phd presentation final

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Σχέση δομής και λειτουργίας των

ανθρώπινων απολιποπρωτεϊνών:

αποΕ4 και νόσος Alzheimer

ΛΕΤΤΑ ΑΡΓΥΡΗ

ΒΙΟΛΟΓΟΣ, MSc

ΑΘΗΝΑ

ΜΑΡΤΙΟΣ 2016

ΕΘΝΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΕΡΕΥΝΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ

ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ»

ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΩΝ & ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ

3. Συμπεράσματα - Συζήτηση

• Η αποΕ, δομή και ρόλος

• Η νόσος Alzheimer (AD)

• Συσχέτιση αποΕ4 με AD

1. Εισαγωγή

2. Πειραματικά αποτελέσματα

• Ανάπτυξη μιας απλής πειραματικής πορείας έκφρασης και

καθαρισμού της αποΕ4

• Διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο η μετάλλαξη της

αποΕ4 [L28P] οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης της

AD

Η απολιποπρωτεΐνη Ε (αποΕ) = κύρια πρωτεΐνη του συστήματος

μεταφοράς λιπιδίων μέσω λιποπρωτεϊνών, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο

στην αθηροσκλήρωση, τη δυσλιπιδαιμία και τη νόσο Alzheimer

Παράγεται από πολλούς ιστούς. Το ήπαρ = κύρια θέση σύνθεση της

αποΕ του πλάσματος. Ο εγκέφαλος = δεύτερος ιστός σύνθεσής της -

κύρια απολιποπρωτεΐνη του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ)

Η ώριμη αποΕ αποτελείται από 299 κατάλοιπα αμινοξέων

Στον ανθρώπινο πληθυσμό απαντάται σε τρεις κύριες ισομορφές, τις

αποΕ2, αποΕ3 και αποΕ4.

ΑποΕ2

ΑποΕ3

ΑποΕ4

112 158

Cys Cys

Cys Arg

Arg Arg

1 299

Εισαγωγή

H απολιποπρωτεΐνη Ε (αποΕ)

Εισαγωγή

Δευτεροταγής δομή της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης Ε

Δεμάτι 4 α-ελίκων,

έπειτα από κρυσταλογραφική

μελέτη ακτίνων Χ

22 kDa N-τελικό πρωτεολυτικό θραύσμα

10 kDa C-τελικό πρωτεολυτικό θραύσμα

24

42

44 53

Νolte et al. (1992). Biophys.J., 63:1221–39

Dong et al. (1994). J Biol.Chem., 69:22358–65.

Εισαγωγή

Chen et al. (2011). Proc.Natl.Acad Sci., 108:14813–8

NMR δομή της αποΕ3

Εισαγωγή

Ζhong and Weisgraber (2009). J.Biol.Chem., 286:6027-6031

Εξαιτίας της αλληλεπίδρασης των δύο περιοχών της, η δομή της αποΕ4

διαφοροποιείται από τις δομές των αποΕ3 και αποΕ2

Οι διαφορές στη δομή των ισομορφών της αποΕ μπορεί να οδηγούν σε διαφορετική

λειτουργία των ισομορφών

Πολυμορφισμός και δομή της αποΕ

αποΕ3 αποΕ4

Εισαγωγή

Ρόλος της αποΕ στη μεταφορά λιπιδίων στο πλάσμα

ΈΝΤΕΡΟ

Λιποπρωτεϊνική λιπάση,

από C-II

Χυλομικρά Υπολείμματα

χυλομικρών

αποΕ

αποΒ48 LDLr

Λιπίδια προερχόμενα

από την τροφή

Ο πιο μελετημένος ρόλος της αποΕ, όσον αφορά τη μεταφορά των

λιπιδίων στο πλάσμα, είναι η ικανότητά της να προωθεί τη

μεσολαβούμενη από υποδοχέα, εκκαθάριση των υπολειμμάτων των

λιποπρωτεϊνών.

