1

AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA BIAŁEK I PEPTYDÓW W SUROWCACH I ŻYWNOŚCI I ICH ROLA W PROFILAKTYCE CHORÓB DIETOZALEŻNYCH NA PRZYKŁADZIE CELIAKII

Małgorzata Darewicz, Jerzy Dziuba Katedra Biochemii, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Podstawowym kryterium oceny wartości odżywczej białek jest zawartość oraz przyswajalność

aminokwasów egzogennych dla człowieka. Ostatnio zaproponowano dodatkowe kryterium oceny białek,

jakim jest możliwość uwalniania biologicznie aktywnych peptydów podczas enzymatycznej hydrolizy

białek. Biologicznie aktywne peptydy, po uwolnieniu przez enzymy proteolityczne mogą regulować różne

funkcje organizmu. Peptydy uwolnione z białek żywności mogą wykazywać aktywność m.in. toksyczną.

Celiakia jest enteropatią glutenową, w której występują zmiany w błonie śluzowej jelita czczego. Leczenie

dietą bezglutenową korzystnie wpływa na jego obraz morfologiczny. Jest ona najszerzej badaną chorobą

żołądkowo-jelitową o podłożu autoimmunologicznym wywołaną obecnością w diecie białek pszenicy,

jęczmienia czy żyta. U pacjentów chorych na celiakię stwierdzono podwyższony poziom transglutaminazy

tkankowej i sugerowano, że fakt ten może odgrywać kluczową rolę w etiologii tej choroby. Zasadnicze

znaczenie w etiologii celiaki odgrywa gluten Wykazano, że gliadyna, która jest rozpuszczalną w etanolu

frakcją glutenu, powoduje celiakię u osób z enteropatią glutenową. Za najbardziej toksyczną w celiakii

uważa się α–gliadynę. Frakcje białkowe rozpuszczalne w etanolu uzyskano również podczas ekstrakcji

etanolem innych zbóż i, ze względu na dużą zawartość proliny (ok. 15%) w stosunku do zawartości białka

ogółem oraz kwasu glutaminowego (nawet 60%), zaliczono je do prolamin. Prolaminy otrzymywane

z żyta to sekaliny, z jęczmienia - hordeiny i owsa – aweniny. W charakterystyce prolamin toksycznych

dla osób chorych na celiakię zastosowanie znalazły: elektroforeza jedno- i dwukierunkowa, spektrometria

mas, wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami, spektroskopia UV, metody

bioinformatyczne i biologiczne.

Stwierdzono, że szkodliwość prolamin zbóż zależy od ich struktury, czyli rodzaju i kolejności

aminokwasów zawartych w ich łańcuchach polipeptydowych. Badając peptydy powstałe z gliadyny

po trawieniu białka enzymami wykazano, że aktywny w celiakii motyw strukturalny jest bogaty w prolinę

i odpowiada N-końcowemu fragmentowi łańcucha polipeptydowego tej frakcji białek. Natomiast obszar

sekwencji aminokwasowej, gdzie występują niewielkie ilości proliny jest nieaktywny. Obszary

charakteryzujące się niższą zawartością proliny wykazują podobieństwo do struktury analogicznych

białek zbóż nietoksycznych w celiakii. Wykorzystując w badaniach syntetyczne polipeptydy udowodniono,

że można wywołać reakcje toksyczne w celiakii stosując peptydy zawierające 8-12 reszt

aminokwasowych. Stwierdzono, że za działanie toksyczne nie są odpowiedzialne boczne grupy

np. lipidów czy cukrów, ale toksyczność ta związana jest z sekwencją aminokwasów. Peptydy

z A-gliadyny których toksyczność potwierdzono w badaniach in vivo, zawsze zawierają jeden z czterech

motywów sekwencji aminokwasowych t.j.: PSQQ; QQQP; QQPY lub QPYP. W łańcuchach

polipeptydowych wielu białek żywności, zawierających frakcje prolaminowe (np. kukurydza)

lub nie zawierających ich wcale, można wskazać na obecność sekwencji zawierających potencjalnie

toksyczne tetrapeptydy PSQQ; QQQP; QQPY lub QPYP. Mimo to nie są one czynnikami etiologicznymi

w celiakii. Konsekwentnie za właściwości toksyczne w celiakii odpowiedzialne mogą być wyżej

2

wymienione motywy strukturalne wraz z otoczeniem, w tym ich skład aminokwasowy i struktura. Metody

komputerowe coraz częściej znajdują zastosowanie i są coraz bardziej pomocne w definiowaniu

właściwości biologicznych białek i peptydów. Programy służące do wyszukiwania sekwencji

homologicznych w stosunku do fragmentów toksycznych dla osób chorych na celiakię mogą służyć

do identyfikacji białek żywności stanowiących potencjalne zagrożenie w tej chorobie. Narzędziami

bioinformatycznymi wykorzystywanymi do wyszukiwania identycznych toksycznych sekwencji

aminokwasowych między peptydami oraz peptydami i białkami są programy BIOPEP, BLAST, MS

BLAST, CLUSTAL W i PeptideSearch. Stwierdzono fundamentalne znaczenie prawidłowo

skomponowanej diety w profilaktyce celiakii. Jak dotąd nie rozstrzygnięto kontrowersji co do toksyczności

aweniny owsa dla osób chorych na celiakię.

3

ANALITYCZNE I FORMALNE UWARUNKOWANIA KONTROLI ALERGENNYCH WŁAŚCIWOŚCI ŻYWNOŚCI

Barbara Wróblewska Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

W ostatnich dwóch dekadach alergia pokarmowa zaczęła stanowić poważny problem zdrowotny.

Zaobserwowano, że ok. 90% wszystkich IgE – zależnych alergii pokarmowych (w tym również reakcji

anafilaktycznych) wywoływanych jest pod wpływem spożywania określonych surowców bądź

ich przetworów. Głównie są to mleko krowie, jaja, ryby, skorupiaki, orzechy, orzeszki arachidowe, soja

i pszenica. Wprowadzona Dyrektywa 2003/89/EC Parlamentu Europejskiego nakazała, aby obecność

tych surowców była wykazywana na etykietach produktów spożywczych jako wskazówka bezpieczeństwa

zdrowotnego dla konsumenta. Ostatecznie, po poprawkach, lista została poszerzona o seler, musztardę,

sezam i siarczyny, które jako środek konserwujący również stanowią przyczynę nadwrażliwości

i wprowadzona w listopadzie 2005 jako EU Labelling Directive 2005/26/EC.

Najlepiej scharakteryzowanymi alergenami są białka orzechów arachidowych. Powszechność

występowania reakcji alergicznych, włącznie z szokiem anafilaktycznym dotyczy 0,5-1,1% populacji,

a ilość białka arachidowego niezbędną do pobudzenie reakcji immunologicznej organizmu oszacowano

w granicach od 100 μg do 1 g. Stosując się do wytycznych europejskich, producenci artykułów

spożywczych zawierających orzechy arachidowe powinni wykazywać na etykietach towarów

ich obecność. W wielu przypadkach jedyną wskazówka dla konsumenta jest informacja o tym, że produkt

„zawiera” lub „może zawierać śladowe ilości orzechów arachidowych”, bez opisu dotyczącego

ich potencjału alergennego. Niektóre produkty nie posiadają jeszcze właściwie zaprojektowanych etykiet

z odpowiednimi oznaczeniami, a są również i takie, które wprowadzają w błąd konsumenta np. wskazując

mleko kozie jako produkt mogący zastąpić mleko krowie dla alergików.

Oznaczaniem alergenności produktów spożywczych powinny zajmować się laboratoria

akredytowane. Dotychczas tylko nieliczne zakłady dużych konsorcjów przemysłu spożywczego

sporadycznie korzystają z usług laboratoriów zagranicznych, ponieważ w Polsce nie ma jeszcze

wyspecjalizowanego laboratorium. Praca tego typu placówek opiera się na wykorzystaniu gotowych

testów do oznaczania alergenów w żywności metodą współzawodniczącą lub kanapkową ELISA

(ang. sandwich & competitive) z wykorzystaniem reakcji antygen-przeciwciało. Otrzymanie takich testów

wiąże się z uzyskaniem wysoce specyficznego przeciwciała (mono- lub poliklonalnego) skierowanego

do badanego alergenu. Problemem jest także wyprodukowanie odpowiedniego materiału referencyjnego.

Można się spodziewać, że w najbliższym czasie wymogi europejskie dotyczące ochrony

konsumenta, najprawdopodobniej zobligują Polskę do powołania laboratorium akredytowanego

ukierunkowanego na analizę alergenów żywności.

4

WYSTĘPOWANIE CELIAKII ATYPOWEJ W GRUPACH RYZYKA U DZIECI

Jerzy Socha1, Bożena Cukrowska2, Barbara Burda-Muszyńska1 1Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii, 2Zakład Patologii,

Instytut-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie

Badania epidemiologiczne ostatnich lat wskazują na wzrost częstości występowania celiakii

w ogólnej populacji (1:100-1:300). W ostatnim 20-leciu obraz kliniczny celiakii zmienił się w kierunku

przewagi postaci atypowych, często z manifestacją kliniczną poza przewodem pokarmowym. Celem

pracy była ocena częstości występowania atypowej celiakii w grupach ryzyka u dzieci w populacji

polskiej. Przebadano 853 dzieci w wieku od 9/12 do 17,5 r. ż. Z następującymi rozpoznaniami zespól

nadwrażliwego jelita grubego (n=276), padaczka (n=85), zaburzenia hiperkinetyczne (n=116), autyzm

(n=74), niedobór masy ciała i/lub wzrostu (n=153) oraz grupa dzieci z innymi schorzeniami (n=149),

w tym niedokrwistość, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, izolowana hipertransaminazemia,

idiopatyczna osteoporoza, bóle głowy. U wszystkich dzieci wykonano testy przesiewowe na obecność

przeciwciał przeciwko endomyzjum oraz przeciwko rekombinowanej ludzkiej transglutaminazie

tkankowej. Pacjentom z dodatnimi testami wykonano biopsję jelita cienkiego, którą oceniono

histopatologicznie wg skali Marsha. Celiakię potwierdzono u 12-ga dzieci (1:71). Badania sugerują

potrzebę wykonywania badań przesiewowych w kierunku celiakii przynajmniej w grupach ryzyka.

Badania przeprowadzono w ramach realizacji projektu PBZ-097/P06/2003

5

ANALIZA CZYNNIKÓW ŻYWIENIOWYCH U PACJENTÓW Z CELIAKIĄ ATYPOWĄ

Hanna Kunachowicz, Anna Wojtasik Zakład Wartości Odżywczych Żywności, Instytut Żywności i Żywienia w Warszawie

W ostatnich latach obserwuje się spadek wykrywania celiakii u niemowląt w pierwszym roku życia,

a wzrost wykrywania postaci atypowych u dzieci, młodzieży, a także osób starszych. Z danych

z piśmiennictwa wynika, że celiakia może występować u osób z innymi chorobami, jak np. cukrzyca typu

I, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, zapalenie stawów, nadwrażliwe jelito grube, nadpobudliwość

i inne. Przyczyną występowania celiakii jest podatność genetyczna organizmu oraz narażenie

na spożywanie glutenu występującego w białkach zbóż, a w szczególności zawartego w gliadynie

peptydu 33-Mer.

Spośród czynników żywieniowych, które są dyskutowane jako jedna z przyczyn wpływających

na postać występującej celiakii, wyróżnia się długość okresu karmienia piersią oraz czas wprowadzenia

do diety glutenu. W ramach prac realizowanych w Projekcie zamawianym przeprowadzono ankiety

dotyczące tych zagadnień. Aktualnie w naszym kraju jest prowadzona dyskusja nad wcześniejszym

wprowadzeniem glutenu do diety niemowląt.

Zdiagnozowanie celiakii wymaga u osoby chorej zmiany diety na dietę bezglutenową. Przedmiotem

wcześniejszych badań autorów była analiza diet bezglutenowych u dzieci z wykrytą celiakią. Wykazała

ona, że podobne błędy żywieniowe, jak w populacji ogólnej, spotyka się u dzieci z celiakią tzn. zbyt

wysokie spożycie energii i tłuszczu, cholesterolu i sodu. Niska natomiast była realizacja norm na wapń,

żelazo, cynk i miedź oraz na witaminę C i witaminy z grupy B.

Stosowanie diety bezglutenowej, zwłaszcza w pierwszym okresie po zdiagnozowaniu choroby

nastręcza wiele obaw i trudności, które muszą być rozwiązywane w regularnym kontakcie z dietetyczką.

Ważnym elementem, niezbędnym przy realizowaniu diety bezglutenowej, jest prawidłowe odczytywanie

informacji podawanych na etykietach produktów, zarówno produktów ogólnego spożycia,

jak i bezglutenowych.

Reasumując, stwierdzona zdiagnozowana celiakia wymaga stosowania diety eliminacyjnej

przez całe życie pacjenta. Natomiast profilaktyka tej choroby u osób z grup ryzyka jest jeszcze w fazie

dyskusji. Wydaje się jednak, że mogłaby ona obejmować m.in. stosowanie w żywieniu produktów z roślin

uprawnych, takich jak groch, gryka i być może jaśniejszych wymiałów pszenicy o niższej zawartości

gliadyny.

6

PROBLEMY OSÓB CHORYCH NA CELIAKIĘ ZWIĄZANE Z ZAKUPAMI ŻYWNOŚCI BEZGLUTENOWEJ

Barbara Aleksandra Cichańska Towarzystwo Przyjaciół Dzieci Krajowy Komitet Kół Przyjaciół Dzieci

na Diecie Bezglutenowej, Warszawa

Streszczenie: Cel - ukazanie problemów związanych z identyfikacją produktów spożywczych

bezpiecznych w diecie bezglutenowej i tym samym wskazanie trudności z jakimi spotykają się osoby

chore na celiakię podczas dokonywania zakupów.

Metody – własne doświadczenie (jestem osobą chorą na celiakię), wywiady z chorymi

(lub ich opiekunami w przypadku dzieci), korespondencja prowadzona z producentami ogólnodostępnej

żywności oraz producentami specjalizującymi się w produkcji żywności bezglutenowej.

Wyniki – spora część dostępnych w Polsce produktów spożywczych jest źle oznaczona pod kątem

zawartości glutenu:

- podawana jest wyłącznie informacja, że produkt zawiera skrobię, bez uszczegółowienia jaka to skrobia,

- na opakowaniu brakuje informacji o zawartości glutenu, a produkt może go zawierać,

- na opakowaniu podana jest informacja, że produkt zawiera „śladowe ilości glutenu” bez oznaczenia

poziomu glutenu w produkcie.

Powoduje to, iż chory na celiakię ma duże problemy z identyfikacją bezpiecznej dla niego żywności i tym

samym nieświadome popełnia błędy w przestrzeganiu diety bezglutenowej.

Końcowe wnioski:

Problemy osób chorych na celiakię związane z identyfikacją żywności bezpiecznej w diecie

bezglutenowej rozwiązałoby utworzenie w Polsce wykazu produktów spożywczych (wykaz zawierający

dokładną nazwę produktu wraz z podaniem producenta) bezpiecznych w diecie bezglutenowej.

Dieta bezglutenowa jest jedynym lekiem w przypadku osób chorych na celiakię i jak sama nazwa

wskazuje, polega na eliminacji glutenu z produktów spożywczych. Gluten jest białkiem zawartym w takich

zbożach jak: pszenica, żyto i jęczmień, stąd bardzo dużo osób uważa, że dieta bezglutenowa ogranicza

się wyłącznie do eliminacji produktów zbożowych takich jak: chleb, bułki, ciasta, ciastka, mąki i makarony,

wyprodukowanych na bazie zbóż zawierających gluten.

Niestety nic bardziej błędnego. Gluten jest powszechnie stosowany w ogólnodostępnym

oraz pozornie bezpiecznym pożywieniu i w różnej postaci dodawany jest obecnie m.in. do: wędlin,

mielonego mięsa, przypraw, słodyczy (w tym czekolad), przetworów warzywnych i owocowych

oraz nabiału (twarożków, jogurtów i serków). Ponadto część ogólnodostępnych produktów, które mogłyby

być bezglutenowymi jest produkowana na tych samych liniach technologicznych, co produkty zawierające

gluten. Powoduje to, że produkty uważane przez chorych za bezglutenowe w rzeczywistości bardzo

często nimi nie są.

Problem z pewnością nie istniałby, gdyby producenci badali produkty pod kątem zawartości

glutenu i uczciwie podawali na produktach, że produkt jest bezglutenowy, w przypadku gdy zgodnie

7

z przyjętymi normami faktycznie jest bezglutenowy lub, że produkt zawiera gluten, jeżeli normy dotyczące

glutenu zostały przekroczone. Niestety tak nie jest, tak więc chory na celiakię dokonując zakupów

żywności napotyka wiele problemów, często ma duże wątpliwości i tym samym nigdy do końca nie może

być pewien, że produkt, który zakupił jest dla niego bezpieczny.

Problemy związane z oznaczaniem zawartości glutenu na produktach spożywczych 1. Problem pierwszy - podawanie na produkcie ogólnej informacji, że produkt zawiera skrobię,

bez szczegółowego oznaczenia, jaka to skrobia

Zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia

20 marca 2000 roku w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich w zakresie etykietowania,

prezentacji i reklamy środków spożywczych (Dziennik Urzędowy L 109, 06/05/2000 P. 0029 - 0042)

oraz zgodnie ze zmianami do w/w Dyrektywy wprowadzonymi Dyrektywą Unii Europejskiej 2003/89/WE

Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 10 listopada 2003 roku w odniesieniu do oznaczania składników

obecnych w środkach spożywczych (Dziennik Urzędowy L 308, 25/11/2003 P. 0015 - 0018) wykaz

składników na opakowaniu powinien zawierać wszystkie składniki środka spożywczego. Wykaz ten

powinien być poprzedzony wyrazem „składniki” (składniki wymieniane są zgodnie z art. 6 i załącznikami I,

II, III i IIIa), a dodatkowo nazwy: „skrobia” i „skrobia modyfikowana” muszą zawsze być uzupełnione

poprzez oznaczenie ich określonego pochodzenia roślinnego, w przypadku gdy składnik ten może

zawierać gluten.

Producentom przedłużono czas wprowadzenia powyższych przepisów do końca 2007 roku,

stąd w dalszym ciągu chory na celiakię spotyka się z produktami, które w składzie zawierają skrobię,

bez szczegółowego oznaczenia jaka to skrobia.

2. Problem drugi – brak informacji o zawartości glutenu na wielu produktach spożywczych,

które w rzeczywistości zawierają gluten

Na wielu ogólnodostępnych produktach takich jak: przetwory mięsne i wędliny, przetwory owocowo-

warzywne, przetwory nabiałowe i słodycze nie ma informacji, że produkt zawiera gluten. Chorzy kupują

te produkty sugerując się informacją podaną na opakowaniu i tym samym bardzo często nieświadomie

popełniają błędy, które wpływają na pogorszenie ich stanu zdrowia.

Zwróciłam się z zapytaniem o zawartość glutenu do wielu producentów tak oznaczonych

produktów. Część z nich odpowiedziała, że produkt niestety nie jest bezpieczny w diecie bezglutenowej,

a część nawet kilkakrotnie ponawiane pytania zbyła milczeniem.

