identificaciÓn molecular de levaduras 1

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 1

Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao Artesanal en

el Departamento de Santander

Laura Katherine León Díaz

Universidad de Santander

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias

Programa de Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021


Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao Artesanal en

el Departamento de Santander

Laura Katherine León Díaz

Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de Microbióloga

Industrial

Director

Nohora Juliana Rueda Forero, Msc. PhD (c)

Codirector

Claudia Johanna Sandoval Lozano, M. Sc

Universidad de Santander

Facultad De Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias

Programa de Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021


Agradecimientos

Agradezco a Dios por permitirme culminar uno de los más grandes proyectos en mi vida,

por permitirme vivir esta experiencia al lado de muchas personas que aportaron algo en mí.

A Nohora Juliana, M. Sc PhD (c) por acompañarme en este proceso, por ser paciente,

amiga y por aportarme los conocimientos que sacaron este proyecto adelante.

También a mi Profesora Claudia por ser una gran persona, darme la oportunidad de

conocerla y aprender de ella.

A mis amigos Andrés, Julián, Brandon por ser el punto de alegría en mi vida, por tantos

años de amistad, algún día seremos más que grandes.

A mis amigas Wendy, Juliana, Yaren, sin ustedes este trayecto largo de universidad no

habría sido el mismo, gracias por cada momento vivido.


Dedicatoria

Dedico esto a Dios que ha sido mi guía, refugio y compañía en todo y en estos años de

carrera en los que a veces he sentido duda.

A mis padres, pilares fundamentales en mi vida, las personas que más me conocen, que

con mucho amor y cariño me han apoyado en todo lo que he logrado.

A mi hermano que amo tanto por ser la persona que más me escucha, por ser el impulso

en mi vida, espero verlo triunfar.

Al amor de mi vida, Daniel que ha estado ahí acompañándome con su amor en cada

momento, en cada cosa que hago, porque ha sido lo mejor que me he cruzado en el camino,

A mis abuelos Nubia y Ovidio que son la principal razón por la que estoy aquí, por

hacerme saber siempre que soy su mayor orgullo.

A mis mascotas, mi apoyo emocional que le dan ese toque de alegría, amor y descanso en

mi vida.


Tabla de Contenido

pág.

Introducción .............................................................................................................................. 16

1. Planteamiento del Problema .................................................................................................. 19

2. Justificación .......................................................................................................................... 21

3. Objetivos ............................................................................................................................... 24

3.1 Objetivo General ................................................................................................................. 24

3.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 24

4. Marco Referencial ................................................................................................................. 25

4.1 Estado del Arte .................................................................................................................... 25

4.2 Marco Teórico ..................................................................................................................... 30

4.2.1 Proceso de Fermentación del Cacao .................................................................................. 30

4.2.2 Roles de los Microorganismos Involucrados en la Fermentación ...................................... 32

4.2.2.1 Levaduras ...................................................................................................................... 32

4.2.2.2 Bacterias ........................................................................................................................ 35

4.2.3 Métodos de Identificación Molecular ................................................................................ 36

4.2.3.1 Métodos Basados en el Análisis de Regiones Ribosómicas. .......................................... 37

4.2.3.1.1 Secuenciación de Regiones Ribosómicas .................................................................... 38

4.2.3.1.2 Polimorfismo de Longitud en los Fragmentos de Restricción del rDNA/rRNA (RFLPs)

.................................................................................................................................. 38

4.2.3.1.3 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ............................................. 39

4.2.3.1.4 PCR en Tiempo Real .................................................................................................. 39


4.3 Marco Legal ........................................................................................................................ 40

5. Hipótesis ............................................................................................................................... 42

5.1 Hipótesis Nula ..................................................................................................................... 42

5.2 Hipótesis Alternativa ........................................................................................................... 42

6. Método .................................................................................................................................. 43

6.1 Diseño del Estudio .............................................................................................................. 43

6.2 Metodología ........................................................................................................................ 43

6.3 Materiales y Métodos ................................................................................................ 44

6.3.1 Cultivo de Levaduras de Interés ........................................................................................ 44

6.3.2 Extracción y Cuantificación de ADN Genómico ............................................................... 44

6.3.2.1Amplificación por PCR .................................................................................................. 45

6.3.2.2 Electroforesis................................................................................................................. 46

6.3.2.3 Purificación de PCR ...................................................................................................... 47

6.3.2.4 Secuencia y Filogenia.. .................................................................................................. 47

7. Resultados ............................................................................................................................. 49

7.1 Extracción, Cuantificación y Purificación de ADN Genómico ............................................. 49

7.2 Amplificación por PCR ....................................................................................................... 50

7.3 Análisis de Secuencia y Filogenia para cada Aislado ........................................................... 52

8. Discusión .............................................................................................................................. 61

9. Conclusiones ......................................................................................................................... 67

10. Recomendaciones ................................................................................................................ 68

Referencias Bibliográficas......................................................................................................... 69

Apéndices ................................................................................................................................. 77


Lista de Tablas

pág.

Tabla 1 Concentración de ADN Levaduras Analizadas.............................................................. 49

Tabla 2 Resumen Identificación Levaduras de Interés ............................................................... 55

Tabla 3 Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 246 en la Región ITS-NL

del ADNr .................................................................................................................................. 56


Lista de Figuras

pág.

Figura 1 Estructura del ADN Ribosómico Nuclear .................................................................... 38

Figura 2 Esquema General de la Metodología ........................................................................... 43

Figura 3 Electroforesis Gel de Agarosa Primer Set de Levaduras .............................................. 51

Figura 4 Electroforesis Gel de Agarosa Segundo Set de Levaduras............................................ 51

Figura 5 Análisis de Control de Calidad (Qualitycheck) para la Secuencia Obtenida de 29A NL-

1F ............................................................................................................................................. 53

Figura 6 Relaciones Evolutivas de Taxones ............................................................................... 57

Figura 7 Árbol Filogenético ...................................................................................................... 59


Lista de Apéndices

pág.

Apéndice 1. Electroforesis......................................................................................................... 77

Apéndice 2. Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Torulaspora

Delbrueckii Levadura 195 ......................................................................................................... 80


Abreviaturas

µl Microlitos (1 x 10 litros)

BAA Bacterias ácido-acéticas

BAL Bacterias ácido-lácticas

g Gramos

l Litros

min Minutos

ml mililitros (1 x 10-3 litros)

mM milimolar (1 x 10-3 molar)

pb Pares de bases

rADN Ácido desoxirribonucleico ribosomal

PCR Polymerase Chain Reaction (siglas en inglés)

sp Especie

YGC Agar al extracto de levadura dextrosa y cloranfenicol


Resumen

Título: Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao

Artesanal en el Departamento de Santander

Autor: León Díaz, Laura Katherine

Palabras clave: Cacao, levaduras fermentadoras, ADN ribosomal

Descripción:

El cacao ha sido priorizado en Colombia como uno de los productos agropecuarios con

mayor potencial gracias al reconocimiento mundial de la calidad de los genotipos que se cultivan

en el país (cacao criollo, forastero e híbrido) ya que cuenta con las condiciones adecuadas para el

cultivo de este fruto. La fermentación es un proceso de reacciones químicas, mediante las cuales,

los azúcares contenidos en la pulpa se transforman en productos como agua, alcohol etílico y

ácido acético, entre otras sustancias, por la acción de microorganismos como las levaduras.

En este estudio se realizó una caracterización e identificación molecular de levaduras

relacionadas a la fermentación de cacao (Theobroma cacao L) mediante PCR punto final de las

regiones 5.8S ITS y 26S (dominio D1/D2) del ADN ribosomal (ADNr) utilizando dos pares de

cebadores específicos para cada región (ITS y NL) empleando así los siguientes ITS1 (5'-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'); NL-1F (5’-

GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG

ACG G-3’) realizando un análisis filogenético para las regiones y determinar su género y

especie.


Se identificaron un total de 40 aislados destacándose Hanseniaspora opuntiae, Pichia

kluyverii y Torulaspora delbrueckii como las levaduras dominantes en este estudio, seguidas de

Cándida parapsilopsis, Cándida sobosivorans, Criptococcus sp, Hanseniospora meyeri, Pichia

kluyverii, Pichia kudriavzevii, Pichia mashurica, Pichia occidentalis, Rhodotorula acuta,

Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, y Wickerhamomyces anomalus, todas

estas con capacidad productoras de compuestos volátiles que le aportan propiedades

organolépticas a los granos de cacao.


Abstract

Title: Molecular Identification of Yeasts Associated with the Fermentation of Artisan

Cocoa in the Department of Santander

Author: León Díaz, Laura Katherine

Keywords: Cocoa, fermenting yeasts, ribosomal DNA,

Description:

Cocoa has been prioritized in Colombia as one of the agricultural products with the

greatest potential thanks to the worldwide recognition of the quality of the genotypes that are

cultivated in the country (Creole, foreign and hybrid cocoa) since it has the appropriate

conditions for cultivation. of this fruit. Fermentation is a process of chemical reactions, through

which the sugars contained in the pulp are transformed into products such as water, ethyl alcohol

and acetic acid, among other substances, by the action of microorganisms such as yeast.

In this study, a molecular characterization and identification of yeasts related to cocoa

fermentation (Theobroma cacao L) was carried out by end-point PCR of the 5.8S ITS and 26S

regions (D1 / D2 domain) of ribosomal DNA (rDNA) using two pairs of specific primers for

each region (ITS and NL) thus using the following ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ')

and ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'); NL-1F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG

GAA AAG-3 ') and NL-4R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') performing a

phylogenetic analysis for the regions and determining their gender and species.

A total of 40 isolates were identified, highlighting Hanseniaspora opuntiae, Pichia

kluyverii and Torulaspora delbrueckii as the dominant yeasts in this study, followed by Candida


parapsilopsis, Cándida sobosivorans, Criptococcus sp, Hanseniospora meyeri, Pichia

kluyhurria, Pichia kluyverria, Pichia kluyhurria occidental , Rhodotorula acuta, Rhodotorula

mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, and Wickerhamomyces anomalus, all of these with the

capacity to produce volatile compounds that provide organoleptic properties to cocoa beans.


Introducción

El cacao es uno de los productos agrícolas de mayor exportación en el mundo,

constituyéndose como la economía más importante que sostiene algunos países de Latinoamérica

y África; reportes de los años 2017/2018 por la Organización Internacional del Cacao (ICCO)

mencionan que alrededor de más de 400 toneladas son producidas en todo el mundo. Santander

principal departamento cacaotero de Colombia, según cifras de Federación Nacional de

Cacaoteros (Fedecacao, 2013) se ha caracterizado por ser productor de un fruto fino y de

agradable aroma, además de obtener una mezcla de sabores frutales e intensos dejando liberar

lentamente y por un largo tiempo el sabor de un extraordinario chocolate criollo. Posterior a la

obtención de los granos, se requiere de una serie de procesos fundamentales para el sabor del

producto como fermentación y secado, seguido de tostado, conchado, templado y molido.

Durante la fermentación las bacterias y levaduras actúan en una sucesión microbiana

definida y compleja, en la que el comportamiento de las diferentes especies impulsa la

degradación de la pulpa de frijol que contribuye como precursor del sabor a chocolate (Afoakwa

et al, 2011). En particular, las levaduras son los primeros microorganismos que crecen al

comienzo de la fermentación y dominan durante las primeras 30 a 40 h; se consideran

fundamentales para la fermentación del grano de cacao, desempeñando diferentes roles

importantes como: la descomposición del ácido cítrico presente en la pulpa, la secreción de

pectinasas que provocan la degradación de la pulpa, la producción de etanol a través de la

fermentación de azúcares (principalmente glucosa) bajo condiciones de bajo oxígeno, que

eliminan los cotiledones del grano de cacao, la producción de diferentes ácidos orgánicos por

diferentes vías metabólicas y la producción de importantes compuestos orgánicos volátiles que se


difunden al interior de los granos y reaccionan con las sustancias responsables del sabor del

producto final durante el proceso de tostado posterior (Ludlow et al, 2016).

