WPROWADZENIE DO CHEMII BIAŁEK

Praca zbiorowa pod redakcja Adama Dubina

Wydziału Biotechnologii UJ Kraków 2003

2

Spis treści

Przedmowa

Rozdział 1 Wstęp - Struktura białek: A. Dubin i B. Władyka

Rozdział 2 Wprowadzenie do metod oczyszczania białek: A. Dubin

Rozdział 3 Chromatografia powinowactwa i techniki pośrednie: M. Rąpała-Kozik

Rozdział 4 Proteomika: J. Silberring

Rozdział 5 Spektrometria masowa: J. Silberring i M. Smoluch

Rozdział 6 Chemiczna modyfikacja białek: A. Kozik

Rozdział 7 Analiza składu aminokwasowego białek i peptydów: P. Mak

Rozdział 8 Fragmentacja białek – mapy peptydowe: A. Dubin i B. Władyka

Rozdział 9 Mikrosekwencjonowanie białek i peptydów: P. Mak

Rozdział 10 Synteza peptydów: A. Dubin

Rozdział 11 Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek: P. Mak

Dodatek

3

Przedmowa

Zapoczątkowanie w 1950 roku prac nad opracowaniem metody sekwencjonowania białek

przez P. Edmana, sekwencja insuliny w 1951 roku przez F. Sangera, opracowanie syntezy

peptydów przez R.B. Merrifielda w 1962 roku oraz prace H. Neuratha to początek

nowoczesnej chemii białek. Wczesne prace Neuratha przypadały na lata w których

rozpoznano białka jako makrocząsteczki o zdefiniowanej aminokwasowej sekwencji i

trójwymiarowej strukturze i badania te były milowym krokiem w wyjaśnieniu struktury

przeciwciał i szeregu enzymów proteolitycznych jak i określenia zmian strukturalnych, które

zachodzą podczas denaturacji białek. W 1994 roku H. Neurath w załoŜonym przez siebie

czasopiśmie Protein Science [3(1994)1734-1739] udowadniał, Ŝe nadchodzi druga, złota era

enzymologii co moŜna teŜ rozumieć jako okres dalszego rozwoju metod chemii białek.

Rzeczywiście, zakończenie etapu sekwencjonowania ludzkiego genomu [Nature 409(2001)

745-964] doprowadziło do ponownego zainteresowania chemią białek poprzez dyskusję nad

koniecznością uruchomienia programu zwanego pod nazwą angielską Human Proteome

Project czyli projektu, którego celem byłaby kompleksowa analiza jakościowa i ilościowa

oraz porównanie duŜych zbiorów białkowych. Jest to obecnie moŜliwe dzięki dopracowaniu

metod rozdziału, identyfikacji oraz analizy porównawczej takich jak 2D-elektroforeza,

spektrometria masowa MALDI-TOF czy nanochromatografia.

Przygotowaną monografią naleŜy traktować jako wprowadzenie do metod chemii białek. Jest

ona przeznaczona przede wszystkim dla studentów biochemii, biotechnologii i chemii

biologicznej oraz dla osób rozpoczynających pracę z zakresu oczyszczania oraz

charakterystyki fizykochemicznej, modyfikacji chemicznej czy analizy struktury

pierwszorzędowej białek i peptydów. Obejmuje ona swoim zakresem ogólny przegląd metod

oczyszczania białek ze szczególnym zwróceniem uwagi na chromatografię powinowactwa;

omawia wybrane metody chemicznej modyfikacji białek, analizę składu aminokwasowego,

przygotowanie map peptydowych oraz oznaczenie sekwencji aminokwasowej peptydów by

wreszcie scharakteryzować róŜne warianty spektrometrii masowej w aspekcie zastosowania

do badania białek i peptydów. Rozdział chemicznej modyfikacji białek oraz appendix

obejmuje przykładowe i sprawdzone w naszych laboratoriach przepisy oznaczeń i analiz

które mogą być wykorzystane w praktyce badawczej lub jako ćwiczenia specjalistyczne.

Mamy nadzieję, Ŝe ta jedyna w polskim piśmiennictwie pozycja poświęcona chemii białek

będzie pomocna dla osób stawiających pierwsze kroki w zakresie szeroko pojętej proteomiki.

Autorzy

4

Rozdział 1

Struktura białek – wstęp

Białka pełnią kluczową rolę we wszystkich procesach biologicznych determinując układ i

kierunek przekształceń chemicznych w Ŝywych komórkach. Dodatkowo pośredniczą one w

wielu innych funkcjach takich jak transport, magazynowanie, ruch, ochrona immunologiczna,

wzrost i róŜnicowanie czy wreszcie stanowią materiał budulcowy podtrzymujący

mechanicznie struktury organizmu. RóŜnorodność funkcji białek wynika z olbrzymiej liczby

odmiennych struktur przestrzennych jakie mogą one przyjmować poniewaŜ funkcja białek

jest następstwem ich struktury.

Białka są złoŜonymi makrocząsteczkowymi polimerami zbudowanymi z aminokwasów,

które są kolejno kowalencyjnie powiązane wiązaniami amidowymi zwanymi wiązaniami

peptydowymi. KaŜda cząsteczka białka ma ściśle określoną ilość podstawowych jednostek

strukturalnych, aminokwasów oraz ściśle określoną ich liniową kolejność - sekwencję, czyli

strukturę pierwszorzędową. W białkach powszechnie występuje 20 róŜnych aminokwasów,

ale szkielet aminokwasowy tego samego białka moŜe zawierać wiele potranzlacyjnych

modyfikacji, które mogą być powodem heterogenności tzn. róŜnic w wielkości, ładunku i

funkcji. Dla kontrastu struktura DNA budowana jest tylko przez cztery róŜne nukleotydy,

które występują parami. Sprawia to, Ŝe jest ona relatywnie prosta, regularna i przewidywalna.

KaŜdy aminokwas zawiera centralny atom węgla oznaczany jako węgiel α do którego

dołączone są cztery grupy: zasadowa aminowa - NH2, kwasowa karboksylowa - COOH, atom

wodoru i łańcuch boczny R róŜny dla róŜnych aminokwasów.

Rysunek1-1: Schematyczna wersja aminokwasu.

Tetraedryczne ułoŜenie czterech róŜnych podstawników wokół węgla α nadaje aminokwasom

charakter związków optycznie czynnych. Białka są zbudowane wyłącznie z L-aminokwasów.

5

W roztworze o obojętnym pH aminokwasy występują w formie zjonizowanej jako jony

obojnacze (dwubiegunowe) z protonowaną grupą aminową NH3+ i zjonizowaną grupą

karboksylową COO - , przy czym w roztworze kwaśnym cofa się dysocjacja grupy

karboksylowej, a w zasadowym grupy aminowej. Jedynie struktura proliny róŜni się znacznie

od innych aminokwasów poniewaŜ jej łańcuch boczny R jest powiązany z azotem i z węglem

α . Technicznie więc prolina jest raczej imino (-NH-) niŜ amino (-NH2) kwasem. W

zaleŜności od polarności i ładunku łańcucha bocznego R, amionokwasy moŜna podzielić na:

-niepolarne, hydrofobowe (alanina, leucyna, isoleucyna, valina i prolina z alifatycznym

łańcuchem R oraz fenyloalanina i tryptofan z aromatycznym R, i jeden aminokwas

zawierający siarkę - metionina);

-polarne, nienaładowane (seryna, treonina i tyrozyna zawierające grupę hydroksylową,

asparagina i glutamina zawierające karboksyamid oraz cysteina z ugrupowaniem –SH. To tej

grupy zalicza się teŜ glicynę choć atom wodoru nie wywołuje polarności jej cząsteczki);

-polarne, naładowane ujemnie (kwas asparaginowy i glutaminowy zawierające dodatkową

grupę karboksylową w łańcuchu bocznym);

-zasadowe, naładowane dodatnio (lizyna zawierająca dodatkową grupę aminową w łańcuchu

bocznym zwaną ε aminową, arginina ze swoją naładowaną grupą guanidynową i histydyna z

protonowanym pierścieniem imidazolu).