Υπερλιποπρωτεϊναιμία τύπου ΙΙΙ

Πρώιμη ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης

ΉΠΑΡ

Εισαγωγή

Στον εγκέφαλο η αποΕ

συντίθεται και εκκρίνεται

κυρίως από τα αστροκύτταρα,

τη μικρογλοία αλλά και από

τους νευρώνες, κάτω από

συγκεκριμένες συνθήκες

Η αποΕ οδηγεί στο

σχηματισμό λιποπρωτεϊνών

στον εγκέφαλο

Οι λιποπρωτεΐνες που

περιέχουν αποΕ συμμετέχουν

στην ομοιόσταση της

χοληστερόλης στo ΚΝΣ

Αστροκύτταρα

αποΕ

Νευρώνας

Σφαιρικά

σωματίδια

Vitali et al (2014). Card.Res., 103:405-413

Μεταφορά λιπιδίων μέσω αποΕ-λιποπρωτεϊνών στον

εγκέφαλο

Δισκοειδή

σωματίδια

Εισαγωγή

• Συμμετέχει στην ανάπτυξη των νευρώνων

• Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση των νευρώνων-

καταστάσεις τραύματος

• Προωθεί τη δημιουργία συνάψεων και συμβάλλει στη διατήρηση της

πλαστικότητάς τους

• Έχει αντιαποπτωτική και αντιφλεγμονώδη δράση

• Εμπλέκεται στο μεταβολισμό και στην εκκαθάριση του Αβ (β

αμυλοειδές πεπτίδιο) από το ΚΝΣ

• Οι ρόλοι της αποΕ εξαρτώνται από τις ισομορφές της αποΕ

ΑποΕ3-νευροπροστατευτικό ρόλο

ΑποΕ4-εμπλέκεται σε διάφορες νευροεκφυλιστικές παθήσεις

(Alzheimer's Disease, ΑD)

Λειτουργίες της αποΕ στον εγκέφαλο

Εισαγωγή

ε4/4

ε3/4

ε3/3

Ηλικία σε έτη

Κίν

δυ

νο

ς ε

μφ

άνισ

ης Α

D (

%)

Myers R. H. et al (1996). Neurology, 46:673-677

Το 40% των ασθενών φέρει ένα τουλάχιστον αλληλόμορφο ε4.

Μετατοπίζει χαμηλότερα την ηλικία εμφάνισης της νόσου

H αποΕ4 είναι ο σημαντικότερος δείκτης κινδύνου της AD

Είναι μία νευροεκφυλιστική διαταραχή, η οποία χαρακτηρίζεται από την

προοδευτική απώλεια της μνήμης και της σκέψης, σύγχυση, παραισθήσεις

και αδυναμία ανταπόκρισης στις απαιτήσεις της καθημερινής ζωής.

Αφορά περίπου 35 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως, ο αριθμός

αναμένεται να διπλασιαστεί έως το 2030. Αποτελεί την 4η αιτία θανάτου

στις αναπτυγμένες χώρες.

Εισαγωγή

H νόσος Alzheimer (AD)

Ενδορρινικός φλοιός

Ιππόκαμπος

Κοιλίες Εγκεφαλικός φλοιός

Αύλακες Έλικες

Φυσιολογικός με ΑD

Εισαγωγή

Α

Β

Bogdanovic N.(2000). J Cell Mol Med., 4:304–5.

Α. Νευρο-ινιδιακά δεμάτια: Ενδοκυτταρικές εναποθέσεις ζευγαρωμένων,

ελικοειδών ινιδίων που αποτελούνται από υπερφωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη

Tau . Β. Αμυλοειδείς ή νευριτικές πλάκες: Εξωκυτταρικές– αδιάλυτες εναποθέσεις

πολυμερισμένου Αβ.