Durante la fermentación, la temperatura aumenta entre 48-52 ° C durante 57 y 80 h, y

solo se observa un crecimiento marginal de levaduras. Después de la fermentación, los granos de

cacao se secan al sol o en secadores mecánicos hasta aproximadamente un 5% de humedad en

los cotiledones y un 7% de humedad en la cáscara (Mota et al, 2018).

Este proceso se subdivide en tres fases, durante la primera actúan las levaduras gracias a

las condiciones iniciales en la pulpa del grano de cacao como el ambiente anaeróbico y el bajo

nivel de pH. En esta fase, se lleva a cabo una fermentación alcohólica y aparecen entre 5 y 6

especies diferentes de levaduras como Dedaryomyces, Hansenulaa, Kloeckera, Rhodotorula, y

Torulopsis que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniaspora que es la predominante

durante las primeras 24 horas, Saccharomyces y Pichia priman durante las 36-38 horas y

Cándida suele encontrarse durante todo el proceso de la fermentación o al final. Las especies

encontradas con mayor frecuencia son S. cerevisae, C. krusei, K. apiculata, H. anomala Pichia

fermentans, y Schizosaccharomyces pombe. Por último, cuando se llega a una temperatura de

50ºC las levaduras dejan de crecer y son sustituidas por bacterias acéticas de los géneros

Acetobacter y Gluconobacter que aprovechan la aireación y el etanol para producir ácido acético

dando paso a la segunda y tercera fase de la fermentación. (Romero et al, 2012)

Diferentes autores han estudiado la biodiversidad de las levaduras implicadas en la

fermentación del cacao. En particular, la presencia de varias especies, entre las cuales las más

frecuentes pertenecen al género

andida, Kluyveromyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kazachstania,

Meyerozyma, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, W


ickerhamomyces, y Cryptococcus spp. (Maura et al, 2016). Sin embargo, muy pocos autores

exploraron la biodiversidad después del secado. Identificar las levaduras presentes durante el

proceso de fermentación permitirá establecer los actores principales y contrastarlos con las

características organolépticas del producto terminado. Generando valor agregado en el proceso

productivo.

Este estudio identifica las levaduras fermentadoras de cacao artesanal del departamento

de Santander amplificando las regiones ITS y NL del ribosoma, a través de PCR punto final, las

secuencias obtenidas posterior a los análisis computacionales permiten identificar cada una de

estos aislados, contrastándolas con las secuencias depositadas en el NCBI (Blastn), a su vez se

realizó un análisis filogenético que enriquece la identificación para finalmente generar un

panorama de los géneros y especies de levaduras que predominan en la fermentación del cacao

artesanal en Santander.


1. Planteamiento del Problema

En Colombia, se han desarrollado estudios donde se ve reflejada la influencia de la

fermentación sobre las características de calidad del grano; sin embargo, la caracterización de los

microorganismos presentes durante la fermentación del cacao no es abundante, detallando

escazas investigaciones acerca del papel que cumplen los microorganismos en este tipo de

procesos. (Cardona, 2016).

En este proceso los microorganismos como las levaduras juegan un papel importante ya

que existe una relación entre las variaciones de temperatura, pH y humedad, la formación de

alcoholes, ácidos y compuestos polifenólicos que pueden disminuir el sabor amargo

produciéndose reacciones bioquímicas que forman el chocolate. (López et al, 2015).

Se requiere ir más a fondo sobre la capacidad que tienen las levaduras en la producción

de compuestos aromáticos en cacao, pues algunos trabajos, han establecido el impacto de los

compuestos volátiles sobre el aroma de los granos, reflejando la importancia de la fermentación

y el secado en la expresión de los materiales en la calidad aromática (Payne et al., 2010). A su

vez, la etapa del procesamiento del grano, aún necesita de estudio, pues el ecosistema

microbiano que participa no es controlado y sigue siendo una fase empírica en las producciones

artesanales del departamento de Santander.

Además de que se desconoce la caracterización de los grupos de levaduras que actúan en

el proceso de fermentación de cacao artesanal que pueden estar funcionando en el desarrollo de

aromas y texturas distintivos que le confieren un valor agregado en la tecnificación del proceso.

La identificación y caracterización a nivel molecular de estos microorganismos fermentadores

que proporcionan dichas características, son de gran interés pues permiten una tecnificación en


cuanto al proceso de fermentación y las características del producto terminado, facilitando la

generación de productos con aromas distintivos, planeados meticulosamente especialmente por

el control y formulación de consorcios microbianos para este fin. (Camu et al 2010).


2. Justificación

Los cultivos iniciadores o “starter” consisten en una especie o combinación de especies

microbianas que una vez adicionados a un producto originan un conjunto de transformaciones en

los componentes básicos (glúcidos–proteínas–lípidos) con un resultado final que se manifiesta en

el cambio de la textura, color y sabor del producto final, incrementando su poder de

conservación y en ocasiones aportan efectos benéficos para la salud del consumidor.

Los microorganismos empleados como cultivos iniciadores pueden ser bacterias,

levaduras y mohos individualmente o una mezcla de ellos (bacteria-bacteria; bacteria-levadura;

bacteria-moho; moho-moho; moho-levadura; levadura-levadura). (González et al, 2013)

Este tipo de iniciadores permitirían la producción de granos de cacao uniformemente

fermentados, con características organolépticas distintivas, estos criterios de éxito han sido

aludidos a una descomposición acelerada de la pulpa con el objetivo de reducir la acidez de las

semillas, limitando la cantidad de sustratos (azúcares de pulpa) disponibles para la producción de

ácidos orgánicos y aumentando la aireación de la masa de fermentación (Schwan, 2014). El

resultado que se obtiene gracias a las levaduras son los numerosos compuestos volátiles cuya

mezcla compleja define sus atributos sensoriales.

Los compuestos volátiles tienen diferente origen: a) Pueden estar contenidos en la

materia prima y variar entre especies, regiones geográficas y entre condiciones climáticas de

cultivo; o b) pueden generarse durante la fermentación en función de la cepa, características del

mosto y condiciones del proceso, incluyendo durante la maduración del producto (Rodríguez,

2011).


Aprovechando la relevancia económica que presenta el departamento de Santander, en

conjunción con los pocos estudios que abordan la caracterización de las levaduras iniciadoras de

la fermentación, se hace necesario comprender y caracterizar estos actores fundamentales del

proceso y a su vez valorar la contribución de especies de levaduras que le proporcionan

características de textura, olor y sabor al proceso de transformación de cacao. El rol de los

microorganismos presentes en este proceso hablando de la diversidad de los tipos de cacao podrá

ofrecer desarrollo al momento de realizar un cultivo óptimo para mejorar la fermentación,

adquirir aromas deseados en el chocolate, obtener productividad constante en la fermentación y

una excelente calidad en condiciones controladas.

La caracterización de estos actores fundamentales permitirá desarrollar cultivos

iniciadores comerciales que perfilen características deseadas durante el proceso de fermentación

modulado por las levaduras proporcionando excelentes cualidades organolépticas al producto

terminado, que permitirán la inclusión al comercio. La industrialización de la fermentación del

cacao colombiano proporcionaría un mayor control sobre la calidad de los granos y el chocolate

derivado de ellos. (Batista et al., 2016). A partir de este proceso se pretende que durante la

fermentación los cultivos iniciadores se basen en levaduras ya que estos microorganismos son

necesarios para obtener una transformación exitosa de la almendra. (Ho, et al 2015).

Esta investigación hace parte de un macro proyecto que pretende establecer cultivos

iniciadores en la fermentación del cacao en Santander asociando las cepas a la producción de

compuestos volátiles de interés. En este trabajo, se presenta la identificación molecular de las

levaduras aisladas, mediante la amplificación de regiones informativas del ribosoma 26S y 5.8S

de las levaduras, como lo son el espaciador transcrito interno (ITS) y NL, usando reacción en

cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas inglés), y comparando con las secuencias


consignadas en el repositorio del Centro Nacional para la información biotecnológica (NCBI),

además de realizar análisis filogenético para poder observar las relaciones entre las levaduras

aisladas que serán el insumo para el contraste posterior con la producción de compuestos

volátiles.

Considerado este panorama, se plantea la siguiente pregunta de investigación:

¿Qué especies de levaduras cultivables con producción de compuestos volátiles de

interés, predominan en la fermentación espontánea del cacao?


3. Objetivos

3.1 Objetivo General

Realizar la caracterización molecular de levaduras cultivables asociadas a la fermentación

espontánea del cacao, amplificando el gen 26S y la región ITS1-5.8S.

3.2 Objetivos Específicos

Establecer los parámetros de reacción y amplificación para el gen 26S y la región ITS1-

5.8S

Identificar las levaduras aisladas asociadas a la fermentación espontánea del cacao.

Establecer la relación filogenética entre las levaduras identificadas y otras especies

reportadas.


4. Marco Referencial

4.1 Estado del Arte

La fermentación de la pulpa de los granos de cacao por microorganismos es esencial para

desarrollar los precursores del sabor a chocolate. Actualmente, la fermentación del cacao todavía

se realiza mediante un proceso tradicional no controlado a través de un consorcio de especies

nativas de levaduras, bacterias del ácido láctico y ácido acético.

Estudios como el de (Zhao, & Fleet, 2014) utilizaron un enfoque novedoso para

determinar el papel de las levaduras y su contribución a la calidad del chocolate, empleando 2

tipos de cajas de fermentación: a la primera le agregaron natamicina (aditivo alimenticio

inhibidor de levaduras) mientras que la segunda se manejó una fermentación normal (control).

Demostraron que levaduras como Hanseniaspora guilliermondii, Pichia kudriavzevii y

Kluyveromyces marxianus fueron las especies principales encontradas en la fermentación. Su

identificación se llevó a cabo mediante extracción y amplificación de PCR empleando cebadores

específicos para la región de ADNr 5.8S-ITS como ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)

e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′). Posteriormente los datos obtenidos se

sometieron a la base de datos GenBank donde se identificaron comparando la homología de

secuencia con los datos disponibles.

Los análisis fisicoquímicos realizados mostraron que los granos fermentados sin

levaduras tenían un mayor contenido de cáscara, y menor producción de etanol, además de

mayor cantidad de ésteres durante la fermentación y una menor presencia de pirazinas en el

producto tostado, además de esto, los granos eran de color violeta violáceo más no


completamente marrones; el chocolate preparado a partir de estos granos sabía más ácido y

carecía del sabor característico del chocolate. Los granos fermentados con crecimiento de

levadura fueron completamente de color marrón y dieron chocolate con caracteres típicos que

fueron claramente preferidos por los paneles sensoriales. Estos hallazgos demuestran que el

crecimiento y la actividad de la levadura fueron esenciales para la fermentación del grano de

cacao y el desarrollo de las características del chocolate.