Tabela 1-1: Aminokwasy występujące w białkach.

Nazwa aminokwasu Symbol

Masa (-masa H2O na

wiązanie peptydowe)

Łańcuch boczny Częstość

występowania (%)

Alanina A, Ala 71,079 CH3- 7,49

Arginina R, Arg 156,188 HN=C(NH2)-NH-(CH2)3- 5,22

Asparagina N, Asn 114,104 H2N-CO-CH2- 4,53

Kwas asparaginowy D, Asp 114,089 HOOC-CH2- 5,22

Cysteina C, Cys 103,145 HS-CH2- 1,82

Glutamina Q, Gln 128,131 H2N-CO-( CH2)2- 4,11

Kwas glutaminowy E, Glu 129,116 HOOC-( CH2)2- 6,26

Glicyna G, Gly 57,052 H- 7,10

Histydyna H, His 137,141 N=CH-NH-CH=C- CH2-

2,23

6

Izoleucyna I, Ile 113,160 CH3- CH2-CH(CH3)- 5,45

Leucyna L, Leu 113,160 (CH3)2-CH- CH2- 9,06

Lizyna K, Lys 128,170 H2N- (CH2)4- 5,82

Metionina M, Met 131,199 CH3-S-( CH2)2- 2,27

Fenyloalanina F, Phe 147,177 C6H5- CH2- 3,91

Prolina P, Pro 97,117 -N-( CH2)3-CH-

5,12

Seryna S, Ser 87,078 HO- CH2- 7,34

Treonina T, Thr 101,105 CH3-CH(OH)- 5,96

Tryptofan W, Trp 186,213 C6H5-NH-CH=C- CH2-

1,32

Tyrozyna Y, Tyr 163,176 4-OH-C6H5- CH2- 3,25

Walina V, Val 99,133 CH3-CH (CH2)-

6,48

1.1. Cztery poziomy struktury białek

Struktura białek moŜe być rozpatrywana na kilku róŜnych poziomach z których kaŜdy

następny jest oparty na poprzednim i od niego zaleŜny. Struktura pierwszorzędowa określa

sekwencję (kolejność) aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym; drugorzędowa opisuje

wzajemne przestrzenne ułoŜenie reszt aminokwasowych sąsiadujących ze sobą w sekwencji

liniowej; trzeciorzędowa odnosi się do powiązań przestrzennych reszt aminokwasowych

oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz takie ich ułoŜenie które stabilizowane jest

mostkami disiarczkowymi. W białkach składających się z więcej niŜ jednego łańcucha

polipeptydowego (podjednostki) moŜna jeszcze mówić o strukturze czwartorzędowej

opisującej wzajemne ułoŜenie podjednostek i rodzaj ich kontaktu.

Rysunek 1-2: Cztery poziomy organizacji struktury białek: struktura A) pierwszorzędowa, B) drugorzędowa, C) trzeciorzędowa, D) czwartorzędowa.

7

1.1.1. Struktura pierwszorzędowa

Kowalencyjne wiązania które łączą kolejne reszty aminokwasowe w łańcuch polipeptydowy

białek nazywamy wiązaniami peptydowymi. JeŜeli α karboksylowa grupa jednego

aminokwasu kondensuje z α aminową grupą drugiego aminokwasu z utratą cząsteczki wody

to powstaje amidowe wiązanie pomiędzy karbonylem grupy (C=O) jednego aminokwasu i

iminową grupą (-N-H) drugiego. Wiązanie amidowe łączące cząsteczki aminokwasów w

chemii peptydów i białek nosi nazwę wiązania peptydowego. Powstaje ono w wyniku

połączenia węgla grupy karboksylowej aminokwasu z azotem grupy aminowej kolejnego.

Wiązanie to dzięki polarnej strukturze mezomerycznej jest wiązaniem częściowo podwójnym,

co wyraŜa się skróceniem połączenia C-N w peptydach w porównaniu z długością tego

połączenia w innych związkach organicznych . Ten częściowo podwójny charakter wiązania

C-N ogranicza swobodną rotację i powoduje, Ŝe atomy bezpośrednio połączone z azotem i

karbonylowym atomem węgla mają tendencję do układania się w jednej płaszczyźnie. Nie

oznacza to, Ŝe wszystkie atomy węgla i azotu w łańcuchu peptydowym są ułoŜone w jednej

płaszczyźnie, gdyŜ przy pozostałych wiązaniach C-N w łańcuchu istnieje swobodna rotacja.

H

R

O

N

H

CH

R

wiazanie peptydowe

H

R N

O H

CH

R-

+

Rysunek 1-3:. Izomeryzacja wiązania peptydowego.

Oprócz wiązania peptydowego kolejnym waŜnym wiązaniem kowalencyjnym mającym

wpływ na strukturę białka jest wiązanie disiarczkowe (cystynowe). Powstaje ono przez

utlenienie grup sulfhydrylowych dwóch reszt cysteiny. Mostki disiarczkowe są główną siłą,

która stabilizuje strukturę białka po uzyskaniu przez nie natywnej konformacji. W niektórych

białkach utrzymują one razem róŜne łańcuchy polipeptydowe jak w przypadku insuliny, gdzie

łańcuchy A i B połączone są dwoma mostkami disiarczkowymi. Często

wewnątrzcząsteczkowe mostki –S-S- stabilizują łańcuch polipeptydowy czyniąc białko mniej

podatnym na degradację. Tu przykładem mogą być toksyny jadu węŜy i polipeptydowe

8

inhibitory proteaz. Mostki disiarczkowe tworzą się spontanicznie gdy grupy sulfhydrylowe

znajdą się w odpowiedniej bliskości w sensie struktury trzeciorzędowej.

Rysunek 1-4: Tworzenie mostków disiarczkowych.

W utrzymaniu prawidłowej struktury białka udział mają teŜ wiązanie niekowalencyjne takie

jak wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne czy interakcje hydrofobowe.

Wiązania wodorowe utworzone pomiędzy resztami w łańcuchach bocznych peptydowo

związanych aminokwasów, atomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz

między resztami polarnymi na powierzchni białek a cząsteczkami wody odgrywają waŜną

rolę w utrzymaniu struktury drugo- i trzeciorzędowej.

PoniewaŜ sekwencja reszt aminokwasowych w białku zawiera podstawową informację która

jest zasadniczo odpowiedzialna za jego strukturę i funkcję, tak więc określenie struktury

pierwszorzędowej (czyli kolejności reszt aminokwasowych) białek jest bardzo waŜnym

aspektem działu biochemii jakim jest chemia białek.

