaduras 9

5.3 Hidrólisis 9

5.3.1 Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético 9

5.3.2 Hidrólisis mixta 9

5.3.3 Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio 10

5.3.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus 10

5.3.5. Azucares reductores 10

5.3.6. Análisis de datos 10

5.4. Determinación de la producción de etanol 10

5.4.1. Prueba de yodoformo 10

5.4.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la 11

técnica del dicromato de potasio

5.4.3. Cromatografía de gases acoplada a masas 11

5.5. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras 11

6. Resultados y discusión 12

6.1. Muestreo y aislamiento 12

6.2. Hidrólisis 12

6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético 12

6.2.2. Hidrólisis mixta 14

6.2.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio 14

6.2.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus 16

6.3. Determinación de la producción de etanol 19

6.3.1. Prueba de yodoformo 19

6.3.2. Determinación semi-cuantitativa de la producción

de etanol por la técnica del dicromato de potasio 19

6.3.3. Cromatografía de gases acoplada a masas 22

6.4. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras 24

7. Conclusiones 26

8. Recomendaciones 27

9. Bibliografía 28

10. Anexos 37

LISTA DE FIGURAS Pág.

Figura 1. Concentación de azucares obtenidos en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamietnos de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos 12

Figura 2. Concentación de azúcares reductores en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamientos de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos 13

Figura 3.Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en buchón con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos 15

Figura 4. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en elodea con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos 15

Figura 5. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en buchón utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación 16

Figura 6. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en elodea utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación 17

Figura 7. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con buchón durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato 20 Figura 8. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con elodea durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato 21

Figura 9. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 30 en el medio hidrolizado con Pleurotus ostreatus, con un tiempo de retención 1.48 minutos 23

Figura 10. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 23a en el medio sin hidrólisis, con un tiempo de retención 1.48 minutos 24

LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en buchón 18

Tabla 2. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en elodea 18 Tabla 3. Identificación preliminar de las levaduras escogidas como mejores productoras de etanol por el método del yodoformo 25

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo 1. Composición de los medios de cultivo utilizados durante la fase experimental 37

Anexo 2. Curva patrón para al determinación de azucares reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) 39

Anexo 3. Curva patrón para la determinación de etanol por el método del dicromato de potasio 41

Anexo 4. Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo utilizado en la investigación 44

Anexo 5. Crecimiento de las levaduras escogidas en los medios hidrolizados y sin hidrólisis biológica 45

Anexo 6. Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis acida (H2SO4) 47

Anexo 7.Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis alcalina (NaOH 5%) 51

Anexo 8. Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus 53

Anexo 9. Resultados de los controles de la prueba cualitativa para la determinación de etanol (yodoformo) 55

Anexo 10. Producción de etanol por la prueba cualitativa de yodoformo y comparación de los resultados con el crecimiento en buchón o elodea como única fuente de carbono. 57

Anexo 11.Análisis estadístico de la determinación de etanol por la prueba del dicromato de potasio 59 Anexo 12.Identificación presuntiva de las 13 cepas de levaduras escogidas como mejores productoras de etanol 61

RESUMEN

En el presente estudio se investigó la capacidad de las levaduras aisladas de la laguna de Fúquene para la producción de etanol, utilizando como sustrato el buchón de agua (Eichhornia crassipes) y la elodea (Egeria densa), mediante una técnica cualitativa (prueba de yodoformo), semicuantitativa (dicromato de potasio) y cromatografía de gases acoplada a masas.

Cuarenta y nueve levaduras fueron aisladas y se identificaron las 13 cepas que presentaron un sobrenadante amarillo laminado característico de etanol en la prueba de yodoformo. Estas cepas se acercaron bioquímicamente a los géneros Candida sp, Brettanomyces sp�� y Hansenula sp. Adicionalmente, se realizaron 3 pre-tratamientos hidrolíticos (ácido, alcalino y biológico) a los sustratos vegetales estudiados (determinando la cantidad de azucares reductores por el método de DNS), encontrando una mayor cantidad de azucares liberados en g/L con el tratamiento biológico (Pleurotus ostreatus) a un nivel de significancia de 0.01. Lo anterior permitió escoger este método hidrolíticos para adecuar los sustratos para la producción de etanol

A partir de esto se realizó un diseño al azar inoculando las mejores levaduras productoras de etanol (escogidas mediante una prueba cualitativa de yodoformo) en los medios específicos de buchón y elodea con el pretratamiento biológico y sin pretratamiento. La concentración de etanol fue determinada a las 24 y 48 horas de cultivo por la prueba del dicromato de potasio; al igual que las concentraciones de azucares y la cantidad de células/ml. Al final de la fermentación se determinó que las levaduras que mayores concentraciones de etanol produjeron con este método fueron C. albicans en medio hidrolizado de buchón (54.97 g/L) y C. lusitaniae en medio hidrolizado de elodea (37.80 g/L�. A partir de esto se realizó una cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas de estas levaduras, donde se comprobó la producción de etanol en los medios hidrolizados y no hidrolizados con un tiempo de retención del catión molecular de 1.48 minutos.

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1. INTRODUCCION

La laguna de Fúquene es una importante fuente hídrica para los departamentos de Boyacá y Cundinamarca; lamentablemente está desapareciendo, debido a la eutroficación producida por la contaminación proveniente de desechos agrícolas, ganaderos y de aguas residuales. Estos desechos contienen alta concentración de nitrógeno (N), fósforo (P) y materia orgánica, promoviendo el crecimiento de plantas acuáticas como buchón de agua y elodea brasilera, que están deteriorando conjuntamente con otros factores el ecosistema y reduciendo el espejo de agua.

A partir de este problema, los pescadores de la Asociación “Los Fundadores” con el apoyo de La Fundación Humedales, el Instituto de Desarrollo Rural -ICONDER- y la Corporación Andina de Fomento –CAF-,empezaron a utilizar como materia prima los desechos de las malezas acuáticas en la producción de abono orgánico. Pero, a pesar de ser efectivo, controla solo parcialmente la problemática de la disposición final de estos desechos, ya que la cantidad de buchón de agua destinada para la producción de bioabono es solo una pequeña proporción comparado con la cantidad extraída mensualmente de material vegetal.

Estudios recientes han empleado el buchón de agua, principalmente, en la producción de papel y biocombustible (bioetanol). El Jacinto de agua o buchón es un excelente candidato como materia prima para los anteriores procesos debido a su contenido de celulosa. La celulosa se hidroliza por acción química o enzimática produciendo azucares que se fermentan posteriormente a etanol. El empleo de esta planta acuática como sustrato puede disminuir la problemática que se presenta en la laguna Fúquene y otras lagunas colombianas con el mismo problema de infestación, y reducir los costos de producción de este biocombustible, ya que el buchón de agua presenta un rápido crecimiento, es de fácil cultivo y propagación.

Por lo anterior esta investigación pretende aislar levaduras procedentes de la laguna de Fúquene capaces de producir alcohol a partir de las plantas acuáticas invasoras, buchón de agua y elodea, como punto de partida en la búsqueda de alternativas para solucionar la disposición final de estas plantas acuáticas una vez extraídas de la laguna de Fúquene y mejorar la calidad de vida de los pescadores de la zona.

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2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIETO DEL PROBLEMA

La laguna de Fúquene constituye una fuente de sustento y seguridad alimentaria para más de 200 familias, muchas de ellas dedicadas a la pesca artesanal; que junto con la agricultura se constituyen en dos campos de donde proceden los ingresos de las mismas. Desafortunadamente en la laguna por causa de la contaminación se acumulan grandes cantidades de nutrientes que permiten el crecimiento de maleza acuática como buchón de agua y elodea. Estas plantas generan eutroficación en la laguna y crea no solo un gran impacto medioambiental, sino también un problema socio económico ya que muchas familias de pescadores dependen de ella (Fundación Humedales, 2001; Cruz, 2004; Estrada et al., 2004)

Estudios recientes han demostrado que el buchón de agua puede ser una opción viable como sustrato para la producción de biocombustible y aunque hasta el momento no se han encontrado estudios reportados para la macrófita elodea, dado el rápido crecimiento y fácil obtención de la laguna, podría ser una alternativa económicamente sustentable y amigable con el medio. Lo anterior debido a que no solo se disminuye la biomasa extraída de la laguna, sino también se contribuye a control de las emisiones de gases tóxicos a la atmosfera por parte de los combustibles provenientes del petróleo (García, et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya, et al2007).

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3. MARCO TEORICO

3.1. Laguna de Fúquene La laguna de Fúquene, se ubica en el sistema hídrico de los ríos Ubaté y Suárez en el departamento de Cundinamarca, con una altitud de 2539 m. Esta laguna tiene una superficie total de 3150 ha, un volumen de 50 millones de m3 y una profundidad media de 2 m (Japan International Cooperation Agency-JICA-, 2000; Ministerio del Medio Ambiente, 2002; Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca -CAR-, 2009). La laguna posee una alta biodiversidad, con una fauna de 91 especies de vertebrados (mamíferos, aves, peces), y hace parte de los humedales del altiplano de Cundinamarca y Boyacá, que son centro de diversidad biológica y endemismo de la biota de agua dulce Andina, más importante del Norte de Suramérica (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial -MAVDT-, et al 2006; Valderrama, 2007).

Esta importante red hídrica soporta una población de más de 200 mil habitantes que viven de la ganadería, la agricultura, la minería, el desarrollo agroindustrial y la pesca; siendo esta ultima una fuente de seguridad alimentaria (Instituto Colombiano para el Desarrollo Rural-INCODER-, 2009). Otro importante servicio ambiental radica en que el complejo de humedales es fuente de agua para el consumo de más de 70,000 personas y como proveedor para el sistema de riego, sobre el cual se basa una de las industrias lecheras más prósperas del país (Maya y Castillo, 2005; Fundación Humedales, 2008).

3.2. Problema ambiental Hoy día, el avance de la frontera agrícola continúa siendo una de las principales causas de la disminución del 70% de la extensión de la laguna. Actualmente hay más de 21.000 hectáreas sembradas con cereales, maíz, arveja y fríjol y la situación se agrava con la ganadería extensiva en ladera e intensiva en la zona plana. Además se usan fertilizantes químicos para adaptar la zona a la actividad agropecuaria y varios concentrados, sales y otros suplementos, cuyos residuos van a parar a la laguna al igual que las excretas (Tognetti, 2006).

Ademas lo anterior, la explotación minera de carbón que saca más de 763.000 toneladas del mineral al año y el desarrollo urbano, le descarga a la laguna las aguas residuales domésticas e industriales de los habitantes de 14 municipios (CAR, 2000 y 2009). El alto deterioro de este cuerpo de agua esta representado en los excesivos niveles de fosfatos y nitratos agregados por el sector ganadero y agricultor, así como la proliferación de plantas acuáticas como buchón de agua y la elodea, que han acelerado procesos de eutroficación y por consiguiente de desecación de la laguna. El espejo de agua se ha reducido considerablemente haciendo imposible la navegación (Fundación Humedales, 2008).