3. Problem trzeci – podawanie informacji, że produkt „może zawierać śladowe ilości glutenu”,

bez oznaczenia poziomu glutenu w produkcie

Produkt jest bezpieczny w diecie bezglutenowej, jeżeli poziom glutenu nie przekracza w nim

20 ppm. Stąd pojęcie śladowe ilości glutenu wcale nie musi oznaczać, że produkt jest niedozwolony

dla osób chorych na celiakię.

Wspomniana wcześniej Dyrektywa Unii Europejskiej 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego

i Rady z dnia 20 marca 2000 roku została bardzo poważnie potraktowana zwłaszcza przez duże

koncerny, które swoje produkty zaczęły wręcz masowo oznaczać napisem „produkt może zawierać

śladowe ilości glutenu”. Firmom, które często zmieniają dostawców składników, same składniki używane

do produkcji oraz, gdzie na tych samych liniach technologicznych produkowana jest zarówno żywność

8

zawierająca gluten jak i bezglutenowa, nie opłaca się badanie produktów pod kątem zawartości glutenu.

Podawanie w tej sytuacji napisu, że „produkt może zawierać śladowe ilości glutenu”, to na pewno bardzo

uczciwe podejście do sprawy, z drugiej jednak strony nie rozwiązuje problemu, gdyż bardzo ogranicza

rynek produktów spożywczych dostępnych dla chorych na celiakię.

Także w tym przypadku zwróciłam się z zapytaniem o zawartość glutenu do wielu producentów

tak oznaczonych produktów. Zdecydowana większość firmie albo w ogóle nie odpowiedziała,

albo w odpowiedzi oświadczała, iż:

- nie opłaca się badać zawartości glutenu w produkcie – wygodniejszym i tańszym rozwiązaniem

jest umieszczenie na opakowaniu napisu: „produkt może zawierać śladowe ilości glutenu”,

- w ogóle nie jest zainteresowana problemami osób chorych na celiakię.

Najczęściej spotykane problemy przy zakupach poszczególnych grup żywności Produkty zbożowe

Bezglutenowy chleb, wszelkie bezglutenowe pieczywo cukiernicze, bezglutenowe: mąki,

makarony, pierogi oraz inne produkty mączne – są z reguły najlepiej identyfikowalne. Produkty te są

produkowane przez firmy specjalizujące się w produkcji żywności bezglutenowej, są badane i właściwie

oznaczane na opakowaniach napisem „produkt bezglutenowy”, „produkt nie zawiera glutenu”

lub symbolem graficznym symbolizującym przekreślony kłos. Coraz częściej także na naszym rynku

pojawia się żywność pochodzenia zagranicznego z napisami w języku kraju producenta, np. gluten-free,

gluten-frei, senza glutine.

Pewnym utrudnieniem jest jedynie to, że produkty te dostępne są praktycznie tylko w sklepach

z żywnością bezglutenową, albo też można je nabyć w formie wysyłkowej bezpośrednio od producentów

lub za pośrednictwem sklepów internetowych.

Zwrócić należy jednak uwagę, że produkty, które naturalnie są wolne od glutenu, mam tu na myśli

takie produkty jak: ryż, kukurydza, gryka, w postaci przetworzonej mogą być zanieczyszczone glutenem.

Stąd chory na celiakię kupując: płatki ryżowe, mąkę kukurydzianą, kaszkę kukurydzianą, mąkę gryczaną,

kaszę gryczaną i mąkę ziemniaczaną powinien albo kupować wskazane produkty od producentów

specjalizujących się w produkcji żywności bezglutenowej lub szukać produktów oznaczonych napisem

produkt bezglutenowy. W przypadku wskazanych produktów wiąże to się z procesem obróbki,

np. mielenia mąki w tym samym młynie i na tych samych maszynach co mąka pszenna.

Mięso, wędliny i inne przetwory na bazie mięsa

Czyste mięso jest produktem bezglutenowym, ale nie dotyczy to mięsa paczkowanego, w tym

głównie mięsa mielonego. Paczkowane mięso mielone prawie zawsze zawiera gluten, a z innym mięsem

paczkowanym bywa różnie. Tylko nieliczni producenci informują o składzie, większość albo w ogóle tego

nie robi albo podaje skład w sposób niezupełnie kompletny. Na rzetelną informację od osób

sprzedających zwykle też nie można liczyć, gdyż w większości sklepów mięsnych, marketów

i hipermarketów ekspedienci nie wiedzą, co to jest gluten oraz nie mają pojęcia o diecie bezglutenowej.

W przypadku wędlin w zasadzie jedynymi bezpiecznymi dla osób na diecie bezglutenowej są

wędliny, które opisano lub oznakowano jako produkt bezglutenowy. Oczywiście mam tu na myśli

wyłącznie wędliny posiadające stosowne atesty wydane przez instytuty uprawnione do badania żywności

pod kątem zawartości glutenu.

9

Wędliny nie zawierające glutenu są oznakowane w identyczny sposób jak produkty zbożowe.

W przypadku wędlin nie zawierających glutenu spotykamy głównie się z wędlinami paczkowanymi,

gdzie informacja ta jest na jednostkowym opakowaniu.

Niestety, obecnie tylko kilku producentów podjęło się próby przebadania swoich produktów

pod kątem zawartości glutenu, stąd rynek tych produktów jest bardzo ubogi. Ponadto chorzy mają

problemy z zakupami bezpiecznych wędlin, gdyż oferują je w sprzedaży tylko wybrane sklepy, a niektóre

z wędlin dostępne są wyłącznie na rynku regionalnym producenta.

Wszelkie inne wędliny i przetwory stanowią bardzo wielką niewiadomą dla chorych na diecie

bezglutenowej. Bardzo często bowiem sami producenci nie mają pewnej informacji, które z używanych

przez nich składników są wolne od glutenu, a które nie, w związku z tym nie mogą zagwarantować,

że ich wyroby są wolne od glutenu. Spożywanie nieodpowiednich wędlin jest niestety najczęstszą

przyczyną nieświadomego łamania rygorów diety.

Koncentraty i przetwory spożywcze, słodycze (w tym czekolady), lody oraz nabiał (jogurty, twarożki)

Największy problem ma chory, gdy zamierza zakupić: koncentraty i przetwory spożywcze, słodycze

(w tym czekolady), lody lub nabiał (jogurty, twarożki). W przypadku tej grupy produktów praktycznie

nie ma produktów spożywczych przebadanych pod kątem zawartości glutenu i oznaczonych jako produkt

bezglutenowy. Powoduje to, że chory jest zdany wyłącznie na uczciwość producenta, co do pełnego

wykazu składników, jakie zawierają te produkty. Niestety, nawet jednak przy pełnym wykazie istnieje

ryzyko, że kupowane produkty mogą być wytwarzane w ciągach technologicznych, na których równolegle

wytwarza się produkty zawierające gluten lub co gorsze produkcja wykonywana jest przemiennie na tych

samych maszynach produkcyjnych, na których jest produkowana żywność zawierająca gluten.

Wnioski: Jeszcze kilka lat temu wystarczyło podać choremu ogólną listę zawierającą rodzaje produktów

spożywczych, w której bezpieczne były np.: jogurty, budynie, płatki kukurydziane, szynka. W dzisiejszych

czasach, przy zróżnicowanym sposobie produkcji lista taka jest zdecydowanie niewystarczająca.

Idealnym rozwiązaniem dla chorego, byłoby podawanie na produktach informacji:

- produkt bezglutenowy (produkt nie zawiera glutenu), w przypadku, gdy produkt ten byłby bezglutenowy

zgodnie z Codex Alimentarius

- produkt zawiera gluten, jeżeli normy podane w Codex Allimetarius zostałyby przekroczone.

Niestety, wprowadzenie takich ustaleń byłoby trudne i w praktyce raczej niewykonalne.

Pewnym rozwiązaniem dla chorym byłoby opracowanie wykazu zawierającego konkretną nazwę

produktu wraz z podaniem producenta tegoż produktu. Można by wówczas przebadać pod kątem

zawartości glutenu chociaż część ogólnodostępnej żywności i umieścić ją w wykazie. Oczywiście wykaz

taki miałby sens, jeżeli producent współpracowałby z twórcami wykazu i nie zmieniał technologii

lub na bieżąco informował o wszelkich zmianach. Chory miałby wówczas dokładną listę produktów,

które może bezpiecznie kupować i unikałby tym samym wielu błędów, które popełnia obecnie.

Jednocześnie chciałabym zaznaczyć, że takie rozwiązanie problemu zakupów żywności

bezglutenowej nie jest nowością i z powodzeniem stosuje się je w niektórych krajach. Także w Polsce

w 2000 roku powstała podobna lista, niestety producenci, nie zachowali się wówczas odpowiedzialnie.

Krótko po opublikowaniu listy część z nich wprowadziła gluten do swoich przetworów, przez co lista stała

się nieaktualna.

10

MOŻLIWOŚCI ELIMINACJI GŁÓWNYCH POKARMOWYCH ZAGROŻEŃ ZDROWOTNYCH ZWIĄZANYCH ZE STRUKTURĄ BIAŁEK I PEPTYDÓW ZIARNIAKÓW PSZENICY

Iwona Konopka, Łucja Fornal Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Immunoreaktywność białka wynika z określonej sekwencji aminokwasów (epitopy liniowe)

i/lub struktury przestrzennej białka/peptydu (epitopy konformacyjne). Uznaje się, że epitopy gliadynowe

mają strukturę liniową, gdyż denaturacja białka tylko nieznacznie obniża ich powinowactwo

do odpowiednich przeciwciał. Jednak jednocześnie wiadomo, że w składzie prolamin pszenicy występują

motywy aminokwasowe zdolne do tworzenia konformacji lewoskrętnej helisy poli-II-proliny zbudowanej

z sekwencji co najmniej trzech reszt proliny i/lub sekwencji bogatych w reszty poliglutaminy. Obecności

tego typu konformacji przypisuje się elastyczne właściwości prolamin oraz ich reomorficzny charakter,

warunkujący ich termostabilność.

W pracy przedstawiono budowę α gliadyn jako źródła najbardziej toksycznych epitopów ziarniaków

pszenicy, porównano sekwencje N-terminalne tej frakcji prolamin, omówiono mechanizm wiązania

epitopów z przeciwciałami antygliadynowymi oraz ich najważniejsze cechy strukturalne. Podano strategię

produkcji ziarna o niższej zawartości toksycznych prolamin poprzez wybór odpowiednich genotypów,

warunków uprawy, eliminowania ziarna z określonych typów stresów środowiskowych oraz stosowanie

w przetwórstwie sortowanie ziarna i/lub mąki. Omówiono również efekty wybranych modyfikacji

fizycznych (głównie procesów cieplnych) i enzymatycznych (m.in. proteolizę gliadyn przez wybrane

szczepy bakterii fermentacji mlekowej, bądź naturalnie występujące w ziarnie enzymy). Pracę kończy

krótkie podsumowanie obecnego stanu wiedzy na temat strawności prolamin, w tym również białek

zmodyfikowanych w procesach technologicznych. Ten aspekt badań związanych z celiakią wydaje się

najmniej poznany, a jednocześnie wiadomo, że odpowiednio strawione białko nie będzie stymulowało

układu immunologicznego.

11

WYKORZYSTANIE METOD BIOINFORMATYCZNYCH DO CHARAKTERYSTYKI I IDENTYFIKACJI PEPTYDÓW W CELU WYKRYWANIA BIAŁEK POTENCJALNIE

TOKSYCZNYCH DLA OSÓB CHORYCH NA CELIAKIĘ

Małgorzata Darewicz, Jerzy Dziuba, Piotr Minkiewicz Katedra Biochemii Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Celiakię definiuje się jako przewlekłą nietolerancję gliadyny (pszenica), sekaliny (żyto), hordeiny

(jęczmień) i aweniny (owies) - białek zawartego w ziarnach zbóż, których spożywanie prowadzi

do zaników kosmków jelita cienkiego, zaburzeń procesów trawienia i wchłaniania, a w konsekwencji

do niedoboru wielu składników pokarmowych. Czynnikiem etiologicznym choroby trzewnej są toksyczne

peptydy. Ich szkodliwość jest związana ze specyficzna sekwencją aminokwasowi oraz obecnością

elementów struktury drugorzędowej.

Celem badań było: wyszukanie sekwencji wykazujących identyczność w stosunku do sekwencji

aminokwasowych białek zbóż, stanowiących peptydy epitopy glutenu, a następnie ich klasyfikację

ze względu na źródło pochodzenia z wykorzystaniem parametrów zaproponowanych przez twórców

programu komputerowego MS BLAST. Do badań wykorzystano sekwencje aminokwasowe, dla których

udowodniono, że zawierają peptydy epitopy glutenu. Przy użyciu programu PREDICT 7 określono

właściwości molekularne (udział struktur drugorzędowych, masa cząsteczkowa, hydrofobowość)

wyszukanych sekwencji wykazujących identyczność w stosunku do sekwencji aminokwasowych prolamin

zbóż, stanowiących peptydy epitopy glutenu. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono,

że bogatym źródłem analizowanych sekwencji peptydów epitopów glutenu okazały się α-, γ-, ω-gliadyny

pszenicy, hordeiny jęczmienia oraz sekaliny żyta. Innymi białkami żywnościowymi, spośród tych,

które zidentyfikowano z wykorzystaniem programu MS BLAST, a zawierającymi sekwencje

aminokwasowi wykazujące identyczność z badanymi peptydami epitopami glutenu były: drożdże

piekarskie (Saccharomyces cerevisiae), drożdże używane w przy wyrobie serów (Yarrowia,

Debaromyces), drożdże kefirowe (Kluyveromyces lactis), kazeina-β (pochodząca z mleka krowiego,

króliczego i wielbłądziego), białko pochodzące od świni (funkcjonujące jako hormon), białko mięśni

kurczaka, krowy oraz konia. Wśród białek zawierających sekwencje identyczne z toksycznymi peptydami

pojawiły się białka owoców i warzyw takich jak: pomidor, marchew, melon. Zidentyfikowano dodatkowo,

jako potencjalnie toksyczne dla osób chorych na celiakię, sekwencje aminokwasowe białek soi,

kukurydzy i ryżu.

Wyniki uzyskane dzięki zastosowaniu programu komputerowego PREDICT 7 dowiodły silnej

ekspozycji reszt aminokwasowych w kierunku hydrofilowego środowiska. Ułatwiona jest wówczas

interakcja epitop-przeciwciało, co tłumaczy immunoreaktywny charakter badanych peptydów.

W poddanych analizie peptydach epitopach glutenu pochodzących z: α-, γ-, ω-gliadyny pszenicy,

hordeiny jęczmienia, sekaliny żyta i aweniny owsa stwierdzono dominujący udział struktury

nieuporządkowanej statystycznego kłębka oraz skrętów -β. Nie stwierdzono obecności struktury

α-helikalnej.

12

IDENTYFIKACJA GRZYBÓW Z RODZAJU FUSARIUM O RAZ MIKOTOKSYN FUZARYJNYCH W ZIARNIE PSZENICY OZIMEJ I JAREJ METODĄ MULTIPLEX PCR

Agnieszka Pszczółkowska, Tomasz Kulik, Jacek Olszewski, Gabriel Fordoński, Krystyna Płodzień Katedra Diagnostyki i Patofizjologii Roślin, Wydział Kształtowania Środowiska i Rolnictwa, UWM w Olsztynie

Zboża są często porażane przez wiele gatunków grzybów będących patogenami, które mogą

prowadzić do obniżenia plonu ziarna i pogorszenia jego jakości. Do najgroźniejszych chorób należy

zaliczyć fuzariozy. Powodowane są one przez grzyby z rodzaju Fusarium, które produkują mikotoksyny

z grupy trichotecenó, eniatyn oraz zearelon i fumonizyny. Ich obecność w żywności i paszach niesie

zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Celem badań było: a) określenie stopnia porażenia ziarna

pszenicy ozimej i jarej przez grzyby z rodzaju Fusarium, b) identyfikacja gatunków z rodzaju Fusarium

zasiedlających ziarno, c) identyfikacja toksyn fuzaryjnych w ziarnie pszenicy. Doświadczenia polowe

zostały założone w ZPD w Bałcynach w latach 2004 - 2006. Analizie molekularnej poddano ziarno

pszenicy ozimej odmiany Tonacja i Sukces oraz jarej odmiany Nawra:

a) ziarno pochodzące ze ścisłego doświadczenia polowego, w którym zastosowano:

- pełną ochronę przeciwko chorobom roślin (I i II zabieg fungicydowy)

- ograniczoną ochronę przeciwko chorobom roślin (I zabieg fungicydowy)

b) ziarno pochodzące z wielkotowarowych pól uprawnych.

Ziarno zostało zmielone w młynku, następnie przeprowadzono izolacje DNA metodą kolumienkową

oraz identyfikację Fusarium spp., F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae,

F. sporotrichioides metodą multiplex PCR z wykorzystaniem specyficznych gatunkowo starterów dla tych

gatunków. Ponadto wykonano analizy na obecność trichotecenów i eniatyn metodą multiplex PCR.

Przeprowadzone analizy molekularne umożliwiły wykrycie w badanym ziarnie pszenicy ozimej

i jarej kompleksu grzybów z rodzaju Fusarium. Obecność Fusarium spp. stwierdzono bezpośrednio

w ziarnie pochodzącym z wszystkich badanych prób. W reakcji multiplex PCR, gdzie zastosowane

startery specyficzne dla Fusarium poae, F. culmorum, F. graminearum i F. sporotrichioides stwierdzono

obecność Fusarium poae w badanym ziarnie za wyjątkiem ziarna odmiany Sukces pochodzącym

z obiektu gdzie zastosowano jeden zabieg fungicydowy z roku 2004 i 2005. Pondto stwierdzono

obecność Fusarium culmorum tylko w ziarnie odmiany Sukces pochodzącym z produkcji polowej z roku

2004, Fusarium graminearum z odmiany Tonacja w roku 2006 i Fusarium sporotrichioides z odmiany

Nawra z roku 2006. W żadnej analizowanej próbie ziarna nie wykryto F. avenaceum. Natomiast w reakcji

multiplex PCR ze starterami specyficznymi dla mikotoksyn z grupy trichotecenów wynik pozytywny

otrzymano w jednej próbie ziarna odmiany Tonacja z produkcji polowej z roku 2006, a zidentyfikowaną

toksyną był nivalenol. W przypadku analiz dotyczących wykrywania eniatyn uzyskano wynik negatywny.

Wskazuje to, że analizowane ziarno pszenicy ozimej i jarej było generalne wolne od wtórnych

metabolitów grzybów – mikotoksyn i było bezpiecznym surowcem, który można wykorzystać do produkcji

artykułów spożywczych i pasz. WNIOSKI: 1. Wszystkie analizowane próby ziarna zasiedlone były

przez grzyby z rodzaju Fusarium. 2. Gatunkiem dominującym było Fusarium poae. 3. Stwierdzono

obecność nivalenolu tylko w jednej próbie ziarna pszenicy ozimej odmiany Tonacja.

13

PODATNOŚĆ ODMIAN I RODÓW PSZENICY OZIMEJ NA ENZYMATYCZNĄ REDUKCJĘ ANTYGENOWOŚCI

Joanna Leszczyńska1, Jacek Waga2, Agata Łącka1, Małgorzata Bryszewska1, Katarzyna Wolska1

1Instytut Podstaw Chemii Żywności, PŁ w Łodzi 2Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie

Białka o charakterze silnych alergenów, intensywnie reagujących z przeciwciałami surowicy

i wywołujących silne objawy chorobowe są na ogół odporne na trawienie proteolityczne.

