kromozom biyolojisi 4

Sitogenetik

Fenotiplerle kromozomal anormalilerini eşleştiren bilim dalı.

Karyotip

Bir bireyin kromozomlarının sayısı,yapısı ve büyüklüğü.

Kromozom anormalileri.

Işık mikroskobu ile incelenebilen anormaliler.

Tarihsel gelişimde sito-genetik• İnsan sito-genetiği, 19. yüzyılın sonlarında,

kromozomların yapı, işlev ve evrimini araştıran bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır.

• Flemming 1882’de ilk kromozom çizimlerini yayımlamış, 1888’de ise ilk kez Waldeyer “kromozom” terimini kullanmıştır.

• 1955 yılında Hsu, Ford ve Levan insan kromozomlarının sayısının 2n=46 olduğunu göstermiştir.

• 1970’li yılların başında G-, R-, C- ve NOR bantlama teknikleri başarılı uygulamalarda kullanılmaya başlanmış,

• Bunu High-Resolution bantlama teknikleri ve FISH teknikleri izlemiştir.

Kromozomların Gözlemlenmesinde Kullanılan

Kimyasallar• Hücre bölünmesinin teşviki

• İğ ipliklerinin durdurulması ve kromozomların ayrılması

• Kromozom boyama

• Fitohemaglutinin

• Hidroksiürea, ametopterin, soğuk uygulaması. Kolşisin, α-bromonaftalin, hidroksikuinolin, hipotonik uygulaması

• Feulgen (DNA’ ya özel), giemsa, karmin

 Conferences and Documents Year *

 Denver Conference 1960

 London Conference 1963

 Chicago Conference 1966

 Paris Conference 1971

 Paris Conference (Supplement) 1975

 Stockholm-1977 ISCN 1978

 Paris-1980 ISCN 1981

  ISCN 1985

 Cancer Supplement ISCN 1991

 Memphis-1994 ISCN 1995

Kromozomların elde edilmesi:

Direkt - Kemik iliğiDoku Kültürleri - Kan, Fibroblast (deri)

Amnion, Koryon vili, Kord kanı

Kemik İliği: Steril enjektör ile (heparinize edilmiş) 0.2 cc kemik iliği alınır. İn vivo mitoz sık.

Direk ve 24 saat doku kültürü

Beyaz Kan ( Lökosit ) – Lenfosit – T-Lenfosit

Steril makasparçalama

Yıkama

Besi ortamı

Besi ortamı

Doku Kültürü

a) Kan: Heparinize enjektör ile ~ 0.3cc kan 5cc steril besi ortamı içine konur. 72 saat etüv 37oC .

Devamlı: Hela, LMTK-

Doku

b) Fibroblast: Primer ve Devamlı. Primer:

c) Amnion: Amniosentez – 15-18 hafta. Amnion sıvısı ile alınan fötüs hücre. Santrifuj- besi ortamı- etüv-37oC.

d) Korion villi: 9-11 hafta a) abdominal b) vajinal olarak girip fötüsün villus hücrelerinden

doku kültürü yapmak.

Kolçisin --- 1 , 1.5 veya 2 saat

Besi Ortamı

Besi Ortamı

Santrifuj1000-1200 rpm

Besi Ortamı

Hücre

Dökeltiat

0.075M KCl

Santrifuj

Hipotonikat

Hücre

Fiksatif1 GAA3 Metanol

Santrifuj

Lökositler

Eritrositlereridiat

Fiksatif3 kez yıkama

Santrifuj

Karıştır

Pastör pipeti 1 damlaHavada kurutma

Mikroskop

Boyama :

Giemsa, floresan DNA Boyaları

Mikroskop

Fotograf

KARYOTİP- Kromozomların belirli bir düzende sıralanması (Boy, sentromer)

7 Grup A-GA grubu 1,2,3 met+subB grubu 4,5 subC grubu 6-12 subD grubu 13-15 satellit-akroE grubu 16-18 subF grubu 19,20 metG grubu 21,22 satellit-akroSeks X submetasentrik

Y akrosentrik

İnsan kromozomlarının sayısal ve yapısal değişiklikleri metafaz evresinde mikroskop altında

incelenir

Özel Teknikler

Bandlama- Tripsin

* Giemsa bandlama (300-900 - haploid set)

C bandlama - Sadece sentromer

* R bandlama - G bandlama tersi boyama* Floresan

NOR - Gümüş ile sadece satellitlerin boyanmasıHRB - PremetafazSCE - Kardeş kromatid değişimi

Budr --- Timin yerine. Prekanserojen. Kırıklar

DERMATOGLİFİK İNCELEME

İN SİTU HİBRİDİZASYON MOLEKÜLER SİTOGENETİK

Kromozom anormalileri belli fenotipleri

oluşturabilir. Down sendromu.

Kromozom incelemeleri

Doku alınması

– Fetal doku: amniocentesis

– chorionic villi sampling

– fetal cell sorting

– Erişkin doku: kan ( lenfositler)

– (ağız epiteli)

– dei

– doku

Preparasyon

Boyama

inceleme

Boyama veya bantlama Araştırıcı Yıl

yöntemi

Q-bantlama Caspersson,Zech,Johansson 1970

G-bantlama (tripsin) Seabright 1971

G- bantlama (acetic-saline) Sumner, Evans, Buckland 1971

C-bantlama Arrighi, Hsu 1971

R-bantlama (sıcak ve Giemsa) Dutrillaux, Lejeune 1971

G-11 boyama Bobrow, Madan, Pearson 1972

Antikor bantlama Dev ve ark. 1972

R-bantlama (fluoresans) Bobrow, Madan 1973

In vitro bantlama (aktinomisin D) Shafer 1973

T-bantlama Dutrillaux 1973

Replikasyon bantlama Latt 1973

Gümüş (NOR) boyama Howell, Denton Diamond 1973

Yüksek Ayırıcı bantlama Yunis 1975

DAPI/distamisin A boyama Schweizer, Ambros 1978

Andrle

Restriksiyon endonukleaz bantlama Sahasrabuddhe, Pathak 1978

Hsu

Giemsa bandlama

R Bandlama

Q Bandlama

Q Bandlama

NOR Bandlama

DAPI/Distamisin A

Kromozom painting

CGH

Telomer fish

Sentromer fish

1 Nolu kromozomu boyama

DNA dizi boyama

Kardeş Kromatid değişim testi genellikle insan periferal lenfositlerine uygulanır. G0 fazındaki hücreler, fitohemaglutinin ile bölünmeye teşvik edilir. İkinci mitozun metafazında hücreleri durdurmak ve mitotik hücre toplamak için, iğ ipliklerini inhibe eden kolşemid ilave edilir ( 72. saatte).

İki hücre döngüsü boyunca araşırıcıya kromatidleri ayırma fırsatı veren BrdU (bromo-deoxy-uridine) kültür ortamına eklenir. Sadece bir zincirde DNA BrdU almışsa normal karanlık Giemsa boyaması olur, diğer zincir daha açık renkle boyanır. Eğer değişim gerçekleştiyse, kromatid parça parça açık ve koyu renklerde görülür: "harlequin kromozomları“.

X Kromatini

Y Kromatini