3.3. Macrófitas contaminantes de la laguna de Fúquene3.3.1. Elodea (Egeria densa) Esta planta se conoce comúnmente como Elodea, y científicamente como Egeria densa, de la Familia Hidrocharitaceae. Es una de las plantas acuáticas más comunes, originaria de Sudamérica y América central que se caracteriza por su rápido crecimiento (Morgan, 2009). Es una planta que puede estar tanto enraizada en el sustrato como flotante, además es una gran consumidora de nutrientes y tiene la ventaja debido a su rápido crecimiento que desprende una sustancia antibiótica que ayuda a evitar el crecimiento de las algas verde-azuladas. Al mismo tiempo consume tantos nutrientes que evita la aparición de otros tipos de algas (Feijo et al., 1993; Calixto y Del Basto, 2005). La planta vive enteramente bajo el agua, salvo sus pequeñas flores que flotan unidas a la planta por delicados tallos (Feijoó et al., 2002). En el verano, se desprenden hijuelos de la planta madre, que luego enraíza, y comienza una nueva planta, formando grupos densos que cubre a los invertebrados acuáticos, peces y anfibios.

Esta planta afecta el movimiento del agua, su calidad y el uso para la pesca, navegación y recreación. (Dirección General de Aguas-DGA- et al., 2005). Al igual que otros hidrófitos de crecimiento laminar-tapizante, la explosión demográfica de esta especie produce desajustes ecosistemáticos, como condiciones de anoxia, eutroficación, alteración del ciclo de los nutrientes, reducción de la penetración lumínica y desplazamiento de especies nativas (Dillon

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et al., 1988). Además, su crecimiento puede dar lugar a obstrucciones de conductos y canalizaciones con la consiguiente pérdida económica para los sectores perjudicados (Ozbay, 2001; The Nature Conservancy of Vermont, 2003)

En nuestro país se encuentran varios cuerpos de agua con invasión de macrófitas acuáticas en Cundinamarca y Boyacá como la laguna de Fúquene, Tota. Sochagota y Palagua (Ramsar, 2008).

3.3.2. Buchón de agua (Eichhornia crassipes) Esta planta se conoce con el nombre de Buchón, Jacinto o Lirio de agua y científicamente como Eichhornia crassipes, de la Familia Ponteridaceae (Petrell y Bagnall, 1991). Puede vivir en aguas duras o blandas con temperaturas de 15 a 30°C, rangos de pH amplios, de 5.5 a 9.0, e iluminación alta o muy alta. Puede alcanzar un diámetro de 30 cm y una altura de 20 cm. Posee hojas en rosetón, peciolos cortos hinchados casi bulbosos, flores vistosas grandes en forma de espiga y de color violeta o azul claro (Schouben, 2005; Masterson, 2007).

El Buchón de agua es una planta de crecimiento rápido que flota sobre la superficie del agua ofreciendo un excelente refugio para los peces y protegiéndolos del sol excesivo y las heladas; sus extensas raíces cuelgan por debajo, donde pueden alcanzar la altura de un metro o más; en estas condiciones su crecimiento se caracteriza por formar masas compactas que son arrastradas por el viento (Aweke, 1993). Estas grandes masas pueden ocasionar problemas en los cuerpos de agua como: Reducción de la biodiversidad, obstrucción de los ríos y alcantarillado interfiriendo físicamente con la navegación, el flujo del agua y las actividades de pesca. Estos bloques compactos toman la luz del sol, impidiendo el desarrollo del fitoplancton, que son básicos en las cadenas alimenticias acuáticas, disminuyen el oxigeno disuelto producido normalmente por las plantas acuáticas sumergidas. Así como alteración en la química del agua (Ozimek et al.1993; Schouben, 2005).

Son consideradas entre las 100 especies más invasoras del mundo por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) ya que pueden obstruir en poco tiempo una vía fluvial o lacustre (Sáenz, 2003). Tiene la capacidad de absorber nutrientes (N, P, Ca, K, entre otros) de los cuerpos de agua, los cuales normalmente se pierden. Como consecuencia de su proliferación en ríos y lagos importantes, están causando problemas en canales de riego agrícolas y afecciones a los ecosistemas ribereños; ya que cubre como una manta toda la superficie del río, por su fácil reproducción vegetativa y sexual (Gunnarsson y Petersen, 2007). Además es una especie sin predadores, ni competidores en muchos sitios (Schouben, 2005; Valderrama, 2007)

3.3.3. Alternativas para la disposición de las macrófitas El buchón de agua se ha convertido en un sustrato para el proceso de compostaje como una alternativa de gestión al problema generado por la disposición final en Colombia y otros países del mundo (Eslava y García, 2001; Fundación Humedales y Netherlands Antilles Healthy Islands Foundation, 2004; Cruz, 2004; Calixto y Del Basto, 2005; Martínez-Nieto, 2004, 2006 y 2007; Palacios, 2007; Fundación Humedales, 2008). Otros usos que se le han dado a esta planta es su utilización para la fabricación de pulpa de papel, a nivel veterinario la alimentación de aves de corral, en la fabricación de muebles y bolsos, como fuente de medicamentos, entre otros. Esta macrófita puede ser económicamente procesada para generar humus de lombriz, biogás y es comúnmente usada en el reciclaje de aguas, ya que contribuye en la reducción del DQO, sólidos solubles, nitritos, fosfatos y potasio principalmente (Abraham y Kurup, 1996; Sharma et al., 1999; Gajalakshmi et al., 2001; Nigam, 2002; Singhal y Rai, 2003; Martínez-Nieto, 2006; Gunnarsson y Petersen, 2007; Palacios, 2007).

Se ha buscado otras disposiciones finales para el buchón de agua dentro de los cuales esta la utilización de estos residuos como materia prima para la industria papelera, por el manejo ecológico de los procesos bajo el esquema de producción más limpia compatible con los ecosistemas. Además está la utilización de este como filtro biológico para la remoción de contaminantes orgánicos e inorgánicos y otras sustancias tóxicas, y la producción de biocombustible como el etanol (Gajalakshmi et al., 2001; Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Lara et al., 2007).

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3.4. Bioetanol El alcohol etílico o etanol es un producto químico obtenido a partir de la fermentación de los azúcares que se encuentran en los productos vegetales, tales como cereales, remolacha, caña de azúcar, sorgo o biomasa. Cuando se produce por la fermentación de los azúcares contenidos en la materia orgánica de las plantas, se denomina bioetanol o etanol de biomasa (Hernández, 2001; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007 y Corporación Colombiana Agropecuaria -CORPOICA, 2009). Para la fabricación de este, se puede utilizar una gran cantidad de materias primas como almidón de maíz, cereales, remolacha o residuos forestales (Gray et al., 2006). El buchón de agua se ha considerado como posible substrato para la producción de etanol ya que tienen una ventaja por su rápido crecimiento y obtención a bajo costo (García et al., 2006; Masami et al., 2008; Mishima et al., 2008).

El combustible bioetanol se emplea como alternativa para disminuir la dependencia de las importaciones de crudo y minimizar el impacto que las fluctuaciones del mercado ocasionan en los precios (Inga, 2009). Adicionalmente a esto, la preocupación actual por el cambio climático debido a las emisiones de los gases del efecto invernadero, ha generado la búsqueda de prácticas que sean más compatibles con el medio ambiente (Kafarov et al., 2006). Por ejemplo se puede mezclar la gasolina con bioetanol, ya que las emisiones de gases tóxicos a la atmosfera por la utilización de etanol es mucho más baja que las emisiones generadas por el petróleo y sus derivados fundamentalmente disminuyen la emisión de óxidos de azufre y nitrógeno (Nigam, 2002; Isarankura-Na-Ayudhya et al., 2007; Masami et al., 2008). Concretamente, emiten un 88% menos de emisiones de dióxido de carbono (CO2) a la atmósfera; sin embargo, su proceso de fabricación supone un gran esfuerzo para producir moléculas de azúcar simple que se consigue por el calentamiento de la biomasa o el tratamiento con ácidos (Campo, 2006; Linde, 2006; Kumar, 2009).

En la actualidad se trabaja fundamentalmente en la búsqueda de materias primas baratas, que sustituyan a las tradicionales materias azucaradas, como melazas para alcanzar mayor eficiencia en los procesos de fermentación, recuperación y purificación de alcohol producido (Hernández, 2001 y Miliarium Aureum, 2004). A raíz de esto se empezó a utilizar como materia prima la biomasa vegetal, desechos agrícolas o madereros, para producir alcohol, denominado de segunda generación (González, 2008).

3.4.1 Producción de BioetanolEn la naturaleza, este proceso es llevado a cabo por diferentes organismos que usan enzimas para “liberar” el azúcar contenido en la celulosa como algunos géneros bacterianos como Clostridium sp y Zymommonas sp que fermentan los azúcares y los transforman en alcohol (Inga, 2009).

Los residuos vegetales contienen una mezcla compleja de carbohidratos como celulosa, hemicelulosa y lignina que son llevados hasta etanol por acción enzimática (Nigam, 2002; Bon et al, 2007; Masami et al., 2008). Las celulosas no pueden ser fermentadas directamente, es necesario degradarlas a azucares más sencillos (García et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya et al; 2007). Para esto se utilizan pre tratamientos de hidrólisis con ácidos concentrados, diluidos y la hidrólisis enzimática (Miliarium Aureum, 2004; Kovacs, 2009).

Los materiales para producir etanol que se encuentran disponibles en gran cantidad y bajo costo son los lignocelulósicos, su empleo podría reducir costes de producción (Angenent, 2007; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007). Una fuente lignocelulolìtica es el buchón de agua, considerada maleza acuática, que puede ser empleada en la producción de biocombustible, ya que puede proporcionar los azucares necesarios para la bioconversión a etanol (Abraham y Kurup, 1996; Nigam, 2007; Misami et al., 2008).

3.5. Hidrólisis La biomasa lignocelulósica presenta una estructura compleja compuesta de tres fracciones (celulosa, hemicelulosa y lignina) que deben ser procesadas. La fracción mayoritaria de esta biomasa es la celulosa cristalina, que debido a su estructura química se dificulta su hidrólisis y conversión a azúcares fermentables (Reese, 1955; Angenent, 2007; Kovacs, 2009). Por el contrario la hemicelulosa es fácilmente hidrolizable, pero su carbohidrato principal, la xilosa, es

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difícil de fermentar a alcohol. Por último la lignina, no puede convertirse en etanol, porque no es un carbohidrato, sino un polímero rígido aromático.

Mediante un proceso químico (hidrólisis) que divide la celulosa y la hemicelulosa por acción de la molécula de agua en medio ácido, en moléculas más pequeñas, se logra una solución azucarada. La hidrólisis permite también eliminar productos de la descomposición que puede tener efectos desfavorables durante la fermentación como el furfural e hidroximetilfurfural (Bon y Ferrara 1996; Miliarium Aureum, 2004; Campo, 2006; García, et al., 2006).

3.5.1. Hidrolisis química 3.5.1.2 Hidrólisis con ácidos concentrados En este proceso se añade ácido sulfúrico a la biomasa seca a una temperatura controlada de 50ºC. Después se añade agua para diluir el ácido de la mezcla, aumentando la temperatura hasta 100ºC. El producto de este proceso se prensa para posteriormente separar la mezcla de ácido y azucares (Badger, 2002; García, et al., 2006).La principal ventaja del proceso de concentración es la alta eficiencia de recuperación del azúcar, que puede ser en el orden de más del 90% de los azúcares de la hemicelulosa y celulosa. Desafortunadamente, es un proceso relativamente lento y costoso en cuanto a la recuperación del ácido. Si este no es recuperado, se deben utilizar grandes cantidades de cal para neutralizar el ácido en la solución de azúcar, lo cual crea gastos adicionales, por lo que industrialmente no se realiza (Badger, 2002).