Otro estudio realizado por (Jespersen et, al 2015) donde identificaron 496 cepas de

levadura a través de análisis microbiológicos convencionales y mediante la amplificación de sus

regiones ITS1-5.8S rDNAITS2 y secuenciación del dominio D1/D2 del ADN ribosómico de

subunidad grande (26S); empleando el uso de primers ITS1 (5’ -TCC GTA GGT GAA CCT

GCG G-3’ ) e ITS4 (5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ) para la primera región y NL-1

(5’ -GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) y NL-4 (5’ -GGT CCG TGT TTC AAG

ACG G-3’) fueron utilizados para la amplificación del dominio D1/D2. El estudio menciona que

tomaron muestras de granos de cacao en dos ocasiones distintas durante las fermentaciones en

pila y en bandeja en Ghana, África Occidental. Encontraron que Candida krusei era la especie

dominante durante la fermentación en pilas, seguida por P. membranifaciens, P. kluyveri,

Hanseniaspora guilliermondii y Trichosporon asahii, mientras que Saccharomyces cerevisiae y

P. membranifaciens fueron las especies dominantes durante la fermentación en bandeja, seguida

de números bajos. de C. krusei, P. kluyveri, H. guilliermondii.

Probablemente las sucesiones microbiológicas observadas durante la fermentación del

cacao tanto en las pilas y las bandejas se deban a cambios en el microambiente, es decir, cambios

en la disponibilidad de nutrientes, pH, temperatura, presencia y concentración de ácidos

orgánicos, así como en la concentración de oxígeno. Es por esto que el aumento relativo de P.


membranifaciens durante la fermentación del cacao podría estar relacionado con su tolerancia

hacia un pH bajo y una alta concentración de ácidos orgánicos, incluido el ácido acético. Se ha

informado que P. membranifaciens adicional inhibe el crecimiento de Hanseniaspora spp. en

frutos, seguramente debido a la competencia del sustrato o la producción de sustancias

inhibidoras, como Hanseniaspora spp. son bastante sensibles al etanol y otros metabolitos

secundarios. También se ha informado que las cepas de P. membranifaciens y P. kluyveri

producen micocinas que inhiben otras levaduras como S. cerevisiae y Candida spp. Las cepas de

C. krusei aisladas de la masa de maíz fermentado autóctono en Ghana han demostrado

previamente ser más tolerantes a la presencia de ácidos orgánicos que S. cerevisiae

Arana et al, (2015) mencionan que en México el proceso de fermentación del cacao es un

paso muy importante para la generación de compuestos aromáticos, que son atribuibles al

metabolismo de los microorganismos involucrados. Existen algunos reportes sobre este proceso

y la identificación de microorganismos; sin embargo, no hay informes que identifiquen las

levaduras involucradas en un proceso de fermentación de cacao mexicano utilizando técnicas de

biología molecular, incluido el polimorfismo de longitud de fragmento restringido (RFLP) y la

electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Su principal enfoque en este estudio

fue identificar las principales especies de levaduras asociadas con las fermentaciones de cacao

mexicano empleando técnicas dependientes e independientes del cultivo logrando dos muestreos

con una diferencia de tiempo de 1 año en el mismo sitio.

Con la aplicación de métodos moleculares, la técnica independiente del cultivo (PCR-

DGGE), se vertió 1 µL de ADN microbiano total extraído de los granos de cacao en cada tiempo

de fermentación en un tubo que contenía un PureTaq Ready-To-Go PCR Beads junto con el

NL1GC (5’-CGC -CCG-CCG-CGC-GCG-GCG-GGC-GGGGCG-GGG-GCA-TAT-CAA-TAA-


GCG-GAG-GAA-AAG3’) y LS2 (5’-ATT-CCC-AAA-CAA-CTC-GAC- TC-3’), posterior a

esto se realizó la secuenciación del dominio D1 / D2 del gen 26S rRNA empleando los primers

NL1 (5’ -GCA-TAT-CAATAA-GCG-GAG-GAA-AAG-3’ ) y NL4 (5’ -ATTCCC-AAA-CAA-

CTC-GAC-TC-3’ ) mediante parámetros guiados por otros autores. Los resultados arrojaron que

la levadura predominante con la técnica en DGGE corresponde a Hanseniaspora sp, seguida de

P. kudriavzevii y P kluyveri sin embargo Saccharomyces cerevisiae fue la principal especie

aislada en ambas ténicas. Los autores mencionan que la diferencia en ambas técnicas con

respecto a las levaduras encontradas se debe a la sensibilidad de DGGE, lo que indica que si una

especie se encuentra en una relación de 10:1 a 100:1, la intensidad de la banda podría ser muy

débil o incluso desaparecer.

Koné et, al (2016) refiere que el sabor del cacao es la propiedad organoléptica más

importante para los consumidores de chocolate. Los granos de cacao crudo de Costa de Marfil no

son conocidos por su excelente calidad de aroma. En búsqueda de la mejora de la calidad del

cacao crudo, este estudio abordó la determinación y control de las condiciones de formación del

compuesto aromático teniendo en cuenta determinar la contribución potencial de la levadura

asociada a la fermentación a la formación de perfiles sensoriales para los granos de cacao. Se

Utilizó métodos moleculares como PCR, se amplificó un fragmento de la región D1 / D2 del gen

de ADNr 26S utilizando cebadores universales tales como NL1 GC (5'-CGC CCG CCG CGC

GCG GCG GGC GGGGCG GGG GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G-3 '; Sigma);

LS2 (5'-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3 '; Sigma), y algunos métodos sensoriales para

determinar el potencial de contribución de sabor de algunas levaduras predominantes aisladas de

ensayos de fermentación de cacao realizados alrededor de Abidjan.


Se encontró que durante el proceso de identificación un total de diez especies de levadura

involucradas en la fermentación del cacao, pero entre ellas, seis cepas fueron identificadas como

Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Pichia kudriavzevii, Pichia

galeiforms, Galactomyces geotrichum y Wickerhamomyces anomalus. Estas levaduras

identificadas produjeron un total de 33 compuestos aromáticos agrupados en cuatro familias

como ésteres, alcoholes, ácidos y otros. Entre todas las levaduras involucradas en la

fermentación realizada en Abidjan, P. kudriavzevii, S. cerevisiae, G. geotrichum y W.

anomaluspodrían se consideran como los contribuyentes más importantes a la formación de

compuestos aromáticos específicos del cacao. Estas capacidades de producción de aroma de

cacao de los aislados de levadura podrían usarse para mejorar el perfil sensorial de granos de

cacao crudos u otros alimentos fermentados. Además, algunos aislados de levadura específicos

pueden usarse como marcadores biológicos para predecir la determinación de las características

sensoriales del chocolate e indicar el origen geográfico o la historia de procesamiento de los lotes

de granos de cacao.

Un estudio reciente realizado en Colombia por (Delgado et, al 2020) donde explica que

las levaduras juegan un papel importante en el proceso de fermentación del cacao. Aunque la

función más relevante es la degradación de los azúcares y la producción de etanol, hay poca

comprensión de las actividades y atributos de las enzimas que les permiten sobrevivir incluso

después del secado. Exploraron la biodiversidad funcional de levaduras asociadas con granos

fermentados de cacao criollo colombiano, capaces de sobrevivir después del secado.

Se aislaron e identificaron 12 especies pertenecientes a 10 géneros de levaduras tolerantes

a osmo, ácido, termo y desecación a partir de granos de cacao fermentados y secos, mediante

técnicas moleculares como el uso de PCR, el ADN de todos los aislamientos se sometió a


polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de la región ITS1-5.8S rRNA-

ITS2 (ITS). La región ITS se amplificó con los cebadores ITS1 (5'-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') y la

identificación a nivel de especie se confirmó mediante la secuenciación del bucle D1-D2 del gen

que codifica el rRNA 26S, después de la amplificación con los cebadores NL1 / NL4 para

obtener un producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las levaduras destacadas

fueron Pichia kudriavzevii y S. cerevisiae como las más frecuentes. Por primera

vez reportamos la presencia de Zygosaccharomyces bisporus en granos de cacao fermentados. Se

encontró que la resistencia a la desecación está relacionada con las diferentes capacidades de

degradación de los sustratos de fermentación, lo que sugiere que pueden existir relaciones

asociativas entre las diferentes especies de levaduras y sus productos de degradación. Además, el

aumento de la termo tolerancia de algunas especies se relacionó con la presencia de polifenoles

en el medio, que podrían jugar un papel fundamental en la conformación de la composición de la

comunidad microbiana.

4.2 Marco Teórico

4.2.1 Proceso de Fermentación del Cacao

Los granos de cacao pertenecientes al árbol (Theobroma cacao) son la principal materia

prima para la producción de chocolate; están cubiertos por una mazorca o vaina que tiene entre

30 y 40 granos cubiertos con una capa mucilaginosa de aspecto viscoso y adherente. Como parte

del proceso de la fabricación del chocolate, se realiza una serie de trabajos que comprenden


desde la recolección, tostado, y conchado que se encargan de potencializar el sabor característico

del chocolate. (Afoakwa et al., 2011; Lima et al., 2011; Schwan y Wheals, 2014).

Cuando la transformación inicia, el cacao crudo mantiene un sabor astringente y

desagradable es por esto que la fermentación es un paso esencial para eliminar la capa de pulpa

que los cubre y al mismo tiempo desarrollar precursores de sabor que destacan al chocolate

(Fowler, 2011; Thompson et al., 2013). Para llevar a cabo una fermentación antes de obtener el

producto terminado, puede realizarse en dos sistemas de fermentación como las pilas y charolas,

en el primer sistema se hacen pilas de estos granos rompiendo las vainas acumulándolos para ser

volteados cada 24-72 horas respectivamente para asegurar que el aire circule entre ellos. El

segundo sistema consiste en usar charolas posicionando los granos de cacao en capas delgadas y

luego acomodar las charolas una encima de otra, de tal manera que el aire pase a través de ellas y

que al mismo tiempo no sea necesario mover los frijoles cada cierto tiempo.

La ecología microbiana y el rol que llevan a cabo este proceso natural o espontáneo

surgen en la pulpa como sustrato de fermentación que tiene las condiciones adecuadas para el

crecimiento microbiano como diversas levaduras, bacterias del ácido láctico (BAL) y bacterias

del ácido acético (BAA) que se desarrollan entre sí. Dentro de las levaduras aparecen entre 5 y

6 especies diferentes como Dedaryomyces, Hansenulaa, Kloeckera, Rhodotorula, y Torulopsis

que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniaspora que es la predominante durante las

primeras 24 horas, Saccharomyces y Pichia priman durante las 36-38 horas y Cándida suele

encontrarse al final o en todo el proceso de la fermentación, Las especies encontradas con mayor

frecuencia son S. cerevisae, C. krusei, K. apiculata, H. anomala Pichia fermentans, y

Schizosaccharomyces pombe (Ardhana y Fleet, 2013; Maura et al., 2016; Jespersen et al., 2015;

Nielsen et al., 2010).


Dentro de las bacterias del ácido láctico (BAL) se encuentran Lactobacillus plantarum y

Lactobacillus fermentum crecen con mayor frecuencia, aunque a veces se informan

contribuciones de las especies Pediococcus y Leuconostoc (Camu et al., 2010b; Kostinek et al.,

2014; Nielsen et al., 2010). Y más tarde bacterias del ácido acético (BAA) como Acetobacter

pasteurianus es con frecuencia el principal contribuyente, pero otras especies también están

involucradas, incluidas Gluconobacter oxydans, Acetobacter tropicalis, Acetobacter lovaniensis

y Acetobacter syzygii (Ardhana y Fleet, 2013; Camu et al., 2010b; Lefeber et al., 2011; Nielsen

et al., 2010).