Celem pracy było stwierdzenie czy białka gliadynowe wybranych odmian i rodów pszenicy ozimej

różnią się pod względem właściwości immunoreaktywnych oraz w jakim stopniu trawienie enzymami

proteolitycznymi obniża ich zdolność wiązania z przeciwciałami przeciwgliadynowymi klasy IgG?

Do oceny immunoreaktywności frakcji gliadyn izolowanej z mąk poddanych modyfikacjom

wykorzystano pośrednią technikę ELISA, w której zostały użyte surowice ludzkie zawierające

przeciwciała przeciwgliadynowe oraz monoklonalne przeciwciała przeciw ludzkiej immunoglobulinie IgG

skoniugowane z fosfatazą alkaliczną. Dla oceny zmian w rozkładzie białek zastosowano elektroforezę

SDS-PAGE, A-PAGE i immunoblotting. Na podstawie wcześniej uzyskanych wyników do obniżania

immunoreaktywności gliadyn mąki pszennej zastosowano subtilizynę, kolagenazę i transglutaminazę.

Analiza właściwości immunoreraktywnych 16 odmian i rodów pszenicy ozimej wykazała znaczne

różnice jak chodzi o zdolność wiązania antygenu przez przeciwciała IgG badanych pacjentów.

Uszeregowanie analizowanych genotypów pod względem wartości immunoreaktywności pozwoliło

utworzyć grupy form o wysokiej, średniej i niskiej wartości rozpatrywanej cechy. Wśród 16 form pszenicy

ozimej stwierdzono obecność genotypów, które z każdą z badanych surowic dawały podobny efekt

reakcji immunologicznej (silny lub słaby). Przykładem mogą być: ród STH 2804 i odmiana Tonacja.

Pierwsza z nich charakteryzowała się najmniejszą immunoreaktywnością, zaś druga zajęła przedostatnie

miejsce w rankingu dla analizowanych surowic. Z drugiej strony stwierdzono występowanie genotypów

reagujących w sposób specyficzny. Typowym przykładem może być Ostka strzelecka. Generalnie jednak

przeszło połowa badanych odmian i rodów zajmowała w rankingu podobne miejsce, a zdecydowana

ich większość znalazła się w tej samej klasie immunoreaktywności bądź też wykazywała różnice jednej

tylko klasy. Trawienie białek gliadynowych 16 odmian i rodów pszenicy ozimej 3 enzymami miało

zróżnicowany wpływ na ich właściwości immunoreaktywne. Generalnie odnotowano spadek wartości

wskaźnika OD/B prawie we wszystkich rozpatrywanych przypadkach. Jednakże wpływ poszczególnych

enzymów na białka gliadynowe różnych form był różny. Spadek immunoreaktywności gliadyn w wyniku

trawienia kolagenazą we wszystkich rozpatrywanych przypadkach był największy. Obserwowany spadek

immunoreaktywności wahał się od ponad 30% do prawie 70%. Duże osłabienie zdolności wiązania

przeciwciał w granicach 70% odnotowano dla odmian Tonacja, Nutka oraz Symfonia modyfikowanych

kolagenazą. Wpływ subtilizyny i transglutaminazy na immunoreaktywność gliadyn był znacznie słabszy.

Praca wykonana w ramach grantu PBZ-KBN-097/P06/2003

14

MODYFIKACJE ANTYGENOWOŚCI GLIADYN MĄKI PSZENNEJ

Joanna Leszczyńska1, Agata Łącka1, Małgorzata Bryszewska1, Katarzyna Wolska1, Jolanta Lukamowicz2 1) Instytut Podstaw Chemii Żywności, PŁ w Łodzi

2)Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi

Z uwagi na rosnącą liczbę osób z nietolerancją glutenu lub alergią na białka glutenowe

podejmowanych jest szereg działań zmierzających do uzyskania mąki o obniżonej immunoreaktywności,

która mogłaby później znaleźć zastosowanie w produkcji żywności o obniżonej alergenności. W pracy tej

zreferowano dotychczas uzyskane wyniki badań zmierzających do uzyskania hipoalergicznej mąki

pszennej, głównie o obniżonej antygenowości frakcji gliadyn. Badacze zajmujący się tą tematyką skupiają

się głównie na procesach technologicznych występujących w trakcie obróbki i przetwarzania żywności,

przede wszystkim na ogrzewaniu oraz na wykorzystaniu enzymów obecnych w przewodzie pokarmowym

podczas trawienia. Poza tym do obniżenia alergenności żywności stosowano: ekstrakcję alergenu,

promieniowanie jonizacyjne, modyfikacje chemiczne i genetyczne.

W naszych pracach skoncentrowano się głównie nad modyfikacjami enzymatycznymi.

W badaniach zastosowano enzymy protelityczne: bromelainę, kolagenazę, subtilizynę, elastazę

oraz transglutaminazę, a także odczynniki sieciujące. W celu obniżenia antygenowości mąki pszennej

zastosowano również fermentację mlekową. Do oceny immunoreaktywności frakcji gliadyn izolowanej

z mąk poddanych modyfikacjom wykorzystano pośrednią technikę ELISA, w której użyto surowic ludzkich

zawierających przeciwciała przeciwgliadynowe oraz monoklonalne przeciwciała przeciw ludzkiej

immunoglobulinie IgG skoniugowane z fosfatazą alkaliczną, a także monoklonalne poliwalentne

przeciwciała przeciw ludzkiej immunoglobulinie skierowane przeciw IgA, IgG, IgM. Dla oceny zmian

w rozkładzie białek zastosowano elektroforezę SDS-PAGE, A-PAGE i immunoblotting.

Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że we wszystkich przypadkach hydrolizy

katalizowanej przez wybrane enzymy uzyskano spadek immnuoreaktywności gliadyn. Jednakże

hydrolizaty mogą zawierać stosunkowo wysoką resztkową immunoreaktywność, poza tym powstające

peptydy często posiadają aktywność biologiczną, a poza tym pogarszają jakość produktu (gorzknięcie).

Usieciowane produkty o obniżonej immunoreaktywności otrzymane w wyniku działania transglutaminazy

wymagają dość dużych stężeń enzymu. Najbardziej obiecujące wyniki uzyskano przy zastosowaniu

reakcji plasteinizacji. W tym przypadku spadek immunoreaktywności był największy, a jednocześnie

unika się wad hydrolizatów.

Wyniki otrzymanych badań pozwalają również na stwierdzenie, że umiejętne wykorzystanie

specyficznych właściwości metabolicznych drobnoustrojów jako metody obniżania alergenności mąki

pszennej wydaje się być obiecującym kierunkiem badań, ponieważ fermentacja jest procesem

naturalnym, bezpiecznie stosowanym od stuleci w produkcji żywności fermentowanej poprawiającym

własności organoleptyczne i zdrowotne produktu. Otrzymana mąka pszenna może być stosowana

jako dodatek do mieszanek dla osób uczulonych, jako że nie wszyscy pacjenci wykazują jednakową

wrażliwość na ten alergen i nie zawsze konieczne jest całkowite wyeliminowanie glutenu z produktu.

Praca wykonana w ramach grantu 2 P06T 02130

15

IMMUNOREAKTYWNOŚĆ GLIADYN ORAZ WŁAŚCIWOŚCI REOLOGICZNE GLUTENU WYBRANYCH ODMIAN I RODÓW PSZENICY OZIMEJ

MODYFIKOWANYCH TIOREDOKSYNĄ

Jacek Waga1, Jerzy Zientarski1, Krystyna Obtułowicz2, Barbara Bilo2, Maria Stachowicz1

1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie 2 Zakład Alergologii Klinicznej i Środowiskowej, Collegium Medium, UJ w Krakowie

Tioredoksyna jest niskocząsteczkowym białkiem (ok. 12 kDa) pośredniczącym w tworzeniu

i rozrywaniu wiązań disulfidowych (SS) pomiędzy różnymi fragmentami białek zapasowych pszenicy.

Wykazano, iż tioredoksyna redukując wewnątrzłańcuchowe wiązania SS niskocząsteczkowych frakcji

α- i β-gliadyn łagodzi ich toksyczność i poprawia parametry cech technologicznych mąki. Celem naszych

badań było stwierdzenie, jak zmieniają się właściwości immunoreaktywne gliadyn i reologiczne glutenu

na skutek modyfikacji tioredoksyną u wybranych odmian i rodów pszenicy.

Badano mąkę sześciu form pszenicy ozimej. Białka gliadynowe ekstrahowano dwustopniowo:

0,1 M NaCl, a następnie 70% EtOH. Wiązania SS uzyskanych białek poddano redukcji w roztworze

tris-HCl o pH=7,9 zwierającym 8 μL tioredoksyny, 7 μL NTR oraz 5 μL NADPH.

Immunoreaktywność natywnych i modyfikowanych ekstraktów badano w układzie direct ELISA

przy użyciu poliklonalnych przeciwciał antygliadynowych (Sigma) oraz surowicy zawierającej przeciwciała

w klasie IgE przeciwko glutenowi od pacjentów z objawami alergii pokarmowych i skórnych. Właściwości

reologiczne glutenu modyfikowanego i nie modyfikowanego tioredoksyną oszacowano na podstawie

analizy ekstensograficznej przy użyciu ekstensografu firmy Brabender.

Specyficzna redukcja wiązań SS obniżyła zdolność wiązania gliadyn zarówno przez fabryczne

przeciwciała antygliadynowe, jak i przez przeciwciała surowicy badanych pacjentów. Obserwowany

spadek immunoreaktywności wahał się – zależnie od odmiany - w granicach 40 – 60% w porównaniu

do próby nie poddanej modyfikacji. Nie stwierdzono natomiast zmiany właściwości reologicznych glutenu

na skutek działania tioredoksyny.

Uzyskany wynik dowodzi, że obok epitopów liniowych istotną rolę w reakcji immunologicznej

odgrywają epitopy konformacyjne. Obserwowany efekt osłabienia immunoreaktywności gliadyn

przy zachowaniu właściwości reologicznych glutenu na niezmienionym poziomie jest zjawiskiem

korzystnym z punktu widzenia poprawy właściwości zdrowotnych odmian i rodów pszenicy.

Praca naukowa finansowana ze środków Ministra Nauki w latach 2004-2006 jako projekt badawczy

zamawiany nr PZB-KBN-097/P06/2003.

16

PROCESY CIEPLNO-WODNE A PROJEKTOWANIE ŻYWNOŚCI O OBNIŻONEJ IMMUNOREAKTYWNOŚCI

Łucja Fornal1, Małgorzata Tańska1, Jadwiga Rothkaehl2, Wojciech Górniak2 1Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

2Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie

Różnorodność struktury białek w surowcach i żywności jest jedną z podstawowych przyczyn

utrudniających obniżenie ich immunoreaktywności. Wiele z nich ma również funkcje metaboliczne,

strukturalne lub ochronne. Z kolei wiązania wodorowe, disiarczkowe lub połączenia z glikozydami czyni je

termostabilnymi i opornymi na proteolizę. Istnieją zatem wielokierunkowe reakcje białek lub peptydów

na ciepło, jedną z nich jest powstawanie nowych struktur o właściwościach alergogennych. Działanie

ciepła i wody jest zatem ciągle otwartym problemem.

Teza badań była następująca: autoklawowanie i prażenie ziaren owsa, nasion gryki i grochu obniża

immunoreaktywność białek. Materiałem badań były ziarna owsa odmian Flamingsstern i Flamingsprofi,

nasiona gryki odmiany Kora i grochu odmiany Ramrod. Obróbka cieplno- wodna obejmowała

autoklawowanie w temperaturze 1200C w czasie 10 i 20 min., a następnie prażenie w temperaturze

1800C przez 2 minuty. Wilgotność ziarna/nasion wynosiła 22%<w<15%. W pierwszym etapie badań

skupiono się na wyznaczeniu barwy przekrojów poprzecznych jako wskaźnika równomiernego

przenikania ciepła. Do pomiaru barwy stosowano system DIA z oprogramowaniem LUCIA G.ver.4.80

określając składowe barwy R,G,B oraz jasność w systemie L* a* b*.

Stosowane warianty działania ciepła i wody wyraźnie zmieniają rozkład średnich wartości

składowych R,G, B, jak i atrybutów barwy w systemie L*a*b* ziaren owsa. Wyraźna jest również reakcja

odmiany. Barwa odmiany żółtonasiennej zmieniała się w kierunku barwy ciemniejszej wraz ze wzrostem

wilgotności i czasu autoklawowania. Natomiast w przypadku ziaren odmiany białonasiennej zmiany barwy

nie wykazują związków z parametrami procesu. W przypadku nasion gryki charakterystyczny jest

wyraźny wpływ wilgotności i czasu autoklawowania na barwę bielma. Niska wilgotność sprzyja barwie

ciemniejszej. Można przypuszczać, że woda ma duże znaczenie w zmianach układu białkowo-

skrobiowego nasion gryki pod wpływem działania ciepła. Porównywalnie w największym stopniu zmieniła

się barwa liścieni grochu odmiany Ramrod. Wszystkie badane atrybuty barwy zmniejszyły wartości

średnie o połowę w porównaniu z barwą nasion kontrolnych.

Zmiany barwy w wyniku działania ciepła i wody mają związki z cechami gatunkowymi

i odmianowymi. Ich intensywność zależy zarówno od wilgotności nasion, jak i czasu obróbki cieplno-

wodnej. Generalnie ciemna barwa wskazuje na denaturację białka. Zmiany w charakterystyce

proteomicznej białek przedstawiają wyniki badań Konopki i in. (2007, str. 17).

17

WPŁYW PROCESÓW CIEPLNO-WODNYCH NA PROTEOM, IMMUNOREAKTYWNOŚĆ ORAZ STRAWNOŚĆ BIAŁEK ZIARNIAKÓW OWSA I GRYKI

Iwona Konopka1, Łucja Fornal1, Piotr Minkiewicz2, Jacek Waga3, Dorota Nałęcz2, Krystyna Skibniewska4

1Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych, 2Katedra Biochemii Żywności,

4Katedra Towaroznawstwa i Badań Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie 3Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie

Nasiona gryki i owsa są alternatywą w żywieniu osób chorych na celiakię, chociaż w tym drugim

przypadku brak konsensusu ze względu na podobieństwo sekwencji prolamin owsa i pszenicy,

sprzyjające wiązaniu z przeciwciałami antygliadynowymi. Procesy technologiczne typowe

w przetwórstwie nasion gryki i owsa mogą powodować modyfikacje konformacji polipeptydów, a czasami

również ich struktury pierwszorzędowej. Celem prezentowanych badań było wskazanie różnic proteomu,

immunoreaktywności białek oraz ich strawności w warunkach in vitro między nasionami kontrolnymi

oraz zmodyfikowanymi w kombinowanym procesie autoklawowania w temp. 120oC/10min (wilgotność

nasion 22%), a następnie prażenia w temp. 180oC (2 min).

Doświadczenia przeprowadzono na nasionach obłuszczonych. Określono proteom nasion

w układzie elektroforezy 2D, skład frakcyjny białek techniką RP-HPLC po ich ekstrakcji zmodyfikowaną

metodą Osborn’a oraz immunoreaktywność frakcji białka nasion rozpuszczalnych w 0.1 M NaCl oraz 70%

etanolu. Immunoreaktywność badano w układzie direct i indirect ELISA przy użyciu poliklonalnych

przeciwciał antygliadynowych (Sigma) oraz surowicy zawierającej przeciwciała w klasie IgE przeciwko

białkom glutenowym od pacjentów z objawami alergii pokarmowych i skórnych. Nasiona poddano

również trawieniu z udziałem pepsyny i pankreatyny, a spektrum aminokwasów uzyskanych po trawieniu

określono przy użyciu chromatografii RP-HPLC.

W proteomie próbek kontrolnych zidentyfikowano 392 i 429 spoty, odpowiednio w nasionach gryki

i owsa. Frakcja albumin i globulin stanowiła 75 i 70% białek gryki i owsa. Obróbka cieplno-wodna

spowodowała drastyczny spadek ekstraktywności białek, w skrajnym przypadku do poziomu ok. 12%

masy białka wyjściowego (gryka) oraz redukcję spotów do ilości 55 i 102 w nasionach gryki i owsa.

Zaobserwowano jednocześnie występowanie nowych spotów, które mogły być polimerami białkowymi

lub ewentualnie pochodzić z rozpadu wolnorodnikowego. Wskazywał na to również zanik frakcji

albuminowo-globulinowej oraz zmiana wyglądu chromatogramów obu frakcji prolamin. Wyniki analiz

immunoreaktywności potwierdziły, że zastosowane procesy cieplno-wodne obniżają zawartość epitopów

w białkach przechodzących do supernatantu. Analizy zmian proteomu i układu frakcji w analizie

RP-HPLC wykazały, że to zjawisko jest bardziej efektem obniżenia ekstrahowalności białek na skutek

tworzenia wiązań nie poddających się rozpadowi w środowisku buforu zawierającego 6 M mocznik, 1%

Triton X-100, 0.5% DTT i 0.5% IPG. Z uwagi na to postanowiono zbadać jak te nowe kompleksy są

trawione przy udziale pepsyny i pankreatyny. Chromatogramy peptydów w układzie RP-HPLC wskazały

na odmienne spektrum produktów hydrolizy białek próbek kontrolnych i modyfikowanych przy zbliżonej

koncentracji białek w supernatantach z obu wariantów trawienia.

18

OCENA ZDOLNOŚCI BAKTERII FERMENTACJI MLEKOWEJ DO DEGRADACJI BIAŁEK ZAPASOWYCH PSZENICY

Bartosz Brzozowski1, Karolina Tatarczuk1, Elżbieta Rzewnicka1, Lucyna Kłębukowska2, Włodzimierz Bednarski1

1 Katedra Biotechnologii Żywności, 2 Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności,

Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Jednym z głównych źródeł białka roślinnego wykorzystywanego powszechnie w żywieniu ludzi

i zwierząt są ziarniaki zbóż (pszenicy, żyta, jęczmienia, owsa, ryżu, kukurydzy i in.). Korzystanie z tych

surowców i ich spożywanie wiąże się jednak z licznymi uciążliwościami, a w ostatnich latach

z coraz częstszymi zagrożeniami żywieniowymi i co za tym idzie potrzeby specjalnej obróbki

technologicznej i kulinarnej.

Jedną z możliwości redukcji immunoreaktywności białek zapasowych zbóż jest zastosowanie

specyficznych enzymów hydrolizujących fragmenty polipeptydów bogatych w prolinę i glutaminę.

Wiele z mikroorganizmów wykorzystywanych w technologii żywności ma zdolność do biosyntezy

enzymów proteolitycznych m.in. bakterie fermentacji mlekowej.

Celem pracy była charakterystyka aktywności proteaz bakterii fermentacji mlekowej oraz ocena

wpływu aktywności tych proteaz na skład i właściwości uwalnianych peptydów z frakcji prolamin pszenicy.