3.5.1.3 Hidrólisis con ácidos diluidos Esta es la hidrólisis más empleada y se realiza mezclando la biomasa con una proporción de ácido sulfúrico de 0.7% o 1% para hidrolizar la hemicelulosa a 190ºC. Para hidrolizar la celulosa que es más resistente se usa ácido sulfúrico al 0.4% y 215ºC. Finalmente el producto hidrolizado se neutraliza y recupera mediante percolación (García et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya et al., 2007).

La mayoría de los procesos de diluir el ácido se limitan a una eficiencia de recuperación de azúcar de alrededor del 50% (Badger, 2002); ya que en la primera reacción convierte los materiales celulósicos en azúcar y la segunda convierte los azúcares a otros productos químicos (Biocombustibles, 2007). La mayoría de los otros productos son el furfural (un producto químico utilizado en la industria del plástico) que puede ser tóxico para los microorganismos empleados en la fermentación (Campo et al., 2006).

La mayor ventaja de los procesos que utilizan el ácido diluido es su rápida tasa de reacción, que facilita la continua transformación. Su mayor desventaja es su bajo rendimiento en azúcar. Para procesos rápidos y continuos, a fin de permitir la penetración del ácido, las materias primas deberán reducirse en tamaño, de manera que la dimensión máxima de las partículas está en el rango de unos pocos milímetros (Badger, 2002).

3.5.2. Hidrólisis enzimática Consiste en transformar la celulosa en azucares de menor peso molecular por la acción de enzimas llamadas celulasas, para que los microorganismos como levaduras o bacterias puedan producir etanol (Reese, 1955). En síntesis, el proceso consiste en descomponer la celulosa y la hemicelulosa del residuo, en azúcares sencillos y transformarlos en etanol por fermentación. En primer lugar se lleva a cabo un pretratamiento del residuo cuyo objetivo es alcanzar los mejores resultados en las etapas siguientes (hidrólisis y fermentación) (Gray et al., 2006). Como resultado del pretratamiento se obtiene una disolución de azúcares provenientes de la ruptura de la hemicelulosa y un residuo sólido (constituido principalmente por la celulosa del residuo original) (Kovacs et al., 2009).

Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen enzima celulasa extracelular capaz de hidrolizar la celulosa (Chacón y Waliszewski, 2005).

A partir de los hongos aeróbicos se han obtenido los complejos celulolíticos utilizados en la mayoría de los estudios (Eriksson y Wood 1985), debido a que son capaces de degradar la celulosa, la hemicelulosa y la lignina por un complejo de enzimas hidrolíticas y oxidativas (Gosh y Gosh, 1992). Entre los otros microorganismos productores del complejo enzimático, los

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termofílicos son de interés por su capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones severas, incluso en niveles de pH altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed y Bayer 1988; Nigam, 2002).

La hidrólisis enzimática es un proceso que presenta ventajas frente a la hidrólisis química, como bajos costos, mayor rendimiento y la no utilización de agentes químicos (García et al., 2006; Mishima et al., 2006; Bon et al., 2007;). Además la producción de subproductos puede ser controlada y las necesidades de energía son relativamente bajas (Badger, 2002; Bell y Attfield, 2007).

3.6. Fermentación de los azúcares Este proceso es llevado a cabo por microorganismos como las levaduras, bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos que fermentan los azucares liberados del pretratamiento. Gracias a la enzima invertasa presente en las levaduras los azucares se convierten en glucosa y fructosa (Hernández, 2001; Inga, 2009). Estas a su vez reaccionan con otra enzima llamada zimasa, que también está presente en la levadura para producir el etanol y dióxido de carbono (Miliarium Aureum, 2004; Garcia et al.,2006; Masami et al.,2008).

3.7. Cuantificación de etanol Existen varios métodos para medir la concentración de etanol. Están los métodos químicos de oxidación simple como la prueba del dicromato de potasio, permanganato, cobre y la prueba del yodoformo. También hay métodos enzimáticos (alcohol oxidasa), de inmunoensayo (atenuación de la energía radiante) y los cromatográficos en fase gaseosa que utilizan columnas de acero inoxidable o vidrio y HPLC (Rovida, et al. 1984; Taylor, et al.1984; Sharma y Quantrill, 1994; Fletcher y Van Staden, 2003; Machinski et al, 2003; Machinski y Nishiyama, 2003; Universidad Nacional de la Plata, 2009). Al igual se encuentran los métodos de picnómetria y refractometria (Masson, 1997; Morrison y Boyd, 1998; Matiz, 2002).

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General Aislar de la laguna de Fúquene cepas nativas de levaduras capaces de producir alcohol a partir de Jacinto o Buchón de agua (Eichhornia crassipes) y/o Elodea brasilera (Egeria densa) como primer paso en la búsqueda de alternativas sostenibles para solucionar la disposición final de esta macrófitas extraídas mecánicamente de la laguna de Fúquene.

4.2. Objetivos específicos • Obtener de la laguna de Fúquene cepas nativas de levaduras que utilicen el buchón y/o

elodea (con o sin pretratamiento de hidrólisis de carbohidratos) como fuente de carbono.

• Escoger las levaduras nativas que produzcan alcohol a partir de la utilización de las macrófitas acuáticas extraídas de la laguna de Fúquene.

• Caracterizar a un nivel taxonómico preliminar las levaduras que produjeron alcohol a partir de buchón de agua y elodea, especies contaminantes de la laguna de Fúquene.

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5. METODOLOGIA

5.1. MuestreoSe escogieron 5 puntos dentro de la extensión de la laguna de Fúquene y se tomaron 3 muestras de agua en cada uno, para un total de 15 muestras. En cada punto se midieron las características fisicoquímicas con sonda multiparámetro, en cuanto a temperatura, pH, conductividad y sólidos disueltos; al igual se midieron parámetros como la profundidad, olor y color. Los puntos fueron georeferenciados con un sistema de Global Position System (GPS), marca GARMIN NUVI 200w suministrado por la Fundación Humedales y a la Asociación de pescadores de Fúquene “Los Fundadores”.

En dos de los sitios muestreados, además se recolectaron muestras por triplicado de las plantas acuáticas buchón y elodea y adicionalmente se tomaron muestras de suelo y compost a un Km en inmediaciones a la laguna de Fuquene del embarcadero en la vereda Guatancuy del municipio de Fúquene.

5.2. Aislamiento de levadurasUn volumen de 5 mL de las 15 muestras de agua obtenidas de la laguna de Fúquene se sembraron en los medios líquidos melaza, YGC, soya-malta, arroz, buchón (Anexo 1). Este mismo procedimiento se llevo a cabo con 5 g. de las muestras sólidas (buchón, elodea, suelo y compost) que fueron agregados a los seis medios descritos anteriormente. Los medios fueron incubados a temperatura ambiente y a las 48 horas se realizó coloración de Gram para comprobar el crecimiento. Al observar crecimiento en las muestras se realizaron pases a medios sólidos para su aislamiento y se les asignó una denominación consecutiva. A las colonias sospechosas compatibles con morfología de levaduras, se les realizó coloración de Gram y se sembraron en medios de cultivo YGC y Sabouraud hasta su purificación.

5.3. Hidrólisis Este procedimiento se realizo como pretratamiento de las macrófitas Jacinto de agua y Elodea brasilera para liberar los azucares contenidos en la pared celular de buchón de agua y elodea mediante los tipos de hidrolisis acida, alcalina y biológica.

5.3.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético Suspensiones en agua destilada de las macrófitas, buchón y la elodea, en una proporción 1:9 m/v, sometidas o no a filtración previa, fueron hidrolizadas con ácido sulfúrico (Masami et al., 2007) o peracético (Abraham y Kurup, 1996), según el método utilizado. En el primer procedimiento se utilizaron soluciones de ácido sulfúrico en tres Concentraciones (2%, 1% y 0,5% m/v), las cuales se mezclaron con las suspensiones de buchón y elodea (con y sin filtración previa) en proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 v/v. Cada mezcla se sometió a esterilización por autoclave a 121ºC, evaluando dos tiempos diferentes 30 y 60 min. Este procedimiento se realizó por triplicado y las unidades experimentales fueron neutralizadas por adición gota a gota de hidróxido de sodio al 10% m/v. La distribución de este diseño fue completamente al azar con arreglo factorial teniendo como factores el tratamiento del sustrato, la concentración del ácido sulfúrico, mezcla sustrato y tiempo de esterilización; con tres repeticiones por tratamiento y un total de 216 unidades experimentales.

El otro método de hidrólisis acida se llevó a cabo hirviendo 10 g del buchón o la elodea lavados y cortados con 100mL de ácido peracético a 100ºC durante 30 minutos. Posteriormente se realizaron lavados con agua destilada hasta que el agua estuviera neutra y el buchón se llevo a 80º C durante toda la noche (Abraham y Kurup, 1996., Masami et al, 2007). 5.3.2. Hidrólisis mixta Para la hidrólisis mixta el buchón y la elodea fueron secados previamente en horno a 105ºC durante 24 horas. Posteriormente, una cantidad del buchón o la elodea secos fueron mezclados por triplicado a una relación 1:8 en ácido sulfúrico al 1% m/v, la mezcla se agitó por 7 horas en agitador magnético a 250 rpm y temperatura ambiente. Esta mezcla se filtró y se lavó con agua caliente a 60ºC y luego se calentó la mezcla de filtrado más agua de lavado a

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100ºC durante 15 minutos y se llevó a un pH de 10 con hidróxido de calcio sólido en combinación con sulfito de sodio 0,1%. La mezcla se neutralizó con ácido sulfúrico 1N hasta pH 6.0 (Nigam, 2002).

5.3.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio Se realizaron dos tratamientos de hidrólisis alcalina utilizando hidróxido de sodio al 5 y 10 % m/v. En uno de ellos, se tomaron suspensiones de buchón y de elodea para mezclarlas por triplicado con Hidróxido de sodio 5% m/v para llegar a proporciones 1:1, 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 v/v; las cuales, se esterilizaron a dos diferentes tiempos, 30 y 60 minutos. Las muestras se neutralizaron mediante lavados con agua. Este procedimiento se baso en la metodología propuesta por Isarankura (2007). El otro método de hidrólisis química alcalina se realizo utilizando una relación macrófita: solución de hidróxido de sodio 10 % de 1:10 (gramos de buchón o elodea en una solución de Hidróxido de sodio 10% m/v). La mezcla se esterilizo en autoclave a 121 ºC por 30 minutos, luego se filtro y lavo con agua destilada hasta su neutralidad. El filtrado de buchón o elodea fue secado durante toda la noche a 80ºC (Abraham y Kurup, 1996). La distribución de este diseño fue completamente al azar teniendo como tratamientos la mezcla de sustratos e hidróxido de sodio y el tiempo de esterilización; con tres repeticiones para un total de 36 unidades experimentales.

5.3.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus (suministrado por al empresa Champinfung LTDA)

El hongo Pleurotus ostreatus se sembró en aserrín, sustrato utilizado comúnmente para la producción industrial de orellanas (Martínez-Nieto, 2009 com. pers.). Una vez invadido el medio por el micelio blanco característico de este género, el hongo estuvo listo para ser empleado en los ensayos de hidrólisis.