4.2.2 Roles de los Microorganismos Involucrados en la Fermentación

4.2.2.1 Levaduras. Las levaduras son hongos unicelulares constituidas en su mayor parte

por células aisladas suelen ser esféricas, elipsoidales/ovoides, cilíndricas con terminaciones

esféricas, apiculadas, ojivales, triangulares, encorvadas, filamentosas. Las dimensiones pueden

oscilar entre 1-3 μM hasta los20-50 μM de longitud según la especie, nutrición, edad y otros

factores que tenga previsto durante su desarrollo. Es posible encontrar levaduras formadoras de

pigmentos que comprende la gama de colores entre los que destacan crema, blanco, negro, rosa,

rojo, naranja y amarillo (Kurtzman, Fell y Boekhout, 2011).

Su reproducción puede realizarse de forma sexual mediante esporulación formando

esporas haploides que luego podrán conjugarse para producir células diploides y seguir con el

ciclo de reproducción, mientras que la reproducción asexual ocurre gemación, fisión y por la

producción de blastoconidias en tallos conocidos como esterigmas (Cabej, 2012).


Relacionado a su forma morfológica las levaduras pueden clasificarse en dos grupos

filogenéticos: “Levaduras ascomicetes y Basidiomicetes”. La primera clase forman ascas libres

establecidas entre 1 a 8 ascosporas haploides producidas como resultado de cariogamia y meiosis

haciéndolas más resistentes al calor y a la desecación manteniendo la viabilidad de la especie

durante los cambios adversos del medio ambiente. Las levaduras basidiomicéticas forman un

basidio cilíndrico y alargado en cuyo extremo se originan las basidiosporas, aunque también

suelen presentar pseudohifas y clamidosporas cuya reproducción se da de forma asexual

mediante gemación (Cabej, 2012).

Dentro de las características fisiológicas, La mayoría de las levaduras crecen a una

temperatura entre 5° y 37°C obteniendo un valor óptimo situado hasta los 28°C. Sin embargo, en

ambientes naturales su temperatura óptima puede variar rigurosamente. Por lo general las

levaduras que habitan en la superficie, se encuentran expuestas a temperaturas máximas que van

desde los 40°C a 55°C bajo condiciones de luz intensa o a temperaturas mínimas osciladas entre

los 5°C a 10°C durante la noche. En cuanto al pH, el crecimiento óptimo para las levaduras

oscila entre4,5 a 6,5 aunque existen especies que toleran grandes variaciones del pH entre 2,8-3 a

2-8,5 (Kurtzman et, al 2011).

La ecología unicelular de las levaduras las adapta mejor a sustratos líquidos o húmedos y

algunas superficies irregulares por lo que estas se hallan típicamente en estos ambientes donde

prevalezcan nutrientes simples, solubles como azúcares y aminoácidos ricos en fuentes de

carbono. Algunas levaduras son osmotolerantes y soportan una actividad de agua (Aw) del orden

de 0.65 dependiendo de las propiedades nutritivas del sustrato, disponibilidad de oxígeno, pH y

temperatura; mientras que el efecto de la presión osmótica varia de una cepa a otra (Kurtzman et,

al 2011).


Cuando el oxígeno está presente, todas las levaduras son aeróbicas ya que éstas crecen

eficientemente gracias a la presencia de carbohidratos del medio para la producción de biomasa y

CO2. Sin embargo, sin la presencia de oxígeno o su disminución, las levaduras cambian su

metabolismo anaerobio o fermentativo, y también así una menor cantidad de biomasa y

producción de alcohol (Sarmiento 2013).

Las levaduras inician la fermentación alcohólica a partir de los azúcares de la pulpa

generando etanol y ácido acético. El proceso comienza desde el ingreso al frijol para matar al

embrión y desencadenar reacciones bioquímicas endógenas que producen los precursores del

sabor a chocolate. Se cree que el ácido acético se produce por bacterias ácido-acéticas a través de

la oxidación de parte del etanol producido por las levaduras. Esta última reacción genera calor

que provoca la fermentación. La temperatura de granos aumenta a 45-50 ° C, también

considerada esencial para una fermentación exitosa y el desarrollo del sabor a chocolate (Zhao et

al, 2014).

Algunas levaduras, como Candida spp. y Pichia spp., metabolizan el ácido cítrico

haciendo que el valor del pH aumente en la pulpa, permitiendo el crecimiento de bacterias

presentes. La pérdida de ácido cítrico por el metabolismo microbiano provoca una deriva alcalina

en el pH. Esto, junto con los niveles crecientes de alcohol y aireación, inhibe las levaduras y su

actividad disminuye. Además, algunos de los aislados de levaduras producen ácidos orgánicos,

incluidos los ácidos acético, oxálico, fosfórico, succínico y málico. Estos ácidos orgánicos

débiles tendrán una capacidad de amortiguación y tenderán a reducir las fluctuaciones en el pH

(Maura et al, 2016).

Estos microrganismos tienen potencial de producción de una gran variedad de

compuestos aromáticos, principalmente, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y algunas


especies producen aromas diferentes. Se sabe que los compuestos volátiles son importantes en el

desarrollo del sabor a chocolate completo (López, 2013). Se han identificado cinco levaduras

principales que producen estos compuestos volátiles: Kloeckera apiculata, S. cerevisiae, S.

cerevisiae var. chevalieri, Candida sp. y Kluyveromyces marxianus las cuales han sido

estudiadas particularmente. Por su parte cepas como Kloeckera apiculata y S. cerevisiae son las

principales productoras de volátiles como el acetato de isopropilo, acetato de etilo, metanol, 1-

propanol, alcohol isoamílico, 2,3-butanodiol, succinato de dietilo y 2-feniletanol (Lima et al,

2011).

Por otro lado, existen cepas productoras de enzimas pectinolíticas como K. marxianus, S.

cerevisiae, Candida rugopelliculosa y K. thermotolerans que descomponen el cemento entre las

paredes de las células pulpares y el jugo resultante (o "miel de cacao") se drena como "sudor".

Esta actividad enzimática es crucial durante las primeras 24 horas porque descompone la pulpa y

permite la penetración de oxígeno en la masa de cacao en fermentación, lo que permite que

crezcan bacterias aeróbicas de ácido acético (Lima et al, 2011).

4.2.2.2 Bacterias. La gran mayoría de las bacterias de ácido láctico aisladas durante la

fermentación del cacao utilizan glucosa a través de la vía de Embden-Meyerhof produciendo más

del 85% de ácido láctico. Sin embargo, algunas especies emplean glucosa a través de la ruta de

hexosa monofosfato que produce 50% de ácido láctico y etanol, ácido acético, glicerol, manitol y

CO2. Su proporción relativa cambiará así la composición del sustrato de la pulpa y, en

consecuencia, puede cambiar la sucesión microbiana (Soto et al, 2011).

Además, contribuyen primero a un aumento de la acidez al producir ácido cítrico y luego

reducen el pH al metabolizarlo y liberar subproductos no ácidos La disimilación de estos ácidos


conduce a una caída general de la acidez y un aumento del valor del pH para dar lugar al proceso

a las bacterias del ácido acético (Madigan et al, 2010).

Las bacterias del ácido acético son responsables de la oxidación del etanol en ácido

acético y de la oxidación posterior de este último en dióxido de carbono y agua. Las reacciones

exotérmicas de las bacterias del ácido acético elevan la temperatura de la masa fermentada, a

veces a 50 ° C o más. La acidez de los granos de cacao, la alta temperatura en la masa de

fermentación y la difusión e hidrólisis de proteínas en los cotiledones se han atribuido al

metabolismo de estos microorganismos. El etanol, los ácidos y el agua que se difunden en el

cotiledón actúan como solventes para que los componentes celulares se transporten a los sitios de

actividad enzimática y viceversa. (Drake, 2012).

4.2.3 Métodos de Identificación Molecular

La identificación molecular de levaduras, posee valor práctico para el desarrollo de

métodos y herramientas para la identificación rápida y precisa los métodos moleculares de

identificación de levaduras y microorganismos en general, se basan en el estudio de las

moléculas de DNA y RNA. En levaduras estos estudios se iniciaron con complementariedad del

DNA nuclear, determinándose la existencia de relaciones coespecíficas entre cepas cuyos

caracteres fisiológicos y morfológicos que se consideran determinantes para discernir entre

especies que son diferentes

A continuación, se describen todos estos métodos, los cuales han permitido el desarrollo

de herramientas de identificación de aplicación biotecnológica para el esclarecimiento de

relaciones filogenéticas entre especies y géneros de levaduras de interés.


4.2.3.1 Métodos Basados en el Análisis de Regiones Ribosómicas. Las subunidades

(5.8S, 18S, y 26S) que codifican los genes ribosomales están dispuestas en tándem formando así

unidades de transcripción que se repiten en el genoma de las levaduras alrededor de 100 y 200

veces (figura 1).

Existen 2 regiones de transcripción como los espaciadores internos (ITS) y los externos

(ETS), que son divisiones procesadas que no forman parte de la molécula de ARNr final, pero se

transcriben constantemente.

A su vez estas unidades codificantes están separadas por espaciadores intergénicos (IGS)

que son llamados NTS.

Cuando se trata de identificación de levaduras las regiones ribosomales que se tienen en

cuenta son el dominio D1/D2 de la subunidad grande ribosomal (gen 26S) que se emplea para

cepas levaduriformes de taxomia ascomiceta (Kurtzman & Robnett, 2011) y la región que

comprende los espaciadores transcritos internos y el gen ribosomal 5.8S (ITS1-5.8S rADN-ITS2)

se emplea para levaduras ascomicetas como basidiomicetas.

Se ha tenido en cuenta que la región ITS ha sido catalogada como una de las principales

para la identificación de levaduras puesto que su sistema de identificación llega hasta nivel de

especie ofreciendo un mayor porcentaje de confianza, cuando se encuentra una identidad igual o

superior al 99% con secuencias depositadas en bases de datos como Genbank o Mycobank, una

levadura es identificada a nivel taxonómico de especie (Kurtzman et al., 2011)


Figura 1

Estructura del ADN Ribosómico Nuclear

Nota: en la figura se puede observar el Claster de genes del ADN ribosomal, se encuentran las unidades 18S, 5.8S y 26S. 2020.

4.2.3.1.1 Secuenciación de Regiones Ribosómicas. Este método es bajo la

determinación y comparación de secuencias nucleotídicas de estas regiones. Como se ha

mencionado anteriormente; las dos regiones más utilizadas son las correspondientes a los

dominios D1 y D2 ubicados en el extremo 5’ del gen 26S (Kurtzman y Robnett, 1998) y el gen

18S (James y col., 1997). La disponibilidad de las secuencias en bases de datos, sobre todo en el

caso de la región D1/D2 del gen 26S, hacen que esta técnica sea muy útil para asignar o

identificar una levadura desconocida a una especie concreta cuando el porcentaje de homología

de sus secuencias es superior o igual a 99% (Kurtzman y Robnett, 1998). Además, el desarrollo

de la PCR, que permite la secuenciación directa de las regiones de interés, junto con las

modernas tecnologías de secuenciación automática, hacen que la aplicación de esta técnica sea

relativamente rápida. (Li et al 2012).

4.2.3.1.2 Polimorfismo de Longitud en los Fragmentos de Restricción del rDNA/rRNA

(RFLPs). La técnica de RFLP de las regiones ITS-5.8S, se desarrolló como una alternativa de

identificación de levaduras de manera rápida para su utilización, su determinación del

polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción se basa en la diferenciación de los


organismos mediante el análisis de los patrones de ruptura que se generan en el sitio específico

del genoma cuando este es cortado empleando enzimas de restricción. Luego en un gel de

electroforesis se muestra el patrón de bandas polimórficas correspondientes a los fragmentos de

distintos tamaños, que se generan con el corte de cada endonucleasa. La similitud de los patrones

que son generados después de este proceso permite establecer relaciones entre especies y cepas

cuya existencia de patrones son únicos permitiendo la identificación (Henrick, 2010).