Νευροπαθολογικές αλλαγές στον

εγκέφαλο των AD ασθενών

Φυσιολογικός με AD

Το Αβ (β-αμυλοειδές

πεπτίδιο4 kDa) προκύπτει

από τη διαδοχική πρωτεόλυση

της APP

Thinakaran G. et al (2008). J.Biol.Chem., 283:29615–9.

Εισαγωγή

H πρόδρομη αμυλοειδής πρωτεΐνη (APP) υφίσταται

πρωτεολυτική αποικοδόμηση από τις α-, β- και γ-εκκριτάσες

Η παραγωγή, ο ολιγομερισμός

και η εναπόθεση του Αβ

διαδραματίζει σημαντικό ρόλο

στην ΑD

Το Αβ42 είναι πιο επιρρεπές στη συσσωμάτωση και συνδέεται ισχυρά με την

παθογένεση της AD

Τα πεπτίδια Αβ μπορεί να

διαφέρουν σε μήκος, οι πιο

συχνές μορφές περιέχουν 38,

40, 42 αμινοξικά κατάλοιπα

(Αβ38, Αβ40, Αβ42)

Το Αβ συσσωρεύεται εσωτερικά στους νευρώνες

Η ενδοκυτταρική συσσώρευση του Αβ προηγείται του

εξωκυτταρικού αμυλοειδούς σχηματισμού

απαρχή των πρώιμων αλλαγών στις νοητικές

διεργασίες

καταρράκτης παθολογικών γεγονότων που οδηγούν

στη δυσλειτουργία των νευρώνων και τελικά στην AD

Η πλειοψηφία του ενδοκυτταρικού Αβ έχει μήκος 42αα

Μεταγενέστερα δεδομένα που προκύπτουν από

μελέτες σε ανθρώπους και πειραματικά μοντέλα ζώων

Το Αβ σχηματίζει εξωκυτταρικά μακριές αδιάλυτες

αμυλοειδείς ίνες που συσσωρεύονται στις

αμυλοειδείς πλάκες των εγκεφάλων ασθενών με ΑD

Εισαγωγή

Υπόθεση του αμυλοειδούς καταρράκτη

Οικογενής ή πρώιμη

μορφή της AD (<65y) Σποραδική ή όψιμη (LOAD)

μορφή της AD (>65y)

απoE4

Μέσω των πλειοτροπικών

δράσεών της συμμετέχει

στα γεγονότα

παθογένεσης της AD

Μεταβάλλουν την

παραγωγή του Αβ

Νευροεκφυλισμός

Εισαγωγή

Η γενετική της AD

APP PSEN1 PSEN2

Διαταράσσει τη δομή

του κυτταροσκελετού

Αριθμό αμυλοειδών

πλακών

Απομάκρυνση του

Αβ από τον

εγκέφαλο μέσω

του ΒΒΒ

Εισαγωγή

Πλειοτροπικές δράσεις της αποΕ4 στην παθογένεση της AD

Διαταράσσει την ομοιόσταση

της χοληστερόλης

Φωσφορυλίωση

της Τau

Σχηματισμός

νευροϊνιδιακών δεματίων

Πρωτεολυτική

ευαισθησία

Δημιουργία

θραυσμάτων

Μιτοχονδριακή

δυσλειτουργία

Ενδοκυτταρική

συσσώρευση

του Αβ

Νευροτοξικότητα

Ο ακριβής μηχανισμός δράσης της αποΕ4 στην παθογένεση της ΑD δεν έχει

διευκρινιστεί

Εισαγωγή

Φυσικά απαντώμενη μετάλλαξη.