Se preparó un medio liquido con extracto de malta, aserrín, buchón o elodea, y se distribuyo un volumen de 45mL en frascos de vidrio, los cuales fueron inoculados con 0.9g, 2.7g y 4.5g del hongo Pleurotus ostreatus. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada tratamiento con distribución completamente al azar y la incubación se hizo a temperatura ambiente.

5.3.5. Azúcares reductores A Todos los tratamientos de las diferentes hidrólisis y sus repeticiones, se les determinó la concentración de azucares reductores expresada en gramo/litro (g/L) por el método del ácido dinitrosalicilico (Anexo 2) descrito por Miller (1959) a temperatura ambiente. En la hidrólisis biológica se tomaron lecturas de azucares reductores a los 5, 7, 10, 11, 12 y 13 días de incubación del hongo a diferentes Concentraciones; mientras que, en los otros procedimientos se realizo el análisis al finalizar el tratamiento.

5.3.6. Análisis de datos Los resultados de la hidrólisis con ácido sulfúrico se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza con arreglo factorial a un nivel de significancia de 0.01. Los datos obtenidos de azúcares reductores en la hidrólisis alcalina con NaOH 5%m/v y biológica fueron analizados mediante análisis de varianza de dos factores con 0.05 de significancia. Las diferencias entre tratamientos se determinaron mediante el test de rango múltiple de Duncan con un nivel de significancia de 0.01 y 0.05 para así poder escoger el mejor tratamiento. La comparación final de los tratamientos de hidrólisis se realizó mediante un análisis de varianza de una sola vía (� 0.01) y Test de rango múltiple de Duncan para las diferencias entre tratamientos.

5.4. Determinación de la producción de etanol 5.4.1. Prueba del yodoformo Se determinó cualitativamente la producción de etanol por las levaduras aisladas mediante el método de yodoformo (Griffin, 1981; Morrison, 1998; Hill et al, 2000) en medios, YGC, Buchón y Elodea sin hidrolisis (Anexo 1). Este consiste en agregar a 5ml del medio de cultivo con crecimiento de levaduras durante 48 horas, 2ml de hidróxido de sodio 10%m/v y 3 ml de lugol (I2-Kl) lentamente, esta mezcla se dejar reposar por 5min y si hay presencia de etanol se observa un precipitado amarillo correspondiente a la formación de yodoformo. Para poder

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establecer diferencias en la formación del precipitado se prepararon controles de etanol así como de otras sustancias que pudieran reaccionar con el reactivo o producirse durante la fermentación alcohólica, como metanol, butanol, isobutanol, acetato de etilo, glicerol, alcohol amílico, acetona, acetaldehído, alcohol isopropílico y fenol. Las proporciones utilizadas de los controles fueron 1:1, 1:9, 1:99 (volumen de etanol u otras sustancias en volumen de medio de cultivo estéril). La interpretación se hizo por cruces, otorgando cuatro cruces al precipitado presentado en la mayor proporción 1:1 de etanol en el medio de cultivo respectivo y una cruz para la proporción menor de 1:99. 5.4.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la técnica del dicromato de potasio Después de escoger el mejor método de hidrólisis a un nivel de significancia de 0.01, y las posible levaduras productoras de etanol a partir de buchón o elodea con el método del yodoformo; se procedió a determinar semi-cuantitativamente la producción del alcohol por el método de dicromato de potasio (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Oviedo, 2009) mediante dos diseños completamente al azar (uno para buchón y otro para elodea). Estos diseños tenían como tratamientos dos medios inoculados con las mejores levaduras escogidas de buchón o elodea y su respectivos controles sin inocular; con tres repeticiones, para un total de 48 unidades experimentales para buchón y 42 unidades experimentales para elodea. Se utilizaron como medios de cultivo, preparaciones de buchón o de elodea con pretratamiento hidrolítico (el mejor método de hidrólisis) y las suspensiones de las macrófitas sin ninguna clase de pre tratamiento hidrolítico. La técnica de dicromato consiste en tomar 2 mL de medio crecido de levaduras (centrifugado a 3200rpm durante 30 minutos) y mezclarlo con 2 mL de una solución oxidante de dicromato de potasio (anexo 3) La mezcla se homogenizó en vórtex a 1500 rpm y se calentó en baño termostatado de 80-85 °C, por 30 min. Se enfrío a t emperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 440 nm y se interpoló en la curva de calibración (Anexo 3), reportando el valor de etanol en g/L en dos tiempos 24 y 48 horas (Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Zumaqué, 2009). Otras variables que se determinaron fueron azúcares reductores (g/L) por el método DNS (Miller, 1959) y recuento celular en cámara de Neubauer para determinar el consumo de azucares y el aumento de biomasa. Mediante la prueba semi-cuantitativa de dicromato se escogieron las dos mejores levaduras posibles productoras de etanol, una en el diseño con buchón y otra con elodea, para realizar cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas y determinar presencia de etanol.

5.4.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas Al caldo de cultivo con las dos levaduras escogidas por la metodología anterior, se les realizo una determinación por cromatografía de gases acoplada espectrómetro de masas en un equipo Agilent Technologer 6850 series lll, con columna HP5MS apolar de 30 metros, utilizando como gas de arrastre helio y una temperatura del inyector de 250ºC. El fin de esta prueba fue comprobar la presencia de etanol en el ensayo.

5.5. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras Las trece levaduras escogidas para el ensayo semicuantitativo utilizando la técnica del dicromato de potasio, se identificaron preliminarmente teniendo en cuenta las características macroscópicas en medios Sabouraud, agar tabaco y Malta-Glucosa; y la formación de estructuras microscópicas características en medios harina de maíz y Caldo leche. Además se determinó el crecimiento en caldo YGC a diferentes temperaturas 0º, 37º y 42ºC y Concentraciones de cloruro de sodio de 10% y 16%; como en agar malta glucosa al 50 % y agar malta sal glucosa (Anexo1). Posteriormente se evaluó el crecimiento y asimilación de Nitratos y de Urea. Adicionalmente se realizò prueba cromogénica empleando el panel para la identificación rápida de levaduras MicroScan de Dade Behring Inc., para la identificación definitiva de las levaduras. Esta prueba fue realizada por el laboratorio clínico del Hospital Universitario San Ignacio.

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6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Muestreo y aislamiento A las colonias aisladas se le asignó una numeración consecutiva, determinando como sospechosas de levaduras un total de cuarenta y nueve colonias diferentes; las cuales crecieron en todos medios empleados incluyendo los medios pre-hidrolizados de buchón y elodea (Anexo 4). Posteriormente estas cepas se sembraron en buchón y elodea sin tratamiento hidrolítico previo, observando crecimiento de todas las cepas en las dos macrófitas (Anexo 5). Esto posiblemente a que estos sustratos fueron previamente secados al aire libre en el municipio de Fuquene donde pueden actuar microorganismos que poseen actividad celulolítica, proteolítica y amilolítica (Calixto y Basto, 2005). Existen estudios que indican que algunas levaduras pueden utilizar parcialmente la hemicelulosa proveniente del buchón de agua hidrolizada con ácido sulfúrico en medio liquido (Nigam, 2002, Isarankura et al, 2007, Masami et al, 2008, Mishima el al, 2008). En los ambientes acuáticos se encuentran una gran variedad de microorganismos, la densidad y el tipo de microorganismo se relaciona con el estado trófico y las características fisicoquímicas del agua (Urano et al, 2000., Russo, 2006); sin embargo, en este estudio estos factores no tuvieron incidencia en el número de aislamientos de levaduras, ya que se presentó un patrón similar de recuperación de cepas en los diferentes puntos de muestreo (Anexo 4).

6.2 Hidrólisis 6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético Los resultados obtenidos en la hidrólisis con ácido sulfúrico mostraron diferencias en la cantidad de azucares reductores liberados de las dos macrófitas (Figura 1 y 2). El análisis de varianza con arreglo factorial encontró diferencias altamente significativas entre los tratamientos utilizando como sustrato buchón (Anexo 6). La suspensión de buchón con una concentración de ácido sulfúrico del 0.5%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de esterilización (0.669g/L), mostro diferencias con los otros tratamientos evaluados, siendo el mejor resultado para la prueba de rango múltiple de Duncan (Anexo 6); mientras que, para elodea se encontró que el mejor tratamiento fue en la suspensión, con una concentración de ácido del 1%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de esterilización (1,081g/L), mostrando diferencias altamente significativas con los otros tratamientos (Anexo 6).

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Figura 1. Concentación de azucares obtenidos en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamietnos de buchon (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.

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�Figura 2. Concentación de azúcares reductores en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido sulfurico y tratamientos de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.

En los resultado para buchón, los picos más altos de azúcares se obtuvieron en las proporciones de 1:1 y 1:19 en la concentración de 0.5% de ácido con sesenta minutos de esterilización; como también, en la proporción 1:1 con una concentración de 1% en sesenta

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minutos y al 2% con una proporción de sustrato de 1:1 con 30 minutos de esterilización. El resto de tratamientos presentaron resultados mucho menores a estos (Figura 1).

La concentración del ácido influyó en la cantidad de azúcares reductores liberados, pero la biomasa vegetal también fue un factor determinante en los resultados, como se puede observar en la proporción sustrato-ácido 1:1 de los tratamientos que presentaron la mayor liberación de azúcares reductores, tanto en buchón como elodea (Figura 1 y 2). Esto se explica porque en esta proporción se encuentra la mayor cantidad de material vegetal hidrolizable con respecto a las demás, favoreciendo la hidrólisis de los polisacáridos y traduciéndose por tanto en un mayor rendimiento de la hidrólisis (Sarrouh et al., 2005). Las otras proporciones tienen una menor cantidad de fibra en donde el ácido pueda ejercer su acción y por consiguiente la cantidad de azúcares liberados va a ser menor (Cunningham y López, 1994). Por esta misma razón se encuentra mayor cantidad de azúcares en los tratamientos de suspensión que en los filtrados. Esto se evidencia más claramente en las diferencias observadas con los valores obtenidos en la misma concentración de ácido sulfúrico pero diferentes proporciones del sustrato (Anexo 6). Por ejemplo en la mejor concentración para buchón de 0.5%, la proporción de sustrato de 1:1 presenta 0.669g/L de azúcar en sesenta minutos de esterilización, siendo una cantidad mayor que las proporciones 1:4, 1:9, 1:19, 1:49 y 1:99 para estas mismas condiciones, con Concentraciones cada una respectivamente de 0,2919 g/L, 0,5629 g/L, 0,134 g/L, 0,0906 g/L y 0,0877 g/L azúcares reductores (Anexo 6).

En publicaciones se ha encontrado que la temperatura también tiene un efecto positivo en la cantidad de azúcares que se hidrolizan jugando un papel importante al separar el complejo celulosa–hemicelulosa al facilitar la acción de las enzimas sobre cada molécula (Mejía et al.,2007). En los estudios realizados por Campo et al. (2006) y Redding et al. (2008) demuestran que temperaturas entre 110 -130ºC ayudan a mejorar la hidrólisis de los materiales celulósicos; posiblemente al trabajar en el presente estudio con una temperatura de 121oC se favoreció la hidrólisis de los componentes estructurales de la pared celular vegetal (Anexo 6 y 7).