1.1.2. Struktura drugorzędowa

Uderzającą cecha natywnych białek jest ich wyraźnie określona struktura przestrzenna

(konformacja), która stanowi o ich aktywności biologicznej. Struktura drugorzędowa jest

określona poprzez chemiczne oddziaływania (głównie wiązań wodorowych) reszt

9

aminokwasowych z innymi aminokwasami znajdującymi się w pobliŜu. Strukturę

drugorzędową identyfikuje się głównie jako substruktury typu helisy α lub struktury

harmonijkowej β. Helisa α ma kształt cylindra, gdzie ciasno skręcony łańcuch główny

polipeptydu tworzy wewnętrzną część cylindra, a łańcuchy boczne aminokwasów wystają na

zewnątrz w ułoŜeniu helikalnym (śrubowym). Helisę α stabilizują wiązania wodorowe

między grupami NH i CO głównego łańcucha przy czym grupa CO kaŜdego aminokwasu

wiąŜe się z grupą NH aminokwasu zajmującego się w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą

do przodu o 4 reszty aminokwasowe co powoduje, Ŝe na jeden obrót helisy przypada 3,6 reszt

aminokwasowych. Teoretycznie, helisy mogą być zarówno prawo- jak i lewoskrętne, ale dla

L-aminokwasów występujących w białkach są zawsze prawoskrętne. W strukturze harmonijki

β, łańcuch polipeptydowy jest całkowicie rozciągnięty w odróŜnieniu do ciasno upakowanego

w helisie α. Harmonijkę β stabilizują wiązania wodorowe pomiędzy grupami CO - NH

naleŜącymi do odrębnych łańcuchów polipeptydowych, przy czym sąsiadujące łańcuchy

polipeptydowe mogą być ułoŜone w jednym kierunku (harmonijka równoległa) lub w

przeciwnych kierunkach (harmonijka antyrównolegla). Dodatkowo, we większości białek

posiadających cząsteczki ściśle upakowane o globularnych kształtach powstałych wskutek

zmian kierunku łańcucha polipeptydowego istnieje element strukturalny zwany zwrotem β.

1.1.3. Struktura trzeciorzędowa

Struktura to odnosi się do powiązań przestrzennych reszt aminokwasowych oddalonych od

siebie w sekwencji liniowej oraz takie ich ułoŜenie, które stabilizowane jest mostkami

disiarczkowymi. Oczywiście zachodzi bardzo ścisłe powiązanie pomiędzy strukturą drugo- i

trzeciorzędową i nadal nie są wyjaśnione wszystkie aspekty zwijania białek choć

modelowanie molekularnej pozwala przewidywać strukturę trzeciorzędową polipeptydów z

duŜym przybliŜeniem. Poznano struktury setek białek dzięki badaniom krystalograficznym i

spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Poziom organizacji jest określony przez

niekowalencyjne oddziaływania pomiędzy strukturami helikalnymi i harmonijkowymi w

powiązaniu z oddziaływaniami łańcuchów bocznych i rdzenia łańcucha polipeptydowego,

unikalnymi dla danego białka. Oddziaływania te są róŜnorakiej natury od hydrofobowych,

jonowych, van der Waalsa do wiązań wodorowych. Zwykle, struktura ta jest stabilizowana

tworzonymi mostkami disiarczkowymi. O końcowej pofałdowanej strukturze (konformacji),

którą przybiera łańcuch polipeptydowy decydują względy energetyczne i z reguły ma ona

najniŜszą energię swobodną.

10

1.1.4. Struktura czwartorzędowa

Wiele białek występuję w roztworach w formie agregatów dwu lub więcej łańcuchów

polipeptydowych, identycznych jak np. dla inhibitora proteinaz alfa-2-makroglobuliny z

osocza ludzkiego (cztery podjednostki) lub róŜnych jak np. dla ludzkiej hemoglobiny (dwie

podjednostki α i dwie β). Podjednostki te oddziaływują często ze sobą róŜnymi siłami np. w

makroglobulinie 2 identyczne podjednostki oddziaływują kowalencyjnie tworząc mostki

disiarczkowe, a następnie takie dimery łączą się wiązaniami hydrofobowymi dając tetramer.

W hemoglobinie są to oddziaływania mieszane jonowo-hydrofobowe. W obu przypadkach

dopiero powstanie takiej struktury przestrzennej potęguje efekt biologiczny białka.

1.2. Literatura

1. Stryer L.: Biochemia. Wydawnictwo PWN-Warszawa 1997.

2. Branden C., i Tooze J.: Introduction to protein structure Gerland Publishing, Inc. New

York – London 1001.

3. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., i Rodwell V.W.: Biochemia Harpera.

Wydawnictwo Lekarskie PZWL 1998.

.

Rozdział 2

Wprowadzenie do metod oczyszczania białek

2.1. Ogólna strategia oczyszczania białek

Obecnie dostępnych jest wiele opracowań opisujących szczegółowo poszczególne metody

izolacji i oczyszczania białek, przygotowania mediów chromatograficznych oraz obszernych

opisów zastosowanej aparatury dlatego w tej monografii ten problem zostanie potraktowany

jedynie skrótowo. Więcej uwagi natomiast zostanie poświęcone temu jak przygotować

materiał badawczy i jak dobrać dostępne metody by osiągnąć zamierzony cel. Spróbujemy

odpowiedzieć na najczęściej nasuwające się pytania.

Oczyszczanie białek jest zwykle procesem wieloetapowym wykorzystującym wiele róŜnych

ich własności biochemicznych i biofizycznych, takich jak kształt, masa, stęŜenie,

rozpuszczalność, ładunek czy hydrofobowość. Za dobra strategię oczyszczania białek uznaje

się taką, która w stosunkowo krótkim czasie, przy duŜej wydajności oraz zachowaniu

aktywności oczyszczanego białka prowadzi do wydajnego maksymalnego usuniecia

zanieczyszczających składników. Nie ma z góry określonej procedury określonej dla

11

oczyszczanego nieznanego białka, a sugestie muszą być kaŜdorazowo weryfikowane

doświadczalnie. W zaleŜności od celów i potrzeb dla których przystępujemy do izolowania

białka, dobieramy źródło izolacji, metodę ekstrakcji i oczyszczania. Bardzo waŜny więc jest

zatem etap opracowania strategii pozyskiwania i oczyszczania białka.

Pierwszym wstępnym etapem jest zebranie dostępnych informacji o białku, którego

oczyszczanie chcemy zaplanować lub o białkach homologicznych. Szczególnie przydatne

będą informacje o parametrach fizykochemicznych takich jak np. punkt izoelektryczny czy

masa cząsteczkowa, budowy: skład aminokwasowy, obecność podjednostek i sposób ich

powiązania, zawartość komponenty cukrowej czy lipidowej oraz ewentualne własności

biochemiczne, które moŜna wykorzystać do specyficznego i w miarę taniego, prostego,

jakościowego oraz ewentualnie ilościowego oznaczania tego białka w mieszaninie.

Kolejny etap to zastanowienie się ile rzeczywiście materiału potrzebujemy do badań, czy

chodzi nam o proces analityczny czy teŜ preparatywny oraz odpowiedni dobór materiału

wyjściowego z którego mamy zamiar pozyskać białko. Zwykle nie jest wystarczająco

doceniony ten etap pomimo Ŝe to właśnie to on moŜe być podstawą sukcesu całego projektu

badawczego, szczególnie przy izolowaniu preparatywnym. Materiał wyjściowy przeznaczony

do ekstrakcji powinien spełniać najwięcej warunków takich jak: dostępność, zasobność w

interesujący składnik, stabilność, mała zawartość składników o podobnych do izolowanego

składnika własności oraz niski koszt. Zobrazujmy to następującym przykładem. JeŜeli mamy

zamiar otrzymać np. 100 mg alfa-1-antychymotrypsyny, która występuję w ludzkim osoczu

prawidłowym w ilości 0,20 mg/ml, to przy zastosowaniu 4 stopniowej procedury izolowania

tego białka przy wydajności całkowitej procesu 20 % musielibyśmy zuŜyć na ten cel około

2,5 l plazmy. Taką ilość plazmy moŜna jednorazowo pozyskać od co najmniej 8

indywidualnych dawców, nie wspominając o trudnościach i wysokich kosztach

przedsięwzięcia. Tą samą ilość białka moŜna natomiast otrzymać juŜ z 500 ml płynu

wysiękowego usuwanego często od jednego pacjenta z ostrym stanem zapalnym opłucnej.