W pierwszym etapie badań poddano charakterystyce wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe proteazy

syntetyzowane przez Lb. acidophilus T0928 i Lb. brevis 37. Wykonano pomiary aktywności

endoproteolitycznej metodą wg Prestona, z zastosowaniem specyficznych inhibitorów proteaz. W drugim

etapie, proteazy utrwalone metodą suszenia sublimacyjnego zastosowano do degradacji gliadyn pszenicy

odmiany Sukces. Gliadyny były hydrolizowane przez 2 godziny w środowisku o kwasowości pH 4,5; 5,5

i 6,8 oraz temperaturze 30 i 37°C. Próbki gliadyn przed i po hydrolizie rozdzielano metodą elektroforezy

kapilarnej.

Przeprowadzone doświadczenia wykazały, iż w temperaturze 30°C i kwasowości środowiska pH

4,5; 5,5 oraz 6,8 preparaty proteaz uzyskane z bakterii nie hydrolizują frakcji gliadyn. W środowisku

o temperaturze 37oC i kwasowości pH 4,5 preparat proteaz uzyskany z Lb. acidophilus T0928

modyfikował gliadyny. Oznaczono 5 podfrakcji gliadyn, ale zmianie uległy pola powierzchni odpowiednich

pików co świadczy o modyfikacji białek.

Preparat proteaz uzyskanych z Lb. brevis 37 hydrolizował gliadyny tylko w środowisku

o temperaturze 37oC i kwasowości pH 6,8. Ilość podfrakcji gliadyn po hydrolizie wzrosła z 5 do 6.

Nowa podfrakcja charakteryzowała się masą czasteczkową 47kDa. Z przeprowadzonych badań wynika,

że zdolność do hydrolizy gliadyn jest zależna od warunków środowiska reakcji.

Praca badawcza była wykonana w ramach Projektu Zamawianego KBN, PBZ 097/P06/2003

„Identyfikacja i sposoby przeciwdziałania toksyczności i alergenności białek nasion ważnych roślin

uprawnych.” oraz Projektu Badawczego Własnego Nr N312 066 31/3701 „Zastosowanie

wysokowydajnego skriningu mikroorganizmów i metod bioinżynierii w pozyskiwaniu peptydaz prolinowych

przydatnych w degradacji peptydów immunoreaktywnych w żywności.”

19

ZMIANY WŁAŚCIWOŚCI IMMUNOREAKTYWNYCH WYBRANYCH FRAKCJI BIAŁEK GROCHU W WYNIKU ZASTOSOWANIA DO OBRÓBKI NASION WYBRANYCH

PROCESÓW HYDROTERMICZNYCH

Lucjan Jędrychowski1, Łucja Fornal2, Agata Szymkiewicz1, Iwona Konopka2

1Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie 2Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Ogólnie znanym stwierdzeniem jest, że procesy technologiczne, a szczególnie procesy

hydrotermiczne powodują znaczne zmiany w zakresie właściwości fizyko-chemicznych, funkcjonalnych

i biologicznych białek poddawanych obróbce surowców. Szczególnie znany jest wpływ procesów

termicznych i hydrotermicznych na zmiany denaturacyjne białek. Wymienione zmiany, związane

ze zmianami strukturalnymi w obrębie epitopów, w sposób zdecydowany mogą wpływać także na zmianę

właściwości immunoreaktywnych białek grochu.

Do badań wpływu procesów hydrotermicznych na zmiany immunoreaktywności wybranych frakcji

białek grochu użyto nasion odmiany Ramrod pochodzących ze zbioru 2005 r., zakupionych w Stacji

Nasion w Olsztynie. Nasiona w stanie wilgotności naturalnej (13%) oraz o podwyższonej wilgotności

(22%) poddawano autoklawowaniu w temperaturze 120oC przez 10 i 20 min (dwa warianty), a następnie

2 minutowemu prażeniu w temperaturze 180oC. Oznaczeń zawartości poszczególnych frakcji białek

grochu dokonano metodą competitive (współzawodniczą) ELISA, stosując królicze przeciwciała

poliklonalne uzyskane w stosunku do oczyszczonych metodą chromatografii frakcji albuminy, leguminy

i wicyliny oraz wcześniej wyznaczone w wyniku optymalizacji parametry.

Zastosowany w badaniach proces prażenia nasion grochu w stanie wilgotności naturalnej nasion

(13% wilgotności) i nasion o podwyższonej wilgotności (22% zawartości wody) w sposób zdecydowany

wpłynął na zmiany właściwości immunoreaktywnych białek grochu w stosunku do immunoreaktywności

obserwowanej w nasionach kontrolnych (nie poddanych obróbce). Najbardziej labilnym białkiem okazała

się legumina nasion grochu. W wyniku procesu prażenia nasion stwierdzono obniżenie właściwości

immunoreaktywnych wymienionej frakcji o ok. 99,5% (przy obróbce nasion o podwyższonej wilgotności

przez 10 min) do ok. 99,7% w stosunku do immunoreaktywności obserwowanej w nasionach wyjściowych

(przy obróbce nasion o podwyższonej wilgotności do 22% przez 20 min). Tak drastyczna (niemal

całkowita) eliminacja właściwości immunoreaktywnych wskazuje na potencjalną możliwość

eliminacji właściwości alergennych wymienionej frakcji w wyniku zastosowania procesu autoklawowania,

a następnie prażenia nasion grochu.

Zdecydowanie bardziej termostabilnymi okazały się frakcje albuminy i wicyliny. Zmiany właściwości

immunoreaktywnych wymienionych frakcji nie były tak wyraźne jak w przypadku leguminy. Obniżenie

wymienionych właściwości dla albuminy było zdecydowanie niższe i wynosiło ok. 30% (dla nasion

o wilgotności 22% autoklawowanych przez 10 min) i o ok. 62% (dla nasion o wilgotności 22%

autoklawowanych przez 20 min). Uzyskane wyniki wskazują, że proces prażenia nie wydaje się

skutecznie eliminować właściwości immunoreaktywnych (i bardzo prawdopodobnie alergenych) albuminy

i wicyliny grochu.

20

WPŁYW SUPLEMENTACJI DIETY TRANEM NA POZIOM WYBRANYCH CYTOKIN U MYSZY BALB/C

Dagmara Mierzejewska1, Ewa Kubicka2, Iwona Konopka3, Lucjan Jędrychowski2

1Zakład Chemii Żywności, 2Zakład Enzymów i Alergenów Żywności,

Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie 3Katedra Przetwórstwa i Chemii Surowców Roślinnych, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Kwasy tłuszczowe są ważnym składnikiem diety niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania

organizmu. Wykazano ich szczególną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu immunologicznego,

szczególnie kwasów wielonienasyconych ( ang. polyunsaturated fatty acids, PUFAs) z rodziny n-3 i n-6.

Przedstawicielem rodziny n-6 jest kwas linolowy występujący głównie w kukurydzy, soi i oleju

słonecznikowym. W tkankach zwierzęcych kwas linolowy jest konwertowany do kwasu arachidonowego

prekursora prostaglandyn i leukotrienów, którym przypisuje się właściwości prozpalne

i immunomodulacyjne. Przedstawicielem rodziny kwasów n-3 jest kwas linolenowy, który w organizmie

zwierzęcym konwertowany jest do kwasów eikosapentaenowego i dokosaheksaenowego.

Wykazano, iż tran jako bogate źródło kwasów wielonienasyconych tłumi odpowiedź zapalną

organizmu, powoduje inhibicję produkcji interleukiny-1 oraz INF. Ważną rolę w tłumieniu odpowiedzi

immunologicznej odgrywa IL-2. Prowadzone badania miały na celu określenie wpływu suplementacji diety

tranem na poziom IL-2 oraz INF-γ

Myszy Balb/C immunizowano dootrzewnowo β-laktoglobuliną i podawano dietę zbożową

suplementowaną tranem. Grupę kontrolną stanowiły myszy immunizowane dootrzewnowo

β-laktoglobuliną. Równolegle prowadzono myszy w wieku 4-6tyg. i 6miesięcy. Doświadczenie

prowadzono 7 tygodni, po czym myszom pobrano krew i śledzionę. W surowicy krwi i medium z hodowli

limfocytów zbadano poziom IL-2 oraz INF-γ testami komercyjnymi R&D.

W żadnej z grup nie udało się oznaczyć IL-2 oraz INF-γ w surowicy krwi w zakresie podanym

w instrukcji testowej, co może być efektem zbyt niskiego ich poziomu dla stosowanego testu. Analiza

zawartości IL-2 oraz INF-γ w medium hodowlanych wykazuje wyraźny spadek ich poziomu w stosunku do

grupy kontrolnej immunizowanej dootrzewnowo β-lg. Pozwala to wnioskować, że suplementacja diety

tranem wpływa na poziom badanych cytokin.

21

STYMULACJA ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ ŚLUZÓWKI MYSZY NATYWNYMI I ZGLIKOLIZOWANYMI ALBUMINAMI GROCHU

Dagmara Mierzejewska, Paulina Mitrowska, Bogumiła Rudnicka, Henryk Kostyra Zakład Chemii Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Celem pracy było zbadanie odpowiedzi immunologicznej śluzówki myszy po immunizacji

natywnymi i glikolizowanymi albuminami grochu.

Materiał badawczy stanowiły albuminy grochu wyekstrahowane z mąki grochowej wodą. Albuminy

oczyszczono z pozostałości cukrów i innych związków towarzyszących za pomocą dializy wobec wody

i wirowania. W formie zliofilizowanej nazwano je ALBUMINAMI NATYWNYMI (AN). Albuminy poddano

glikacji z glukozą przez 7dni w temperaturze 37°C, następnie oddializowano i zliofilizowano. Ten produkt

nazwano ALBUMINAMI ZGLIKOLIZOWANYMI (AG). Testem „Glyko-Protein”(Pearc’e) wykazano

obecność glikoprotein po glikacji. AN i AG podawano myszom bezpośrednio do żołądka 0, 7 i 14 dnia

w dawce 2mg/mysz. W surowicy krwi badano poziom przeciwciał IgG i IgA skierowanych do AN i AG

w czasie trwania doświadczenia. Stwierdzono, że miano końcowe (ang. end point titre) dla obu

antygenów zawiera się w granicy od 1: 27 - 28. W żadnym z badanych przypadków nie stwierdzono

istotnego poziomu przeciwciał klasy IgA. Na koniec doświadczenia ze śledziony i węzłów kreskowych

myszy wyizolowano limfocyty. Hodowle limfocytów prowadzono w obecności badanych antygenów

i kontrolowano pod mikroskopem. Stwierdzono, że albuminy zglikolizowane efektywniej pobudzały

komórki do proliferacji w stosunku do albumin natywnych.

Podsumowując przeprowadzone badania można stwierdzić, że: 1) podawane albuminy natywne

i zglikolizowane wywołały odpowiedź układu immunologicznego myszy; 2) podawana dawka albumin

nie pobudziła śluzówki do produkcji przeciwciał klasy IgA; 3) glikacja zwiększa właściwości

immunoreaktywne albumin o czym świadczą wyniki stymulowanych hodowli komórkowych; 4) odpowiedź

układu może świadczyć o zainicjowaniu tolerancji na białka pokarmowe (w tym przypadku są to albuminy

grochu), co jest podstawową rolą układu immunologicznego śluzówki, wymaga to jednak dużo bardziej

zaawansowanych badań.

22

WPŁYW HYDROLIZATÓW ENZYMATYCZNYCH BIAŁEK GROCHU NA AKTYWNOŚĆ DROBNOUSTROJÓW JELITOWYCH

Dominika Świątecka1, Aleksander Świątecki2, Henryk Kostyra1 1 Zakład Chemii Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

2 Zakład Mikrobiologii, Wydział Biologii, UWM w Olsztynie

Białka żywności oprócz podstawowej swej funkcji odżywczej, stanowić mogą istotne źródło wielu

krótkich peptydów, charakteryzujących się wysoką aktywnością biologiczną. Dotychczas poznano

i opisano tylko nieliczne bioaktywne peptydy. Zakłada się, że zakres aktywności tych związków jest

bardzo szeroki i dotyczyć może oddziaływania na procesy fizjologiczne organizmu i immunostymulacji.

Zwrócono również uwagę na antyoksydacyjne oraz przeciwdrobnoustrojowe działanie peptydów.

Celem niniejszej pracy było określenie wpływu krótkich peptydów, pozyskanych z białek grochu

na skutek degradacji enzymatycznej białka natywnego, na aktywność wybranych drobnoustrojów

jelitowych. Ocenę zmian aktywności fizjologicznej Escherichia coli, Enterococcus faecalis i Proteus

mirabilis w środowisku natywnych białek grochu i ich hydrolizatów przeprowadzono za pomocą różnych

technik mikrobiologicznych. Zmiany w dynamice namnażania bakterii przy ich ekspozycji na badany

substrat określano, metodą hodowli na pożywkach stałych i płynnych. Dynamikę namnażania

oraz aktywność fizjologiczną analizowano metodą mikroskopową, przy wykorzystaniu barwienia

fluoroforowego (DAPI). Przeżywalność bakterii w środowisku białek grochu i ich hydrolizatów oznaczano

za pomocą zestawu fluorescencyjnego Live/Dead (BacLight™ Bacterial Viability Kit). Natomiast zmiany

w aktywności metabolicznej drobnoustrojów powodowane ekspozycją na badany substrat peptydowy

określano na podstawie redukcji soli tetrazolowych (CTC).

Przeprowadzone badania wpływu hydrolizatu białek grochu na rozwój i aktywność wybranych

bakterii potwierdziły silne hamujące działanie ekstraktów peptydowych na badane grupy bakterii.

W poszczególnych eksperymentach, w odniesieniu do białka natywnego, wykazano silny hamujący

wpływ hydrolizatu na rozwój bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Aktywność metaboliczna

Escherichia coli, Proteus mirabilis i Enterococcus faecalis, oznaczana na podstawie rozkładu chlorku

tetrazolowego (CTC), była hamowana pod wpływem hydrolizatu białkowego podczas tworzenia biofilmu

bakteryjnego. Wykazano również, iż suplementacja podłoża hydrolizatem białkowym grochu przyspiesza

tempo obumierania komórek bakteryjnych w obrębie biofilmu.

Uzyskane wyniki badań, wskazują na istotną rolę hydrolizy enzymatycznej w przekształcaniu białek

żywności. Powstające w tych procesach, aktywne mikrobiologicznie oligopeptydy, wpływają istotnie

na tempo procesów mikrobiologicznych. Zmiana dynamiki namnażania bakterii oraz ich aktywności

metabolicznej, przeżywalności i zdolności do tworzenia biofilmów może wpływać bezpośrednio

na funkcjonowanie przewodu pokarmowego. Uwalnianie takich oligopeptydów z żywności in vivo może

mieć istotny wpływ na zmiany w kompozycji bakteryjnego ekosystemu jelitowego oraz odgrywać istotna

rolę w zapobieganiu chorób zakaźnych.

23

PROBLEMY DIAGNOSTYCZNE I OCENA KLINICZNA ATYPOWYCH POSTACI CELIAKII

Barbara Burda-Muszyńska1, Beata Oralewska1, Bożena Cukrowska2, Maria Zielińska-Michałkiewicz3, Marzena Olszaniecka4, Maria Agnieszka Zegadło-Mylik2, Jerzy Socha1

1Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii, 2Zakład Patologii, 3Poradnia Psychiatryczna, 4Poradnia Neurologiczna, Instytut-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie

W patogenezie celiakii odgrywają rolę predyspozycje genetyczne, działanie toksyczne glutenu

oraz aktywacja reakcji autoimmunologicznych. Obraz kliniczny celiakii zmienił się w ostatnim 20-leciu

w kierunku przewagi postaci atypowych.

Celem pracy była ocena występowania celiakii atypowej u dzieci w grupach ryzyka i analiza

kliniczna rozpoznanych przypadków. Przebadano 853 dzieci wieku od 9/12 do 17,5 r.ż, które podzielono

na grupy badawcze w zależności od rozpoznania klinicznego: zespól nadwrażliwego jelita grubego

(n=276), padaczka (n=85), zaburzenia hiperkinetyczne (n=116), autyzm (n=74), niedobór masy ciała

i/lub wzrostu (n=153) oraz grupa dzieci z innymi schorzeniami, w tym niedokrwistość,

autoimmunologiczne zapalenie wątroby, izolowana hipertransaminazemia, bóle głowy, idiopatyczna

osteoporoza (n=149). Objawy nietolerancji pokarmowej na zboża zawierające gluten oceniono

na podstawie kwestionariusza. U wszystkich dzieci wykonano testy przesiewowe w kierunku celiakii

na obecność przeciwciał przeciwko endomyzium (EmA) metodą immunofluorescencji pośredniej

oraz przeciwko rekombinowanej ludzkiej transglutaminazie tkankowej (hrtTG-Ab) metodą

immunoenzymatyczną (ELISA). Dodatnie testy przesiewowe (EmA i hrtTg-Ab) stwierdzono u 14-ga

dzieci, u których wykonano biopsję jelita cienkiego. U 9-ga dzieci badanie histopatologiczne wykazało

III stopień zaniku wg skali Marsha, II stopień u jednego, a I stopień u dwójki dzieci. U dwójki dzieci

stwierdzono prawidłowy obraz śluzówki jelitowej. U pacjentów z dodatnimi badaniami przesiewowymi

zaplanowano przeprowadzenie pogłębionego wywiadu żywieniowego w kierunku nietolerancji glutenu.

Nasze badania pokazują, że celiakia może przebiegać z objawami atypowymi zarówno związanymi

z przewodem pokarmowym, jak również spoza przewodu pokarmowego pod postacią zespołu

nadwrażliwego jelita grubego, zaburzeń hiperkinetycznych, niedoboru masy ciała i wzrostu,

niedokrwistości.

Badania przeprowadzono w ramach realizacji projektu PBZ-097/P06/2003

24

PODSTAWY TEORETYCZNE ROZWOJU TOLERANCJI NA GLUTEN - PREWENCJA CHOROBY TRZEWNEJ

Bożena Cukrowska1, Barbara Burda-Muszyńska2, Jerzy Socha2 1Zakład Patologii, 2Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii,

Instytut-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie

Celiakia jest to trwała enteropatia, wynikająca z nieprawidłowej odpowiedzi immunologicznej

na wprowadzony do diety gluten u osób genetycznie predysponowanych. Znaczącą rolę

w patomechanizmie celiakii odgrywa zaburzenie rozwoju tolerancji immunologicznej błon śluzowych

na antygeny pokarmowe, w tym gluten. Tolerancja pokarmowa jest czynnym procesem, w którym

na skutek kontaktu układu GALT (tkanki limfatycznej związanej z jelitem) z antygenami pokarmowymi

dochodzi do powstania swoistych limfocytów regulujących (hamujących) odpowiedź immunologiczną.

U osób z celiakią obserwuje się natomiast aktywację limfocytów prozapalnych odpowiedzialnych za zanik

kosmków jelitowych i aktywację procesów autoimmunologicznych.

Badania na zwierzętach pokazują, że tolerancja pokarmowa rozwija się we wczesnej ontogenezie

na skutek podawania niewielkich dawek antygenu, a pokarm matki chroni przed reakcją zapalną

skierowaną przeciwko danemu antygenowi. Wydaje się, że wzrost atypowych postaci celiakii, często

z uogólnioną autoimmunizacją i współwystępowaniem celiakii z innymi chorobami autoimmunologicznymi

wynika z późnego wprowadzenia glutenu do diety niemowląt (w Polsce powyżej 9 miesiąca życia).