Los tratamientos con ácido sulfúrico en Concentraciones generalmente por debajo del 4% en peso, han sido de mayor interés en los estudios al ser económicos y eficaces (Breijo y Yufera, 1989). Sin embargo se ha demostrado que los materiales que han sido sometidos a la hidrólisis ácida pueden ser más difíciles de fermentar, por la presencia de sustancias tóxicas que puede inhibir a las células y afectar a la tasa de crecimiento específico de células y rendimiento de masa por ATP (Palmqvist, 2000; Mussatto et al., 2004; Galbe y Zacchi, 2007).

La hidrólisis con el ácido peracético mostró una concentración de azúcares reductores de 0,083g/L para buchón y 0,08g/L para elodea; comparados con las mejores Concentraciones encontradas en el ácido sulfúrico se demuestra una menor capacidad hidrolítica de esta sustancia, debido posiblemente a que es un oxidante fuerte utilizado en la decoloración, desinfección y blanqueo de materiales celulolíticos mas que un compuesto hidrolítico (Teixeira et al., 2000; Zhaoa et al., 2007, Bernal-Castillo, 2009 com. pers.). En investigaciones se ha encontrado que hidroliza parcialmente los materiales lignocelulósicos, deslignificando y aumentando la superficie y la exposición de las fibras de celulosa (Neidleman, 1993; Xue-Bing et al., 2008). Además, como se comento anteriormente, la temperatura influye en la liberación de azúcares y este tratamiento utilizo una temperatura de 105 oC menor a la utilizada en la hidrólisis con ácido sulfúrico y por debajo del rango propuesto por Redding et al (2008) para mejorar la hidrólisis de celulosa.

Para muchos autores la hidrólisis acida presenta bajos rendimientos y una elevado formación de subproductos tóxicos (furfural y hidroximetilfurfural) con un alto consumo de energía; por eso investigadores como Mussatto et al., (2006) recomiendan la mezcla de hidrólisis ácida y alcalina para mejora los resultados que pueden obtenerse solamente usando ácidos. También otros investigadores como Lazaro y Arauzo (1994) recomiendan la hidrólisis enzimática que usa menos energía y da productos puros con rendimientos cuantitativos.

6.2.2. Hidrólisis mixta Los resultados obtenidos en cuanto a concentración de azúcares reductores fue de 0,09g/L para elodea y buchón. Esta cantidad es un poco superior a la obtenida con el ácido peracético,

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y comparada con la hidrólisis con ácido sulfúrico es inferior en las dos macrófitas (Anexo 6). Las Concentraciones de azúcares reductores deberían haber sido mayores que en los tratamientos con ácido sulfúrico; ya que la adición de sustancias alcalinas se usan como una forma eficaz de acondicionamiento para reducir la toxicidad de los hidrolizados generados a partir de pre-tratamiento de la biomasa lignicelulolitica para la producción de etanol (Ranatungaet al., 2000; Horváth et al., 2005). Sin embargo, en este estudio la liberación de azúcares reductores fue menor a otras hidrólisis; pero hay que tener en cuenta que el ajuste de pH con hidróxido de calcio si no se hace en un tiempo corto hay perdida del 10 % de la glucosa (Kumar et al.,2009).

6.2.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio Los resultados encontrados la hidrólisis con NaOH al 5% evidenció la menor cantidad de azúcares reductores tanto en buchón como elodea (Figura 3 y 4), comparado con las hidrólisis con ácido sulfúrico, peracético y la mixta. El análisis de varianza encontró diferencias significativas en los tratamientos con NaOH al 5% a un nivel de 0.05 (Anexo 8). El mejor tratamiento en buchón (0.16 g/L de azúcares reductores) (Figura 3) fue con una proporción de sustrato 1:1 y una esterilización durante 30 minutos al igual que en elodea (0.09 g/L azúcares reductores) (Figura 4).

�Figura 3.Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en buchón con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.

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�Figura 4. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio al 5% en elodea con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.

La menor cantidad de azúcares reductores en buchón se dio en la proporción de sustrato 1:49 y 1:99 (Figura 3) en los dos tiempos de esterilización; y para elodea se presentó en las proporciones de 1:4, 1:9, 1:49 y 1:99 (Figura 4) .

Comparando los azúcares obtenidos en este tratamiento con respecto a la mejor concentración obtenida en la hidrólisis con ácido sulfúrico, son mucho menores; debido posiblemente, a que la hidrólisis alcalina provoca un hinchamiento de la celulosa que no necesariamente conlleva a una hidrólisis, ni modifica su composición química (Fuentes et al., 2008). La concentración en los procesos industriales en los que se utiliza el hidróxido de sodio está entre el 1 y el 5% como la utilizada en este estudio, e implica un aumento en volumen de 30 a 60% respectivamente de la celulosa, sin llegar a hidrolizarla (Fuentes et al., 2008; Núñez, 2008), razón por la cual estos resultados no mostraron un incremento significativo en la concentración de azúcares reductores.

En los resultados obtenidos con NaOH al 5% con los del 10% se observa en buchón una concentración de 0.12g/L de azúcares reductores que es menor que la encontrada al 5%, y en elodea se obtuvo la misma cantidad de azúcares 0.09 g/L en las dos Concentraciones; demostrándose así, que Concentraciones un poco mayores de hidróxido de sodio no ejerce resultados significativos en los rendimientos de azúcares reductores.

6.2.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus Los resultados encontrados durante los 13 días de incubación del hongo muestran que en buchón la concentración de azúcares reductores comienza a aumentar al inicio del tratamiento hasta el día 10 donde empiezan a disminuir ligeramente (Figura 5 y 6).

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Figura 5. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en buchón utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación.

En la macrófita elodea también se observó al día 10 un aumento de los azúcares donde después comienzan a disminuir (Figura 6). En la figura 6 no se observa claramente la disminución al haber una variación pequeña entre los valores, pero al observar los datos como por ejemplo en la concentración del 2% en el día 10 se obtuvieron 2,44 g/L de azúcares reductores y al día 11 fue de 2,38 g/L, donde se aprecia la disminución (Anexo 8).

Figura 6. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis biologica con Pleurotus ostreatus en elodea utilizando diferentes Concentraciones del hongo durante 13 días de incubación.

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Según el análisis de varianza se presentó diferencias significativas entre los tratamientos (Anexo 8) y se evidencio mediante la prueba de Duncan que los mejores resultados en buchón se obtuvieron con la concentración del hongo del 10% a los 10 (4,256g/L) y 7 días (4,375g/L)de incubación (Anexo 8). Para la elodea el análisis estadístico mostró que los tratamientos del hongo a los 7 (3,37 g/l), 10 (3,48 g/l) y 11 días (3,48 g/l) con concentración de P. ostreatus del 10 %, al igual que en la concentración del hongo al 3% a los 10 (3,27 g/l) y 11 días (3,21 g/l), no presentaron diferencias significativas entre ellos (Anexo 8).

Después de los diez días de incubación se observó la disminución de los azúcares reductores en las dos macrófitas desde el día once hasta el trece, día en el cual se realizó la última lectura de azúcares reductores debido a su tendencia a disminuir (Anexo 8). La reducción de la actividad enzimática podría atribuirse a la acumulación de subproductos que la inhiben; los cuales son producidos durante el metabolismo del hongo, como resultado de la hidrólisis de los diferentes componentes de los ácidos orgánicos esterificados de la hemicelulosa, y de los derivados fenólicos solubilizados de la lignina (Palmqvist, 2000; Rodríguez et al., 2003;Sánchez y Carlos, 2005).

Al comparar los azúcares obtenidos con las demás hidrólisis realizadas se observo como la actividad enzimática es mucho más eficiente que cualquier sustancia química utilizada. Al comparar estadísticamente los mejores tratamientos de cada tipo de hidrólisis, el análisis de varianza muestra diferencias significativas a un nivel de 0.01 entre tratamientos y de acuerdo con la prueba de Duncan, los tratamientos con el hongo P. ostreatus a una concentración del 10 % a los 10 y 7 días de incubación fueron los de mayor liberación de azúcares (Tabla 2). En elodea la mayor cantidad de azúcares se presentó con una concentración del hongo de 10% a los 10 y 11 días de incubación (Tabla 2).

Tabla 1. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en buchón.

Tratamiento Azúcaresreductores (g/L)

Suspensión buchón -0.5 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min 0,67 b

Ácido Peracético -Neutralización lavados 0,083 c

NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos 0,16 c

NaOH 10 % - Neutralización lavados 0,12 c

H2SO4+ Hidróxido de calcio +sulfito sodio -Neutralización Ácido 0,090 c

Hongo concentración 10 % a los 10 días de incubación 4,375 a


Tabla 2. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en elodea.

Tratamiento Azúcaresreductores (g/L)

Suspensión elodea -1 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min 1,08 d

Ácido Peracético -Neutralización lavados 0,08 e

NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos 0,09 e

NaOH 10 %-Neutralización lavados 0,09 e

H2SO4-Hidroxido de calcio +sulfito sodio - Neutralización Ácido 0,09 e


Hongo concentración 10 % a los 11dias de incubación 3,48 ab

Hongo concentración 10 % a los 7dias de incubación 3,37 bc

Hongo concentración 3 % a los 10dias de incubación 3,27 c

Hongo concentración 3 % a los 11dias de incubación 3,21 c

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Una de las ventajas del uso de la hidrólisis biológica como tratamiento del material lignocelulolitico, es que las enzimas pueden actuar sobre los compuestos tóxicos presentes en los hidrolizados y cambiar su composición. Se ha encontrado que el uso de la lacasa y de las enzimas de la peroxidasa de los hongos de podredumbre blanca, ha promovido el aumento en el consumo de glucosa y la productividad de etanol, debido a la acción de estas en ácidos y compuestos fenólicos (Mussatto y Roberto, 2004). La selectividad de las enzimas no permite la conversión a otro tipo de compuestos diferentes a azúcares evitando así la formación de compuestos tóxicos para los microorganismos (Mejía et al., 2007). Lo que se ve reflejado en los resultados, con un rendimiento mayor de azúcares reductores en la hidrólisis biológica en comparación con los otros tratamientos probados (Tabla 1 y 2). Otros autores han encontrado altos rendimientos con este tipo de hidrólisis como Bon, y Ferrara (1996), Nigam (2002), Campo et al., (2006), Galbey y Zacchi (2007), Isarankura-Na-Ayudhya et al., (2007) y Kumar et al., (2009).

Algunos autores como Hatakka (1984), Lazaro y Arauzo (1994), utilizaron este tipo de hongo para hidrolizar materiales lignocelulosicos, ya que se alcanzan rendimientos superiores a los de cualquier hidrólisis; encontrando en este estudio resultados similares, donde la cantidad de azúcar hidrolizada a partir de la biomasa vegetal de las plantas acuáticas, buchón y elodea, fue mayor al de los tratamientos químicos.

Con base a estos resultados, la hidrólisis biológica al 10 % de concentración de P. ostreatuscon 10 días de incubación, se escogió por su mayor contenido de azúcares liberados en las dos macrófitas, para la determinación de alcohol etílico por el método del dicromato de potasio. Este hongo es muy utilizado porque tiene un alto potencial biotecnológico en diferentes sectores industriales, siendo capaz de degradar compuestos tan complejos como la lignina (Manzano et al., 2004). Además esta hidrólisis trae beneficios ya que no produce sustancias tóxicas para los microorganismos y su utilización a nivel industrial puede ser más económica comparada con el gasto de emplear ácidos diluidos o concentrados (Badger, 2002).