Tak więc często źródło materiału wyjściowego opisane w literaturze moŜe być z

powodzeniem zastąpione przez inne lepiej spełniające warunki wstępnej oceny.

Następne nasuwające się pytanie to: czy oczyszczane białko powinno zachować swoją

aktywność biologiczną? Nie jest na przykład konieczne potrzebne aktywne biologicznie

białko gdy ma być ono uŜyte jedynie jako antygen do przygotowania przeciwciał, lub gdy

chcemy wyznaczyć jedynie jego masę cząsteczkową czy sekwencję pierwszorzędową. JeŜeli

zaleŜy nam na otrzymaniu najaktywniejszego biologicznie preparatu to w pierwszym rzędzie

naleŜy określić warunki w których interesujące nas białko jest najbardziej stabilne, tak by

12

warunki te zastosować następnie w procesach ekstrakcji, oczyszczania, zagęszczania i

przechowywania białka. Zwykle jest konieczny kompromis pomiędzy warunkami największej

stabilności białka, a warunkami pozwalającymi na jego wydajną izolację. Do róŜnych

czynników często znacząco wpływających na aktywność biologiczną białek naleŜą:

temperatura, pH, rodzaj uŜytych buforów czy rozpuszczalników organicznych, obecność

detergentów, czynników chaotropowych i redukujących, jony metali i ich chelatory,

niekontrolowana proteoliza oraz czas i warunki oczyszczania i przechowywania.

WaŜne pytanie na które naleŜy odpowiedzieć jeszcze w trakcie planowania etapów

oczyszczania białka jest teŜ to jaka rzeczywiście czystość białka jest konieczna do badań

które zamierzamy wykonać (kryteria czystości białek patrz rozdział 2.7). Na przykład, dla

uzyskania przeciwciał monoklonalnych, czy przeprowadzenia oznaczeń kinetycznych

oczyszczanego enzymu wystarczy czasem czystość 50%, szczególnie jeŜeli zanieczyszczenia

nie zawierają aktywności kompetycyjnej, podczas gdy 95% czystości konieczne będzie dla

przygotowania przeciwciał poliklonalnych czy teŜ oznaczenia sekwencji aminokwasowej, a

99% wymagane jest dla oznaczenia składu aminokwasowego czy uŜycia oczyszczonego

białka jako standardu. Oczywiście znacznie prościej jest oczyścić z duŜą wydajnością białko

do 95% czystości niŜ usunąć te dodatkowe 5 % zanieczyszczeń. Często taki dodatkowy

stopień doczyszczający powoduje inaktywację białka i przy znacznym spadku końcowej

wydajności oczyszczania prowadzi teŜ do spadku jego aktywności biologicznej. Tak więc w

przypadku gdy tak wysoka czystość białka nie jest konieczna dla wykonania planowanego

eksperymentu ten dodatkowy proces jest niepotrzebną stratą czasu, funduszy i energii.

Wstępna strategia oczyszczania białka obejmuje cztery podstawowe etapy:

Zebranie informacji o białku

I

Ustalenie zapotrzebowania

I

Ustalenie aktywności biologicznej

I

Ustalenie wymaganej czystości

13

2.2. Wstępne przygotowanie materiału biologicznego

PoniewaŜ źródłem białek są najczęściej narządy i tkanki zwierzęce lub roślinne, płyny

ustrojowe albo teŜ zawiesiny komórkowe pierwszym etapem izolowania jest uwalnianie

białek do roztworu, czyli ekstrakcja prowadzona zwykle poprzez rozbicie komórek na skutek

zastosowania mechanicznego, chemicznego lub osmotycznego szoku. Jest to stosunkowo

łatwe zadanie w przypadku miękkich tkanek czy komórek zwierzęcych oraz dla białek

rozpuszczalnych w buforowanych roztworach wodnych, ale bardziej skomplikowane przy

tkankach roślinnych czy komórkach bakteryjnych, szczególnie gdy interesujące białka są

hydrofobowe i stanowią integralną część błony. Zagadnienie izolowania i oczyszczania

błonowych, hydrofobowych białek stanowi odrębne zagadnienie i nie będzie tu omawiane.

Zainteresowanego Czytelnika odsyłamy do monografii von Jagow i Schägger „A practical

guide to membrane protein purifiocation”, Academic Press 1994.

Istotnym z punktu widzenia wydajnego odzysku aktywnego biologicznie materiału jest

odpowiedni dobór warunków ekstrakcji. NaleŜy więc określić warunki w których interesujące

nas białko jest stabilne i tak dobrać ekstrakcję by uzyskać najefektywniejszy odzysk. Zwykle

konieczny jest kompromis pomiędzy tymi dwoma parametrami.

Czynnikami wpływającymi na wydajną ekstrakcje są przede wszystkim:

- temperatura i pH (zwykle obniŜenie temperatury jest konieczne ze względu na stabilność

izolowanego białaka ale wpływa niekorzystnie na szybkość ekstrakcji)

- rodzaj uŜytych soli buforujących i ewentualnie dodatek detergentów (typowe detergenty

patrz rys.2-1)

- uŜycie czynników chaotropowych (czynniki te pomagają białkom pozostać w środowisku

wodnym, przy jednoczesnym osłabieniu oddziaływań hydrofobowych moŜna je więc

czasem stosować wymienne za detergenty przy jednoczesnym łatwym ich usuwaniu z

ekstraktu poprzez dializę. Własności takie wykazuje z substancji organicznych np.

mocznik i chlorowodorek guanidyny, ale teŜ aniony znajdujące się po prawej stronie serii

Hofmeistera (Cl-, Br-, I- czy CNS-)

- czynniki redukujące (poniewaŜ często izolowane białka mają wyeksponowane grupy

tiolowe, które z łatwością ulegają utlenianiu często konieczne jest zachowanie w buforze

ekstrakcyjnym warunków redukujących poprzez dodatek ditiotreitolu czy 2-

merkaptoetanolu w stęŜeniu 1-20 mM)

- jony metali i ich chelatory (często obecność jonów wapnia czy magnezy jest niezbędna do

zachowania aktywności biologicznej białka, ale w większości wypadków obecność jonów

14

metali cięŜkich prowadzi do jej drastycznego spadku. Ten ostatni problem moŜna uniknąć

poprzez dodatek do buforu ekstrakcyjnego chelatorów takich jak np. EDTA-Na2 ( sól

sodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) w stęŜeniu 5-25 mM)

- inhibitory proteolityczne oraz czynniki bakteriostatyczne (poniewaŜ nienaruszone

komórki posiadają składniki destrukcyjne, które są zwykle oddzielone w nienaruszonej

komórce od docelowych substratów przegrodami wewnątrzkomórkowymi, przy

przygotowaniu ich ekstraktu niszcząc te naturalne przegrody doprowadzamy do

wydostania się np. enzymów proteolitycznych i ich kontaktu z innymi składnikami

komórki. By zapobiec destrukcyjnemu działaniu tych enzymów ekstrakcję prowadzi się w

zwykle w niskiej temperaturze często dodając do ekstrakcyjnego buforu mieszaniny

niskocząsteczkowych inhibitorów. Mieszanina inhibitorów jest tak dobrana by hamować

enzymy proteolityczne czterech klas (serynowe, cysteinowe, aspartylowe i

metaloproteinazy). Typowy skład takiego koktajlu to: 2 mM fenylometylosulfono fluorek

(PMSF) - inhibitor serynowych proteaz; 1 mM E-64 (L-trans-epoksybursztynylo-L-

leucylamido-(4-guanidino) butan - inhibitor proteinaz cysteinowych; 5 ug/ml pepstatyny

A - inhibitor proteinaz aspartylowych i 5 mM EDTA-Na4 - inhibitor metaloproteinaz.