Badania epidemiologiczne pokazują, że wprowadzanie niewielkich dawek glutenu pomiędzy

4-6 miesiącem życia w okresie karmienia piersią zmniejsza ryzyko zachorowania na celiakię do 2 roku

życia. Wprowadzenie glutenu poniżej 4 miesiąca życia i powyżej 7 miesiąca powoduje natomiast wzrost

ryzyka uogólnionej autoimmunizacji i występowania innych chorób autoimmunologicznych.

Przedstawione badania sugerują możliwość prewencji celiakii poprzez wczesne (od 4 miesiąca)

wprowadzanie do diety niemowląt karmionych piersią niewielkich dawek glutenu.

Badania przeprowadzono w ramach realizacji projektu PBZ-097/P06/2003 i projektu międzynarodowego

UCM Utrecht

25

WPŁYW MIESZANEJ MIKOTOKSYKOZY NATURALNEJ ZIARNA ZBÓŻ NA WYBRANE PODSTAWOWE WSKAŹNIKI PROFILU METABOLICZNEGO

I HISTOPATOLOGICZNEGO ŚWIŃ

Maciej Gajęcki, Kazimierz Obremski, Łukasz Zielonka, Ewa Skorska-Wyszyńska, Magdalena Gajęcka, Ewa Jakimiuk, Magdalena Polak Katedra Weterynaryjnej Ochrony Zdrowia Publicznego,

Wydział Medycyny Weterynaryjnej, UWM w Olsztynie

W doświadczeniu użyto pszenicę ozimą odmiany Sukces po jednokrotnym oprysku fungicydami,

w której stwierdzono obecność zearalenonu (33,75 μg/kg paszy), deoksyniwalenolu (29,81 μg/kg paszy)

i toksynę T-2 (9,97 μg/kg paszy). Ze skażonego zboża sporządzono mieszankę paszową,

którą podawano świniom z grupy doświadczalnej przez okres 14 dni. Podczas doświadczenia pobierano

krew do badań hematologicznych, biochemicznych, toksykologicznych i immunologicznych oraz post

mortem pobrano wycinki tkanek z jelit cienkich. W uzyskanym materiale badawczym pochodzenia

zwierzęcego stwierdzono statystycznie istotne zmiany w obrazie hematologicznym i biochemicznym

surowicy krwi wskazujące na toczący się proces zapalny w organizmie badanych zwierząt,

czego dowodem jest obraz histopatologiczny jelit cienkich. W pobranych próbkach tkanek jelit cienkich

świń stwierdzono zmniejszenie liczby komórek kubkowych w nabłonku jelit u zwierząt grupy

doświadczalnej w porównaniu z grupą kontrolną, zwiększenie liczby limfocytów w błonie śluzowej ściany

jelit oraz w nabłonku pokrywającym kosmki jelitowe. Stwierdzono również liczne komórki plazmatyczne

w błonie śluzowej. Przedstawione zmiany dowodzą o toczącym się procesie zapalnym w błonie

śluzowej przewodu pokarmowego oraz o zmianach profilu metabolicznego i nieznacznym,

ale statystycznie istotnym pobudzeniu układu immunologicznego, co potwierdza o toczącym się procesie

usposabiającym do wystąpienia patologii mimo bardzo niskiej dawki podawanych mikotoksyn.

26

OCENA SPOSOBU ŻYWIENIA DZIECI Z PÓŹNO ROZPOZNANĄ CELIAKIĄ

Anna Wojtasik1, Hanna Kunachowicz1, Barbara Ratkovska1, Barbara Burda-Muszyńska2 1 Zakład Wartości Odżywczych Żywności, Instytut Żywności i Żywienia w Warszawie

2 Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii,

Instytut Pomnik -Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie

Celiakia jest chorobą, w której dieta bezglutenowa musi być stosowana przez całe życie.

Stosowanie takiej diety, która jest dietą eliminacyjną, nastręcza wiele trudności, zwłaszcza w pierwszym

okresie jej wprowadzania. Dotyczy to m.in. pacjentów, u których atypowa postać celiakii, bez objawów

ze strony przewodu pokarmowego, może współistnieć z innymi chorobami i została rozpoznana

w późniejszym okresie życia. Popełniane błędy żywieniowe mogą prowadzić do upośledzenia stanu

odżywienia pacjenta oraz braku efektywności leczenia.

Badania przeprowadzone we wcześniejszych latach wśród dzieci z już wykrytą celiakią

i stosujących dietę bezglutenową przez dłuższy czas, wykazały zbyt wysokie w stosunku do zaleceń

spożycie energii, tłuszczu, cholesterolu i sodu. Niska natomiast była realizacja norm na wapń, żelazo,

cynk i miedź oraz na witaminę C i witaminy z grupy B. Wskazuje to, że podobne błędy żywieniowe,

jak w populacji ogólnej, spotyka się u dzieci z celiakią.

W niniejszych badaniach przeprowadzono analizę sposobu żywienia u dzieci z późno wykrytą

celiakią (średnio w wieku 10 lat), u których dieta bezglutenowa stosowana jest od niedawna.

Grupę badaną stanowiło 14 dzieci w wieku od 4 do 16 lat. Zostały one wyłonione w badaniach

przesiewowych w kierunku celiakii, przeprowadzonych w IP-CZD wśród 853 dzieci z grup ryzyka -

pacjentów w wieku od 2 do 18 lat, z różnym rozpoznaniem klinicznym, takim jak zespół nadwrażliwego

jelita grubego (IBS), autyzm, zaburzenia hiperkinetyczne (ADHD), padaczka, niedobór masy ciała

i/lub wzrostu (NMC/W) i inne (bóle głowy, niedokrwistość, osteoporoza itp.). U badanych dzieci

nie obserwowano typowych dla celiakii objawów ze strony przewodu pokarmowego.

U pacjentów z celiakią dokonano oceny spożycia żywności metodą częstotliwości spożycia,

przy zastosowaniu odpowiednio opracowanego kwestionariusza oraz albumu fotografii porcji produktów

i potraw. Obliczenia dotyczące wartości odżywczej badanych diet prowadzono przy wykorzystaniu

programu komputerowego, współpracującego z bazą danych zawierającą informacje dotyczące wartości

odżywczej produktów bezglutenowych. Analogiczną ocenę, przy wykorzystaniu ogólnie dostępnej bazy

danych o składzie produktów spożywczych, przeprowadzono również w grupie kontrolnej 14 dzieci,

u których nie stwierdzono celiakii i spożywających zwyczajową dietę.

Uzyskane wyniki porównano z normami odpowiednimi dla wieku i płci badanych dzieci, przyjmując

poziom zalecanego spożycia.

27

WPŁYW ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN NA ZAWARTOŚĆ ZWIĄZKÓW TOKSYCZNYCH I ALERGIZUJĄCYCH W NASIONACH WYBRANYCH ROŚLIN UPRAWNYCH

Alicja Sułek1, Grażyna Podolska1, Kazimierz Noworolnik1, Jerzy Księżak1, Jerzy Dziuba2, Iwona Konopka3

1Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa, Państwowy Instytut Badawczy w Puławach 2Katedra Biochemii Żywności, 3Katedra Przetwórstwa i Chemii Żywności,

Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Stosowane środków chemicznych w zasiewach pszenicy fungicydów i herbicydów jest obecnie

nieodzownym elementem agrotechniki. Badania literaturowe wskazują, że stosowanie środków ochrony

roślin powoduje zmiany zawartości białka, wpływa na cechy wartości technologicznej pszenicy. Wpływ

ten jest uzależniony od rodzaju, dawki oraz terminu stosowania środka chemicznego. Postawiono zatem

hipotezę: środki ochrony zasiewów wpływają na zawartość związków alergennych w nasionach roślin.

Wpływ ten zależy od dawki , rodzaju substancji aktywnej oraz terminu stosowania zabiegu. Celem badań

było określenie wpływu środków ochrony roślin na plonowanie oraz skład białek pszenicy ozimej i jarej,

gryki, owsa i grochu. Analizy chemiczne polegały na oznaczeniu w ziarnie białek (albuminy + globuliny,

gliadyny i gluteniny) oraz izolowaniu i analizie frakcji gliadynowej. W celu pozyskania materiału

badawczego dla każdego gatunku założono osobne doświadczenia polowe, w których uwzględniono

stosowane w poszczególnych gatunkach roślin preparaty chemiczne. Kontrolę stanowiły poletka

bez ochrony chemicznej.

Po zastosowaniu herbicydu Sekator wzrastał procentowy udział w białku albumin i globulin, malał

glutenin a gliadyn nie zmieniał się. Analiza jakościowa i ilościowa frakcji α gliadyn wykazała

zróżnicowanie pod wpływem działania herbicydu. Zastosowanie fungicydu spowodowało wzrost

plonowania pszenicy jarej w stosunku do obiektu kontrolnego. Najwyższy plon ziarna z jednostki

powierzchni uzyskano stosując Amistar w okresie zawiązywania nasion. Stosowanie fungicydu

niezależnie od terminu wpłynęło na zwiększenie procentowego udziału w białku frakcji gliadyn

w porównaniu do obiektu kontrolnego. Analiza ilościowa i jakościowa α gliadyn po zastosowaniu

fungicydu Amistar w obu badanych terminach wykazała zróżnicowanie w stosunku do obiektu

kontrolnego.

Pod wpływem herbicydu wzrastała zawartość albumin i globulin, obniżała się zawartość frakcji

α/β gliadyn. Gluteniny ulegały zmniejszeniu. Analiza frakcji gliadyn wykazała, że pod wpływem ochrony

herbicydowej nie zmieniała się ilość spotów gliadyn, natomiast znacznemu zmniejszeniu uległa ilość

α gliadyn z 34 do 24. Zastosowanie fungicydu w okresie zawiązywania nasion powodowało wzrost frakcji

α, ω i γ gliadyn w stosunku do obiektu kontrolnego i stosowania fungicydu w okresie liścia flagowego.

28

WPŁYW WARUNKÓW STRESOWYCH NA ZAWARTOŚĆ ZWIĄZKÓW TOKSYCZNYCH I ALERGIZUJĄCYCH W NASIONACH WYBRANYCH ROŚLIN UPRAWNYCH

Jerzy Księżak1, Alicja Sułek1, Grażyna Podolska1, Kazimierz Noworolnik1, Jerzy Dziuba2, Iwona Konopka2

1Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa, Państwowy Instytut Badawczy w Puławach 2Katedra Biochemii Żywności, 3Katedra Przetwórstwa i Chemii Żywności,

Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Terminem „czynnik stresowy” lub „stres” określa się te czynniki środowiska, których działanie może

doprowadzić do odwracalnych lub nieodwracalnych zaburzeń w funkcjonowaniu rośliny i budujących ją

struktur. Zaburzenia te mogą polegać na zakłóceniu wzrostu i rozwoju rośliny oraz procesów

metabolicznych. Założono zatem, że stres suszy ma wpływ na syntezę ilościową i jakościową białek

roślin uprawnych. Celem badań było określenie wpływu niedoboru wody na produkcyjność i zawartość

związków alergennych w nasionach pszenicy ozimej i jarej, gryki, owsa i grochu. Realizując cel badawczy

założono dla każdego gatunku odrębne jednoczynnikowe doświadczenie wazonowe metodą serii

niezależnych w czterech powtórzeniach. Czynnikiem doświadczenia był poziom wody w podłożu.

Uwzględniono trzy poziomy czynnika. Optymalną wilgotność na poziomie 60% polowej pojemności

wodnej (ppw) utrzymywaną przez cały okres wegetacji rośliny, stresową - 30% ppw utrzymywaną

przez cały okres wegetacji rośliny oraz wilgotność na poziomie 30% ppw utrzymywaną od fazy kwitnienia

do dojrzałości pełnej. Doświadczenie przeprowadzono w hali doświadczeń wegetacyjnych w wazonach

Mitscherlicha.

Analiza chromatograficzna białek pszenicy jarej odmiany Nawra wykazała, że stres suszy wpływał

na udział w białku poszczególnych frakcji. Stwierdzono zmniejszenie zawartości albumin i globulin

o 1,8 % oraz 1% wzrost zawartości gliadyn i glutenin, co wskazuje na wzrost zawartości białek

alergennych. Analiza jakościowa wykazała zmiany zawartości liczby białek w przyjętym zakresie mas

cząsteczkowych i punktu izoelektrycznego. Pod wpływem stresu suszy zwiększała się liczba α gliadyn.

U pszenicy ozimej wilgotność podłoża miała istotny wpływ na zawartość gliadyn. Powodowała

ogólny wzrost zawartości gliadyn o około 10%. Susza wpływała na udział poszczególnych frakcji białek,

powodując zmniejszenie frakcji ω gliadyn i wzrost zawartości frakcji α/β i γ gliadyn. Analiza frakcji

α gliadyn wykazała, wzrost spotów pod wpływem stresu suszy.

W przypadku gryki wilgotność gleby zmieniała w sposób istotny ilości prolamin gryki, jakkolwiek

nie powodowała zmian proporcji pików. Zawartość frakcji gliadyn w warunkach stresowych była o 10 %

niższa (stres przez cały okres wegetacji) i o 14% (stres od okresu kwitnienia do zbioru) w stosunku

do obiektu kontrolnego. Analiza frakcji gliadyn wykazała różnicowanie ilości spotów gliadyn w zależności

od wilgotności gleby. Największa ich ilość (222), wystąpiła w przypadku optymalnej wilgotności podłoża.

Przy tej wilgotności stwierdzono też najmniej, bo jedynie 3 spoty α gliadyn. Stres w okresie od kwitnienia

do zbioru powodował wzrost spotów zarówno całej frakcji gliadyn jak i α gliadyn gryki.

29

WPŁYW ODŻYWIANIA ROŚLIN AZOTEM I TERMINU JEGO APLIKACJI NA ZAWARTOŚĆ ZWIĄZKÓW TOKSYCZNYCH I ALERGIZUJĄCYCH

W NASIONACH WYBRANYCH ROŚLIN UPRAWNYCH

Grażyna Podolska1, Alicja Sułek1, Kazimierz Noworolnik1, Jerzy Księżak1, Jerzy Dziuba2, Iwona Konopka2

1Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach 2Katedra Biochemii Żywności, 3Katedra Przetwórstwa i Chemii Żywności,

Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Nawożenie mineralne, a zwłaszcza azotowe wywiera duży wpływ zarówno na wielkość plonu

jak i jego jakość. Liczne badania wskazują, że nawożenie azotowe u pszenicy powoduje zmiany ilościowe

w zawartości białka, glutenu oraz zmiany w poszczególnych frakcjach białek. Postawiono zatem hipotezę:

dawka nawożenia azotem oraz termin jej aplikacji wpływa na wielkość plonu oraz powoduje zmiany

zawartości poszczególnych frakcji białek, w tym białek wywołujących reakcje alergiczne u ludzi.

Celem badań było określenie wpływu dawki nawożenia azotem i sposobu aplikacji azotu

na wielkość plonu i zawartość białek alergennych w nasionach pszenicy ozimej i jarej, gryki, owsa

i grochu. W celu uzyskania materiału do analizy założono dwuczynnikowe doświadczenie polowe w RZD

IUNG, Puławy, Kępa. Czynnikiem pierwszego rzędu była dawka nawożenia azotem, czynnikiem drugiego

rzędu był sposób aplikacji azotu, Oba czynniki zróżnicowano u poszczególnych gatunków roślin.

Uwzględniono następujące dawki azotu: - pszenica ozima i jara 0, 90, 180 kg N ha-1 aplikowane

dwukrotnie lub trzykrotnie w okresie wegetacji roślin; gryka – 0, 30, 60 N ha-1, azot aplikowano

dwukrotnie, groch - 20 i 60 N ha-1, uwzględniono forme sypką (mocznik) i formę płynną (RSM). Mocznik

stosowano przedsiewnie, natomiast RSM w fazie pąkowania grochu. Owies - 0, 45, i 90 kg N ha-1, azot

stosowano dwukrotnie lub trzykrotnie w okresie wegetacji owsa. Obiekt kontrolny stanowiły poletka

bez nawożenia azotem. Wyniki badań wskazują na istotna zależność dawki i sposobu aplikacji azotu na

zmiany ilościowe i jakościowe poszczególnych frakcji białek.

Analiza frakcji białek pszenicy jarej pod wpływem nawożenia azotem wskazuje, że zarówno dawka

jak i sposób aplikacji azotu wywarły istotny wpływ na procentowy udział w białku poszczególnych frakcji.

Na obiekcie kontrolnym stwierdzono największą ilość frakcji albumin + globulin oraz najmniejszą

procentową zawartość frakcji glutenin. Największą procentową zawartość gliadyn stwierdzono

na obiekcie z zastosowaniem dawki azotu 180 kg, którą aplikowano trzykrotnie w okresie wegetacji.

Pod wpływem zastosowania nawożenia azotowego w ilości 160 kg N/ha w stosunku do obiekty

kontrolnego procentowa zawartość frakcji α gliadyn wzrosła o 1.8%.

Analizę chromatograficzną białek pszenicy ozimej wykonano na obiekcie 0 i 180 kg N ha-1.

wykazała, że zastosowanie nawożenia azotem powodowało wzrost albumin i globulin, wzrost frakcji

gliadyn i to zarówno ω, α/β, γ. Największemu wzrostowi uległa frakcja HMW.

Pod wpływem wzrastających dawek nawożenia azotem zmniejszała się ilość prolamin gryki,

oraz proporcja pików, o czasie retencji od 11 do 14 min, natomiast gluteliny gryki ulegały niewielkiemu

wzrostowi w porównaniu do obiektów bez nawożenia azotem.

30

OCENA SKŁADU AMINOKWASOWEGO I WARTOŚCI ODŻYWCZEJ WYBRANYCH ROŚLIN UPRAWNYCH W ASPEKCIE ICH ROLI W DIECIE BEZGLUTENOWEJ

Wojciech Kłys, Anna Wojtasik, Hanna Kunachowicz, Barbara Ratkovska, Krystyna Iwanow Instytut Żywności i Żywienia, Zakład Wartości Odżywczych Żywności w Warszawie

Substancje alergizujące są zawarte zarówno w produktach roślinnych, jak i zwierzęcych.

Przedmiotem niniejszej pracy są produkty roślinne, a w szczególności zawierające gluten. Molekularną

podstawą zmian alergizujących w organizmie są epitopy. Są to determinanty antygenowe, które są

fragmentami łańcuchów polipeptydowych o charakterystycznej sekwencji aminokwasów. Nie jest poznana

zależność zawartości toksycznych epitopów od metod uprawy zbóż i mało poznana jest zależność

od wpływu procesów technologicznych.

Dieta pozbawiona alergenów bądź toksycznych peptydów musi być dietą eliminacyjną.

Stąd szczególnie istotne jest poznanie ich zawartości w żywności i właściwe, precyzyjne znakowanie

produktów spożywczych. Według Komisji Unii Europejskiej można prowadzić politykę chroniącą ludzi

przed alergenami i wystąpieniem nietolerancji pokarmowych. Rozważana jest możliwość wprowadzania

do żywienia grup ryzyka produktów mogących zastąpić tradycyjne wyroby ze zbóż lub stosowania takich

odmian pszenicy oraz ich wymiałów, które są niskogliadynowe.

Celem pracy było oznaczenie składu aminokwasowego i wartości odżywczej wytypowanych

produktów roślinnych, będących przedmiotem oceny zawartości peptydów toksycznych.