6.23 Determinación de la producción de etanol 6.3.1. Prueba del yodoformo De las cuarenta y nueve levaduras aisladas se determinó por medio de la prueba del yodoformo, que nueve levaduras eran las posibles mejores productoras de etanol a partir de buchón y 6 a partir de elodea en los medios con buchón y elodea hidrolizados (Anexo 10). Esta prueba también dio positiva en YGC, el cual contiene un azúcar simple que puede ser transformado fácilmente por las levaduras a etanol (Petrovska et al, 2000; Buitrago y Estrada, 2007).

La prueba del yodoformo (CHI3) se basa en la formación de este compuesto que se observa como un precipitado de color amarillo a partir de una reacción de halogenación en medio básico (Griffin, 1981.; Primo, 1996; Morrison et al, 1998). Al realizar la prueba a los tubos con diferentes proporciones de etanol en medio estéril, se presentó un precipitado color amarillo laminado (Anexo 9).

Algunos de los otros compuestos utilizados como controles presentaban color y apariencia similar a los tubos con las diferentes proporciones de etanol, como el alcohol isopropílico y el acetaldehído (Anexo 9). En literatura se ha reportado que el acetaldehído es el único aldehído sencillo que da positivo para la prueba de yodoformo y alcohol isopropílico es un alcohol secundario que puede oxidarse formando una cetona, la cual reacciona positivamente formando el haloformo amarillo llamado yodoformo (Grifiin, 1981., Primo, 1996, Morrison et al, 1998) Sin embargo se visualiza (Anexo 9) que los colores de los tubos de estos compuestos suelen ser más oscuros que el etanol, al finalizar la reacción.

Por otro lado, la cetona presenta dos fases en el tubo de proporción 1:1, se alcanza a observar un amarillo en el fondo del tubo (Anexo 9); el cual posiblemente sea producto de la formación de yodoformo, ya que se ha reportado como un compuesto yodoformo positivo (Grifiin, 1981, Morrison et al, 1998). En el anexo 9 se observan las diferencias entre los precipitados formados por los compuestos empleados como controles en esta prueba.

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6.3.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la técnica del dicromato de potasioLos resultado encontrados en los dos diseños experimentales mostraron una mayor producción de etanol con la levadura 30 en el medio buchón hidrolizado con Pleurotus ostreatus a las 48 h de incubación (Figura 7) y en elodea con la levadura 17 en las mismas condiciones (36,425g/L) (Figura 8). Comparando los medios sin hidrólisis de los dos ensayos se observó que la levadura 23a en elodea presentó la mayor producción de etanol a las 48 horas (Figura 7 y 8).

Figura 7. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con buchón durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato

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Figura 8. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con elodea durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato

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Las Figuras 7 y 8 con relación a la producción de etanol y consumo de azúcares reductores en buchón y elodea respectivamente, muestran como la cantidad de etanol aumenta de las 24 a las 48 horas, y los azúcares reductores disminuyen (Anexo 5; esto se debe a que los microorganismos consumen los azúcares para su crecimiento y producción de etanol. Cuando la cantidad de sustrato no es suficiente detienen el crecimiento y la producción de etanol como lo afirman Palmqvist y Hahn-Hagerdal (2000), Fujita et al. (2002), Cervantes y Pedroza (2007) Aguilar y Saucedo (2008) y Xiros y Christakopoulos (2009).

En el ensayo con buchón, la Figura 7 muestra que la más baja producción de etanol en el medio sin hidrólisis se obtuvo con la levadura 1 y la más alta en la 16. En el medio hidrolizado en este mismo diseño la menor concentración producida fue en la cepa 16 y R y la mayor con la levadura 30. En elodea la menor concentración de etanol en el medio no hidrolizado se observó en la levadura 1 y T a las 48 horas y la mayor en la 23a. En los medios hidrolizados la menor concentración se dio en la 30 y la mayor en la 23a (Figura 8).

La levadura 30 en el diseño con buchón hidrolizado a las 24 horas presentó una concentración de etanol de 38,40g/l y a las 48 de 55,303g/l, mostrándose un aumento significativo en la producción, al igual que la levadura 23a en elodea con una producción de etanol de 18,511g/l a las 24 horas y a las 48 horas de 30,867g/l (Figura 7 y 8). El análisis de varianza mostró diferencias significativas en los dos diseños (� 0.05) y en el caso de buchón, la levadura 30 en el medio hidrolizado con P. ostreatus, no presentó diferencias significativas con la levadura T y 1 en el mismo medio a las 48 h, siendo los mejores tratamientos.

En la prueba de rango múltiple de Duncan al evaluar el diseño in vitro con elodea muestra que la levadura 23a en medio hidrolizado biológicamente fue el mejor tratamiento y no evidenció diferencias significativas con las levaduras 17, T y 23 en el mismo medio a las 48 horas, como tampoco con las levaduras T y 23 a las 24 horas (Anexo 11).

En los medios sin hidrólisis se observó una producción de etanol en bajas Concentraciones de las 24 a las 48 horas al compararlos con los medios hidrolizados (Figura 7 y 8); esto se puede deber a que las levaduras no tienen los mecanismos necesarios para degradar los compuestos de las macrófitas como la celulosa y la lignina; mientras que con relación a la hemicelulosa se han aislado algunas levaduras degradadoras de este compuesto como Candida sp yTrichosporon sp (Fernández y Novo, 1988; Palmqvist y Hahn-Hagerdal, 2000; Srinorakutara et al., 2006; Battan et al., 2007: Cervantes y Pedroza, 2007). No obstante lo que pudo haber permitido a los microorganismos acceder a estos sustratos fue el proceso de esterilización al que fueron sometidos los medios antes de ser inoculados, además del pre-secado de las muestras en la planta de producción de bioabono ubicada en el Municipio de Fúquene, antes de su uso en el laboratorio.

En los medios hidrolizados si se presentó una liberación de azúcares reductores posiblemente a partir de lignina, celulosa y hemicelulosa debido a la maquinaria enzimática que posee P. ostreatus (Manzano et al., 2004; Mussatto y Roberto, 2004). Por consiguiente se puede ver en este estudio al igual que lo observado por autores como Fuentes et al. (2008), que la hidrólisis logra el aprovechamiento de los azúcares reductores liberados de la degradación de los componentes de las macrófitas, generada por el hongo Pleurotus ostreatus.

Además es importante resaltar que el procedimiento térmico, generalmente, es utilizado como pretratamiento para aplicar posteriormente hidrólisis, debido a que separa el complejo celulosa–hemicelulosa facilitando la acción de las enzimas sobre cada molécula. El uso de la temperatura en este estudio posiblemente favorece la hidrólisis de la hemicellosa mientras que la celulosa no pudo ser afectada. Por consiguiente este tratamiento tiene efectos más notables sobre la hemicelulosa y en menor medida sobre la celulosa (Mejia et al., 2007).

Las levaduras que produjeron la mayor concentración de etanol por el método dicromato de potasio se escogieron para la realización de la cromatografía de gases. (Las levadura 30 en el medio hidrolizado de buchón y la 23a en el medio sin hidrólisis de elodea).

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6.3.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas En los cromatogramas se comprueba la producción etanol (Tiempo de retención de 1.48 minutos), por las levadura 30 y 23a en medios que contenían buchón y elodea respectivamente, a las 48 horas de incubación. Con relación a la levadura 30 en medio hidrolizado biológicamente a las 48 horas, se observa además del etanol otros productos de fermentación como el dióxido de carbono, 1-propanol, 2-metil y 1-butanol, 2-metil (Figura 9); al igual para elodea se presentaron productos de la fermentación como el dióxido de carbono, acetato de etilo y 1-butanol, 3-metil (Figura 13). Estos alcoholes se pueden presentar en la fermentación como consecuencia del metabolismo de los azúcares (Madigan et al.,2003; Ramírez, 2006).

Figura 9. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 30 en el medio hidrolizado con Pleurotus ostreatus, con un tiempo de retención 1.48 minutos

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Figura 10. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 23a en el medio sin hidrólisis, con un tiempo de retención 1.48 minutos

Por medio de este método se pudo comprobar la producción de etanol de las levaduras escogidas en el medio hidrolizado como sin hidrólisis. Es un método de elección para la determinación de etanol que ofrece alta selectividad y resultados precisos, utilizado en varios estudios (Corrales y Rangel, 1999; Monsalve et al., 2006; Sarmiento y Silva, 2007; Oviedo et al., 2009 y Peña y Arango, 2009).

6.4. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras Se determinó mediante las pruebas bioquímicas y el MicroScan que la mayoría de las levaduras escogidas como posibles productoras de etanol son cercanas al género Candida sp (Tabla 5, Anexo 12). Los otros géneros encontrados fueron cercanos a �� , y Hansenula sp (Tabla 5, Anexo 12).

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Tabla 3. Identificación preliminar de las levaduras escogidas como mejores productoras de etanol por el método del yodoformo

Código Identificación

1 Brettanomyces sp.

16 Hansenula sp

17 Hansenula sp

23 Candida parasilopsis

23 a C. lusitaniae

30 C. albicans

45 H. polymorpha

R C. parasilopsis

T C. lusitaniae

Los resultados encontrados tienen relación con lo reportados por varios estudios de aislamiento de levaduras acuáticas, los cuales mencionan que algunas especies del género Cándida pueden encontrase en dichos ambientes (Ochoa y Vázquez, 2004). Adicionalmente especies del género Candida sp. se han reportado como productoras de etanol y algunas a partir de compuestos vegetales prehidrolizados como el buchón de agua (Isarankura et al, 2007., Mishima el al, 2008., Masami et al, 2008., Nigam, 2002;). El género Hansenula sp. también ha sido reportado por algunos autores como productor de etanol (Olena et al, 2008., Voronovsky et al, 2009., Dejelal et al, 2006). Dichas investigaciones dan soporte a los resultados encontrados en este estudio, ya que se determinó que las levaduras identificadas como mejores productoras de etanol, en su mayoría fueron aisladas de las muestras de agua de la Laguna, (1, 16, 23, 23a, 30, R, T) y se determinó que producían etanol a partir de las macrófitas acuáticas hidrolizados y sin hidrólisis.

El hallazgo de levaduras productoras de etanol en dos macrófitas invasoras de la laguna de Fuquene (Masami et al, 2008 y Nigam, 2002), es de importancia como punto de partida para posteriores estudios, como una alternativa amigable con el medio y sustentable económicamente para disponer de los residuos de dichas plantas al ser extraídas mecánicamente de la laguna. Y además si se pueden usar para la producción del biocombustible se va a contribuir al control de la emisión de gases tóxicos a la atmosfera por parte de los combustibles provenientes del petróleo y a mejorar la calidad de vida de los habitantes de la zona de influencia de la Laguna de Fúquene.

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7. CONCLUSIONES

En total de la laguna de Fúquene y de las macrófitas buchón y elodea, se aislaron 49 cepas y trece de ellas que presentaron la mayor producción de etanol fueron identificadas como cercanas a los géneros Candida sp, Brettanomyces sp y Hansenula sp., esto demuestra la diversidad de la Laguna de Fúquene y la importancia de la implementación de medidas para su conservación.