Βρέθηκε μετά από γενωμική ανάλυση

σε δείγματα ασθενών (Pittsburgh-US)

με σποραδική μορφή της ΑD (LOAD)

Άτομα ετεροζυγώτες για τη μετάλλαξη

έμφανίζουν μεγαλύτερο κίνδυνο

ανάπτυξης LOAD σε σχέση με άτομα

φορείς της αποΕ4

Η αντικατάσταση της LeuPro

αναμενόμενα επιφέρει αλλαγή στο

ελικοειδές περιεχόμενο της Ν-τελικής

περιοχής της αποΕ4 και η αλλαγή

αυτή μπορεί να επηρεάσει τη δομή και

λειτουργία του μορίου

Η μετάλλαξη αποΕ4 [L28P]

Σκοπός

Σχέση δομής και λειτουργίας των ανθρώπινων απολιποπρωτεϊνών: αποΕ4 και νόσος Alzheimer

Κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο η αποΕ4[L28P] οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο

εμφάνισης AD, αλλά και η χρησιμοποίηση της μετάλλαξης ως εργαλείο για το ρόλο που

διαδραματίζει η αποΕ4 στην ανάπτυξη της νόσου

Έκφραση της αποΕ μέσω βακτηριακών κυττάρων

Η cDNA αλληλουχία της αποΕ φέρεται στον πλασμιδιακό φορέα

κλωνοποίησης pET32a

Η αποΕ εκφράζεται συντηγμένη με ετικέτα ιστιδίνης (His) +

θειορεδοξίνης (Trx)

Απομάκρυνση της ετικέτας Trx-His από την αποΕ Πέψη με

θρομβίνη

Απομόνωση της αποΕ κατόπιν λιπιδίωσης - απολιπιδίωσης

Thrombin

recognition

site

Morrow JA et al (1999) Prot. Express. 16:224–30

Πειραματικός σχεδιασμός

Πρωτόκολλο έκφρασης και καθαρισμού της

ανασυνδυασμένης ανθρώπινης αποΕ

5‘ – AAG GCC CTG GTA CCA CGC GGA TCC AAG GTT GAA – 3' N – Lys Ala Leu Val Pro Arg /Gly Ser Lys Val Glu – C Αλληλουχία αναγνώρισης για θρομβίνη αποE4 5' – AAG GCC CTG GAA GTG TTA TTC CAG GGG CCC GGA TCC AAG GTT GAA – 3' N – Lys Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln/Gly Pro Gly Ser Lys Val Glu – C Αλληλουχία αναγνώρισης για 3C πρωτεάση αποE4

• Η 3C πρωτεάση

έχει πιο υψηλή

ειδικότητα

συγκρινόμενη με

τη θρομβίνη

• Δεν κόβει την

αποΕ σε μη

επιθυμητά σημεία

κοπής

• Επιτρέπει την

απλοποίηση του

πρωτοκόλλου

καθαρισμού

Πειραματικός σχεδιασμός

Νέο πρωτόκολλο έκφρασης αποΕ

3C αποΕ4

BamH I

BamH I

Η τελική ποσότητα πρωτεΐνης που ανακτάται έπειτα από λυοφιλοποίηση και αποδιάταξη/αναδιάταξη ≈ 10mg/Lt αποΕ4 καθαρότητας ≈95%

Ανάλυση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου

δειγμάτων ανασυνδυασμένης αποΕ4 που

παράχθηκαν μέσω διαφορετικών

συστημάτων έκφρασης.

Διαδρομή 1: μοριακός δείκτης

Διαδρομή 2: ανασυνδυασμένη αποΕ4

παραγμένη από κύτταρα θηλαστικών, μέσω

του συστήματος επιμόλυνσης με αδενοϊό

(αποΕ4 adenovirus)

Διαδρομή 3: ανασυνδυασμένη αποΕ4

παραγμένη μέσω του νέου πρωτοκόλλου

βακτηριακής έκφρασης της αποΕ4

(αποΕ4 E.coli)

Πειραματικά αποτελέσματα

Έκφραση και καθαρισμός της αποΕ4

Εύρος τιμών που έχει δημοσιευτεί για το περιεχόμενο α-έλικας της αποΕ4 παραγόμενη είτε από βακτηριακά κύτταρα, είτε από κύτταρα θηλαστικών= 44-71%