Materiałem do badań były odmiany pszenicy: „Tonacja”, „Nawra” i „Sukces”, owies, gryka, groch.

W pracy oznaczano zawartość białka metodą Kjeldahla, skład aminokwasowy metodą

chromatografii jonowymiennej kolumnowej z zastosowaniem automatycznego analizatora aminokwasów

firmy Beckman, obliczono wskaźniki wartości odżywczej białka: CS – Chemical Score EAA – Essential

Amino Acid Index PDCAAS – Protein Digestion Corrected Amino Acid Score. Oznaczono również

zawartość tłuszczu metodą Soxhleta, błonnika metodą enzymatyczną, witamin: tiaminy – metodą

tiochromową – niacyny – metodą mikrobiologiczną, składników mineralnych – wapnia, magnezu, sodu,

potasu, miedzi, cynku i manganu – metodą atomowej spektrometrii absorpcyjnej ASA oraz żelaza

i fosforu – metodą spektrofotometryczną.

Zawartość aminokwasów odgrywających istotną rolę przy powstawaniu celiakii tj. kwasu

glutaminowego i proliny była znacznie wyższa w białku badanych pszenic w porównaniu z białkiem

pozostałych roślin. Pod względem wartości odżywczej ziarno gryki i grochu może zastąpić w diecie

pszenicę jako surowiec do przygotowywania produktów zbożowych bezglutenowych. Trudność stanowi

wartość organoleptyczna i cechy fizykochemiczne otrzymywanych produktów. Owies również

charakteryzuje się wysoką wartością odżywczą i stanowić może cenne urozmaicenie diety, chociaż

jego rola w celiakii nie jest jeszcze jednoznacznie wyjaśniona.

31

IDENTYFIKACJA GRZYBÓW Z RODZAJU FUSARIUM ORAZ MIKOTOKSYN FUZARYJNYCH W ORZESZKACH GRYKI ODMIANUY KORA METODĄ MULTIPLEX PCR

Jacek Olszewski, Agnieszka Pszczółkowska, Gabriel Fordoński, Tomasz Kulik, Krystyna Płodzień Katedra Diagnostyki i Patofizjologii Roślin, Wydział Kształtowania Środowiska i Rolnictwa, UWM w Olsztynie

Grzyby wśród mikroorganizmów chorobotwórczych stanowią liczną grupę patogenów roślinnych.

Zasiedlają one nie tylko płody rolne, ale produkują także niebezpieczne dla zdrowia metabolity wtórne,

jakimi są mikotoksyny. Do najgroźniejszych patogenów roślinnych zalicza się grzyby z rodzaju Fusarium

oraz produkowane przez nie toksyny z grupy trichotecenów i eniaty. Celem badań było: a) określenie

stopnia porażenia nasion gryki przez grzyby z rodzaju Fusarium, b) identyfikacja gatunków z rodzaju

Fusarium zasiedlających nasiona, c) identyfikacja toksyn fuzaryjnych z nasion. Analizie molekularnej

poddano orzeszki gryki pochodzące z:

a) doświadczenia szklarniowego wazonowego przeprowadzonego w latach 2004 – 2005: - rośliny uprawiano w warunkach optymalnej wilgotności gleby (60 – 70% ppw) - rośliny uprawiano w warunkach obniżonej wilgotności gleby (30 – 35% ppw)

b) doświadczenia szklarniowego wazonowego przeprowadzonego w latach 2005 – 2006: - rośliny uprawiano w warunkach pełnej dawki nawozowej NPK - rośliny uprawiano w warunkach pełnej dawki nawozowej NP i obniżonej K - rośliny uprawiano w warunkach pełnej dawki nawozowej NK i obniżonej P - rośliny uprawiano w warunkach pełnej dawki nawozowej PK i obniżonej N

c) doświadczenia polowego przeprowadzonego w latach 2005 – 2006: - nasiona zaprawiane zaprawą fungicydową - nasiona nie zaprawiane zaprawą fungicydową

d) nasiona pochodzące z pól uprawnych z roku 2004 i 2006.

Nasiona zostały zmielone w młynku, następnie przeprowadzono izolacje DNA metodą

kolumienkową oraz identyfikację Fusarium spp., F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae,

F. sporotrichioides metodą multiplex PCR z wykorzystanim specyficznych gatunkowo starterów dla tych

gatunków. Ponadto wykonano analizy na obecność trichotecenów i eniatyn metodą multiplex PCR.

Przeprowadzone analizy molekularne umożliwiły wykrycie w badanych nasionach gryki odmiany

Kora kompleksu grzybów z rodzaju Fusarium. Obecność Fusarium spp. stwierdzono w orzeszkach

pochodzących z roślin uprawianych na polach uprawnych, poletkach doświadczalnych, w których nasiona

do siewu zostały zaprawione zaprawą fungicydową i nie były zaprawione oraz z doświadczeń

wazonowych w warunkach pełnej dawki NPK, pełnej PK i obniżonej N, pełnej NK i obniżonej P

oraz z warunków, gdzie zastosowano optymalne uwilgotnienie gleby podczas wegetacji roślin. W reakcji

multiplex PCR, w której zastosowane startery specyficzne dla Fusarium poae, F. culmorum,

F. graminearum i F. sporotrichioides stwierdzono obecność jedynie Fusarium poae. Największym

porażeniem charakteryzowały się nasiona pochodzące z upraw polowych oraz z poletek

doświadczalnych. Natomiast w reakcji multiplex PCR ze starterami specyficznymi dla mikotoksyn z grupy

trichotecenów oraz eniatyn uzyskano wynik negatywny. Wskazuje to, że analizowane nasiona gryki było

wolne od wtórnych metabolitów grzybów – mikotoksyn i było bezpiecznym surowcem, który można

wykorzystać do produkcji artykułów spożywczych i pasz. WNIOSKI: 1. Ziarno gryki odmiany Kora

zasiedlone było prze grzyby z rodzaju Fusarium, a gatunkiem dominującym było Fusarium poae.

2. Nie stwierdzono obecności fuzariotoksym w analizowanym ziarnie gryki.

32

IMMUNOREAKTYWNE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK ZAPASOWYCH PSZENICY OZIMEJ TONACJA PORAŻONEJ GRZYBAMI Fusarium graminearum

Bartosz Brzozowski1, Karolina Tatarczuk1, Agata Szymkiewicz2, Włodzimierz Bednarski1 1Katedra Biotechnologii Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

2Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Hodowla zbóż w niesprzyjających warunkach, czy niewłaściwe przechowywanie ziarna zbóż może

doprowadzić do jego porażenia przez patogeny np. grzyby z rodzaju Fusarium. Infekcja ziarna zbóż

przez grzyby z rodzaju Fusarium prowadzi do pojawienia się w nich toksyn, hormonopodobnych

składników i enzymów m.in. proteaz. W hydrolizie białek ziarniaków zbóż przez proteazy rodzime,

zakwasu piekarniczego, lub proteazy syntetyzowane przez patogeny uwalniane są peptydy i polipeptydy

charakteryzujące się właściwościami toksycznymi, czy alergizującymi. U osób predysponowanych

genetycznie może to prowadzić do wystąpienia chorób m.in. celiakii. Celem badań było określenie

wpływu Fusarium graminearum na skład i właściwości immunoreaktywne frakcji białek zapasowych

pszenicy. Doświadczenie polegało na porażeniu grzybem F. graminearum wyjałowionych ziarniaków

pszenicy i inkubacji (4 dni, 25°C) do momentu rozpoczęcia zarodnikowania grzybów i porośnięcia ziarna

grzybnią, ale nie dopuszczając do jego skiełkowania. W kolejnym etapie doświadczenia ziarno ponownie

porażono grzybem, a następnie inkubowano (4 dni, 25°C) doprowadzając do skiełkowania pszenicy.

W ziarnie przed i po inkubacji oznaczono aktywność enzymów proteolitycznych oraz przeprowadzono

ekstrakcję gliadyn, które charakteryzowano technikami elektroforetycznymi CGE, SDS-PAGE i wykonano

immunobloting metodą półsuchą z wykorzystaniem surowicy krwi uzyskanej od osób z objawami alergii

pokarmowej na gluten. Przeprowadzone badania wykazały, że porażenie ziarna pszenicy Fusarium

graminearum nie poddanego kiełkowaniu nie zmienia właściwości immunoreaktywnych uwalnianych

peptydów. Charakterystyka elektroforetyczna białek nie wykazała zmian w składzie ilościowym

i jakościowym gliadyn.

Istotne zmiany stwierdzono w składzie białek gliadynowych izolowanych z kiełkującego ziarna

pszenicy skażonego Fusarium graminearum. Charakterystyka immunologiczna białek wykazała obecność

polipeptydu o masie cząsteczkowej od 20 kDa do 24 kDa, reagującego z przeciwciałami uzyskanymi

z krwi osób z nietolerancją glutenu, co wskazuje, że również proteazy fuzaryjne mogą uwalniać z białek

zapasowych pszenicy potencjalnie niebezpieczne dla człowieka polipeptydy.

Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że syntetyzowane przez Fusarium graminearum

proteazy oddziaływają na skład ilościowy i jakościowy białek zapasowych pszenicy. Uwalniane

polipeptydy, w trakcie kiełkowania porażonych grzybem ziarniaków, reagują z przeciwciałami izolowanymi

z krwi osób, u których stwierdzono nietolerancję glutenu. Wydaje się więc, że proteazy grzybowe,

podobnie jak proteazy rodzime ziarniaków zbóż, mogą uwalniać alergenne, czy potencjalnie toksyczne

dla ludzi peptydy i polipeptydy.

Praca badawcza była wykonana w ramach Projektu Zamawianego KBN, PBZ 097/P06/2003

„Identyfikacja i sposoby przeciwdziałania toksyczności i alergenności białek nasion ważnych roślin

uprawnych”.

33

ZASTOSOWANIE HPLC I GC/MS DO ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA FENYLOALANINY W PRODUKTACH NISKOBIAŁKOWYCH

Małgorzata Piecyk, Agnieszka Śrama, Anna Bzducha, Mieczysław Obiedziński Katedra Biotechnologii Mikrobiologii i Oceny Żywności,

Zakład Oceny Jakości Żywności, SGGW w Warszawie

Celem pracy była ocena przydatności metod HPLC i GC/MS do ilościowego oznaczania

fenyloalaniny w zbożowych produktach niskobiałkowych (PKU). Materiałem badawczym były produkty

PKU dwóch firm A i B, oraz odpowiadające im produkty tradycyjne.

W produktach przeprowadzono oznaczenia zawartości białka metodą Kiejdahla i oznaczenie

fenyloalaniny metodą RP-HPLC z detektorem UV (λ= 214 nm) oraz metodą GC/MS, przy użyciu zestawu

testowego EZ:faast firmy Phenomenex. Oznaczenie zawartości aminokwasu wykonano po hydrolizie

kwasowej prowadzonej przy zastosowaniu (6M HCl, 24 i 48 h, temp. 110°C). Na podstawie %RSD

metodę HPLC uznano za bardziej wiarygodną. Stwierdzono wyższą zawartość białka od deklarowanej we

wszystkich produktach firmy B i niektórych firmy A. Wyższa zawartość białka, nie wpłynęła na ilość

wykrytej metodą HPLC fenyloalaniny, której poziom w większości produktów, znajdował się poniżej

deklaracji producenta. W większości przypadków, nie stwierdzono istotnego wpływu czasu hydrolizy

na ilość uwolnionej fenyloalaniny. Przeprowadzone badania pozwoliły na sformułowanie następujących

stwierdzeń i wniosków:

1. Stwierdzono wyższą niż deklarowana zawartość białka we wszystkich produktach firmy B

i niektórych firmy A.

2. Analiza statystyczna wyników (%RSD) wykazała, że HPLC jest dokładniejszą

i bardziej odpowiednią metodą do ilościowego oznaczania zawartości fenyloalaniny niż GC/MS.

3. W oparciu o wyniki otrzymane metodą HPLC stwierdzono, że w większości badanych produktów

(2/3 przebadanych artykułów) poziom fenyloalaniny w produkcie jest niższy niż to wynika

z deklaracji producenta.

4. Na podstawie analizy statystycznej (istotność różnic) stwierdzono, że wydłużenie czasu hydrolizy

z 24 na 48 godzin, nie wpływa istotnie na ilość uwolnionej fenyloalaniny

w przypadku 73% produktów.

5. Wyższa zawartość białka nie wpłynęła na ilość wykrytej metodą HPLC fenyloalaniny,

której poziom w większości artykułów, znajdował się poniżej deklaracji producenta.

34

ZAGROŻENIA ALERGENNE POWODOWANE SPOŻYWANIEM JĘCZMIENIA (Hordeum vulgare L.) I PRODUKTÓW JEGO PRZETWORZENIA

Ewa Kubicka, Lucjan Jędrychowski, Ewelina Semenowicz Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Ziarniaki jęczmienia i produkty jego przetworzenia, szczególnie kasze i płatki, słód, piwo uchodziły

do niedawna za produkty nie zagrażające zdrowiu konsumenta. Aktualnie, w związku ze zdecydowanym

wzrostem występowania uczuleń, w tym alergii pokarmowych, okazało się, że spożywanie ziarniaków

jęczmienia i produktów ich przetworzenia stwarza poważne zagrożenie zdrowotne. Przyczyną

występowania reakcji alergicznych są liczne białka wymienionych ziarniaków.

Dotychczas wykazano, że głównymi alergenami pokarmowymi występującymi w piwie i jęczmieniu

są białka o ciężarze molekularnym 45 kDa (najprawdopodobniej białko Z4), 26 kDa oraz 9 kDa (białko

odpowiedzialne za transport lipidów - LTP 1). Wykazano także, że białko jęczmienia (określone

jako BMAI-1) o ciężarze molekularnym 14.5 kDa oraz jego forma glikozylowana o ciężarze ok. 15 kDa są

również bardzo silnymi alergenami wywołującymi wziewne alergiczne reakcje IgE- zależne, o silnych

symptomach astmy (określanej jako astma piekarzy). Stwierdzono, że są to białka o aktywności

inhibicyjnej w stosunku do trypsyny i α-amylaz.

Ponadto sygnalizuje się, że wiele białek jęczmienia a mianowicie białka o ciężarze molekularnym 7 kDa,

9 kDa, 11 kDa, 26 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 35 kDa, 38 kDa, 40 kDa, 46 kDa, 60 kDa, 62 kDa, 66 kDa,

69 kDa and 72 kDa także wykazuje właściwości alergenne, co potwierdzono w testach wykonanych

metodą immunoblottingu z wykorzystaniem surowic osób uczulonych.

Zarówno reakcje - symptomy alergiczne, jak i mechanizmy ich powstawania w przypadkach uczuleń

na białka jęczmienia, pszenicy i żyta są bardzo zróżnicowane. Występują opóźnione reakcje komórkowe

(T-cell mediated reaction), jak i reakcje natychmiastowe IgE-zależne, a także reakcje anafilaktyczne.

Wykazano przy tym, że droga wniknięcia alergenu wydaje się mało istotna, gdyż stwierdzano reakcje

zarówno kontaktowe, wziewne jak i wynikające z ich spożycia .

Tak szerokie spektrum białek jęczmienia o zaznaczonych właściwościach alergennych skłoniło

do podjęcia badań nad ich właściwościami immunoreaktywnymi.

Stwierdzono, że białka izolowane zarówno z ziarniaków jęczmienia jak i piwa reagują z IgE

pacjentów ze stwierdzoną alergią na białka jęczmienia. Stosując metodę chromatografii jonowymiennej

rozdzielono białka ekstrahowane z jęczmienia na frakcje. Spośród wszystkich uzyskanych frakcji, jedna

frakcja o masie cząsteczkowej około 16 kDa charakteryzowała się bardzo wysoką immunoreaktywnością

w stosunku do IgE pacjentów ze stwierdzoną alergią na białka jęczmienia. Obecność frakcji o tej masie

cząsteczkowej stwierdzono również w piwie.

Uzyskane wyniki zdają się potwierdzać wysoki stopień zagrożenia alergennego wynikającego

ze spożycia ziarniaków jęczmienia i produktów uzyskanych z ich przetworzenia technologicznego.

Nieodzowne wydają się dalsze badania mające na celu ocenę zmian ich właściwości

immunoreaktywnych i alergennych w procesach technologicznych.

35

ZAWARTOŚĆ IMMUNOREAKTYWNYCH FRAKCJI BIAŁEK (ALBUMINY, LEGUMINY I WICYLINY) W NASIONACH DOSTĘPNYCH NA RYNKU POLSKIM ODMIAN GROCHU

Lucjan Jędrychowski, Agata Szymkiewicz

Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN w Olsztynie

Oceny przydatności poszczególnych odmian grochu do wytwarzania określonych produktów

(głównie koncentratów spożywczych i tzw. zup błyskawicznych) dokonuje się najczęściej na podstawie

wcześniej dokonanych charakterystyk ich właściwości funkcjonalnych i odżywczych. Ze względu

na ilościowy wzrost występowania uczuleń na białka roślin strączkowych, oraz na stwierdzony wysoki

poziom reakcji krzyżowych w obrębie nasion roślin strączkowych, nieodzownym wydaje się

uwzględnienie również ich właściwości immunoreaktywnych i alergennych. Tego typu podejście wydaje

się być uzasadnionym w kontekście wymogów Unii Europejskiej dotyczących konieczności znakowania

produktów spożywczych zawierających związki alergenne.

Badania przesiewowe dotyczące zawartości poszczególnych frakcji białek nasion grochu

wykonano na następujących powietrznie suchych (13% wilgotności) dostępnych na rynku polskim

odmianach: Komandor, Brylant, Bohun, Wenus, Hubal, Set, Tarchulska, Turkus, Ramrod (Piast), Kuroch.

Nasiona pochodziły z wyspecjalizowanych w produkcji materiału siewnego Stacji Hodowli Roślin

ze zbioru w 2005 roku

Oznaczeń zawartości poszczególnych frakcji białek grochu dokonano metodą competitive

(współzawodniczą) ELISA, stosując królicze przeciwciała poliklonalne uzyskane w stosunku

do oczyszczonych metodą chromatografii frakcji albuminy, leguminy i wicyliny oraz wcześniej

wyznaczone w wyniku optymalizacji parametry.

Zawartość immunoreaktywnych frakcji białek w różnych odmianach grochu wyrażono w μg/mg białka

ogółem.

Wyniki uzyskane w zakresie oznaczania zawartości immunoreaktywnych frakcji albuminy, leguminy

i wicyliny w nasionach dostępnych na rynku polskim odmian grochu nie wykazały statystycznie istotnych

różnic w zawartości poszczególnych frakcji białek pomiędzy odmianami nasion grochu. Wśród badanych

białek najwięcej było immunoreaktywnie reagującej wicyliny (w zależności od odmiany od 467,90 μg/mg

w odmianie Ramrod do 576,32 μg/mg białka ogółem w odmianie Set. Zawartość leguminy kształtowała

się w zakresie od 256,92 μg/mg w odmianie Set do 345,97 μg/mg w stosunku do białka ogółem

w odmianie Ramrod. Na znacznie niższym poziomie występowała w badanych nasionach

immunoreaktywna albumina (od 43,98 μg/mg w odmianie Ramrod do 86,78 μg/mg w stosunku do białka

ogółem w odmianie Bohun).