El mejor pretratamiento para buchón y elodea fue el biológico con Pleurotus ostreatus a los diez días de incubación que presentó la mayor liberación de azúcares fermentables con un promedio de 55,303g/l y 30,867g/l para buchón y elodea respectivamente.

Las levaduras C. albicans ��C. lusitaneae produjeron la mayor cantidad de etanol en medios con buchón y elodea hidrolizados y no hidrolizados, los cuales fueron comprobados por cromatografía de gases. El potencial de esas cepas para futuras investigaciones en el campo de los biocombustibles de segunda generación es de gran importancia ya que permite el aprovechamiento de materiales lignocelulósicos.

Con los resultados obtenidos durante este trabajo se cumplió con el objetivo general de la investigación, ya que se aislaron levaduras capaces de producir etanol a partir de las macrófitas acuáticas buchón y elodea, siendo un punto de partida para una posible solución a la disposición final de estos residuos vegetales una vez extraídos mecánicamente de la laguna de Fúquene.

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8. RECOMENDACIONES

Las levaduras C. albicans y C. lusitanie se recomiendan para futuras investigaciones en la producción de biocombustibles en medios con las plantas acuáticas, buchón o elodea, tratadas por métodos biológicos con P. ostreatus.

Es necesario continuar con los estudios de estas macrófitas acuáticas para dar una alternativa industrial a escalas mayores en la producción de etanol.

Continuar con la identificación molecular de las cepas aisladas de la laguna de Fuquene para así conocer las mejores condiciones de fermentación inherentes a la cepa, para el aprovechamiento de buchón y elodea en la producción de etanol.

Se debería investigar los microorganismos que actúan en el pre-secado que realizan la Asociación de pescadores “Los Fundadores” para la producción de bioabono, y utilizada en este estudio, como cepas promisorias en la liberación de azúcares fermentables, al ayudar en la degradación del material constitutivo de la pared celular de las plantas acuáticas, buchón y elodea.

Es recomendable cuantificar la producción de alcohol por métodos cromatograficos y optimizar la producción de biocombustibles de las levaduras aisladas.

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10. ANEXOS

Anexo 1. ��

MEDIO COMPONENTES CANTIDAD (g, mL o UI)LMelaza Melaza 100g

Sulfato de magnesio (MgSO4) 0.5g Sulfato de amonio (NH4)2SO4) 5g Fosfato de potasio (KPO4) 1g Cloranfenicol 0,5g Penicilina 20000 UI Agar-agar 15g

Soya-Malta Malta 30g Harina de soya 3g Cloranfenicol 0,5g Penicilina 20000 UI Agar-agar 15g

Arroz Arroz 500g Cloranfenicol 0,5g Penicilina 20000 UI Agar-agar 15g

Dextrosa Sabouraud Glucosa 40g Peptona 10g Agar-agar 15g

YGC Glucosa 20g Extracto de levadura 5g Cloranfenicol 0.1g Agar-agar 15g

Medio de crecimiento dePleurotus ostreatus

Aserrín 1600g

Salvado de trigo 360g Melaza 40g Cal 1g

Malta Glucosa 50 % Glucosa 500g Extracto de malta 10g Extracto de levadura 2.5g Agar-agar 15g

Malta Glucosa Extracto de malta 20 g Glucosa 20 g Peptona 1g Agar-agar 15g

Tabaco Tabaco de cigarrillos 50g Agar-Agar 15g

Malta Sal Glucosa Glucosa 128g Extracto de malta 20g Extracto de levadura 5g Cloruro de sodio (NaCl) 100g Agar-agar 15g

YGC con 10 % de Cloruro de Sodio (NaCl)

Glucosa 20g Extracto de levadura 5g Cloruro de sodio (NaCl) 100g Cloranfenicol 0.1g Agar-agar 15g

YGC con 16 % de Cloruro de Sodio (NaCl)

Glucosa 20g Extracto de levadura 5g Cloruro de sodio (NaCl) 160g Cloranfenicol 0.1g Agar-agar 15g

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Harina de Maíz Harina de maíz amarillo 20g Glucosa 20g Peptona 20g Tween 80 0.19mL Agar-agar 15g

Leche Leche entera 170mL Cloranfenicol 0.25g

Caldo nitrato Glucosa 20g Nitrato de sodio (NaNO3) 2g Sulfato de magnesio heptahidratado (MgS04 * 7H20)

0.5g

Fosfato mono potásico (KH2PO4) 0.5g Sulfato ferroso (SO4Fe) 1g

Urea Urea 20g Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)

9.1g

Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)

9.5g

Extracto de levadura 0.1g Rojo de fenol 0.01g Agar-agar 15g

Ascosporas Glucosa 1g Cloruro de sodio (NaCl) 5g Peptona 10g Agar-agar 15g

Todos los medios deben ser llevados a esterilizar en autoclave a 121º C (15lb de presión) durante 15. El medio malta sal glucosa y malta glucosa 50% son esterilizados en un baño de agua hirviendo por 30 minutos.

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Anexo 2.

Curva patrón para al determinación de azucares reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)

Preparación del reactivoEn un vaso de precipitado de 250mL, se adiciono 50mL de agua destilada y 1.6g de hidróxido de sodio, disolviendo continuamente en una plancha magnética a temperatura ambiente. Luego se agrego lentamente 43.8 g de tartrato de sodio y potasio hasta su disolución completa. Se cubrió el vaso de precipitado con papel aluminio. Posteriormente se agrego 1g de ácido 3,5-di-nitro salicílico (DNS) lentamente continuando con la agitación. Se completo hasta un volumen de 100ml con agua destilada en el vaso de precipitado El reactivo se dejo toda la noche en agitación constante y al otro día se paso a un balón volumétrico aforado de 100mL previamente forrado con aluminio.

Preparación de la solución stock de glucosa 2g/LSe peso 0.2g de glucosa anhidra y se disolvió en 50mL de agua destilada utilizando un balón volumétrico aforado de 100mL. Después de homogenizarse de completo, se llevo a un volumen de 100mL con agua destilada.

Preparación de las soluciones de glucosa de la curva patrónSe utilizo la formula de V1*C1= V2*C2 y para preparar las seis diferentes Concentraciones de glucosa g/L con un volumen final de 2mL. El procedimiento para preparar cada una se ve a continuación.

Reactivo Blanco Concentraciones g/L

0.50 0.70 1.00 1.50 1.70 2.00

Glucosa (mL) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

Agua (mL) 0.25 - - - - - -

Se protegen los tubos de ensayo tapa rosca de 13*100mm con papel aluminio.

Reactivo de DNS

0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

Se calientan los tubos de ensayo en un baño termostatado con agua hirviendo sin papel aluminio por cinco minutos y posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en

hielo durante 5 minutos.

Agua destilada (mL)

2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la absorbancia de cada solución a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba.

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Determinación de la concentración de azucares reductores de cada muestra Se toman 0.25mL de la muestra en un tubo de ensayo, forrando cada uno con aluminio para protegerlo de la luz, y se agregan 0.25mL de reactivo DNS. Se calientan los tubos de ensayo en un baño termostatado con agua hirviendo sin papel aluminio por cinco minutos y posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos. Al cabo de este tiempo se pone nuevamente el papel aluminio a cada tubo y se determina la absorbancia de cada solución a una longitud de onda de 540nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba. Luego de tener la absorbancia se reemplaza en la ecuación que se determino por medio de una regresión lineal con la curva patrón que se muestra a continuación.

Curvas patrón para la cuantificacion de azucares reductores del reactivo de DNS.

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Anexo 3.

Curva patrón para la determinación de etanol por el método del dicromato de potasio

Preparación de los reactivos

• Solución oxidanteSe mezclan 4.165 g de dicromato de potasio (97%) y 250 mL de ácido sulfúrico (96%) en un vaso de precipitado de 600mL. Luego esta solución se para a un balón volumétrico aforado de 1000 mL y se completa hasta el aforo con agua destilada.

• Solución de carbonato de potasioSe mezclan de 20 g de carbonato de potasio (98%) en un vaso de precipitado de 250mL hasta que se disuelva. Luego esta solución se transfiere a un balón volumétrico de 100mL y se completa con agua destilada hasta el aforo.

Después de tener las 2 soluciones anteriores preparadas se realiza la solución final:

• Solución final. Se toman 4 mL de la solución oxidante en un tubo de ensayo y luego se adiciona, gota a gota, 2 mL de solución de carbonato de potasio hasta finalizar el burbujeo.

Procedimiento para la realización de la curva patrónSe prepararon diferentes concentraciones de etanol en agua destilada (2,5, 5,0, 10, 15, 20, 30) como se muestra en la tabla siguiente. Se mezclan 2 mL de la solución final con 2 mL de los diferentes patrones en un tubo de ensayo homogeneizándose en vórtex a 1500 rpm durante 10 s. Seguidamente se realiza un calentamiento en baño termostatado de 80-85 °C, por 30 min. Se enfría a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 440 nm, ajustando la absorbancia con el blanco de prueba

• El blanco se prepara con ácido sulfúrico con una concentración de 6N.

Determinación de etanol en cada muestraSe tomaron 10mLde la muestra de medio de cultivo en un tubo de ensayo y se centrifuga a 3500 rpm durante 20 min. Se trabaja con el sobrenadante de donde se toman 2mL en un tubo de ensayo y se mezclan con 2mL de la solución final en un vórtex por 10 segundos. Estos tubos son puestos en un baño termostatado de 80 a 85ºC por 30 minutos. Al cabo de esto se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a una longitud de onda de 440 nm ajustando la absorbancia con el blanco de prueba. Los datos obtenidos se multiplican por el factor que corresponda a cada medio que se presentan a continuación debajo de cada grafica, para hallar la concentración en g/L.

Concentración g/l

Etanol(mL)

Agua destilada(mL)

Blanco* - - 2.5 0.05 19.95 5 0.1 19.9

10 0.2 19.8 15 0.3 19.7

20 0.4 19.6

30 0.5 19.5

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Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea hidrolizada con P. ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra (1993). Factor= 35.71

Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio elodea sin pretratamiento hidrolítico, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra (1993). Factor= 105.03

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Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchón hidrolizado con P. ostreatus, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra (1993). Factor= 68.90

Grafica de los diferentes patrones de etanol en medio buchón sin pretratamiento hidrolítico, ajustada de acuerdo con la metodología planteada por Torrenegra (1993). Factor=133.92

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Anexo 4.

Aislamiento de levaduras en cada medio de cultivo utilizado en la investigación.

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Muestra Ubicación �� !�" �##��$��%��&�

Agua Laguna de

Fúquene sector Ubate

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Agua Laguna de

Fúquene sector Tagua

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Agua Laguna de

Fúquene Monroy ��

Agua Laguna Fúquene

sector la Isla ��

Buchón Laguna Fúquene

sector la Isla ��

Agua Laguna de

Fúquene sector Suarez

��

Elodea Laguna de

Fúquene sector Suarez

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Suelo

Vereda Guatancuy, municipio de

Fúquene. Predio Fundación Humedales

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Compost

Vereda Guatancuy, municipio de

Fúquene. Predio Fundación Humedales

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Anexo 5.

Crecimiento de las levaduras escogidas en los medios hidrolizados y sin hidrólisis biológica

Crecimiento de levaduras en buchón hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de producción de etanol por el método del dicromato de potasio.

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Crecimiento de levaduras en elodea hidrolizado con Pleurotus ostreatus en el ensayo de producción de etanol por el método del dicromato de potasio.