Ποσοστό α-έλικας στα 222nm

αποΕ4 (E.coli)

55%

αποΕ4 (adenovirus)

58%

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες της αποΕ4 (E.coli)

Μέτρηση του ποσοστού α-έλικας

αποΕ4 E.coli

αποΕ4 adenovirus

Μήκος κύματος, nm

Βιβλιογραφία:

Tm αποE4 = 45-50 oC

Βιβλιογραφία:

ΔG αποE4 = 8,9 kcal/mol

Tm αποΕ4(E.coli)= 48⁰C Tm αποΕ4(Adenovirus)= 48⁰C

ΔG αποΕ4(Adenovirus)= 8.3 kcal/mol ΔG αποΕ4(E.coli)= 9.1 kcal/mol

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες της αποΕ4 (E.coli)

Προφίλ θερμικής και χημικής αποδιάταξης

Πειραματικά αποτελέσματα-Λειτουργικές ιδότητες της αποΕ4 (E.coli)

Κινητική διαύγασης διαλύματος φωσφολιπιδικών (DMPC)

κυστιδίων

Ανάλυση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου

δειγμάτων αποΕ4 αγρίου τύπου και της

μεταλλαγμένης E4 [L28P], μετά τον

καθαρισμό τους.

Διαδρομή 1: αποΕ4 wt,

διαδρομή 2: αποΕ4 [L28P],

διαδρομή 3: μοριακός δείκτης

Καθαρότητα παραγόμενων πρωτεϊνών ≈ 96%

Η καθαρότητα των δειγμάτων επιβεβαιώθηκε και με ανάλυση MALDI-ΤΟF

Πειραματικά αποτελέσματα

Έκφραση, απομόνωση και καθαρισμός της αποΕ4 αγρίου

τύπου και της μεταλλαγμένης Ε4 [L28P]

Υποδεικνύεται μία πιο εκτεταμένη αποδιάταξη του μορίου στο χώρο

α-ελικότητα222nm

(%)

αποΕ4 wt 53.1 ± 2.2

αποΕ4 [L28P] 43.2 ± 2.1*

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Μέτρηση του ποσοστού α-έλικας

αποE4 [L28P] θερμοδυναμικά

αποσταθεροποιημένη σε σχέση

με την αποΕ4 wt.

Στην αποΕ4 [L28P] παρουσιάζεται

απώλεια της χαρακτηριστικής για το

μόριο της αποΕ ενδιάμεσης

κατάστασης αποδιάταξης =

ανεπαρκής διάταξη του Ν-τελικού

άκρου του μορίου.

Τm (⁰C) Φαινόμενη ΔΗ (Kcal/mol)

αποΕ4 wt 51.8±0.7 27.0 ± 0.5

αποΕ4 [L28P] 48.5± 1.8* 17.9 ± 0.7***

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Προφίλ θερμικής και χημικής αποδιάταξης

Η αποΕ4 [L28P] > σήμα φθορισμού από την αποΕ4 wt

ANS= ιχνηθέτης που συνδέεται σε υδρόφοβες επιφάνειες + εκπέμπει έντονο σήμα φθορισμού

H μετάλλαξη αλλάζει τη διαμόρφωση του μορίου έκθεση

μεγαλύτερης επιφάνειας υδρόφοβων περιοχών στο διαλύτη.

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Μελέτη του υδροφοβικού προφίλ με τη χρήση του ANS

Η αποΕ4 [L28P] διαυγάζει το διάλυμα των DMPC αλλά με πιο αργή

κινητική σε σχέση με την αποΕ4 wt

Δυσκολία του μορίου να υιοθετεί τις απαραίτητες αλλαγές στη

δομή για τη δέσμευση των λιπιδίων

Σταθερά κινητικής αναμόρφωσης

(βραδεία φάση), s-1

αποΕ4 wt 5.9 x 10-4 ± 0.7 x 10-4

αποΕ4 [L28P] 4.2 x 10-4 ± 1.0 x 10-4

Πειραματικά αποτελέσματα-Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Κινητική αναμόρφωσης διαλύματος φωσφολιπιδικών