W kontekście uzyskanych wyników nie wydaje się, aby zróżnicowanie odmianowe nasion grochu

mogło być czynnikiem umożliwiającym selekcję zmierzającą do znacznego obniżenia

immunoreaktywności (przypuszczalnie również alergenności) białek nasion grochu.

36

NULL ALLELE BIAŁEK GLIADYNOWYCH – CHARAKTERYSTYKA ELEKTROFORETYCZNA, IMMUNOLOGICZNA ORAZ ICH ZNACZENIE W BADANIACH

NAD WYTWARZANIEM HIPOALERGICZNYCH LINII PSZENICY

Jacek Waga, Jerzy Zientarski Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie

Gliadyny stanowią polimorficzny kompleks białkowy zbudowany z kilkuset monomerów,

zróżnicowanych pod względem budowy fizykochemicznej oraz sekwencji aminokwasowych.

Ich dziedziczenie warunkowane jest przez sześć genów zlokalizowanych na chromosomach 1-szej i 6-tej

grupy homeologicznej (loci: Gli A1, Gli B1, Gli D1, Gli A2, Gli B2 oraz Gli D2). Każdy locus składa się

z kilkunastu, niekiedy kilkudziesięciu silnie sprzężonych genów, które tworzą serie alleli wielokrotnych.

Na obrazie elektroforetycznym A-PAGE różnych odmian pszenicy prążki białkowe, które są produktami

ekspresji poszczególnych alleli, łączą się w grupy określane jako bloki gliadynowe.

W wyniku spontanicznych mutacji punktowych w obrębie sekwencji regulatorowych bądź ramki

odczytu DNA dochodzi niekiedy do zamiany jednego nukleotydu na inny (najczęściej cytozyny

na tyminę), w wyniku której kodon glutaminy (CAA lub CGA) przechodzi w stop kodon (TAA lub TGA)

blokujący syntezę określonej grupy gliadyn. Zablokowane geny określane są jako pseudogeny lub null

allele. Powstają wówczas charakterystyczne, puste miejsca w odpowiednich strefach lokalizacji białek

na obrazie elektroforetycznym. Badania wykazały, iż genetycznie zmienione gliadyny mają obniżoną,

w porównaniu z natywną postacią tych białek, zdolność wywoływania charakterystycznych dla celiakii

uszkodzeń tkanek jelita cienkiego u osób chorych na celiakię.

W Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie wytworzono szereg linii zawierających null

allele w loci Gli B1, Gli D1 oraz Gli B2 (chromosomy 1B, 1D i 6B). Stanowią one mieszańcowe potomstwo

kombinacji orkiszu (odmiany Oberkummler Rotkorn) i pszenicy zwyczajnej (rodu LAD 480). Na podstawie

testu ELISA wykazano niższą zdolność wiązania przeciwciał klasy IgE przeciwko glutenowi (których

obecność stwierdzono w surowicy pacjentów z objawami alergii pokarmowych i skórnych) przez gliadyny

ekstrahowane z mąki linii zawierających warianty niekodujące w porównaniu z genotypami wzorcowymi,

zawierającymi pełny komplet bloków białkowych.

Null allele zlokalizowane na różnych chromosomach dziedziczą się zgodnie z prawami Mendla,

co pozwala łączyć je (na drodze krzyżowań i selekcji) w jednym genotypie mieszańcowym oczekując

addytywnego efektu łagodzenia właściwości toksycznych i alergizujących gliadyn. Pozwala to

przypuszczać, iż genotypy zawierające null allele w loci Gli 1 oraz Gli 2 mogą odegrać istotną rolę

w pracach nad wytworzeniem pszenicy hipoalergicznej.

Praca naukowa finansowana ze środków Ministra Nauki w latach 2004-2006 jako projekt badawczy

zamawiany nr PZB-KBN-097/P06/2003

37

IZOLOWANIE I OCZYSZCZANIE WYBRANYCH FRAKCJI BIAŁEK GLIADYNOWYCH METODĄ ODWRACALNEJ AGREGACJI I ULTRAWIROWANIA

Jerzy Zientarski1, Jacek Waga1, Andrzej Skoczowski2 1 Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Krakowie

2 Instytut Fizjologii Roślin, PAN w Krakowie

Gliadyny stanowią złożony kompleks monomerycznych białek zapasowych pszenicy,

którym przypisuje się szkodliwe właściwości toksyczne i alergogenne. Prace nad eliminacją tych

niekorzystnych właściwości wymagają analizy białek zarówno na poziomie całego kompleksu

jak i pojedynczych monomerów. Dotychczas, w naszych pracach nad oczyszczaniem gliadyn,

wykorzystywaliśmy metodę elektroforezy preparatywnej A-PAGE. Jej ograniczeniem jest stosunkowo

niska rozdzielczość w strefie szybciej migrujących ω-gliadyn jak również niewielka ilość możliwych

do uzyskania białek w obrębie tej grupy. Celem badań było opracowanie metody uzupełniającej opartej

na ultrawirowaniu, pozwalającej w krótkim czasie uzyskiwać większe ilości dokładnie oczyszczonych

frakcji ω-gliadyn.

Białka izolowano z mąki orkiszu (odmiany Oberkummler Rotkorn) i pszenicy zwyczajnej (odmiany

Ostka strzelecka). Zastosowano procedurę polegającą na odwracalnej reagregacji białek zawartych

w ekstrakcie poprzez wytworzenie określonej siły jonowej i wartości pH, a następnie oddzielenie

otrzymanych agregatów metodą ultrwirowania. Czystość uzyskanych preparatów określono na podstawie

elektroforezy analitycznej A-PAGE. Stwierdzono, iż opisana metoda pozwala dokładnie i w sposób

powtarzalny wydzielać z ekstraktu określone frakcje białek gliadynowych kontrolując siłę jonową

i pH roztworu. Obrazy elektroforetyczne wykazały, że wyizolowano dwie frakcje z grupy gliadyn

oznaczanych symbolem ω-5, które na podstawie badań innych autorów są głównym alergenem

w reakcjach anafilaktycznych zależnych od pszenicy.

Uzyskany wynik sugeruje, że ultrawirowanie może być efektywnym narzędziem gromadzenia

znacznych ilości oczyszczonych gliadyn (rzędu kilku miligramów), które mogą być wykorzystane

do analizy ich właściwości immunoreaktywnych (test ELISA, immunoblotting) i alergizujących (punktowe

testy skórne).

Praca naukowa finansowana ze środków Ministra Nauki w latach 2004-2006 jako projekt badawczy

zamawiany nr PZB-KBN-097/P06/2003

38

ENZYMATYCZNE WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK GROCHU I ICH ENZYMATYCZNEGO HYDROLIZATU

Regina J. Frączek1, Elżbieta Kostyra1, Henryk Kostyra2, Agata Wojkian1

1Katedra Biochemii, Wydział Biologii, UWM w Olsztynie, 2Zakład Chemii Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Celem badań było określenie potencjału immunogennego i alergennego białek grochu

i ich enzymatycznego hydrolizatu. Materiałem badawczym były nasiona grochu polskiej odmiany

„Ramrod”, pochodzące ze zbiorów z 2005 roku. Białka grochu ekstrahowano buforem o pH 2,5.

Hydrolizat białek grochu otrzymano za pomocą dwustopniowej pepsynowo-trypsynowej hydrolizy.

Badania immunometryczne przeprowadzono z użyciem wyprodukowanych przeciwciał poliklonalnych

wobec ekstraktu białek grochu i jego hydrolizatu oraz surowicy krwi pochodzącej od pacjentów

cierpiących na alergię pokarmową, stosując metodę ELISA. Białka grochu i ich hydrolizat

scharakteryzowano metodą SDS-PAGE elektroforezy i immunoblotingu. Antygenowe frakcje białek

grochu i ich hydrolizatu wyodrębniono za pomocą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem

przeciwciał poliklonalnych. Frakcję białkową o najwyższej aktywności immunogennej wyizolowano

za pomocą metody HPLC. Metodą degradacji Edmana określono jej masę cząsteczkową i sekwencję

dziesięciu aminokwasów od N-końca.

39

ANALIZA BIAŁEK NASION GROCHU (PISUM SATIVUM L.) METODĄ ELEKTROFOREZY DWUKIERUNKOWEJ

Jerzy Dziuba, Dorota Nałęcz, Iwona Szerszunowicz, Piotr Minkiewicz Katedra Biochemii Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Celem pracy była analiza białek nasion grochu metodą elektroforezy dwukierunkowej

(2D-PAGE), obejmującej izoelektryczne ogniskowanie (IEF) oraz elektroforezę w żelu

poliakryloamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS-PAGE).

Do badań wykorzystano ziarno grochu siewnego, gładkiego odmiany Ramrod (polska nazwa Piast)

pochodzące ze zbiorów 2005 roku (Stacja Hodowli Roślin, Piaski-Szelejewo).

Ekstrakcję wszystkich białek grochu prowadzono przy pomocy 10% TCA i schłodzonego (-20°C)

acetonu. Osad przemywano schłodzonym (-20°C) 80% metanolem z dodatkiem CH3COONH4. Aceton

odparowywano. Następnie białka ekstrahowano w obecności buforu FENOL (pH 8.0, Sigma)/SDS.

Do warstwy fenolowej dodawano schłodzony (-20°C) 80% metanol z dodatkiem 0.1M CH3COONH4

w celu precypitacji białek, przechowując próbki w temp. -20°C przez okres 14h. Uzyskany osad

po precypitacji białek (16 000 × g, 5 min., 4°C) przemywano 100% metanolem (-20°C), a następnie 80%

acetonem (-20°C). Pozostałość metanolu i acetonu usuwano w koncentratorze igłowym a osad

rozpuszczano w buforze do 2-DE (bufor do rehydratacji). Analizie elektroforetycznej poddawano białka

bezpośrednio po ekstrakcji fenolowej oraz białka oczyszczone z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej

(SPE), przy użyciu roztworów zawierających acetonitryl, kwas trifluorooctowy i wodę. Do analizy IEF

stosowano paski żelowe IPG Dry Strips (18cm, pH 3-10) (Bio-Rad). Rozdziały białek prowadzono

w 12.5% żelach poliakrylamidowych (wymiary: 215 x 276 x 1 mm). Komputerową analizę obrazów żeli

wykonano przy pomocy programu ImageMaster 2D Platinum (GE Healthcare, Uppsala, Szwecja).

Dla wszystkich wykrytych białek obliczano ich względną zawartość, punkty izoelektryczne

oraz obserwowane masy cząsteczkowe.

Na obrazach żeli białek oczyszczanych metodą SPE znaleziono 124 spoty występujące, na co

najmniej 2 z trzech żeli, natomiast na obrazach żeli białek nie poddanych ekstrakcji – 333 spoty obecne

na co najmniej 4 z pięciu żeli. Wynik ten świadczy o stracie części białek podczas ekstrakcji do fazy

stałej. Z drugiej strony zastosowanie SPE pozwoliło na poprawę rozdzielczości pierwszego kierunku

(IEF). Charakterystyczną cechą żeli białek grochu jest nagromadzenie spotów o stosunkowo dużej

intensywności w zakresie pI 5.5 – 7.5 oraz mas cząsteczkowych 35000 – 80000 Da. W literaturze,

mimo prowadzenia intensywnych badań białek roślinnych metodą 2D-PAGE brakuje danych dotyczących

nasion grochu.

Elektroforeza dwukierunkowa jest metodą przydatną do identyfikacji białek nasion grochu.

Zastosowanie SPE pozwala na uzyskanie ostrego obrazu głównych frakcji białek (o najwyższej

zawartości), ale nie może być polecane w przypadku analizy białek, których względna zawartość jest

niska.

40

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA JAKO NARZĘDZIE IDENTYFIKACJI BIAŁEK NASION OWSA I GRYKI ORAZ ICH FRAKCJI PROLAMINOWYCH

Jerzy Dziuba, Piotr Minkiewicz, Marta Dziuba, Dorota Nałęcz, Agata Hanasiewicz, Iwona Szerszunowicz

Katedra Biochemii Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Celem pracy była analiza białek ogółem i frakcji prolaminowych białek nasion owsa (Avena sativa)

oraz gryki (Fagopyrum esculentum) metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D-PAGE).

Materiał badawczy stanowiło ziarno owsa odmiany Flämingstern oraz gryki odmiany Kora. Ziarno

owsa pochodziło ze zbiorów w 2005 roku z Przedsiębiorstwa Hodowlanego Lochow-Petkus Polska

Sp. z o.o. (Prusy-Kondratowice), a ziarno gryki ze Stacji Hodowli Roślin Palikije (Wojciechów Lubelski).

Z nasion owsa oraz gryki ekstrahowano białka ogółem (nie frakcjonowane) przy użyciu buforu

ekstrakcyjnego (6 M mocznik, 1% (w/v) Triton X-100, 0.5% (w/v) DTT, 0.5% (v/v) bufor IPG pH 3-10).

Ekstrakcję prowadzono 1 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie ekstrakty odwirowywano.

Otrzymany supernatant, zawierający białka, przechowywano w temp. -80°C. Prolaminy ekstrahowano

przy pomocy roztworu Tris-HCl (50mM, pH 8.8). Ekstrakcję prowadzono 1 h w temperaturze 4°C.

Otrzymany ekstrakt odwirowywano. Prolaminy rozpuszczano w 75% (v/v) etanolu, roztwór

odwirowywano, a supernatant, odparowywano w koncentratorze igłowym do 1/4 początkowej objętości,

liofilizowano, po czym przechowywano w temp. -80°C. W przypadku gryki ekstrakcja była skuteczna tylko

po uprzednim obłuszczeniu nasion.

Do analizy IEF stosowano paski żelowe IPG Dry Strips (18cm, pH 3-10) (Bio-Rad). Rozdziały

SDS-PAGE białek prowadzono w 12.5% żelach poliakrylamidowych (wymiary: 215 x 276 x 1 mm).

Komputerową analizę obrazów żeli wykonano przy pomocy programu ImageMaster (GE Healthcare,

Uppsala, Szwecja). Dla wszystkich wykrytych białek obliczano ich względną zawartość, punkty

izoelektryczne oraz obserwowane masy cząsteczkowe.

W wyniku porównania obrazów żeli stwierdzono obecność na żelach białek ogółem owsa

26 spotów odpowiadających prolaminom, natomiast na żelach białek ogółem gryki 105 spotów

odpowiadających prolaminom. Na obrazach elektroforetycznych prolamin owsa i gryki występowały

regiony uporządkowane zawierające spoty o zbliżonym punkcie izoelektrycznym i różnych

obserwowanych masach cząsteczkowych (głównie na żelach prolamin owsa) oraz o zbliżonych

obserwowanych masach cząsteczkowych i różnych punktach izoelektrycznych (głównie na żelach

prolamin gryki). Takie uporządkowane obszary mogą służyć jako wskaźniki występowania frakcji

prolaminowej w białkach ogółem (zwłaszcza w białkach gryki).

Metoda elektroforezy dwukierunkowej jest przydatnym narzędziem identyfikacji prolamin,

szczególnie pochodzących z nasion gryki. Istotną rolę jako wskaźniki obecności prolamin odgrywają

uporządkowane serie spotów o zbliżonych punktach izoelektrycznych i różnych masach cząsteczkowych

lub zbliżonych masach cząsteczkowych i różnych punktach izoelektrycznych. Białka gryki (zarówno białka

ogółem, jak i frakcja prolaminowa) są bardziej heterogenne, niż białka owsa (na obrazach żeli białek gryki

można zaobserwować więcej spotów, niż na obrazach żeli białek owsa).

41

USTALENIE WYTYCZNYCH DO OPRACOWANIA TESTU IMMUNOMETRYCZNEGO ZE ZNACZNIKIEM ENZYMATYCZNYM W CELU OZNACZANIA ZAWARTOŚCI

ALERGENNYCH BIAŁEK GROCHU ORAZ WERYFIKACJA JEGO PRZYDATNOŚCI

Lucjan Jędrychowski, Agata Szymkiewicz, Barbara Wróblewska Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

W badaniach wybranych alergenów w surowcach i produktach spożywczych obok klasycznych

metod biochemicznych dosyć istotną rolę (głównie z uwagi na specyficzność) odgrywają metody

immunometryczne. Wybór odpowiednich metod analitycznych i warunków analiz jest zagadnieniem

bardzo złożonym i trudnym, uzależnionym w znacznej mierze od właściwości badanego alergenu.

Celem badań było dokonanie wyboru metod ekstrakcji, rozcieńczeń gotowego ekstraktu

przy oznaczaniu poszczególnych frakcji białek oraz określenie trwałości alergenów użytych

do opłaszczania mikropłytek podczas ich przechowywania, a także określenie trwałości roztworów

przeciwciał.

W celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia surowego ekstraktu (pozwalającego na odczyt

wartości absorbancji w granicach mieszczących się na prostym odcinku krzywej standardowej)

przygotowano w dziesięciu powtórzeniach próby o stężeniu białka ogółem 0,025 0,05, 1, 2, 4 i 8 μg/ml

oraz kierując się wytycznymi wynikającymi z wcześniej uzyskanych wyników statystycznych

w dwudziestu powtórzeniach próby o stężeniu białka ogółem 0,1 μg/ml. W celu określenia trwałości

wyizolowanych alergenów przeprowadzono doświadczenie, w którym mikropłytki opłaszczone

odpowiednim alergennym białkiem przechowywano w lodówce (temp. ok. 4oC) lub zamrażarce

(temp. ok. -20oC) przez okres 2–24 tygodni. Jednocześnie prowadzono badania mające na celu

określenie trwałości rozcieńczonych przeciwciał (1:100), które przechowywano również w wymienionych

warunkach temperatury w lodówce lub zamrażarce. Na każdej opłaszczonej płytce przechowywanej

w lodówce testowano różnie przechowywane przeciwciała, podobnie na płytkach przechowywanych

w zamrażarce.

Stwierdzono, że w przypadku oznaczania w surowym ekstrakcie zawartości albuminy i leguminy,

surowy ekstraktu białek grochu należy rozcieńczać tak, aby uzyskać roztwory robocze zawierające

2-8 μg/ml białka ogółem tj. w stosunku 1:2 i 1:4. W przypadku oznaczania wicyliny próby surowego

ekstraktu białek powinny być rozcieńczane w stosunku 1:80 lub 1:100. Uzyskane wyniki wskazują

na najwyższą czułość testu mikropłytkowego w stosunku do wymienionych alergenów.

Ponadto stwierdzono, że:

• Trwałość i przydatność do badań roztworu wyjściowego przeciwciał przechowywanych w buforze

fosforanowym (PBS) w rozcieńczeniu 1:100 wynosi co najmniej 6 miesięcy;

• Przydatność opłaszczonych mikropłytek do badań, przy ich przechowywaniu w temp +4oC (lodówka)

wynosi 20 tygodni (przy stosowaniu przeciwciał przechowywanych w zamrażarce);

• Decydującym czynnikiem o trwałości testu jest aktywność przeciwciał (najkorzystniejszym

jest przechowywanie ich w postaci roztworu wyjściowego 1:100 w stanie zamrożenia).

42

WALIDACJA WYBRANYCH METOD IMMUNOMETRYCZNYCH STOSOWANYCH DO OZNACZANIA ALERGENÓW POKARMOWYCH

Lucjan Jędrychowski, Agata Szymkiewicz, Barbara Wróblewska Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Charakterystyka immunoreaktywnych właściwości wybranych, potencjalnie alergennych białek

grochu wymaga zastosowania odpowiednich metod i narzędzi badawczych. W ocenie metod

analitycznych istotnymi parametrami są czułość metody, precyzja, powtarzalność i specyficzność.