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Anexo 6.

Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis acida (H2SO4)

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Anexo 7.

Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis alcalina (NaOH 5%)

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Modelo Suma de cuadrados

tipo III

Grados de libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

.022a 11 0,002 852,829 0

Intercepto 0,286 1 0,286 123657,324 0

Concentración del sustrato

0,009 5 0,002 746,095 0

Tiempo de esterilización (min)

0,01 1 0,01 4214,046 0

Concentración del sustrato * Tiempo de esterilización (min)

0,003 5 0,001 287,318 0

Error 0 24 0 Total 0,308 36 Corrección Total

0,022 35

<��(��/��= �� )�� *"��!4C-�(��)�1

NaOH 5 %

Proporción

Tiempo de esterilización(min)

30 60

1:1 0,159 a 0,085 bcd

1:4 0,108 b 0,075 cd

1:9 0,098 bc 0,074 cd

1:19 0,092 bcd 0,068 cd

1:49 0,088 bcd 0,068 cd

1:99 0,088 bcd 0,0670 d

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tipo III

Grados de

libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

.024a 11 .002 15.368 .000

Intercepto .003 1 .003 23.839 .000

Concentracióndel sustrato

.017 5 .003 23.839 .000

Tiempo de esterilización (min)

.001 1 .001 8.310 .008

Concentracióndel sustrato * Tiempo de esterilización (min)

.006 5 .001 8.310 .000

Error .003 24 .000 Total .031 36 CorrecciónTotal

.028 35

<��(��/��= �� )�� *"��!4C-�� 1

NaOH 5 %

Proporción

Tiempo de esterilización(min)

30 60

1:1 0,093 a 0,071 ab

1:4 0,078 ab 0,068 b

1:9 0,075 ab 0,067 b

1:19 0,074 ab 0,068 b

1:49 0,070 ab 0,067 b

1:99 0,073 ab 0,068 b

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Anexo 8.

Análisis estadístico de los tratamientos de hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus

Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de significancia de 0.05.


tipo III

Grados de libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

36.545a 17 2,15 101,99 0

Intercepto 503,25 1 503,25 23876,212 0

Tiempo (días) 9,33 5 1,866 88,531 0

Concentracióndel hongo

23,612 2 11,806 560,128 0

Tiempo (días) * Concentración del hongo

3,603 10 0,36 17,092 0

Error 0,759 36 0,021

Total 540,554 54

Corrección Total

37,304 53

Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón.

Tiempo (días) Concentración del hongo Pleurotus

ostreatus Azucares reductores (g/L)

5 7 10 11 12 13

2% 2,05 h 2,17 gh 2,24 gh 2,22 gh 2,15 gh 2,10 h

3% 2,13 h 3,69 cd 3,73 bcd 3,50 de 3,33 ef 3,19 f

10% 2,40 g 4,25 a 4,37 a 3,96 b 3,78 bcd 3,63 d

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Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de significancia de 0.05.


tipo III

Grados de libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

12.743a 17 ,750 38,718 ,000

Intercepto 410,804 1 410,804 21219,728 ,000

Tiempo (días) 4,907 5 ,981 50,698 ,000

Concentración del hongo

7,191 2 3,595 185,722 ,000

Tiempo (días) *Concentración del hongo

,644 10 ,064 3,327 ,004

Error ,697 36 ,019

Total 424,244 54

Corrección Total

13,439 53

Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en elodea.

Concentración del hongo Pleurotus

ostreatus

Tiempo (días)

Azucares reductores (g/L)

5 7 10 11 12 13

2% 1,93 d 2,38 c 2,44 c 2,38 c 2,22 c 2,17 d

3% 2,16 d 2,99 b 3,27 ab 3,21 ab 2,96 b 2,87 b

10% 2,41 c 3,367 ab 3,48 a 3,48 a 3,01 b 2,88 b

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Anexo 9.

Resultados de los controles de la prueba cualitativa para la determinación de etanol (yodoformo)

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Prueba de yodoformo controles de etanol y algunos posibles interferentes. En la primera columna de la izquierda se observan los resultados de la prueba de yodoformo para los controles con proporciones de izquierda a derecha 1:1, 1:9 y 1:99 en medio buchón; en la columna de la derecha para el medio elodea con las mismas proporciones. En las filas se encuentran los diferentes compuestos. A. Etanol, B. Acetato de etilo, C. Acetona, D. Alcohol Isopropílico, E. Metanol.

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Anexo 10.

Producción de etanol por la prueba cualitativa de yodoformo y comparación de los resultados con el crecimiento en buchón o elodea como única fuente de carbono.

CEPA

Prueba de Yodoformo

Crecimiento única

Fuente de carbono

Caldo YGC Buchón Elodea Buchón Elodea

1 +++ +++ +++ ++ +++

2 - - - + ++

3 ++ + - ++ ++

4 ++ + + ++ ++

5 +++ + - + ++

6 ++ + + + ++

7 +++ - - +++ +++

8 - - - ++ ++

Y - - - ++ ++

9 - - - ++ ++

S + - - ++ +++

10 + - - +++ ++

11 - - - ++ ++

T ++ +++ ++ ++ ++

14 + - - +++ ++

16 +++ +++ + ++ +

16a - - - ++ ++

17 +++ + ++ + +

17a ++ + - + ++

17m ++ + + ++ +

18 + - - ++ +++

19 + - - ++ +++

21 - - - ++ +

22a ++ + + + +

23 +++ +++ ++ ++ ++

23a +++ ++ ++ +++ +++

25a +++ + - ++ ++

26 + - - ++++ ++++

R +++ +++ + ++++ ++++

29 - - - + +

30 ++ +++ +++ +++ ++++

35 + + - ++ ++

40 - - - ++ +

41 +++ - - ++ +++

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42 - - - + +

45 +++ +++ + +++ ++

50 - - - ++ ++++

52 - - - + +

59 - - - ++ +

U - - - +++ +++

54 + + - ++ ++

60 - - - +++ +++

63 + - - ++ +++

70 - - - + +++

74 - - - +++ ++++

76 - - - + +++

77 - - - +++ +++

79 - - - + +

81 + ++ - ++ +

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Anexo 11.

Análisis estadístico de la determinación de etanol por la prueba del dicromato de potasio

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tipo III

Grados de

libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

4863.458a 9 540.384 12.059 .000

Intercepto 16.476.797 1 16.476.797 367.678 .000

Tiempo(horas) 159.235 1 159.235 3.553 .073

Hidrolisis 3.546.820 1 3.546.820 79.147 .000

Levadura 1.157.402 7 165.343 3.690 .009

Error 985.888 22 44.813

Total 22.326.143 32

Corrección Total

5.849.345 31

<��(��/��= �� (��)�� (�� 1

Determinación de etanol Levadura Medio Etanol g/L

24 48 1 Hidrolizado 37,180 bcd 41,570 ab

Sin hidrolisis 6,935 f 9,462 fT Hidrolizado 37,605 bcd 41,34 ab

Sin hidrolisis 10,151 f 13,413 f16 Hidrolizado 23,655 cdef 34,679 bcd

Sin hidrolisis 10,656 f 22,277 def23 Hidrolizado 31,245 bcde 37,665 bcd

Sin hidrolisis 8,084 f 12,310 fR Hidrolizado 23,175 cdef 36,333 bcd

Sin hidrolisis 9,278 f 11,988 f30 Hidrolizado 38,400 bc 54,9704 a

Sin hidrolisis 7,533 f 12,999 f45 Hidrolizado 17,706 ef 35,598 bcd

Sin hidrolisis 12,034 f 14,004 fControl Hidrolizado 16,490 ef 16,655 ef

Sin hidrolisis 6,476 f 6,495 f

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�' �� (�� (��)�1"�� /��01041


tipo III

Grados de

libertad

Cuadro medio

F calculado

Significancia

Modelo Corregido

2376.381a 8 297.048 18.408 .000

Intercepto 12.905.660 1 12.905.660 799.741 .000

Tiempo(horas) 275.171 1 275.171 17.052 .001

Hidrolisis 1.610.432 1 1.610.432 99.796 .000

Levadura 490.777 6 81.796 5.069 .003

Error 306.609 19 16.137

Total 15.588.649 28

Corrección Total 2.682.989 27

<��(��/��= �� (�� 1

Determinación de etanol Levadura Medio Etanol g/L

24 481 Hidrolizado 17,546 fghi 32,474 abc

Sin hidrolisis8,865 i 14,698 fghi

T Hidrolizado 33,393 ab 35,230 aSin hidrolisis 12,034 ghi 14,652 fghi

17 Hidrolizado 29,627 abcde 36,425 aSin hidrolisis 10,289 hi 17,684 fghi

23 Hidrolizado 30,775 abcd 33,577 abSin hidrolisis 10,65 ghi 16,030 fghi

23 A Hidrolizado 21,664 defg 37,803 aSin hidrolisis 18,511 fgh 30,867 abcd

30 Hidrolizado 23,288 cdef 31,785 abcSin hidrolisis 11,132 ghi 16,030 fghi

Control Hidrolizado 20,336 efgh 24,724 bcdefSin hidrolisis 6,384 i 6,568 i

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Anexo 12.

Identificación presuntiva de las 13 cepas de levaduras escogidas como mejores productoras de etanol

Compuesto LEVADURAS

L23 LR L30 L23A LT L1 L16 L17 L45

Hidroxiprolina-b- Naftilamida + + + + + - - - -

L-isoleucina-b-naftilamida - - - D + - D + +

L-prolina-b-Naftilamida + + + + + - - - -

L-tirosina-b-Naftilamida + + + + + + + + +

Glicina-b-Naftilamida - - - - - - D + +

Glicilglicina-b-Naftilamida + - + + + - - - -

Glicil-L-arginina 4-metoxi-b-Naftilamida + - + - - - - - -

Glicil-L-prolina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -

L-arginil-L-arginina-b-Naftilamida + + - - - - - - -

L-lisil-L-alanina 4-metoxi-b-Naftilamida - + - - - - - - -

L-alanina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -

L-seril-L-tirosina-b-Naftilamida - - - - - - - - -

Urea - - - - - - - - -

3-Indoxil-fosfato + + + + + - + + +

L-histidina -b-Naftilamida D + D D D D D + +

Sacarosa - + - - - + - - -

Sacarosa + + + + + + + + +

Trehalosa + + + + + + + + +

p-nitrofenil-�-D-glucopiranosido - - - - - - - - -

o-nitrofenil-�-D-glucopiranosido - - - + + - - - -

o-nitrofenil-�-D-Galactopiranosido - - - - - - - - -

p-nitrofenil-�-D-glucopiranosido - - + + + + + + +

p-nitrofenil-�-Fucopiranosido - - - + + + + + +

p-nitrofenil-�-D-Galactopiranosido - - - - + + + + +

p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Glucosamina - - - - - - - - -

p-nitrofenil-�-D-celobiosa - - - - - - - - -

p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Galactosaminida - - + - - - - - -

Identificación presuntiva

C.

pa

rap

silo

sis

Ca

nd

ida

sp

.

C.

alb

ica

ns

Ca

nd

ida

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.

C.

lusita

nia

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Bre

tta

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s

sp.

Ha

nse

nu

la s

p

Ha

nse

nu

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H.

po

lym

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ha

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aislamiento de levaduras

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