Najlepszą metodą uniknięcia infekcji bakteryjnej będącej często źródłem enzymów

proteolitycznych jest stosowanie jałowych roztworów i naczyń co jednak nie zawsze jest

moŜliwe. W takiej sytuacji naleŜy rozwaŜyć moŜliwość zastosowania czynników

bakteriostatycznych takich jak azydek sodu (0,01%), n-butanol (1%) czy nawet

zastosować antybiotyki).

PrzewaŜnie białka rozpuszczalne ekstrahuje się do 50 mM buforu o pH 7,0-7,5, często

zawierającego NaCl (0,1 M); EDTA (5 mM); 2-merkaptoetanol (5mM) lub ditiotreitol (1

mM) z dodatkiem inhibitorów proteaz.

Z metod stosowanych do dezintegracji komórek naleŜy wymienić następujące:

- homogenizatory (tłokowe, noŜykowe, młynkowe, wysokociśnieniowe tzw. French press,

ultradźwiękowe)

- zamraŜanie i rozmraŜanie

- szok rozpuszczalnikowy spowodowany rozpuszczalnikami organicznymi lub szok pH

- dehydratacja.

15

Rysunek 2-1: Typowe detergenty.

16

Często stosuje się celowo jedynie ograniczoną destrukcję komórki tak by zachować, w miarę

nienaruszone struktury subkomórkowe oraz uniknąć ewentualnego trawienia proteolitycznego

przez enzymy znajdującymi się w innym przedziale komórkowym niŜ oczyszczane białko. W

takim przypadku moŜna próbować najpierw izolować frakcje subkomórkowe np. poprzez

zastosowanie róŜnicowego wirowania lub wirowania w róŜnych gradientach gęstości

(sacharoza, Ficoll), a później przygotować ekstrakt danej organelli komórkowej wzbogacony

w oczyszczane białko. Uzyskany ekstrakt białek komórkowych powinien być w dalszej części

oczyszczania traktowany w taki sposób by zapobiec procesom destabilizacji zawartych w nim

białek. Taka destabilizacja prowadząca do utraty aktywności biologicznej białek moŜe być

spowodowana wieloma czynnikami takimi jak: temperatura, trawienie proteazami zawartymi

w homogenacie lub autotrawieniem, nieodpowiednim – ekstremalnym pH, niewłaściwym

składem zastosowanego buforu, czynnikami utleniającymi etc. Często teŜ w procesie

oczyszczania białka jego stęŜenie znacznie spada co tez moŜe prowadzić do jego adsorpcji

do podłoŜa i utraty dobrej wydajności oczyszczania i obniŜenia aktywności właściwej.

Dlatego teŜ naleŜy unikać przechowywania rozcieńczonych roztworów czystych białek,

szczególnie enzymatycznych, a gdy jest to niezbędne, naleŜy stosować dodatki białka

nośnikowego np. albuminy jako stabilizatora.

2.3. Technika strącania białek

Jedną z najprostszych metod oczyszczania białek jest precypitacja, która polega na

selektywnym wytrącaniu białek z roztworu przy zastosowaniu czynnika precypitującego,

uŜytego w odpowiednim stęŜeniu i działającego w odpowiednich warunkach. Rozkład

hydrofilnych i hydrofobowych reszt na powierzchni białka określa jego rozpuszczalność.

Rozpuszczalność białka jest wynikiem oddziaływań polarnych z wodnym rozpuszczalnikiem,

jonowych oddziaływań z solami i elektrostatycznych oddziaływań pomiędzy naładowanymi

cząsteczkami. Własności rozpuszczające wodnych roztworów moŜna zmieniać poprzez

zmianę siły jonowej i pH. Poprzez dodatek mieszających się z roztworami wodnymi

rozpuszczalników organicznych lub polimerów moŜna tez zmieniać warunki selektywnej

precypitacji.

Najczęściej stosowanymi czynnikami precipitujacymi są:

- sole o własnościach antychaotropowych tj. te znajdujące się po lewej stronie serii

Hofmeistera (siarczan amonu, siarczan sodu). Większość białek wytraca się w granicach

40-80% soli (Tabela 2-1).

17

- rozpuszczalniki organiczne (etanol, aceton). Większość białek wytrąca się w przedziale

25-60 % rozpuszczalnika.

- polimery organiczne (glikol polietylenowy PEG). Większość białek wytrąca się do 15%

polimeru.

Czynniki te powodują zwiększoną ekspresje hydrofobowych rejonów cząsteczki białkowej

poprzez usuwanie stabilizującej otoczki dipoli cząsteczek wody, skutkiem czego staje się ona

słabiej rozpuszczalna i bardziej podatna na tworzenie agregatów i wypadanie z roztworu.

Takie wytrącanie jest oczywiście najbardziej wydajne jeŜeli prowadzi się je w punkcie

izoelektrycznym białka. Nawet przy zastosowaniu wstępnej standaryzacji metoda ta nie

wykazuje zbyt duŜej selektywności, a dodatkowo posiada ograniczenia w przypadku niskich

stęŜeń białek i dlatego stosuje się ja zwykle jako wstępną metodę frakcjonowania ekstraktów,

po której następują kolejne etapy oczyszczania, najczęściej techniki chromatografii cieczowej

takie jak sączenie molekularne czy chromatografia hydrofobowa. Szczególnie w przypadku

stosowania rozpuszczalników organicznych metoda precypitacji powinna być

przeprowadzana w obniŜonej nawet do –20o C temperaturze z uwagi na denaturujące działanie

tych rozpuszczalników.

18

Tabela 2-1: Zakres wysalania siarczanem amonu.

2.4. Zagęszczanie, wymiana buforu i przechowywanie białek

Jedną z metod zagęszczania białek jest opisany powyŜej proces ich strącania. Zwykle wiąŜe

się on jednak z koniecznością późniejszego odsalania próbki tak by moŜna było zastosować

następne stopnie oczyszczania. Najlepiej jest tak zaplanować cały proces oczyszczania

interesującego nas białka by uniknąć konieczności zmiany buforu, poniewaŜ zwykle jest to

zabieg długotrwały powodujący często spadek aktywności właściwej oczyszczanego białka

oraz spadek wydajności całego procesu oczyszczania. Zobrazujmy to przykładem. Sekwencja

oczyszczania obejmująca w kolejności wytrącanie siarczanem amonu, a następnie

chromatografię jonowymienna nie jest logiczna z uwagi na konieczność długotrwałego

procesu dializy poprzedzającego proces chromatografii jonowymiennej. Zastosowanie jedynie

chromatografii jonowymiennej prawdopodobnie doprowadzi do podobnego wyniku

19

końcowego przy jednocześnie większej wydajności procesu i uzyskaniu wyŜszej aktywności

właściwej produktu. Natomiast zastosowanie sekwencji: wysalanie siarczanem amonu,

chromatografia hydrofobowa jest jak najbardziej prawidłowe, poniewaŜ nie wymaga procesu

długotrwałej dializy. Podobnie np. białko wytrącone glikolem polietylenowym moŜe być

niemal bezpośrednio oczyszczone w procesie sączenia molekularnego, natomiast

zastosowanie innych typów chromatografii wymaga procesu dializy.

Zagęszczanie roztworów białek jest moŜliwe na drodze wytrącania, chromatografii

jonowymiennej, ultrafiltracji czy liofilizacji.