(DMPC) κυστιδίων

o Μοριακή αναλογία των PC/C-αποΕ4 wt + PC/C-

αποΕ4 [L28P]

egg PC (mol)

Χοληστερόλη (mol)

ΑποE4 (mol)

100 10 1

Πειραματικά αποτελέσματα

Παρασκευή ανασυγκροτημένων λιποπρωτεϊνικών

σωματιδίων που περιέχουν αποΕ4

• Και οι 2 πρωτεΐνες

σχημάτισαν

λιποπρωτεϊνικά σωματίδια

δισκοειδούς μορφής

• Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη

σχηματίζει και δίσκους

μεγαλύτερης διαμέτρου –

όχι καλά σχηματισμένους

Πειραματικά αποτελέσματα

Ανάλυση σχήματος των PC/C-αποΕ4 wt και

PC/C-αποΕ4 [L28P] με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας

α-ελικότητα222nm

(%)

PC/C- αποΕ4 wt 68.2 ± 0.4

PC/C- αποΕ4 [L28P] 67.0 ± 0.5*

Πειραματικά αποτελέσματα- Βιοφυσικές ιδιότητες των PC/C-αποΕ4 [L28P]

Μέτρηση του ποσοστού της α-έλικας-

Προφίλ θερμικής αποδιάταξης

Σε ↓C(0.375μM) αποΕ4=

ΟΧΙ τοξικότητα.

≠

Σε ↑C(1μM) αποΕ4= παρόμοια μείωση

της βιωσιμότητας.

Η PC/C-αποΕ4 [L28P] και στις 2

συγκεντρώσεις μειώνει τη

βιωσιμότητα των κυττάρων σε σχέση

με την PC/C-αποΕ4 wt

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Επίδραση των ελεύθερων λιπιδίων ή PC/C-αποΕ4 wt και

αποE4 [L28P] στη βιωσιμότητα των κυττάρων

SK-N-SH (δοκιμασία ΜΤΤ)

Πειραματικός σχεδιασμός- Αποτελέσματα προηγούμενων μελετών

Μελέτη της ελλειμματικής στο C-τελικό άκρο μορφή της

αποΕ4, αποΕ4 [Δ(166-299)] στην παθογένεση της AD

Η αποΕ4-165 = αντίστοιχο MB (19 kDa) με θραύσματα της αποΕ4 που

απαντώνται στον εγκέφαλο ασθενών με LOAD και που εμφανίζονται στην αρχή της πορείας παθογένεσης της νόσου.

Προηγούμενες μελέτες ανέδειξαν πως:

Η αποΕ4-165

Προωθεί την πρόσληψη του Αβ42 από

τα νευρικά κύτταρα

Ενδοκυτταρική συσσώρευση του Αβ42

Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

Αρχικό γεγονός

στη

παθογένεση

της AD

Dafnis I. et al (2010). J Neurochem.,115:873–84.

STOP

Κύτταρα SK-N-SH ή πρωτογενείς

νευρώνες μυών.

Προσθήκη στο μέσο των κυττάρων 375nΜ των

διαφόρων μορφών της αποΕ4 + 25ng/ml Αβ42.

Επώαση στους 370C για t=24h +απομάκρυνση Αβ42-

επώαση για 24h επιπλέον.

Πειραματική πορεία

Έλεγχος μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας

φθορισμού του ενδοκυτταρικού εντοπισμού του

Αβ42 στα κύτταρα

Πειραματικός σχεδιασμός

Επίδραση της αποΕ4 [L28P] στην πρόσληψη Aβ42 από SK-

N-SH κύτταρα και πρωτογενείς νευρώνες μυών

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Η αποΕ4 [L28P] οδηγεί

στην πρόσληψη του

Aβ42 στα SK-N-SH

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Η PC/C-αποΕ4 [L28P] και η PC/C-αποΕ4 wt

δεν προωθούν την πρόσληψη του Aβ42 στα SK-N-SH

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων μυών

η αποΕ4 [L28P] προωθεί την ενδοκυτταρική πρόσληψη του Aβ42

Οι δραστικές οξυγονούχες ενώσεις (ROS) είναι δείκτες οξειδωτικού stress.

