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Alloreaktivität vorhersagen
Dipl. Biol. Michaela Wolf
Transplantations- und Infektionsimmunologie, AG Prof. M. Sester, Campus Homburg
23. Jahrestagung des Arbeitskreises Nierentransplantation der Deutschen Gesellschaft für Urologie
13.11.2015
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Abstoßungsreaktionen
• Hyperakut (innerhalb von Minuten)
• Akut (innerhalb von Tagen/Wochen)
• Chronisch (innerhalb von Monaten/Jahren)
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Hyperakute Abstoßung bei Vorkommen von präformierten zytotoxischen Antikörpern
Kissmeyer-Nielsen et al. (1966) The Lancet
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Präformierte HLA-Antikörper
Präformierte HLA-AK können entstehen durch immunisierende Ereignisse:
• Schwangerschaft
• Bluttransfusion
• Transplantation
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Antikörper-vermittelte akute Abstoßung
Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451
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Präformierte Antikörper vorhersagen
• Humoral bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch Antikörper-Vorhersage mittels:
– Mikrolymphozytotoxische Tests
• CDC-Crossmatch
• Flow-Crossmatch
– Festphasen-Immunassays
• ELISA
• Luminex
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Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe, Inkubation für 120 min
American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-
1051 (Platte)
Special Interview Article
Interview with Dr Paul Terasaki
J. Michael Cecka
Department of Pathology, UCLA Immunogenetics
Center,
1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,
USA,
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Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe, Inkubation für 120 min
Lyse der Spender Lymphozyten positiv
Keine Lyse der Lymphozyten negativ
C´ C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´
American Journal of Transplantation 2003, 3; 1047-
1051 (Platte)
Special Interview Article
Interview with Dr Paul Terasaki
J. Michael Cecka
Department of Pathology, UCLA Immunogenetics
Center,
1000 Veteran Avenue, Los Angeles, CA 90095,
USA,
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Mikrolymphozytotoxischer Test – CDC-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe, Inkubation für 120 min
DTT Behandlung
(30 min)
Negatives Testergebnis
IgM AK anwesend
Positives Testergebnis
IgG AK anwesend
C´ C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´
C´ Lyse der Spender
Lymphozyten positiv
Keine Lyse der Lymphozyten negativ
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Fluoreszenzmikroskopische Auswertung – CDC-Crossmatch
http://www.mh-hannover.de/fileadmin/institute/transfusionsmedizin/downloads/Vorlesung_Immenschuh_Immungenetik_0209
positives Testergebnis lysierte Zellen
negatives Testergebnis intakte Zellen
C´
C´
C´
C´
C´ C´
C´
C´
C´
C´
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Bewertung – CDC-Crossmatch
Anteil toter Zellen TERASAKI Score Bewertung
0-10% 1 negativ
11-20% 2 zweifelhaft positiv
21-50% 4 schwach positiv
51-80% 6 positiv
81-100% 8 stark positiv
0 nicht auswertbar
Altermann (2006) Histol Histopathol 21: 1115-1124
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Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe
C´
C´
C´
C´
C´
+
CDC-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
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Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe
C´
C´
C´
C´
C´
+
CDC-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG
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Flow-Crossmatch im Vergleich zum CDC-Crossmatch
Serum vom Empfänger
Inkubation bei RT oder 37°C für 60 min
C´ C´ C´
C´ C´
Komplementzugabe
C´
C´
C´
C´
C´
Fluoreszenzmarkierter anti-human IgG
+
CDC-Crossmatch
Flow-Crossmatch
Lymphozyten Isolation vom Blut des Spenders
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Mikrolymphozytotoxischer Test
• B-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I + II Antikörpern
• T-Zell Crossmatch: Detektion von HLA-Klasse I Antikörpern
beide Crossmatches messen die humorale/Antikörper-vermittelte-Antwort
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Festphasen Assay
• ELISA (eher historisch)
• Luminex (aktuell)
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ELISA (eher historisch)
HLA Klasse I Ag
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ELISA (eher historisch)
HLA Klasse I Ag
Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger
Non anti-HLA AK
Emp
fän
ger-
Seru
m
Donor AK im Empfängerserum
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ELISA (eher historisch)
HLA Klasse I Ag
Donor spezifische anti-HLA Klasse I AK vom Empfänger
Non anti-HLA AK
Emp
fän
ger-
Seru
m
Donor AK im Empfängerserum
Enzymgekoppelter anti-human Ig AK
Substrat - Farbumschlag
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Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie
• Anstelle von ELISA-Platte Mikropartikel (Beads mit 2-6 μm Durchmesser)
• Beads haben eigene Fluoreszenzen und sind mit gereinigten HLA-Antigenen beladen
• Nachweis: Quantifizierung der Mikropartikelbindung der Anti-HLA-AK des Testserums durch Fluorophor-markierte anti-human-IgG-Sekundärantikörper
• Luminex Messgerät hat zwei Laser: – der erste erkennt die farbkodierten Beads – der zweite die darauf gebundenen sekundären AK mit Fluorophor-Phycoerythrin
Mikro-Bead mit HLA-Antigenen
Detektions-AK
AK im zu unter-suchenden Serum Antigen
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Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie
• Screening Test – verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der
Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind
– Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II
• Single Antigen-Test – erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK – Einsatz bei immunisierten Patienten – Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet.
Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.
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Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie
• Screening Test – verwendet Beadpopulationen, die mit Ag der Klasse I (A, B und C) oder der
Klasse II (DRB1, DQB1, DQA) beschichtet sind und ermöglicht zunächst die qualitative Aussage, ob Empfänger HLA-AK positiv oder negativ sind
– Mix aus 12 Beadpopulationen für Klasse I und 6 für Klasse II
• Single Antigen-Test – erlaubt exakte Spezifizierung der HLA-AK – Einsatz bei immunisierten Patienten – Bei Luminex SA ist jede Beadpopulation mit Ag einer Spezifität beschichtet.
Für SA I werden 98 Ag-Spezifitäten verwendet, für SA II- 96 Ag-Spezifitäten.
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Exemplarisches Ergebnis einer Luminex Analyse
Institut für Immunologie und Genetik, Labor Thiele, Kaiserslautern
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Prinzip Luminex - Bewertungskriterien
A. Konvalinka and K. Tinckam (2015) J Am Soc Nephrol 26: 1489–1502
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Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag
HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :
• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation
HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)
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Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag
HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :
• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation
HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatus („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)
HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung
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Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015)
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Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015)
![Page 29: Alloreaktivität vorhersagen - nieren-transplantation.com · Prinzip Luminex - Mikropartikeldurchflusszytometrie • Anstelle von ELISA-Platte Mikropartikel (Beads mit 2-6 μm Durchmesser)](https://reader030.vdocuments.net/reader030/viewer/2022041204/5d5322f488c993ff0e8bdaf9/html5/thumbnails/29.jpg)
Bestmögliches HLA-AK-Screening im klinischen Alltag
HLA-AK Testung vor Tx – Präexistierende HLA-AK können entstehen durch :
• Schwangerschaft • Bluttransfusion • Transplantation
HLA-Typisierung bei Aufnahme auf Warteliste PRA gemäß ET-Manual 4mal pro Jahr wiederholen Festlegen des Immunisierungsstatuses („I“ > 5% PRA; „HI“ > 85% PRA) Festlegen von verbotenen Antigenen („hohe“ AK-Titer)
HLA-AK Testung bei Tx – Vorgehen genau geregelt gemäß RiLi BÄK (DÄB 03.08.2015) – Negatives Crossmatch Voraussetzung
HLA-AK Testung nach Tx
– Gibt noch keinen optimalen Zeitpunkt zur AK Testung Im Median treten de novo Donor-spezifische HLA AK (dnDSA) 3,8-68 Monate nach Tx auf – Vorhandensein von dnDSA führt zu signifikant reduziertem Tx-Überleben
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Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)
Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26
Wah
rsch
ein
lich
keit
de
s Tr
ansp
lan
tatü
ber
leb
ens
Jahre nach Transplantation
grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle
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Überleben von Nierentransplantaten in Abhängigkeit von donorspezifischen Antikörpern (DSA)
C´
Wah
rsch
ein
lich
keit
de
s Tr
ansp
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tatü
ber
leb
ens
Jahre nach Transplantation
grau hinterlegt: 95-%-Konfidenzintervalle
Loupy (2013) N Engl J Med 69:1215-26
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Vorhersage T Zell vermittelter Abstoßungen?
Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451
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präformierte T-Zellen vorhersagen
Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:
– Limiting-Dilution Analyse
– Proliferationsassay - CFSE
Langzeit-Assays
(Proliferation von mehreren Tagen)
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präformierte T-Zellen vorhersagen
Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch:
– Limiting-Dilution Analyse
– Proliferationsassay - CFSE
– ELISPOT
– AlloFlow
Langzeit-Assays
(Proliferation von mehreren Tagen)
Kurzzeit-Assays
(8-24h)
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ELISPOT
Anti-IFNγ AK
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ELISPOT
Anti-IFNγ AK
Empfängerlymphozyten
Spenderlymphozyten mit Antigen
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ELISPOT
Anti-IFNγ AK
Sezerniertes IFNγ
Empfängerlymphozyten
Spenderlymphozyten mit Antigen
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ELISPOT
Anti-IFNγ AK
Enzymgekoppelter Sekundär-AK
Empfängerlymphozyten
Spenderlymphozyten mit Antigen
Ergebnisse nach 16-24h
Sezerniertes IFNγ
Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363
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ELISPOT - Bewertung
Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363
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ELISPOT - Outcome
Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18: 1602–1606 Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363
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AlloFlow – Vollblut-Assay
Wolf et al., unpublished
Vorteile:
Vollblut-Assay
Geringes Probenvolumen
8h Zeitdauer
Je 500µl Blut vom Empfänger und Spender
Spenderblut +
Empfängerblut
a-CD28 a-CD49d
Brefeldin A 1ml
Spender Empfänger
+ a-CD45 APC
500µl LiHep Blut 700µl LiHep Blut
Waschen Waschen
2h
4h
Durchflusszytometrische Analyse
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AlloFlow – Vollblut-Assay
IFN-γ
CD
69
IFN-γ
CD
45
reaktive CD4 oder CD8 T-Zellen
Empfänger
Spender
IFN-γ
Wolf et al., unpublished
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7.810 -0 3
0.03125
0.125
0.5
2
8
DL
29
66
67
84
114
124
183
462
466
191
63
106
115
470
472
71
82
83
90
47
110
31
37
24
128
94
473
57
35
86
69
56
98
172
85
96
113
44
61
89
45
55
77
469
65
52
54
87
100
116
480
117
59
68
126
78
62
73
64
22
70
81
7.810 -0 3
0.03125
0.125
0.5
2
8
DL
% a
llore
acti
ve C
D8 T
-cells
Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen
CD8
dialysis patients
hohe mediane Reaktivität
Moderate mediane Reaktivität
Keine mediane Reaktivität
% a
llore
akti
ver
CD
8 T
-Zel
len
Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten Wolf et al., unpublished
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Überblick / Ausblick
• Methoden zur Vorhersage von präformierten AK vor einer Transplantation sind sehr gut geeignet, um antikörperdominierte Abstoßungsreaktionen zu verhindern
• Methoden zur Vorhersage der zellulären Alloreaktivität waren bisher aufwendig und daher ungeeignet für die klinische Routine • In 5-10% kommt es nach Tx zu T-zellulär vermittelten Abstoßungen
• Multicenter-Studie zu AlloFlow klinisches Outcome
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Lieben Dank für Ihre Aufmerksamkeit
• http://www.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2F1.bp.blogspot.com%2F-vgGP_BMr4CI%2FVBdtNmY6vEI%2FAAAAAAAAA_c%2FwLNjS2v_SUk%2Fs1600%2FWhite_blood_cell_eating_germs_by_ShyDude28.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.worldaccordingtolupus.co.uk%2F&h=669&w=900&tbnid=Ea6od4Q2rL2QUM%3A&docid=nByax3ZG3quvNM&itg=1&ei=s9ZBVrbgNMzXUeOhgZAE&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=634&page=5&start=82&ndsp=22&ved=0CLsCEK0DMF5qFQoTCPaF6PLhhckCFcxrFAod41AAQg
Cynthia McKelvey (2015)