Ultrafiltrację prowadzi się zwykle w przeznaczonych do tego celu ciśnieniowych aparatach

typu Amicon na specjalnych błonach półprzepuszczalnych o określonych rozmiarach por

takich, które umoŜliwiają odcinanie przepuszczalności białek o określonych wielkościach.

Zwykłe do zagęszczania białek stosuje się błony PM lub YM 10, 30 czy 100 zatrzymujące

białka odpowiednio o dolnym limicie mas 10, 30 i 100 kD. Zagęszczanie zwykle prowadzi

się pod ciśnieniem gazu obojetnego (3 atm.). Poprzez kilkakrotne zagęszczenie roztworu

białka np. na membranie PM 10 i rozcieńczanie innym buforem moŜna dokonać wymiany

buforu czyli teŜ przeprowadzić odsolenie roztworu białka. Proces ten, szybszy od procesu

tradycyjnej dializy, prowadzić jednak moŜe do znaczniejszych strat białka, szczególnie przy

pracy z rozcieńczonymi roztworami oczyszczonego białka. Przy małych objętościach i

stęŜeniu białka zaleca się raczej uŜywanie ultrafiltracji na specjalnie do tego celu

przygotowanych komercyjnie dostępnych zestawach do ultrafiltracji poprzez wirowanie.

Inny sposób wymiany buforu w roztworach białkowych to zastosowanie sączenia

molekularnego na kolumienkach wypełnionych Ŝelem o ziarnach z tak małymi średnicami

kanalików wewnętrznych (porów), Ŝe nie przepuszczają białek, a pozwalają na wnikanie soli i

innych substancji drobnocząsteczkowych opóźniając ich wypływ z kolumny. Do tego celu

stosuje się np. kolumienki PD-10 firmy Pharmacia wypełnione Ŝelem Sephadex G-25. Ten

sposób zmiany buforu jest szybki, ale wymaga niewielkiej objętości próbki na starcie i

zawsze prowadzi do trzykrotnego zwiększenia jej objętości próbki po przesączeniu.

Liofilizacja to proces sublimacji wody i innych rozpuszczalników pod wysoką próŜnią i w

niskiej temperaturze prowadzony w celu zakonserwowania labilnego materiału biologicznego

w formie odwodnionej. Proces ten przebiega zwykle w czasie kilku godzin, jeŜeli oczywiście

grubość warstwy zamroŜonych roztworów wodnych białek nie przekracza 1 cm i

powierzchnia parowania jest odpowiednio duŜa. Dlatego najlepiej zamraŜać roztwory na

ściankach, a nie tylko na dnie probówek. Gdy warstwa zamroŜonego płynu jest większa od 1

cm to w czasie procesu liofilizacji wychładza się tylko część próbki, a reszta szczególnie na

20

dnie przy ściankach probówki ulega rozmroŜeniu i energicznie parując moŜe spowodować jej

utratę poprzez wypchnięcie całej próbki na zewnątrz probówki. Oczywiście w procesie

liofilizacji poza niektórymi nietrwałymi solami lub lotnymi rozpuszczalnikami (np. kwaśny

węglan amonu czy metanol) większość składników buforów pozostaje wraz z białkiem w

zliofilizowanym osadzie, a zwiększające się ich stęŜenie moŜe czasem być powodem utraty

aktywności białka.

Większość białek monomerycznych jest bardziej stabilna w przechowywaniu w stanie

zliofilizowanycm niŜ w roztworze. Niektóre kompleksy białkowe, szczególnie te

stabilizowane oddziaływaniami hydrofobowymi, lepiej jest przechowywać w niskiej

temperaturze w obecności soli np. w 25-50% roztworach siarczanu amonu jako tzw. mokry

osad. Niektóre białka enzymatyczne, niestabilne w stanie zamroŜonym (np. trombina ludzka)

lepiej je przechowywać w stanie niezamroŜonym w niskiej temperaturze (-20oC) w obecności

50% gliceryny. Warunki przechowywania białka wpływają na jego stabilności i zachowanie

jego aktywności biologicznej. PoniewaŜ przewaŜnie nie da się przewidzieć jakie warunki są

najlepsze dla przechowywania danego białka kaŜdorazowo naleŜy to sprawdzać

doświadczalnie.

2.5. Metody ilościowego oznaczania białek i peptydów

Istnieje wiele metod ilościowego oznaczania białek i peptydów lecz jedynie obliczenie

dokonane z dokładnie oznaczonego składu aminokwasowego jest metodą bezpośrednią. Inne

metody są oparte na róŜnych załoŜeniach i zwykle są przeliczane wzg. krzywych

wykonanych na białkach czy peptydach standardowych. Idealna metoda oznaczania białka

powinna cechować się szybkością i łatwością wykonania, dokładnością, czułością i precyzją

oraz powinna być specyficzna i wolna od interakcji z innymi niŜ białka substancjami.

Oczywiście takiej metody jeszcze nie odkryto. W niniejszym opracowaniu omówimy jedynie

najczęściej uŜywane metody, a to:

- opartą o pomiar absorbancji w ultrafiolecie

- metodę Lowry

- metodę Bradford

- metodę BCA

- metody immunologiczne

21

2.5.1. Określanie ilości białka poprzez pomiar absorbancji w ultrafiolocie

Ilościowe określenie białka w roztworze jest moŜliwe przy uŜyciu spekltrofotometru.

Absorbcja promieniowania bliskiego ultrafioletu (280 nm) przez białka zaleŜy od zawartości

reszt tryptofanu (W) i tyrozyny (Y) oraz w niewielkim stopniu teŜ reszt fenyloaminy (F) czy

obecności mostków disiarczkowych (-S-S-) i dlatego adsorbancja roztworów o zawartości 1

mg/ml róŜnych białek róŜni się często znacznie (od wartości 4,0 dla białek wełny bogatych w

tyrozynę do 0,35 dla C-1-Inhibitora plazmy ludzkiej). Dla długości fali λ = 280 nm w

neutralnym środowisku stosunek absorbancji poszczególnych aminokwasów W : Y : F = 5550

: 1490 : 0,7. PoniewaŜ wartość pomiaru zaleŜy od grubości warstwy (l) absorbujacej próbki

zgodnie z prawem Beera-Waltera: A (absorbancja) = ε c l (gdzie: ε- molowy współczynnik

absorpcji zaleŜny od rodzaju białka; c - stęŜenie białka w molach/litr) więc przy pomiarze w

w warstwie większej niŜ 1 cm naleŜy to koniecznie uwzględnić. Aby obliczyć stęŜenie

musimy więc znać molowy współczynnik absorbcji badanego białka dla danego pH w którym

prowadzimy pomiar, poniewaŜ współczynnik ten zaleŜy od pH. Współczynniki dla znanych

białek są dostępne w literaturze, a dla nieznanego białka wielkość ta musi być albo oznaczona

eksperymentalnie np. ze wzoru Scopesa poprzez pomiar absorbancji czystego roztworu

białka przy dwóch długościach fali (205 i 280 nm), albo wyliczony z ponizszego wzoru:

ε280 [M-1cm-1) = (5550 x ilość reszt W + 1490 x ilość reszt Y + 125 x ilość reszt C)

gdzie: 5550, 1490 i 125 to odpowiednie współczynniki absorbancji odpowiednio dla reszt W,

Y i C. Do pomiaru naleŜy próbkę tak rozcieńczyć by uzyskać absorbancję w zakresie wartości

0,3 bo wtedy dokładność pomiaru jest największa. Analizowana próbka oczywiście musi być

klarowna więc najlepiej ją przed pomiarem przesączyć przez filtr Millipore 0,2 µm lub

odwirować.