Η επώαση των κυττάρων με αποE4 [L28P] + Aβ42 οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των

ROS

Τα επίπεδα των ROS παραμένουν αυξημένα για τουλάχιστον 24h μετά την πρόσληψη του

Αβ42 από τα κύτταρα.

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Επίδραση της μη λιπιδιωμένης αποΕ4 [L28P]

στο σχηματισμό ROS

στα SK-N-SH παρουσία Αβ42

Ελεύθερη λιπιδίων αποΕ4

Αβ42-24h

Σχ

ετι

κό

ς φ

θο

ρισ

μό

ς D

CF

(%

)

αναφοράς

αναφοράς

αποΕ4 wt

αποΕ4 wt

αποΕ4 [L28P]

αποΕ4 [L28P]

Ελεύθερη λιπιδίων αποΕ4

Αβ42-24+24h

Σχ

ετι

κό

ς φ

θο

ρισ

μό

ς D

CF

(%

)

αναφοράς αποΕ4 wt αποΕ4 [L28P]

αναφοράς αποΕ4 wt αποΕ4 [L28P]

Πειραματικά αποτελέσματα- Λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P]

Η παρατηρούμενη μείωση της βιωσιμότητας στα SK-N-SH παρουσία

λιπιδιωμένης αποΕ4 [L28P] σχετίζεται με τη δημιουργία ROS

Επίδραση της λιπιδιωμένης αποΕ4 [L28P]

στο σχηματισμό ROS

στα SK-N-SH απουσία Αβ42

αναφοράς αποΕ4 wt αποΕ4 [L28P]

PC/C αποΕ4

Σχ

ετι

κό

ς φ

θο

ρισ

μό

ς D

CF

(%

)

αναφοράς αποΕ4 wt αποΕ4 [L28P]

Γρήγορο & Απλό

Χαμηλό κόστος

Εύκολο για άτομα με μικρή εμπειρία στη βιοχημεία των απολιποπρωτεϊνών

Υψηλές αποδόσεις στην παραγωγή καθαρής αποΕ4 (10 mg/Lt)

Ισομορφές της αποΕ και μεταλλαγμένες μορφές τους παράγονται με αντίστοιχη απόδοση

Παραγόμενη αποΕ = δομικά και λειτουργικά ορθή.

Συμπεράσματα – Συζήτηση Πλεονεκτήματα νέου πρωτοκόλλου έκφρασης & καθαρισμού

της αποΕ4

Συμπεράσματα – Συζήτηση

Η ελεύθερη λιπιδίων μεταλλαγμένη αποΕ4 [L28P] έχει:

Μειωμένο περιεχόμενο σε α-έλικα

Είναι θερμοδυναμικά αποσταθεροποιημένη

Εκθέτει σε μεγαλύτερο ποσοστό υδρόφοβες επιφάνειες στο διαλύτη

Τα PC/C-αποE4 [L28P] περιέχουν:

Δομικά ελαττωματικούς πληθυσμούς λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων

Ανάλυση της δομής

της μεταλλαγμένης αποΕ4 [L28P]

Συμπεράσματα – Συζήτηση

Η αποΕ4 [L28P]:

Προωθεί την κυτταρική πρόσληψη του εξωκυτταρικά χορηγούμενου Αβ42 σε SK-N-SH κύτταρα και σε πρωτογενή καλλιέργεια νευρώνων μυών

Αυξάνει το σχηματισμό ROS σε SK-N-SH κύτταρα και τα επίπεδα αυτών παραμένουν αυξημένα 24h μετά την απομάκρυνση του Αβ42