4.2.3.1.3 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). La técnica de PCR

seguida de una electroforesis en gradiente de desnaturalización se ha introducido recientemente

Mediante PCR-DGGE, los fragmentos de DNA con distintos tamaños, pero diferente secuencia

puede ser divididos en geles de poliacrilamida que tiene un gradiente linear de agentes

desnaturalizantes de DNA (es una mezcla de urea y formamida). En dicho gel de DGGE, la

doble hebra que tiene el ADN se va desnaturalizando poco a poco puesto que contiene regiones

discretas llamadas dominios de fusión que es específica para la secuencia. Cuando el fragmento

aparece parcialmente desnaturalizado, su movilidad se reduce en el gel de poliacrilamida. Así,

fragmentos del mismo tamaño, pero distinta secuencia mostrará distinto comportamiento en el

gradiente de desnaturalización (Ercolini, 2014).

4.2.3.1.4 PCR en Tiempo Real. La técnica se basa en la detección y cuantificación de una

sonda fluorescente cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR

en la reacción. El proceso, se lleva a cabo en un termociclador que tiene un sistema de detección

capaz de capturar y cuantificar la señal emitida por el donante (ADN con sonda) al final de cada

ciclo para cada muestra. La información obtenida se representa como una curva de amplificación


que proporciona información de la cantidad de ADN que se amplifica. Este número de ciclo se

denomina ciclo umbral (Ct) y es inversamente proporcional al número de copias de la muestra

(cantidad de ADN). Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la cantidad inicial de la muestra

numéricamente (ADN o células) con gran precisión, dentro de una amplia gama de

concentraciones (Fernández-Espinar et al., 2016).

4.3 Marco Legal

Para este proyecto los experimentos se realizaron solamente a nivel de laboratorio con

fines de investigación, los materiales y sustancias que se generaron como efecto de este trabajo

fueron contenidos y destruidos de acuerdo con las medidas de bioseguridad implementadas por

el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la UDES, por lo que las actividades del

proyecto no generaron impacto ambiental. Con el fin de garantizar la trazabilidad de los

resultados, la seguridad del experimentador y demás individuos durante la ejecución de los

procedimientos y el análisis de las muestras, se tomaron en cuenta las Buenas Prácticas de

Laboratorio (BPL) establecidas por el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología. Esta

investigación no involucró seres humanos o derivados.

De acuerdo con la Resolución Nº 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de la

República de Colombia del 4 de octubre de 1993, por la cual se establecen las normas científicas,

técnicas y administrativas para la investigación en salud, esta investigación tuvo en cuenta el

Título IV de la bioseguridad de las investigaciones, Capítulo I de la investigación con

microorganismos patógenos o material biológico que pueda contenerlos. Principalmente, en sus

artículos 63-66, 68 y 71 en donde se dispone la normatividad para el manejo de estos


microorganismos. Las levaduras que se usaron en este estudio hacen parte del grupo de riesgo I y

II (nulo o bajo riesgo al individuo o la comunidad y riesgo individual moderado) En cuanto a la

manipulación de estas cepas, el artículo 68 dispone que deben procesarse en laboratorios básicos

de microbiología empleando gabinetes de seguridad cuando se considere necesario.


5. Hipótesis

5.1 Hipótesis Nula

El resultado de la amplificación de las regiones del ADN ribosomal seleccionadas

permitirá la clasificación de las levaduras aisladas del proceso de fermentación espontánea del

cacao hasta el nivel de especie.

5.2 Hipótesis Alternativa

El mayor número de especies de levaduras identificadas corresponderá a los géneros de

Cándida y Saccharomyces.


6. Método

6.1 Diseño del Estudio

Investigación tipo experimental

6.2 Metodología

Figura 2

Esquema General de la Metodología

Nota: en la figura se puede observar el resumen general de la metodología empleada en este estudio. 2020.


6.3 Materiales y Métodos

6.3.1 Cultivo de Levaduras de Interés

Las levaduras de interés se cultivaron por agotamiento en los agares YCG y Sabouraud

(proceso realizado en el laboratorio CICTA de la Universidad Industrial de Santander, sede

Guatiguará) con un periodo de incubación de 48h a 30°C. Una vez cumplido este lapso se tomó

un inoculo para siembra en medio líquido (Caldo Sabouraud 2%) incubándolas a 30°C por 24h,

posteriormente, se transportaron a la universidad de Santander UDES, para su posterior

procesamiento.

6.3.2 Extracción y Cuantificación de ADN Genómico

Se empleó el kit de extracción de ADN genómico Wizard®, (Promega) (Epicentre®

Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA) según instrucciones del fabricante y las

modificaciones sugeridas por Serrano Blanco (2017). El proceso de extracción se basó en tres

momentos: a partir de 1 ml de caldo de cultivo Sabouraud se llevó a centrifugación a 7,000 rpm

× 20 minutos para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante. Se transfirió la muestra a un

tubo de 1.5ml de micro centrífuga y se realizó la precipitación de células agregando 293µl de

EDTA (50mM), el pretratamiento de lisis de pared celular con 125µl de Proteinasa K y se llevó

una incubación a 37°C por 1 hora luego se empleó vórtex por 2 minutos, finalmente se

centrifugó 11,000 g × durante 4 minutos y se removió el sobrenadante.

La segunda etapa corresponde a la lisis celular y la precipitación de detritos, se adicionó

de 300µl de Solución nuclear de lisis y 100µl de Solución de precipitación de proteínas; se llevó


vigorosamente a vórtex por 20 segundos. Durante 5 minutos se dejó la muestra a -20°C y se

centrifugó a 11,000 g × por 3 minutos.

Finalmente, en la tercera etapa que corresponde a la precipitación y lavados del ADN; se

transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5ml de micro centrífuga y se añadieron 300µl de

isopropanol mezclando por inversión hasta encontrar la visibilidad de hebras de ADN genómico,

se centrifugó a 11,000 × g por 4 minutos se descartó el sobrenadante y se añadieron 300µl de

etanol al 70% para lavar el pellet de ADN y centrifugarlo a 11,000 × g por 2 minutos.

Posteriormente se descartó el sobrenadante y se dejó secar el etanol durante 10-15 minutos.

Se añadieron 30µl de Solución de Rehidratación de ADN y 1,5µl de solución de RNasa a

la muestra de ADN purificada; se agitó en vórtex durante 1 segundo y se centrifugó brevemente

a 4,000 rpm × 20 segundos para colectar el líquido e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. Se

rehidrató el ADN incubándolo a 65°C durante 1 hora y añadió posteriormente 25µl de Solución

de Rehidratación de ADN y se almacenó toda la noche a 4°C para su posterior uso.

Por otro lado, la cuantificación del ADN genómico se realizó mediante el uso de

espectrofotometría con una (OD260) tomando alrededor de 1,5 a 2 µL de cada muestra en el

Nanodrop 2000. La cantidad de ADN se expresó en concentraciones de ng/µl.

6.3.2.1Amplificación por PCR. El ADN extraído se utilizó para realizar PCR y

amplificar las subunidades del ribosoma específicamente los genes 26S del dominio D1/D2 y

5.8S que comprenden las regiones ITS y NL. El mix de reacción de 2x contiene: Buffer Green

1x, MgCl2 a 1,8mM; dNTPs a 0.2 mM; primers ITS1 a 100μM (5’-TCC GTA GGT GAA CCT

GCG G-3’) e ITS4 a 100μM (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´); primers NL-1F (5’-GCA

TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) a 100μM y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG


G-3’) a 100μM; 25 U de Taq DNA polimerasa, entre 1 hasta 5μl de ADN dependiendo de la

levadura en estudio y completado con agua estéril.

Atendiendo los parámetros de PCR en una reacción de 50 μl según (Bornemann y Hartin,

2000) para la amplificación de las levaduras con los sets de primers ITS1 (5’-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´), fueron

utilizados para la amplificación de la región ITS1-5.8S rDNA-ITS2. Las reacciones se realizaron

en un termociclador automático (SimpliAmp Applied Biosystems A24811) En las siguientes

condiciones: desnaturalización inicial a 94 ºC durante 3 min; 30 ciclos de desnaturalización a

94ºC durante 2 minutos, anillaje a 60ºC durante 1 minuto, extensión a 72ºC durante 2,5 minutos;

elongación final a 72ºC durante 7 min; conservación a 4ºC.

Posteriormente la segunda amplificación se realizó básicamente según lo descrito por

(Crafack et al. 2013) con los primers NL-1F (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-

3’) y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) en las siguientes condiciones

desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, 30 ciclos a 94 ° C durante 90 s, anillaje a 53 ° C

durante 30 s y alargamiento a 72 ° C durante 90 s, seguido de una elongación final paso a 72 ° C

durante 10 min conservación a 4ºC

6.3.2.2 Electroforesis. El producto fue verificado por electroforesis utilizando un gel de

agarosa al 0.8% corrido a 80 V durante 70 minutos. Este se cargó con aproximadamente 10 µl de

muestra y se incluyó 6 µl de marcador de peso molecular de 1 kb (GeneRulerTM DNA ladder

ready to used, Thermo Fisher Scientific) en cada gel. Las bandas fueron evidenciadas mediante

el Sistema de documentación en gel GEL DOC, de BioRad


6.3.2.3 Purificación de PCR. Según instrucciones del fabricante; la purificación de PCR

se llevó a cabo mediante el kit Sigma Aldrich (GenElute Gel Extraction Kit Sufficient For 70

Purifications). La confirmación del ADN genómico purificado se realizaba en gel de agarosa al

0.8% corrido a 80 V durante 30 minutos. Este paso se realiza con el fin de obtener amplicones de

buena calidad eliminando los contaminantes como remanentes de Buffers, dNTPs, polimerasa,

mediante un simple centrifugado y obtener una recuperación de ADN hasta de un 80% según

indicaciones del kit empleado.

6.3.2.4 Secuencia y Filogenia. A partir de 20 µl de la reacción purificada se envió a

Corpogen (Bogotá, Colombia) realizando el método de secuenciación Sanger dichas secuencias

se recibieron en archivos tipo raw, fasta y electroferogramas de calidad del proceso para su

análisis bioinformático. Las secuencias se analizaron mediante la plataforma Quality Check de

Thermo Fisher con el fin de establecer su calidad. Posteriormente, utilizando el software

BioEdit, con la herramienta Contig Assembly program, se obtuvo la secuencia del amplicón

(Contig), estas son el insumo para el análisis de bases de datos y filogenia.

Posteriormente se tomó los “contigs” obtenidos para cada una de las secuencias, se

contrastaron con la base de datos del NCBI

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch#), de las coincidencias

identificadas se tomaron las secuencias con las identidades más altas (>85%), aleatoriamente se

seleccionaron entre dos o tres para poder realizar el set de datos. Los análisis filogenéticos se

realizaron de forma individual para cada uno de los aislados, y un árbol filogenético que reúne

todos los aislamientos identificados. Los parámetros para este ensayo se definieron: árboles

individuales, método de Neighbor Joining, bootstrap de 500 repeticiones. Para el set de datos de


los aislados identificados, se realizó análisis del conjunto de secuencias en MegaX (Kumar, et al,

2018) para identificar el modelo que soporta el árbol, el bootstrap se definió en 500.