Zaletą tej metody oznaczania białka jest jej prostota przy całkowitym odzysku próbki, a wadą

jest to, Ŝe interferuje z innych chromoforami, narzuca konieczność określenia absorbancji

właściwej i daje jedynie moŜliwość dokładnego ilościowego oznaczenia białka tylko w

przypadku ich czystych roztworów. Uwaga: kwasy nukleinowe mogą dawać nawet

dziesięciokrotnie większą od białek absorbancje przy λ 280 nm.

Adsorbancja promieniowania dalekiego ultrafioletu (205 nm) jest powodowana głównie przez

wiązanie petydowe białek przy czym maksimum tej absorbancji przypada na 190 nm. Przy tej

długości fali pochłanianie promieniowania przez tlen jest jednak zbyt duŜe by moŜna było

22

łatwo przeprowadzić pomiar. Za absorbancję roztworów białek w tym rejonie ultrafioletu

odpowiedzialne są reszty aminokwasów w następującym stusunku W : F : Y : H : M : R : C =

19,6 : 9,3 : 5,6 : 5,1 : 1,9 : 1,4 : 0,7. Zalety metody to jej prostota, duŜa czułość (ok. 30 x

większa od oznaczania przy 280 nm) natomiast wadą jest konieczność dokładnej kalibracji

spektrofotometru oraz to, Ŝe wiele składników buforów i innych związków interferuje silnie w

tym rejonie.

2.5.2.Metoda Lowry i wsp.

Pomimo Ŝe metoda Lowry i wsp., podobnie jak większość metod chemicznych oznaczania

białek nie pozwala na określenie absolutnej ilość białka jest ona nadal jedną z najczęściej

stosowanych ze względu na jej prostotę wykonania, powtarzalność i niskie koszty. Do

wczesnych lat 80 tych praca Lowry i wsp., była najczęściej cytowaną pracą w naukowej

literaturze biochemicznej. Metoda ta jest oparta na reakcji biuretowej. W wyniku utworzenia

koordynacyjnego połączenia miedzi w dwoma przyległymi wiązaniami peptydowymi w

białkach czy peptydach, powstaje w środowisku zasadowym barwny produkt soli

kompleksowej, która reaguje z odczynnikiem Folin-Ciocalteau będącym mieszanina kwasów

fosforowolframowy i fosforomolibdenowy. Redukcja tych kwasów do odpowiednich tlenków

zarówno przez miedź związaną z białkiem jak i przez reszty tyrozyny i tryptofanu prowadzi

do powstania błękitu heteropolimolibdenianu oznaczanego spektrofotometrycznie.

Intensywność barwy zaleŜy nie tylko od ilości białka, ale teŜ od jego składu

aminokwasowego. Tak więc zaleca się stosowanie odpowiednich wzorców oznaczanego

białka. PoniewaŜ jednak w większości przypadków jest to niemoŜliwe więc stosuje się jako

wzorzec albuminę i dlatego wykonane oznaczenie jest względne. Czułość tej metody w.

oryginalnej mikroprocedurze przy długości fali 700 nm wynosi około 5 µg. Wadą metody

jest fakt, Ŝe wiele substancji takich jak np. fenole, puryny i pirymidyny, kwas moczowy

reagują z odczynnikiem Folina-Ciocalteau, a inne takie jak np. siarczan amonu, zobojętniony

kwas trichlorooctowy, etanol, sacharoza, glicerol czy detergenty obniŜają intensywność

barwy.

2.5.3. Metoda Bredford

Obserwacja wiązania barwnika znanego pod nazwą Coomassie Brillant Blue G250 ( rys. 2-1)

przez białka została wykorzystana do opracowania w 1976 r nowej wygodnej metod ich

oznaczania. Wolny barwnik występuje w trzech róŜnych formach jonowych: kationowych

czerwonej i zielonej o maksimum absorbancji odpowiednio przy 470 i 650 nm oraz w formie

23

niebieskiej anionowej, która wiąŜe się do białek i wykazuje maksimum absorbancji przy 590

nm. Ilość białka moŜe być oznaczana poprzez oznaczanie tej niebieskiej jonowej formy.

Rysunek 2-2: Coomassie Brilliant Blue G-250.

Barwnik wiąŜe się głównie do reszt argininy i słobo do reszt lizyny, histydyny, tyrozyny,

tryptofanu i fenyloalaniny białek, ale nie do wolnych aminokwasów tak więc podobnie jak w

metoda Lowry i wsp., barwa zaleŜeć będzie nie tylko od ilości, ale teŜ od jakości

oznaczanego białka. Dodatkowo słabe wiązania van der Waalsa i oddziaływania hydrofobowe

odgrywają pewną rolę we wiązaniu barwnika. Najbardziej powtarzalne wyniki otrzymuje się

dla standardowej metody przy ilości białka w zakresie 20-100 µg , a w wariancie mikro- dla

1-10 µg. Zaletą metody jest trwałość odczynnika reakcyjnego, a główne wady podobne są do

tych wymienionych przy metodzie Lowry i wsp., ze szczególnie silną interrakcją z

detergentem typu Triton X-100.

2.5.4. Metoda BCA

Kwas bicinchoninowy (BCA) został zastosowany po raz pierwszy w 1985 roku przez Smith i

wsp., do oznaczania białka w oparciu o zasadę podobną do tej wykorzystanej w metodzie

Lowry i wsp. Najpierw następuje konwersja Cu+2 do Cu+1 w środowisku alkalicznym, a

nastepnie Cu+1 jest wykrywany przez reakcję z BCA. PoniewaŜ jednak BCA jest stabilne w

alkalicznym środowisku moŜna było w tej metodzie zastosować pojedynczy odczynnik w

miejsce dwustopniowej procedury stosowanej w metodzie Lowry i wsp. W wyniku reakcji

powstaje purpurowe zabarwienie rozpuszczalnej soli kompleksowej, które jest oznaczane

ilościowo spektrofotometrycznie przy 562 nm.

24

Rysunek 2-3: Kompleks Cu+1 z BCA.

Makromolekularna struktura białka, ilość wiązań peptydowych oraz obecność czterech reszt

aminokwasowych w białku (cysteina, cystyna, tryptofan i tyrozyna) to czynniki

odpowiedzialne za wywoływanie barwy w reakcji z BCA. Metoda ta eliminuje konieczność

precyzyjnego pomiaru czasu reakcji oraz solidnego wytrząsania w czasie dodawania

odczynnika rozwijającego barwę co jest konieczne w przypadku uŜycia metody Lowry i wsp.

Dodatkową zaletą w porównaniu do poprzednio omówionych metod jest to, Ŝe w szerokim

zakresie stęŜeń barwa nie zaleŜy od siły jonowej buforów czy teŜ od zawartości niejonowych

detergentów, mocznika czy chlorowodorku guanidyny. Wprawdzie podobnie jak poprzednie

metody pomiar jest zaleŜny od obecności czynników redukujących, ale te ostatnie mogą być

eliminowane z próbki poprzez strącanie białka przed pomiarem kwasem trifluorooctowym lub

acetonem. Standardowa i mikro- metoda pozwalają odpowiednio oznaczać 10-100 µg i 0,5-

1,0 µg białka, a dodatkowo przy zastosowaniu pieca mikrofalowego moŜna skrócić czas

inkubacji do kilku sekund.

2.5.5. Metody immunologiczne oznaczania ilościowego białek

Z ilościowych metod immunologicznych naleŜy wymienić immunodyfuzję radialne,

immunoelektroforezę rakietowa, cytometria przepływowa i metod ELISA (ang. enzyme-

linked immunosorbent assay). W metodzie immunodyfuzji radialnej wykorzystuje się

zjawisko swobodnej dyfuzji przeciwciał (Ab) i antygenu (Ag) w Ŝelu zwykle agarowym. W

tym samym czasie tworzący się precypitat kompleksu Ab-Ag nie dyfunduje i w strefie

równowagi powstają pierścienie precypitacyjne o średnicy uzaleŜnionej od stęŜenia antygenu.