Celem podjętych badań była ocena przydatności wybranych metod immunometrycznych

do diagnozowania obecności alergennych białek (albuminy, leguminy i wicyliny) w nasionach grochu

odmiany Ramrod oraz ocena możliwości ich zastosowania do badań przesiewowych.

W badaniach stosowano metodę współzawodniczą ELISA (ang. Competitive ELISA)

do oznaczania zawartości poszczególnych antygenów pokarmowych, metodę pośrednią ELISA

(ang. Indirect ELISA) do wyznaczenia niezbędnych rozcieńczeń i miana przeciwciał oraz immunoblotting

do kontroli jakościowej obecności alergenów. Analizę statystyczną wykonano stosując dwuczynnikową

analizę wariancji.

W wyniku analizy statystycznej ustalono, że stężenie „białek surowego ekstraktu” (metodą

competitive ELISA) określa równanie prostej: y = -0,39008logx+1,06734, gdzie x- wartość absorbancji

(przy średniej ogólnej - 0,982, odchyleniu standardowym - 0,563, błędzie średniej - 0,039,

błędzie prognozy - 0,02574 i współczynniku korelacji - (- 0,99913).

Zawartość poszczególnych białek (przy zachowaniu warunków doświadczenia) określają równania:

• Albuminy y=-0,32170logx+1,01150; gdzie x- wartość absorbancji (przy średniej ogólnej: 0,898;

odchyleniu standardowym: 0,469, błędzie prognozy: 0,10325 i współczynniku korelacji:

-0,98001);

• Leguminy : y=-0,37095logx+1,07179 przy średniej ogólnej : 0,978 i odchyleniu standardowym:

0,549, błędzie prognozy : 0,053756246 i wysokim współczynniku korelacji: -0,995826276;

• wicyliny : y=-0,29587logx+1,20030 przy średniej ogólnej: 1,152, odchyleniu standardowym: 0,566,

błędzie prognozy: 0,074771 i współczynniku korelacji: -0,99278.

Na podstawie uzyskanych wyników analizy statystycznej stwierdzono, że stosowana metoda

immunometryczna ELISA charakteryzuje się stosunkowo wysoką czułością (limit detekcji dla większości

białek grochu kształtował się na poziomie ng/ml, a przy oznaczaniu wiciliny - 0,1ng/ml). Precyzja analizy

wyznaczona między kolejnymi doświadczeniami była zróżnicowana. Dla grupy doświadczeń wykonanych

na odczynnikach pochodzących z jednej partii handlowej – bardzo wysoka, dla różnych partii - uzyskano

mało powtarzalne wyniki. Podsumowując, stwierdzono, że podczas doboru warunków metody

analitycznej typu ELISA niezbędna jest daleko posunięta standaryzacja antygenów, przeciwciał

i odczynników.

43

OCENA PRZYDATNOŚCI METODY IMMUNOMETRYCZNEJ ZE ZNACZNIKIEM FLUORYMETRYCZNYM DO OZNACZANIA LEGUMINY GROCHU

Lucjan Jędrychowski, Barbara Wróblewska, Agata Szymkiewicz Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Czułość testów immunometrycznych, szczególnie w odniesieniu do składników stwarzających

zagrożenie zdrowotne konsumentów, jest bardzo istotnym parametrem jakościowym testów

analitycznych. Na zwiększenie czułości testów immunometrycznych pozwalaja między innymi metody

polegające na wykorzystaniu znacznika fluorescencyjnego oraz układu awidyno-biotynowego. W pracy

podjęto badania dotyczące oznaczania leguminy grochu metodą immunometryczną ELISA

z zastosowaniem znacznika fluorescencyjnego –F-ELISA.

Celem badań było ustalenie optymalnego stężenia antygenu do opłaszczania mikropłytki,

wyznaczenie optymalnych stężeń (rozcienczeń) koniugatu przeciwciał ze znacznikiem fluorescencyjnym

oraz ustalenie warunków analizy (czas i temperatura inkubacji) oraz czułości pomiarów

immunofluorymetrycznych.

W badaniach stosowano pośrednią metodę ELISA (ang. INDIRECT F-ELISA) oraz metodę

współzawodniczącą (ang. COMPETITIVE F-ELISA) z wykorzystaniem znacznika fluorescencyjnego.

Podczas analizy zastosowano poliklonalne królicze przeciwciała skierowane przeciwko leguminie

(rozcieńczenie 1:50 000), oraz koniugat koziego antykróliczego przeciwciała IgG znaczonego alkaliczną

fosfatazą (w rozcieńczeniach 1:15 000, 1:30 000 i 1: 60 000), (Sigma A 3937). Mikropłytki opłaszczano

używając 100 μL roztworu antygenu o stężeniach 1 μg/mL, 5 μg/mL i 10 μg/mL. Do wyznaczenia krzywej

standardowej stężenia leguminy stosowano roztwory antygenu w zakresie stężeń od 0,0001 do 1000

μg/mL. Wszystkie oznaczenia wykonywano w dwóch powtórzeniach. Jako substrat fluorescencyjny

stosowano 4-methylum-billiferyl phosphate, (Sigma, M-3168) w rozcieńczeniu 1:10, w ilości 100 μL

na studzienkę. Poziom intensywności fluorescencji oznaczano po 60 min, 90 min i 120 min

w temperaturze pokojowej, w ciemni, przy długości fali 440 nm, a wzbudzania dokonywano światłem

o długości fali 360nm. Odczyty wykonano przy użyciu spektrometru luminescencyjnego: Perkin Elmer,

Luminescence Spectrometer LS 50 B.

Stwierdzono, że najkorzystniejsze warunki oznaczania miana przeciwciał, oraz stężenia leguminy

(możliwy zakres oznaczania antygenu 0,1-100 μg/mL) przy użyciu metody ELISA ze znacznikiem

fluorescencyjnym uzyskano przy opłaszczeniu mikropłytki roztworem antygenu o stężeniu 1 μg/mL,

rozcieńczeniu koniugatu w stosunku 1: 30 000 i czasie inkubacji 30 min.

44

OCENA POTENCJAŁU ALERGENNEGO PODJEDNOSTEK WICYLINY GROCHU

Lucjan Jędrychowski, Agata Szymkiewicz, Ewelina Bagińska Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Coraz większe zainteresowanie nasionami roślin strączkowych wynika z faktu, że są one cennym

źródłem biologicznie wartościowego białka. Oprócz wysokiej wartości odżywczej niektóre z wymienionych

białek mogą wywoływać u ludzi i zwierząt niepożądane reakcje alergiczne. Z tego względu w ostatnich

latach wiele uwagi poświęca się badaniom zmierzającym do poprawy funkcjonalnych właściwości białek

i obniżenia bądź eliminacji właściwości alergennych.

Celem podjętych badań było określenie potencjału alergennego wicyliny grochu i jej poszczególnych

podjednostek.

Wydzielenia wicyliny dokonano metodą wysalania przy pomocy siarczanu amonu (wysycenie

75%). Uzyskaną frakcję wicyliny oczyszczono metoda chromatografii kolumnowej (FPLC)

z wykorzystaniem jako nośnika złoża DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia LKB).

W wyniku zastosowania wymienionych metod chromatograficznych wydzielono z wicyliny frakcje

zawierające podjednostki różniące się masą cząsteczkową i hydrofobowością. Dokładnej charakterystyki

wicyliny i jej frakcji dokonano metodą elektroforezy dwukierunkowej.

Poliklonalne królicze przeciwciała wyprodukowane, zarówno do całej wicyliny, jak i do jej poszczególnych

podjednostek charakteryzowały się zadowalająco wysokim mianem (miano wicyliny wynosiło ok. 1:100

000, zaś miano dla jej podjednostek wynosiło ok. 1:40 000). Najwyższą immunreaktywnością

charakteryzowały się podjednostki wicyliny o masie ok. 50 kDa.

Wykazano, że wicylina grochu jest białkiem o wysokiej odporności na denaturację termiczną

i na hydrolizę enzymami trawiennych, co sugeruje wysoki potencjał alergenny tego białka. Proces

dwustopniowej hydrolizy enzymatycznej przy udziale pepsyny i następnie trypsyny pozwolił na uzyskanie

8,5% stopnia hydrolizy i doprowadził do obniżenia immunoreaktywności tej frakcji w stosunku do wartości

przed hydrolizą o ok. 30 %.

Uzyskany metodą elektroforezy dwukierunkowej elektroforegram wicyliny wskazuje na celowość

wykonania głębszych badań proteomicznych wymienionej frakcji białek w kontekście ich właściwości

alergennych.

45

USTALENIE WYTYCZNYCH DO KONSTRUKCJI SZYBKIEGO PRZEPŁYWOWEGO TESTU IMMUNOMETRYCZNEGO DO OZNACZANIA ZAWARTOŚCI ALERGENNYCH BIAŁEK

W WYBRANYCH PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH

Lucjan Jędrychowski, Ewa Kubicka Zakład Enzymów i Alergenów Żywności, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, PAN w Olsztynie

Problem produkcji szybkich diagnostycznych testów immunometrycznych jest zagadnieniem

bardzo złożonym i trudnym. Szereg rozwiązań w tym zakresie jest opatentowanych a sporo z nich

stanowi tajemnicę zawodową producentów. Dodatkowym utrudnieniem w uzyskaniu wymienionych

testów jest fakt akceptowania przez producentów przemysłowych (głównie ze względów ekonomicznych)

produkcji rzędu około miliona sztuk testów. Przy opracowywaniu wytycznych do produkcji szybkich

diagnostycznych testów przepływowych do detekcji głównych alergennych białek nasion grochu

uwzględniono wyniki walidacji immunometrycznych testów używanych do detekcji wymienionych białek

tj. metodę indirect i competitive ELISA i zwrócono szczególną uwagę na:

- Charakterystykę podstawowych parametrów mających wpływ na jakość i koszt diagnostycznych

przepływowych testów paskowych: (takich jak- limit detekcji (czułość), wymagana specyficzność,

szybkość oznaczenia, format i system detekcji, format linii testowej, matryca próby, wzór kasety,

wymagania odnośnie stabilności).

- Metody i etapy produkcji przepływowych testów paskowych zabezpieczające powtarzalność testów.

- Wymagania w stosunku do przeciwciał i stosowanych odczynników wychwytujących (a szczególnie

rodzaj, czystość i stężenie przeciwciał oraz czułość i specyficzność, gwarantujące uzyskanie

końcowego produktu wysokiej jakości, reaktywność, przeciwciał po adsorpcji do stałej powierzchni

membrany, po całkowitym wysuszeniu, ewentualnej stabilizacji i po rehydratacji (przeciwciała, które

sprawdziły się w innym systemie, takim jak ELISA lub western blot, niekoniecznie muszą się sprawdzić

w systemie tego testu).

- Metody detekcji (wizualizacji wyniku) - rodzaje odczynników detektora używane do wizualizacji sygnału,

rodzaj kompleksów immunologicznych w linii testowej; wykorzystanie systemu rozpoznawania

ligandów.

- Parametry odgrywające duże znaczenie w funkcjonowaniu testu a szczególnie rodzaj membrany,

której właściwości pozwalałyby na odpowiednią szybkość przepływu kapilarnego i zdolność wiązania

białka, oraz rodzaj wyściółki próby, rodzaj wyściółki koniugatu.

Podstawowe etapy produkcji szybkich diagnostycznych, przepływowych testów immunometrycznych to:

1. Optymalizacja składu buforu odczynnika zabezpieczającego przed chemiczną modyfikacją próby; 2. Ilościowe nanoszenie odczynników(przeciwciał i koniugatów) na membranę, konstrukcja linii

kontrolnej i linii detekcji; 3. Utrwalanie odczynnika wychwytującego na membranie; 4. Blokowanie membrany przy użyciu białka obojętnego immunometrycznie; 5. Przygotowanie wyściółki koniugatu; 6. Przygotowanie wyściółki próby; 7. Laminowanie wyściółek i membran.

46

MOŻLIWOŚĆ ROZPOZNANIA PRODUKTÓW SPOŻYWCZYCH NIE ZAWIERAJĄCYCH GLUTENU NA PODSTAWIE INFORMACJI NA ETYKIETACH

Barbara Ratkovska, Wojciech Daniewski, Hanna Kunachowicz, Anna Wojtasik Zakład Wartości Odżywczych Żywności, Instytut Żywności i Żywienia w Warszawie

Podstawą leczenia celiakii jest stosowanie przez osoby chore diety bezglutenowej. Podjęcie

właściwej decyzji o włączeniu lub wykluczeniu z tej diety wybieranego produktu wymaga znajomości

zasad znakowania oraz uważnego czytania informacji podanych na opakowaniach żywności. Głównym

źródłem informacji o składzie środków spożywczych dostępnych na rynku są ich etykiety. Celem pracy

był przegląd obowiązujących przepisów oraz aktualnych zaleceń dotyczących znakowania żywności,

w tym produktów bezglutenowych, pod kątem zapewnienia konsumentom stosującym dietę bezglutenową

informacji o obecności glutenu w produkcie. Najbezpieczniejszą do stosowania w diecie bezglutenowej

grupą produktów są środki spożywcze specjalnego żywieniowego przeznaczenia, adresowane do osób

chorych na celiakię. Są one oznakowane napisem „produkt bezglutenowy”, który powinien znajdować się

obok nazwy produktu. Codex Alimentarius definiuje środki specjalnego żywieniowego przeznaczenia

nie zawierające glutenu jako:

- składające się lub zrobione wyłącznie ze składników nie zawierających prolamin pochodzących z pszenicy, żyta, jęczmienia, owsa lub ich hybryd, w których zawartość glutenu nie przekracza 20 ppm;

- składające się ze składników pochodzących z pszenicy, żyta, jęczmienia, owsa lub ich hybryd, które zostały pozbawione glutenu, w których zawartość glutenu nie przekracza 200 ppm;

- zawierające składniki mieszane pochodzące z obu wyżej wymienionych grup, w których zawartość glutenu nie przekracza 200 ppm.

Metodą zalecaną do oznaczania zawartości glutenu w żywności bezglutenowej jest metoda

immunoenzymatyczna (ELISA) z użyciem przeciwciała monoklonalnego R5. Zgodnie z aktualnymi

przepisami o znakowaniu środków spożywczych obowiązkowe jest podanie na etykiecie nazwy produktu

oraz wykazu składników, co jest szczególnie istotne w przypadku produktów złożonych. Na podstawie

tych informacji, spośród wielu produktów ogólnego spożycia osoby chore na celiakię mają możliwość

wyboru tych produktów, które mogą być bezpiecznie przez nie spożywane. Są to np. produkty naturalnie

bezglutenowe, takie jak kukurydza, ryż, gryka, proso, mleko, owoce i warzywa, mięso, a także

ich przetwory, nie zawierające w swoim składzie dodatku surowców pochodzących z pszenicy i innych

zbóż zawierających gluten. W celu zapewnienia konsumentom cierpiącym na alergie i nietolerancje

pokarmowe właściwej informacji, w Dyrektywie 2000/13/WE (z późn. zm.), a w konsekwencji

w rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 16 grudnia 2002r. (z późn. zm.) w sprawie

znakowania środków spożywczych wprowadzono obowiązek wykazywania na etykietach produktów

obecności typowych alergenów, w tym glutenu. Reasumując, można stwierdzić, że wprawdzie

obowiązujące przepisy zapewniają osobom chorym na celiakię informację na temat składu środków

spożywczych, to jednak nie zawsze przekłada się to właściwy wybór żywności. Trudności mogą wynikać

z nieczytelności etykiet, niewłaściwej interpretacji przepisów przez producentów bądź braku dostatecznej

wiedzy u osób z celiakią.

47

METODY BIOINFORMATYCZNE W BADANIACH BIAŁEK I PEPTYDÓW ŻYWNOŚCI

Anna Iwaniak, Marta Dziuba Katedra Biochemii Żywności, Wydział Nauki o Żywności, UWM w Olsztynie

Do wyjaśniania zjawisk zachodzących na określonym poziomie molekularnym wykorzystywane

są zarówno metody teoretyczne i eksperymentalne. Wiedza o składnikach żywności jest stale

poszerzana dzięki ciągle udoskonalanym i interdyscyplinarnym metodom badawczym z zakresu

m.in. biologii molekularnej, genetyki, farmakologii, fizjologii oraz bioinformatyki.

Bioinformatyka jest dziedziną oparta na tworzeniu i zbieraniu dużej ilości informacji dotyczących

sekwencji oraz wykorzystaniu metod wirtualnych służących do zachowywania, udostępniania i analizy

danych.

Wiele laboratoriów badawczych stosuje techniki komputerowe w ocenie składników żywności,

w tym białek. Techniki te znajdują zastosowanie w modelowaniu właściwości fizyko-chemicznych

białek, przewidywaniu ich struktury, charakterystyce stopnia homologii między białkami lub badaniu

relacji struktura-funkcja białek i peptydów. Podstawowym narzędziem analizy komputerowej

makrocząsteczek są bazy danych pracujące w połączeniu ze specjalnie zaprojektowanymi

algorytmami umożliwiającymi ocenę białek wg różnych kryteriów.

Przedmiotem warsztatów jest praktyczna prezentacja opracowanej w Katedrze Biochemii

Żywności UWM w Olsztynie strategii badania białek i bioaktywnych peptydów jako prekursorów

bioaktywnych peptydów. Podstawą strategii jest baza danych sekwencji białek i biologicznie

aktywnych peptydów BIOPEP (http://www.uwm.edu.pl/biochemia) oraz wykorzystanie informacji

zawartych w bazach danych takich jak Swiss-Prot oraz InterPro. Swiss-Prot jest źródłem informacji

na temat sekwencji białek, zaś InterPro służy do wyszukiwania motywów strukturalnych w sekwencji

białka decydujących o jego funkcji.

BIOPEP jest przeznaczony do analizy sekwencji białek jako prekursorów biologicznie

aktywnych peptydów w oparciu o następujące wyróżniki ich oceny:

1) częstość występowania bioaktywnych fragmentów w sekwencji białka (A);

2) potencjalna aktywność fragmentów białka (B);

3) profil potencjalnej aktywności biologicznej białka.

Wymienione kryteria dają odpowiedź na pytanie, które z białek są potencjalnie najlepszymi

prekursorami biologicznie aktywnych peptydów. Wzajemne współdziałanie baz danych białek (683),

peptydów (1969) oraz enzymów o sprecyzowanej specyficzności pozwalają na

zaprojektowanie procesów proteolizy (in silico) w aspekcie pozyskiwania bioaktywnych

peptydów lub eliminowania tych, które wywierają niekorzystny wpływ na organizm poprzez

dobór odpowiednich enzymów. Wyniki oparte na teoretycznym modelu badań mogą znaleźć

zastosowanie nie tylko w projektowaniu odpowiednich cech żywności, ale także we współczesnej

biochemii m.in. do przewidywania biologicznej funkcji białek. Strategia obejmująca m.in. wykazanie

obecności bioaktywnego motywu w sekwencji białka, zaprojektowanie jego uwalniania, stanowi punkt

wyjścia do weryfikacji wyników za pomocą spektrometrii mas.