7. Resultados

7.1 Extracción, Cuantificación y Purificación de ADN Genómico

Se aislaron y purificaron 70 cepas de levaduras obteniendo en promedio 337,51 ng/μl, la

relación de 260/280 determina la pureza del ADN, el rango óptimo está entre 1,8-2 para estas

muestras, la relación en promedio estuvo en 2,08 lo que denota que en la extracción no se

encuentran proteínas, lípidos o remanentes de alcoholes utilizados durante la extracción, sin

embargo, señala que pudo haber ARN en las muestras extraídas; a su vez, la relación 260/230

<1,5 mostrando contaminación con sales, el promedio de las extracciones fue de 1,58 lo que

significa presencia de sales en ciertas muestras, el detallado se describe en la (tabla 1)

Tabla 1

Concentración de ADN Levaduras Analizadas

Levadura Concentración

ADN (ng/µl) 260/280 260/230 Levadura

Concentración

ADN (ng/µl) 260/280 260/230

0 1 678 2,29 2,48 137 182,9 2,04 1,65

0 4 98,0 2,16 1,86 139 62,43 2,42 0,88

12 1102,7 1,99 2,11 140 65,63 2,25 0,86

17 103 1,61 1,06 141 54,06 1,74 0,78 19 495,6 2,17 2,1 143 1165,2 2,01 1,44

30 721,2 2,03 1,76 154 394,1 2,06 1,74

31 114,3 1,43 1,09 158 562,7 2,1 1,76

33 527,2 2,16 2,34 163 735,26 2,18 1,94

35 134 1,6 0,62 187 57,43 1,84 0,68

43 51,5 2,37 0,78 188 1145,6 2,13 2,26

44 173,1 2,08 1,73 195 114,96 2,33 1,21

45 105 1,26 0,64 200 90,26 1,69 0,75

52 43,1 1,25 0,57 211 53,4 2,36 0,65

70 289,4 2,13 1,73 218 922,26 2,23 2,31

71 259,36 2,23 2,04 219 243,2 1,82 1,14 73 242,4 2,01 1,5 227 63,5 2,26 0,71

74 618 1,99 1,85 231 465,76 1,98 1,24

81 891,1 2,18 2,39 232 348,8 2,02 1,53

85 476,2 2,15 2,14 233 291,53 2,04 1,98

87 269,4 2,1 1,89 236 25,96 2,77 0,53


Tabla 1 (Continuación).

Levadura Concentración

ADN (ng/µl) 260/280 260/230 Levadura

Concentración

ADN (ng/µl) 260/280 260/230

91 43,73 2,13 1,17 239 342,2 1,57 1,13

93 221,4 2,19 1,51 242 374,83 2,2 2,06

96 148,06 2,17 1,29 244 258,6 2,06 1,75

97 442 1,92 1,17 245 204,3 2,13 2,15

103 65,36 1,46 0,39 246 133,03 1,96 1,05 105 586,3 1,9 1,51 11C 544,5 2,06 2,09

107 107,46 1,79 0,75 13A 351,4 2,16 1,92

111 1252,5 2,28 2,36 29A 66,7 1,89 2,01

115 188,6 2,07 1,68 92A 21,6 2,36 0,92

117 300,8 2,17 2,28 99C 470,4 1,93 1,44

120 277,9 2,11 1,89 109SBA 54,7 1,83 0,88

131 936,6 2,04 1,94 110MRS 1859 2,24 2,37

132 75,56 1,89 0,56 112B 362,23 2,14 1,7

133 32,6 2,31 0,44 117A 128 2,19 1,84

134 298,6 2,3 1,8 173MRS 169,13 1,81 0,71

135 486,6 2,05 2,13 241B 40,56 1,85 0,49 136 229,4 2,12 1,84

Nota: en la tabla se observar la concentración ADN obtenido (ng/µL) de cada uno de los ensayos de extracción con

las relaciones 260nm y 280nm.2020.

7.2 Amplificación por PCR

La región que incluye el gen 5,8S y las regiones intergénicas ITS1 e ITS2 se amplificaron

utilizando los oligonucleótidos ITS-1 e ITS-4, los pesos moleculares de estas regiones se basan

en bandas entre 400 y 750pb.

Por otro lado, la amplificación del gen 26S se utilizaron los cebadores NL-1 y NL-4

cuyos pesos moleculares se mantienen entre los 600pb respectivamente

A continuación, se evidencian los resultados de amplificación mediante electroforesis en

gel de agarosa con los cebadores ITS1; ITS4 y NL-1; NL-4 para el primer y segundo set de

levaduras (figuras 3 y 4) en total se realizaron 8 sets de amplificaciones (ver apéndice A).


Figura 3

Electroforesis Gel de Agarosa Primer Set de Levaduras

Nota: (A) Primers ITS carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 99C, carril 3 lev 110 MRS, carril 4 lev 74,

carril 5 lev 232, carril 6 lev 11C, carril 7 lev 19, carril 8 lev 12, carril 9 control positivo lev 4, carril 10 control

negativo. (B) Primers NL carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 99C, carril 3 lev 110 MRS, carril 4 lev

74, carril 5 lev 232, carril 6 lev 11C, carril 7 lev 19, carril 8 lev 12, carril 9 control positivo lev 4, carril 10 control

negativo. 2019.

Figura 4

Electroforesis Gel de Agarosa Segundo Set de Levaduras

Nota: Electroforesis gel de agarosa (A) primers ITS carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 45, carril 3 lev

52, carril 4 lev 97, carril 5 lev 103, carril 6 lev 107, carril 7 lev 133, carril 8 lev 163, carril 9 lev 211, carril 10 lev

231. (B) primers NL, carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 45, carril 3 lev 52, carril 4 lev 97, carril 5 lev

103, carril 6 lev 107, carril 7 lev 133, carril 8 lev 163, carril 9 lev 211, carril 10 lev 231. 2019.

500 250

750

A

I

m

a

g

e

n

S

E

Q

B

I

m

a

g

e

n

S

E

Q

I

250

750 500

500 750

750 500 250

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1027-152X2009000500001&script=sci_arttext

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1027-152X2009000500001&script=sci_arttext


7.3 Análisis de Secuencia y Filogenia para cada Aislado

Una vez se obtuvo las secuencias para cada uno de los amplicones, se realizó la

verificación de la calidad de estas, la figura 5 describe detalladamente el proceso, ejemplificando

el análisis para el aislado 29A.

Esta herramienta se encarga de tomar las secuencias examinando los picos del

electroferograma realizando así una comparación entre los más adecuados y al finalizar propone

una secuencia corregida.

Según resultados obtenidos en la (Tabla 1) y las (Figuras 3 y 4) más (Apéndice A), se

lograron aislar, extraer y amplificar mediante PCR 70 cepas de levadura, en el momento de

realizar la secuenciación a través del método de Sanger junto con su respectivo análisis

evidenciado en la figura 5, la identificación completa se realizó solo para 40 cepas de levadura,

las 30 cepas restantes no se lograron identificar, pues las secuencias de los primers reversos no

tenían buena calidad, al hacer el ensamblado, la no especificidad de la secuencia arrojaba

resultados variables.

Para este grupo de secuencias se requiere, re secuenciar, y realizar nuevamente el

análisis.

En general el porcentaje de las secuencias obtenidas fueron de excelente calidad, para los

40 aislados identificados presentes en la tabla 2.


Figura 5

Análisis de Control de Calidad (Qualitycheck) para la Secuencia Obtenida de 29A NL-1F

Nota: en la figura se observa el control de calidad de la levadura 29A obtenidos con los primers NL, se muestra el

paso a paso en detalle. 2020.

Brevemente con cada uno de los cebadores se realizaron observaciones verificando su

calidad y una vez obtenidas las secuencias de las regiones amplificadas se procedió a hacer una

revisión de estas con las reportadas en las bases de datos internacionales GenBank utilizando

BLASTn (herramienta básica de búsqueda de alineación local).

La secuencia señalada en este paso B de la figura 5, es el inicio para la verificación de

afiliación parcial de cada una de las lecturas, porque se obtiene una secuencia “Forward”

corregida. Este mismo proceso se debe realizar para las lecturas “Reversas” de cada uno de los

primers utilizados. Con el fin de hacer el empalme de la secuencia completa Forward+Reverse


se debe obtener la complementaria de la reversa, este proceso se realizó en el software Bioedit

(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (Hall, et al 2011).

Finalmente, utilizando BioEdit, con la aplicación CAP (Contig assembly Program) se

obtiene la secuencia ensamblada. Con esta secuencia se realiza el análisis de identidad y

similitud en la base de datos del National Center for Biological Information (NCBI) utilizando la

herramienta Blast Nucleotide (Blastn)

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch)

Las lecturas con índice >200, se aceptaron, señalando que los alineamientos se acoplaron

exitosamente con secuencias consignadas en la base de datos, las identidades consideradas en la

identificación deben ser >98 y coberturas >98 los valores de E deben ser de 0. En general se

obtuvo 140 secuencias para el set de primers ITS y 140 secuencias para el set de primers NL,

posterior a este análisis se obtuvo una excelente lectura para 40 aislados (Tabla 2), los 30

aislados restantes, presentaron baja calidad en las secuencias, lo que requiere una nueva PCR y

re-amplificación para poder realizar un análisis preciso de cada una de ellas.

Para la afiliación filogenética de los aislados identificados se utilizó el software Mega,

versión X para la construcción de los árboles, las secuencias analizadas se alinearon utilizando la

herramienta ClustalW con secuencias conocidas, utilizando el método de Neighbor Joining con

el modelo de Kimura de dos componentes, para la confiabilidad estadística se realizó un

“bootstrap” de 500 para cada árbol filogenético obtenido.

Los pasos descritos se realizaron según se detalló en la metodología y se obtuvieron las

secuencias consenso para las levaduras de interés, la tabla 2 señala el resumen en la

identificación de las secuencias de interés.

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html


Tabla 2

Resumen Identificación Levaduras de Interés

Identificación Según Blast

Levaduras Denominación

17 Candida parapsilopsis

158 Candida sobosivorans

43 Criptococcus sp*

112B, 13A, 01, 12,105, 154, 188 Hanseniaspora opuntiae

143 Hanseniospora meyeri

74, 111, 131, 132, 218, 245, 99C 110MRS Pichia kluyverii

227, 239 Pichia kudriavzevii

117, 232 Pichia mashurica

246 Pichia occidentalis

45 Rhodotorula acuta

31 Rhodotorula mucilaginosa

19, 30, 33, 81, 85, 29A Saccharomyces cerevisiae

70, 96, 139, 140, 195, 109SBA Torulaspora delbrueckii

11C, 04 Wickerhamomyces anomalus

Nota: en la tabla se observa la identificación de levaduras según la base de datos GenBank, empleando Blast-n. 2020.

Según la tabla anterior, se obtuvo un 57,14% de identificación de levaduras con excelente

calidad en el momento de realizar el contig del set de primers ITS y NL sin sobrelapamientos en

las secuencias y picos bien definidos, mientras que el porcentaje restante, es decir, el 42,85% de

las secuencias con la finalidad de obtener su género y especie no se logró debido a la baja calidad

de los primers reversos en el momento de adquirir la secuencia consenso y dar finalidad al

proceso los picos mostrados en el electroferograma no eran bien definidos presentando quizá

contaminación de otra secuencia de ADN lo que interrumpían la identificación.