Podobnie w metodzie radialnej dyfuzji elektroforezę antygenu prowadzi się w Ŝelu

25

agarozowym zawierającym przeciwciała dla tego antygenu. Tworzące się kompleksy Ab-Ag

w miejscu równowagi linie precypitacyjne kształtem przypominające rakietki, których

ysokość (pole powierzchni) jest wprost proporcjonalne do stęŜenia antygenu. Poprzez

zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał skierowanych dla badanego

antygenu cytometria przepływowa moŜe być uŜyta do dokładnego określenia małych ilości

antygenu w pojedynczych komórkach populacji. Daje to znaczną przewagę tej metody nad

popularnie stosowane immunodetekcję za pomocą przeniesienia na membranę

(immunoblotting) wymagający lizy komórek.

Metody te zostały wcześniej opisane w innych wydaniach tej serii wydawniczej: Analiza

instrumentalna w biochemii - 2001 (A. Kozik i wsp.), Przeciwciała monoklonalne – 2000 (J.

Bereta i M. Bereta) oraz Ćwiczenia z immunologii – 1999 ( red. J. Pryjma).

2.6. Dokumentacja oczyszczania

Główne metody oczyszczania białek i peptydów takie jak: Ŝelowe sączenie molekularne,

chromatografie: jonowymienna, oddziaływań hydrofobowych, powinowactwa i jej pochodne

oraz w wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz zostały

omówione juŜ w innym wydaniu tej serii wydawniczej: Analiza instrumentalna w biochemii -

2001 (A. Kozik i wsp.). Przy opracowaniu strategii oczyszczania białka wymagane jest jednak

ustawienia tych metod w logiczny ciąg, który powinien doprowadzić do wydajnej izolacji i

oczyszczenia do homogenności aktywnego biologicznie białka. KaŜdy kolejny etap

oczyszczania musi być monitorowany poprzez pomiar całkowitej ilości białka, pomiar

aktywności biologicznej oraz elektroforetyczny obraz zawartości białek w uzyskanym

preparacie. JeŜeli nie ma moŜliwości określania aktywności biologicznej moŜna

monitorowanie przeprowadzić poprzez oznaczanie ilości antygenu w mieszaninie ze

specyficznymi przeciwciałami. Z uzyskanych danych wylicza się na kaŜdym zastosowanym

stopniu oczyszczania odzysk białka całkowitego (B), odzysk całkowitej aktywności (A),

aktywność właściwą oczyszczanego białka jako stosunek A/B, stopień oczyszczenia

określający ile razy w danym stopniu oczyszczania zwiększyła się aktywność właściwa

oczyszczanego białka oraz wydajność oczyszczania. JeŜeli wydajność jakiegoś

zastosowanego stopnia oczyszczania jest niska (np. poniŜej 50%) naleŜy go zastąpić innym

wydajniejszym; jeŜeli nawet wydajność oczyszczania danego stopnia jest wysoka ale stopień

oczyszczania na tym etapie jest niski (np. mniejszy od czynnika 2) naleŜy ten stopień zastąpić

innym. Schemat typowego oczyszczania białka przedstawiono w tabeli 2-2.

26

Tabela 2-2: Oczyszczanie elastaz (1 i 2) z ziarnistości leukocytów krwi konia.

Etapy oczyszczania

Białko całkowite

[mg]

Wydajność białka [%]

Aktywność całkowita

[J]

Wydajność aktywności

[%]

Aktywność właściwa [J/mg]

Oczyszczenie

Homogenat komórkowy

3600 100 6400 100 1,8 1

Ekstrakt ziarnistości

140 3,9 3800 59 27 15

Sephadex G-75

9,2 0,25 1400 22 152 84

CM-Sephadex: Szczyt 1 Sczyt 2

1,6 0,9 0,7

0,045 0,025 0,020

483 218 265

7,5 3,4 4,1

302 242 378

167 134 210

2.7. Kryteria czystości

Z metod elektroforetycznych jedynym dobrym kryterium czystości białka jest elektroforeza

dwuwymiarowa obejmująca izoelektroogniskowanie w jednym kierunku i elektroforezę

SDS-PAGE w drugim kierunku. Metoda ta pozwala rozdzielić białka wykazujące róŜnice nie

tylko w masach cząsteczkowych, ale i w punktach izoelektrycznych. Niestety ta metoda jest

pracochłonna, wymagająca specjalistycznej aparatury i nie nadaje się dla białek o skrajnych

wartościach punktów izoelektrycznych (9<pI<3). Wykazanie homogenności białka w

stosowanej powszechnie elektroforezie denaturującej SDS-PAGE zwykle nie wystarcza i

konieczne jest potwierdzenie tego jeszcze w innym rodzaju rozdziału np. w elektroforezie

natywnej PAGE lub teŜ wysokorozdzielczej chromatografii jonowymienną w systemie FPLC

na kolumnie Mono Q (dla białek kwaśnych) czy Mono S (dla białek zasadowych). Dobrym

przykładem potwierdzającym taka konieczność moŜe być nieudana próba wykazania

heterogeniczności mieszaniny dwu białek osocza ludzkiego albuminy i alfa-

antychymotrypsyny metodą SDS-PAGE, poniewaŜ białka te nie róŜnią się masą

cząsteczkową. Zastosowanie natywnej elektroforezy PAGE w związku z róŜnicami w

punktach izoelektrycznych tych białek wykazuje natomiast heterogeniczność mieszaniny.

Brak widocznych dodatkowych prąŜków na elektrogramach SDS-PAGE i natywnym PAGE

wybarwionym CBB R-250 po rozdziale 5 µg białka, moŜna uznać za 99% czysty preparat.

Homogenny peptyd powinien wymywać się (w gradiencie o nachyleniu1% na minutę) z

kolumy C-18 w RF HPLC jako pojedynczy, symetryczny szczyt zarówno w pH 3 jak i 7.

27

Dobrymi kryteriami homogenności białek i peptydów są teŜ oczywiście takie specjalistyczne

metody jak analiza sekwencyjna czy spektrometra masowa.

Literatura

Literatura źródłowa

1. Rosenberg I.M.: Protein analysis and Purification. Benchtop techniques. Birkhauser,

Boston-basel-Berlin 1996.

2. The protein protocols. Handbook. Red.: J.M. Walker. Humana Press 1996.

3. Protein purificatiion protocols. Red.: S. Doonan. Humana Press, Totowa, New Jersey

1996.

4. Władyka B.: Określenie struktury pirwszo- i trzeciorzędowej – dwa sposoby

charakterystyki białek. Praca magisterska IBM UJ, Kraków 2002.

5. Rawn J.D.: Biochemistry. Carolina BSC, Burlington NC. 1988.

Literatura uzupełniaj ąca

1. Kozik A., Rąpała-Kozik M., Guevara-Lora I.: Analiza instrumentalna w biochemii.

Wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej. Seria

Wydawnicza IBM UJ 2001.

2. Ćwiczenia z immunologii. Praca zbiorowa pod red. J. Pryjmy, . Seria Wydawnicza

IBM UJ 1999.

3. Bereta J., Bereta M.: Przeciwciała monoklonalne. Otrzymywanie i zastosowanie. .

Seria Wydawnicza IBM UJ 2000.

4. Walkowiak B.: Technik chromatografii cieczowej. Przykłady zastosowań. Amersham.

Amersham Pharmacia Biotech, MORPOL, Lublin, 2000.