Η PC/C-αποΕ4 [L28P]:

Προωθεί το σχηματισμό των ROS και μειώνει σημαντικά τη βιωσιμότητα των SK-N-SH κυττάρων

Τα ευρήματα σχετίζονται με τα πρώιμα γεγονότα της παθογένεσης της LOAD

Ανάλυση λειτουργίας της αποΕ4 [L28P]

Συμπεράσματα – Συζήτηση

Η μεταλλαγμένη αποΕ4 [L28P] έχει παρόμοια λειτουργία με το θραύσμα της αποΕ4 [Δ(166-299)], που έχει αντίστοιχο MB με φυσικά απαντώμενα θραύσματα της αποΕ4 στον εγκέφαλο, και εμφανίζεται στην αρχή της πορείας παθογένεσης της LOAD.

Οι κοινές λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4 [L28P] και του θραύσματος ενισχύουν τη θεωρία, ότι η ενδοκυττάρωση του Αβ από τα νευρικά κύτταρα αποτελεί αρχικό γεγονός στην πορεία παθογένεσης της LOAD

Η δομή της αποΕ4 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της AD

Η ανάλυση της σχέσης δομής-λειτουργίας καλύτερη κατανόηση του ρόλου της αποΕ4 + μηχανισμό παθογένειας της νόσου

Δημοσιεύσεις:

• Letta Argyri, Ioannis Dafnis, Theodossis A. Theodossiou, Donald Gantz, Efstratios Stratikos and Angeliki Chroni. Molecular basis for increased risk for late-onset Alzheimer’s disease due to the naturally occurring Leu28Pro mutation in apolipoprotein E4. J Biol Chem. 2014 May 2;289(18):12931-45.

• Letta Argyri, Vassiliki Skamnaki, Efstratios Stratikos and Angeliki Chroni. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification (2011),Oct;79(2): 251-7.

Συμπεράσματα

Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή

Μαίρη Μαυρή Βαβαγιάννη,

Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα

Χημείας, ΕΚΠΑ

• Ντία Γαλανοπούλου, Καθηγήτρια,

Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ

• Αγγελική Χρόνη, Ερευνήτρια Α’,

Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και

Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»

• Σπύρος Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής,

Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

• Θωμάς Μαυρομούστακος, Καθηγητής,

Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ

• Βικτώρια Μαγκριώτη, Επίκουρη

Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ

• Βασιλική Οικονομίδου, Επίκουρη

Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

Ευχαριστίες

ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ

Ευστράτιος Στρατίκο, Ερευνητής Α’,

ΙΠΡΕΤΕΑ, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»

(Βιοφυσικές δοκιμασίες)

Συνεργάτες-Εργαστηριακή Ομάδα

Δρ. Ιωάννη Δάφνη (πρωτογενείς

καλλιέργειες νευρώνων μυών)

Δρ. Γεώργιο Δανιήλ

Υποψ.διδάκτωρ Κρίστυ Γκολφινοπούλου

Δρ. Φαίη Σούκου

Δρ. Αγγελική Παναγιωτοπούλου (CD)

Δρ. Μαρίνα Σαγνού, Δρ. Θεοδόση

Θεοδοσσίου (Confocal)

Dr. D. Gantz (electron microscopy images)

Τμήμα Φυσιολογίας και Βιοφυσικής,

Πανεπιστήμιο της Βοστώνης

ΙIBEAA (MALDI-TOF ανάλυση)

• Δρ. Αντωνία Βλάχου

• Δρ. Μανούσο Μακριδάκη

Ο σχηματισμός των ROS

εξαρτάται από την πρόσληψη του

Aβ42

1 Εισαγωγή

1.3 Συσχέτιση ΑποΕ4 με AD

1.1 Η αποΕ, δομή και ρόλος 1.2 Η νόσος του Alzheimer (AD)

Υπόθεση του αμυλοειδούς καταρράκτη