Para contrastar los resultados obtenidos con el NCBI se realizó un análisis filogenético

para cada uno de los aislados de interés, presentados en la tabla 2. Para el aislado 246,


identificado como Pichia occidentalis, en la región ITS se obtuvo lecturas en BLASTn con

índice >200, lo que muestra que los alineamientos se acoplaron exitosamente con secuencias

consignadas en la base de datos, con identidades de 99,76%, cobertura del 100% y valores E de

0, lo que señala que estos resultados son confiables y se puede estimar la identificación para este

aislado, para este fragmento se encontró una relación con Pichia kudriavzevii, al contrastar la

secuencia consenso para la región NL los índices, valores E y cobertura fueron idénticos a los

descritos para ITS, afiliando el aislado con Pichia kudriavzevii, Pichia occidentalis e

Issatchenkia occidentalis con un 99,82% de identidad.

Para definir esto se realizó un análisis para una única secuencia que reuniera la región

ITS y NL encontrándose que este aislado corresponde a Pichia occidentalis con 101 hits de 125

coincidencias halladas en el blast. La tabla 3 muestra la descripción taxonómica para los aislados

correspondientes a este género y especie.

A continuación, se evidencia la identificación a nivel filogenético de uno de los géneros

encontrados de las levaduras presentadas en la tabla 2 (ver apéndice B) para la identificación

completa de los demás géneros hallados.

Tabla 3

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 246 en la Región ITS-NL del ADNr

Descripción Taxonómica Levadura 246 ITS/NL

Taxonomía Número de Hits Número de organismos

Fungi 125 15

Sacharomycetales 124 14

Pichiae 122 12

Pichia 121 11

Pichia occidentalis 101 1

Nota: en la tabla se observa el empalme de la levadura 246 con ambos primers. 2020.


Para el análisis filogenético se realizó el árbol con la secuencia completa de la región

amplificada con los primers ITS y NL, se obtuvo el árbol consenso, donde el aislado se afilia con

la cepa A2 de Pichia occidentalis (número de acceso MK4019682.1), como lo muestra la figura

6.

Figura 6

Relaciones Evolutivas de Taxones para el aislado 246 primers ITS y NL

Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining (Saitou, et al, 1987). El árbol de

consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones, se toma para representar la historia evolutiva de los taxones

analizados. Las ramas correspondientes a particiones reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se

colapsan. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque

(500 repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de

kimura de dos componentes. Este análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas

fueron 1º + 2º + 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción de eliminación por pares). Hubo un total de 1303 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis

evolutivos se realizaron en MEGA X. (Kumar, et al. 2018). 2020.

El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones, se toma para representar la

historia evolutiva de los taxones analizados.


Las ramas correspondientes a particiones reproducidas en menos del 50% de réplicas de

bootstrap se colapsan.

El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la

prueba de arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas.

Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de kimura de dos

componentes. Este análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón

incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin codificación.

Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción de

eliminación por pares). Hubo un total de 1303 posiciones en el conjunto de datos final. Los

análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al, 2018).

En general, los amplicones obtenidos para la región ITS como para la región NL

arrojaron resultados comparables en el BLAST, es decir: lecturas con índice >200, las

identidades >98 y coberturas >98 con valores de E de 0, en el caso de los aislados que no

pudieron definir especie con los contigs NL o ITS se realizó empalme de toda la secuencia.

Para el análisis filogenético se creó un set de datos en formato FASTA para los contigs

NL, ITS y para NL e ITS. Para el set NL se obtuvo 763 regiones conservadas, 852 regiones

variables, 452 sitios informativos parsimoniosos.

Se analizó el set de datos para establecer el mejor modelo obteniendo que la filogenia se

realiza con Maximum Likelihood, y el modelo de sustitución de Kimura de dos componentes, se

obtuvo el árbol filogenético descrito en la figura 7.


Figura 7

Árbol Filogenético

Nota: La historia evolutiva se infirió mediante el método de unión de vecinos. Se muestra el árbol óptimo. El

porcentaje de réplicas de árboles en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba bootstrap (500 réplicas)

se muestra junto a las ramas. El árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades

que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon

utilizando el método de 2 parámetros de Kimura (Kimura,1980) y están en las unidades del número de sustituciones

de bases por sitio. Este análisis involucró 79 secuencias de nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones con

menos del 95% de cobertura del sitio, es decir, se permitieron menos del 5% de huecos de alineación, datos faltantes

y bases ambiguas en cualquier posición (opción de eliminación parcial). Hubo un total de 427 posiciones en el

conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al 2018).2020.


Se muestra el árbol óptimo. El porcentaje de réplicas de árboles en los que los taxones

asociados se agruparon en la prueba bootstrap (500 réplicas) se muestra junto a las ramas. El

árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades que las

distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se

calcularon utilizando el método de 2 parámetros de Kimura (Kimura,1980) y están en las

unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 79 secuencias de

nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones con menos del 95% de cobertura del sitio, es

decir, se permitieron menos del 5% de huecos de alineación, datos faltantes y bases ambiguas en

cualquier posición (opción de eliminación parcial). Hubo un total de 427 posiciones en el

conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al 2018)

Del árbol filogenético se resaltan las afiliaciones monofiléticas para los clados de

Saccharomyces, Torulaspora y Hanseniospora donde se identifica el ancestro común en el nodo

interno con un soporte de rama del 96%, por su parte el clado de Wickerhamomyces y Candida

son monofiléticos con un soporte de rama del 87%. El clado del Género Pichia se encuentra

definido para las especies kudriavzevii y occidentalis conectadas por un ancestro a Pichia

kluyveri. Finalmente, los géneros Candida, Rhodotorula y Criptococcus se afilian en el último

clado filogenéticamente distantes de los anteriores señalados. Para cada uno de los aislados

identificados, se confirma lo señalado en la tabla 2.


8. Discusión

Actualmente se están desarrollando enfoques moleculares para proporcionar una

identificación más rápida y objetiva de levaduras en comparación con los métodos fenotípicos

tradicionales. Las dianas ribosómicas, especialmente los dominios ITS1, ITS2 y D1-D2 del

operón de ADN, se han mostrado particularmente prometedoras para la identificación

molecular. (Fell, et al, 2010).

El primer apartado de Figura 3 y 4 secciones A se encuentran los fragmentos de PCR

amplificados con primers universales ITS-1 e ITS-4 enfocándose en la región ITS-5,8S. Se

encuentran bandas de excelente calidad, claridad e intensidad manejando pesos variables entre

los 500 y 800 pb. Kabir et al., 2015, explica que el espaciador interno transcrito o ITS del ADN

ribosómico, es ampliamente utilizado en estudios filogenéticos porque constituye una fuente de

información sobre varias especies fúngicas. Entre las ventajas de la utilización de la región ITS

es el requerimiento de una cantidad baja de material genético para la amplificación y las

secuencias disponibles para la comparación facilitan en gran medida la identificación de

especies.

Además, que Schoch et al, 2012, mencionan que la región ITS es considera como el

código universal para el estudio de microorganismos del reino Fungi ya que al presentar una

longitud comprendida entre los 500 y 800 pb son sitios diana empleados para la detección

molecular y realización de estudios filogenéticos de interés puesto que estas secuencias son

cortadas y posteriormente degradas durante la maduración del ADNr. Esta región junto con el

gen 5.8S también presentan una alta probabilidad y exactitud de identificación muy definida al

momento de codificar la subunidad pequeña del ADNr.


El segundo apartado de Figuras 3 y 4 secciones B y (C empleada en el apéndice A) se

evidencian los fragmentos amplificados realizados con primers universales NL-1F y NL-4R

específicamente para región 26S dominio D1/D2 de las levaduras aisladas. Se observa una gran

homogeneidad entre las bandas visualizándose a la altura de los 600 pb, además de una alta

calidad e intensidad; aunque algunas bandas se encuentran ligeramente por encima o por debajo

del rango, se debe al tamaño de los fragmentos varían de especie a especie, por ejemplo, algunos

estudios han reportado que levaduras como Metschnikowia pulcherrima amplifican alrededor de

390 pb, mientras que Hanseniaspora uvarum amplifican 760 pb o Saccharomyces cerevisiae 880

pb. (Guillamón et al., 1998).

Se conoce que el dominio D1/D2 constituye una región altamente variable de la

subunidad grande (26S) del ADN ribosómico, con diferencias entre especies de hasta una sola

base. Específicamente hablando en el caso de levaduras se ha determinado que existe una

variación superior al 1% en esta región indicando diferencia de especies. Por lo tanto, se conoce

que el tamaño promedio de esta región cercana a los 600 pb. La mayoría de levaduras pueden ser

identificadas analizando el dominio D1/D2, sin embargo, la región ITS es utilizada para

distinguir especies que son muy cercanas. (Fell, et al., 2010).

Este dominio (D1/D2) ha sido secuenciado en la mayoría de hongos ascomicetos y es

común a todas las especies de levaduras, lo que permite un reconocimiento intraespecífico entre

ellos, es decir, permite diferenciar cepas de una misma especie, por ser una región altamente

variable ayuda a mejorar la identificación de las especies. (Segura et al., 2010).

En la tabla 2 se observa el nombre de las especies de levaduras identificadas según datos

arrojados por Blastn. Se identificaron alrededor de 14 especies, las cepas identificadas con los

códigos 112B, 13A, 01, 12,105, 154, 188 corresponden a Hanseniaspora opuntiae y los códigos


74, 111, 131, 132, 218, 245, 99C 110MRS a Pichia kluyverii dos de las especies más abundantes

en este estudio.

Algunas cepas en la producción de etanol, como Pichia spp y Candida spp., metabolizan

el ácido cítrico haciendo que el valor del pH aumente en la pulpa lo que permite el crecimiento

de bacterias. La pérdida de ácido cítrico tanto en los “sudores” como por el metabolismo

microbiano provoca una deriva alcalina en el pH. Esto, junto con los niveles crecientes de

alcohol y aireación, inhibe las levaduras y su actividad disminuye

Se ha descubierto en estudios anteriores que Pichia kluyveri tienen un potencial

aromático muy alto en otros productos fermentados como el vino, en adición, se ha propuesto el

uso de cultivo iniciador para fermentaciones de cacao, donde su influencia en el sabor del cacao

es positiva para el perfil organoléptico del chocolate. (Crafack et al., 2013).

Por otro lado, cepas con codificación 19, 30, 33, 81, 85, 29A correspondieron al género

de Saccharomyces cerevisiae, este microorganismo se ha considerado como una especie ejemplo

en el aporte de características sensoriales en distintos tipos de cacao, en el estudio realizado por

(Menezez et al, 2016), mencionaron que la inoculación de S cerevisiae en granos de cacao

contribuye atributos organolépticos basándose desde un perceptible sabor a caramelo,

característico (chocolate) y hasta una sensación astringente o amargosa. Además de ser la especie

dominante en las fermentaciones de cacao en diferentes países, incluidos Brasil, Ghana,

Indonesia y Malasia. (Ardhana et al, 2013).

En adición, S cerevisiae es una levadura con alto poder fermentativo al producir grandes

cantidades de compuestos aromáticos, lo que sugiere que esta cepas podría estar colaborando en

la elaboración de características de aroma y sabor se encuentra, además de que se encuentra entre

las principales levaduras que producen compuestos volátiles como acetato de isopropilo, acetato


de etilo, metanol, 1-propanol, alcohol isoamílico, 2,3-butanodiol, succinato de dietilo y 2-

feniletanol seguidas de Kloeckera apiculata, Candida sp. y Kluyveromyces marxianus. (Schwan

et al, 2014).

En general, el género de Rhodotorula sp correspondiente a los aislados 45 y 31 se ha

descrito como una levadura productora de carotenoides naturales, en la industria alimentaria,

farmacéutica e incluso en el uso de aguas residuales; dicha característica se ha tenido en cuenta

debido a su alta eficiencia y fácil manipulación en los esquemas de procesamiento, la utilización

comercial de microorganismos con potencial biotecnológico para producir carotenoides naturales

está actualmente limitada por el alto costo de producción, su participación en fermentaciones de

cacao se encuentra en la su producción en gran escala debido a su alta tasa de crecimiento y

naturaleza unicelular a partir de etanol, ácido acético, lípidos y acetaldehído. (Rodríguez, et al,

2012).

Una única cepa aislada en este estudio de identificación de levaduras fermentadoras con

código 43 se identificó como parte del género Cryptococcus. A pesar de que este

microorganismo, es considerado como una levadura causante de enfermedades infeccionas como

la neumonía y otras a nivel respiratorio, en el proceso de fermentación de cacao esta cepa se

caracteriza por la producción de lípidos y otros ácidos grasos que aportan nutrientes a la manteca

de cacao que es un ingrediente esencial del chocolate que se obtiene a partir de granos maduros

del planta (Theohroma cacao) el estudio realizado por Hassan et al, 2010 donde emplea una

mutante de Cryptococcus curvutus (UfaM3) para la producción de este subproducto del

chocolate, su rendimiento en la conversión de nutrientes a partir de los granos a lípidos como

ácido oleico se encuentra entre un 44 y 49% factor que es importante para la industria alimenticia


ya que puede alcanzar. uno de los precios más altos entre todas las grasas y aceites comerciales y

puede fluctuar ampliamente.

La figura 5 menciona la excelente calidad y los picos definidos del estudio, este tipo de

comparaciones permite que la identificación de las especies fúngicas se pueda tipificar cepas de

una misma especie. (Webster et al, 2012). Se hallaron en algunas cepas de levaduras su alta

calidad correspondiente al 57,14 % de identificación completa con ambos primers, el porcentaje

no resultante del 42, 85%se debía a esa baja calidad en la secuencia, se tiene que tener en cuenta

que para obtenerlas los primers Forward como Reverse deben mantener una intensidad en sus

bases nitrogenadas aptas para la lectura y empalme considerando un contig competente para

análisis, Valdelamar et, al 2011, menciona que para obtener la secuencia consenso al comparar

el sentido Forward (5’-3’) y el sentido Reverse (3’-5’), es de suma importancia porque en este

proceso las polimerasas tienen diferentes porcentajes de fidelidad o en ocasiones pueden existir

problemas en la electroforesis de secuenciación y esto a su vez puede generar falsos

polimorfismos. Como también es útil el consenso cuando el fragmento que se está analizando es

mayor a 700 pb debido a que permite obtener un tamaño mayor de secuencia al complementar

ambas cadenas.

En cuanto al análisis filogenético, el modelo permitió obtener la clasificación de las

levaduras en las divisiones Ascomycota: Clados Saccharomyces, Torulaspora, Hanseniaspora,

Wickerhamomyces, Candida y Pichia y las divisiones Basidiomycota: Clados Rhodotorula y

Cryptococcus, además permite observar la diversidad en cuanto a las levaduras fermentadoras y

las relaciones evolutivas que las conectan. Este tipo de clasificación, en el caso de

microorganismos de interés biotecnológico puede servir como una herramienta predictiva de las

aplicaciones biotecnológicas. (Kurtzman, et al, 2015).


En el contexto de este estudio, este árbol filogenético es fundamental para contrastar la

producción de los compuestos volátiles y pode establecer si las afiliaciones filogenéticas se

relacionan con la producción de metabolitos de interés. Ya se ha establecido que muchas vías

metabólicas se comparten ampliamente entre las especies, especialmente la fermentación de la

glucosa, identificada entre las especies de Saccharomycotina, Taphrinomycotina y

Basidiomycota, sin embargo, se resaltan otras vías, como, por ejemplo, la fermentación de la D-

Xilosa, restringida a linajes filogenéticos específicos. (Kurtzman, et al, 2015).


9. Conclusiones

La identificación molecular de las levaduras de interés, apoyada por la amplificación de

regiones del ADN ribosomal informativas en términos evolutivos como la ITS y D1/D2 son de

gran ayuda en procesos biotecnológicos como la determinación de cultivos iniciadores, que

potencian las propiedades organolépticas de los granos de cacao producidos en el departamento

de Santander. De los aislamientos analizados, se encontró predominancia de Hanseniaspora

opuntiae y Pichia kluyveri cepas con alto potencial para la producción de compuestos volátiles y

mayor permanencia en el momento de la realización del proceso por las condiciones ambientales

que los granos le generan.

Cabe mencionar que la identificación molecular, es un procedimiento de meticuloso

desarrollo altamente susceptible a contaminación (durante la PCR) o lecturas erróneas durante la

secuenciación, especialmente el tipo Sánger, lo que deriva en procesos de identificación

truncados que requieren de la incorporación de otras herramientas o técnicas de análisis.


10. Recomendaciones

Dado que este trabajo es una parte de un macro proyecto, se recomienda tomar la

identificación molecular generada y contrastarla con las clasificaciones bioquímicas realizadas

previamente. Además de analizar si los compuestos volátiles que producen estos aislados se

asocian con las afiliaciones filogenéticas obtenidas.

Finalmente, se recomienda revisar detalladamente los electroferogramas de las secuencias

reversas de los aislados que no se lograron identificar en el contexto de este trabajo de grado.


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Apéndices

Apéndice 1. Electroforesis

Figura 1

Electroforesis Gel de Agarosa Tercer Set de Levaduras

Figura 2

Electroforesis Gel de Agarosa Cuarto Set de Levaduras


Figura 3

Electroforesis Gel de Agarosa Sexto Set de Levaduras

Figura 4

Electroforesis Gel de Agarosa Séptimo Set de Levaduras


Figura 5

Electroforesis Gel de Agarosa Octavo Set de Levaduras


Apéndice 2. Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Torulaspora

Delbrueckii Levadura 195

El análisis Blast de la secuencia consenso para el amplicón de la región NL arrojó lecturas con

índice >200, lo que muestra que los alineamientos se acoplaron exitosamente con secuencias

consignadas en la base de datos, con identidades de 100%, cobertura del 100% y valores E de 0,

124 se asociaron con Sacharomycetes, de estos 120 coincidieron con el género Torulaspora y

112 con la especie delbrueckii, la tabla 5 muestra esta clasificación.

Tabla 1

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 195 en la Región NL del ADN

Descripción Taxonómica Levadura 195 NL


Sacharomycetes 124 8


Sacharomycetaceae 121 5

Torulaspora 120 4

Torulaspora delbrueckii 112 1

Estos resultados se confirmaron con lo hallado en el análisis filogenético descrito en la figura 3.


Figura 1

Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 195

Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining

Se muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de la rama = 0.02477882. El

porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de

arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas El árbol está dibujado a escala, con

longitudes de rama en las mismas unidades que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el

árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Kimura y

están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 12

secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin

codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción

de eliminación por pares). Hubo un total de 919 posiciones en el conjunto de datos final. Los

análisis evolutivos se realizaron en MEGA X


Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Saccharomyces

cerevisiae Levadura 29A. Para este aislamiento se encontró una afiliación con Saccharomyces

cerevisiae, como se describe en la tabla 2 y en la figura 2

Tabla 2

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 29A en la Región ITS/NL del ADNr.

Descripción Taxonómica Levadura 29A ITS/NL



Sacharomycetaceae 98 8

Sacharomyces 97 7

S. cerevisiae 69 6

S. cerevisiae/paradoxus 20 1

Figura 2

Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 29A

Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining

El árbol de consenso bootstrap inferido de 500repeticiones se toma para representar la

historia evolutiva de los taxones analizados. Las ramas correspondientes a particiones

reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se colapsan. El porcentaje de árboles

replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (500


repeticiones) se muestran junto a las ramas Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el

método de Kimura y están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este

análisis involucró 6 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º

+ 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias

(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 920 posiciones en el conjunto de datos final.

Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.

Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Hanseniospora

opuntiae Levadura 01: El análisis Blast de la secuencia consenso para el amplicón de la región

NL arrojó 132 hits asociados con hongos, de estos 126 se afiliaron con el orden

Sacharomycetales y 123 pertenecieron al género Hanseniospora, para la especie la mayoría de

hits (77) se afiliaron con la especie opuntiae, los demás se afiliaron con especies guillermondii

(19), meyeri (7), aquellos hits que se afiliaron con hanseniospora sp (20) no se consideraron, la

tabla 3 muestra esta clasificación

Tabla 3

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 01 en la Región NL del ADNr

Descripción Taxonómica Levadura 01 NL


Fungi 131 23


Hanseniaspora 123 19

Hanseniospora opuntiae 77 1

Hanseniospora guilliermondii 19 1

Hanseniospora meyeri 7 1


En cuanto a los eventos evolutivos, se encontró que el aislado 01, se afilia con el

Hanseniospora opuntiae aislado P13 (Número de acceso: MF979601.1 en el NCBI), la

disposición del árbol obtenido sugiere que la levadura 01 pertenece a este género y especie, pues

su relación filogenética se aleja de la especie guillermondi, la figura 15 muestra el árbol

filogenético obtenido.

Figura 3

Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 01

Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining



arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas El árbol está dibujado a escala, con








análisis evolutivos se realizaron en MEGA X

Levadura 112B: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume

que el aislamiento denominado “112B” es Hanseniospora opuntiae para la región D1/D2 del gen

26 S que codifican los primers NL, las especies guillermondi y meyeri se encontraron en los

análisis blast afiliadas en menor número con la secuencia de interés, esto se presenta cuando hay

cercanía filogenética descrita para este género esta denominación surge de la cercanía

filogenética entre las dos especies, como se presenta en la tabla 4 y la figura 4.

Tabla 4

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 112B en la Región D1/D2 del Gen

26S

Descripción Taxonómica Levadura 112B-NL



Hanseniaspora 124 23

Hanseniospora opuntiae 75 1

Hanseniospora guilliermondii 16 1

Hanseniospora meyeri 7 1


Figura 4

Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 112B

Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining.

El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones se toma para representar la




repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el




(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 3107 posiciones en el conjunto de datos

final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.

Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Pichia kluyverii

Levadura 110 MRS: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume que

el aislamiento denominado “110MRS” presumiblemente es Pichia kluyverii para la región

D1/D2 del gen 26S que codifican los primers NL.


La tabla 5 describe la clasificación taxonómica, y la figura 5 señala las relaciones

filogenéticas con los aislados identificados en el análisis blast.

Tabla 5

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 110MRS en la Región D1/D2 del

Gen 26S.

Descripción Taxonómica Levadura 110MRS-NL



Pichia 117 7

P. kluyverii 109 1

Pichia sin clasificar 3 3

Figura 5

Relaciones Evolituvas de Taxones Levadura 110MRS

Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining.

El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones se toma para representar la





repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el




(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 911 posiciones en el conjunto de datos final.

Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.

Levadura 218: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume que

el aislamiento denominado “112B” presumiblemente es Pichia kluyverii para la región D1/D2

del gen 26 S que codifican los primers NL, esto se describe en la tabla 6.

Tabla 6

Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 112B en la Región D1/D2 del Gen

26S

Descripción Taxonómica Levadura 218-NL



Pichia 118 7

Pichia kluyverii 110 1

Pichia sin clasificar 3 3

Nota: La descripción filogenética mostrada en la imagen 10 señala una afiliación directa con el clado de Pichia kluyverii

reafirmando la identificación señalada por el blast.


Figura 6

Relaciones Evolutivas de Taxones Levadiura 112B

Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining.



arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas . El árbol está dibujado a escala, con







análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.

identificaciÓn molecular de levaduras 1

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