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Sistemas de modificación celularSistemas de modificación celularSistemas de modificación celularSistemas de modificación celular

• IntroducciónIntroducción• Genes marcadoresGenes marcadores• Técnicas de introducción de ADN en las células animales en Técnicas de introducción de ADN en las células animales en

cultivocultivo TransfecciónTransfección

Métodos químicosMétodos químicos Métodos físicosMétodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estableEstablecimiento de líneas de expresión estable

Transducción: vectores viralesTransducción: vectores virales AdenovirusAdenovirus Retrovirus y LentivirusRetrovirus y Lentivirus

• Métodos de introducción de proteínasMétodos de introducción de proteínas

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Manipulación del cultivo celular para la modificación Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes.de la expresión y/o función de los genes.

Ácidos nucleicosÁcidos nucleicos ADN: construcciones con la secuencia codificante

del gen de interés,… ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o

antisense)

Proteínas:Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo)

Anticuerpos:Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína

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¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula?célula?

Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica)

Caracterizar la función de la proteína de interés

Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada)

Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador)

Obtener proteína recombinanteproteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero

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Condiciones ideales de introducción del ADNCondiciones ideales de introducción del ADN

El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente

Eficiencia máxima Toxicidad nula

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Estrategias de introducción de ADNEstrategias de introducción de ADN

Transfección:Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos Vector: plásmido de expresión

Transducción o infección:Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales Vector: material genético del virus

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Transfección: vectorTransfección: vector

Componentes de un plásmido de expresión deComponentes de un plásmido de expresión decélulas de mamífero:células de mamífero:

1. Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN

2. Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido

1. Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva)

2. Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés)

3. Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero)4. Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que

han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina).

Amplificación del vector en

bacterias

Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables

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Vector de expresión para células de mamíferoVector de expresión para células de mamífero

MCS:MCS: multi cloning site

Para amplificacióny selección en bacterias

PromotorPromotor Seq. de poliadenilación

Promotor

Gen de Gen de resistencia a la resistencia a la neomicinaneomicina(selección en céls. mamífero)(selección en céls. mamífero)

Seq. de poliadenilación

http://www.invitrogen.com

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Permiten:Permiten:Controlar la eficiencia de entrada del ADNEstudiar la regulación de la expresión de un genMonitorizar la localización subcelular de la proteína

Genes marcadores o “reporter”Genes marcadores o “reporter”

Aplicaciones:Aplicaciones:Normalización de los ensayos de expresiónSeguimiento de una proteína marcada con un gen reporterOptimización de la metodología de introducción del ADN

Codifican para proteínas de fácil detecciónCodifican para proteínas de fácil detección

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Genes “reporter” más comunesGenes “reporter” más comunes

Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)

Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía.

Luciferasa (luc)

Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro.

-galactosidasa (-gal or lacZ)

Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan.

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Green fluorescent protein (GFP)

El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo.

La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria.

La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto.

En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales

AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1.

Nuevas proteínas fluorescentes disponibles:

Genes “reporter” más comunesGenes “reporter” más comunes

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Métodos de TransfecciónMétodos de Transfección

1.1. Métodos químicos:Métodos químicos:

Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o “carrier”)

2.2. Métodos físicos:Métodos físicos:

Introducción del ADN de forma directa

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Métodos de TransfecciónMétodos de Transfección

1.1. Métodos químicos:Métodos químicos: Coprecipitación con fosfato cálcico DEAE-dextrano Lípidos catiónicos Polyethylenimine (PEI)

2.2. Métodos físicos:Métodos físicos: Electroporación Microinyección “Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun” Magnetofección

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La eficienciaeficiencia de transfección depende de la superación de varias

barreras:

1) adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y

entrada del complejo en la célula (membrana plasmática)

2) liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación

lisosomal

3) translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el

núcleo

Barreras que tiene que superar el ADNBarreras que tiene que superar el ADN

http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html

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1.1. Métodos químicosMétodos químicos

Coprecipitación con fosfato cálcico:

precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

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1. Métodos químicos1. Métodos químicos

DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano): complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol

Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

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1. Métodos químicos1. Métodos químicos

Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas

Este método recibe el nombre de LipofecciónLipofección

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Protocolo de Lipofección

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1. Métodos químicos1. Métodos químicos

Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares

Gen marcador: -galactosidasa

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1. Métodos químicos1. Métodos químicos

PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

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1. Métodos químicos1. Métodos químicos

PEI Lípidos catiónicos

Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293

Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

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DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent

1. Métodos químicos1. Métodos químicos

Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares

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Factores que pueden influir en la eficiencia de Factores que pueden influir en la eficiencia de TransfecciónTransfección

Presencia de antibióticosPresencia de antibióticos El complejo puede interaccionar con el antibiótico

disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad

Presencia de sueroPresencia de suero El suero puede disminuir la eficiencia de transfección Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más

tóxico para las células

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2. Métodos físicos2. Métodos físicos

Microinyección:Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula

Biolístico (biological ballistics):Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio.

Electroporación:Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular

Magnetofección: Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células

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MicroinyecciónMicroinyección

Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio.

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MicroinyecciónMicroinyección

Limitaciones

Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados)

Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo)

Seguimiento individual de cada célula microinyectada

Aplicaciones más corrientes:

Microinyección de células adherentes en cultivo

Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto)

Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

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Biolistic particle deliveryBiolistic particle delivery

Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN.

Helios Gene Gun - BioRad

Aplicaciones:Aplicaciones:Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales

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ElectroporaciónElectroporación

Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática.

Ventajas:Ventajas:• Técnica simple, reproducible y de gran eficacia

Desventajas:Desventajas:• Requiere desenganchar las células del sustrato• Mucha mortalidad celular • Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular

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ElectroporaciónElectroporación

Parámetros:Parámetros: Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm) Longitud del pulso (de seg a mseg)

Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60%

En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo.

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MagnetofecciónMagnetofecciónMATra - Magnet Assisted TransfectionMATra - Magnet Assisted Transfection

Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.

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Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula. Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000).

Tipos de transfecciónTipos de transfección

http://www.promega.com/guides/transfxn_guide/transfxn.pdf

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Ventajas Elevado nivel de expresión Es fácil co-expresar varias proteínas Procedimiento fácil y rápido

Ventajas Población celular homogénea (clonal) Producción continua de proteína (teóricamente) Almacenamiento de células expresoras del transgen

Transfección transitoria vs. Transfección estable Transfección transitoria vs. Transfección estable Transfección transitoria

Transfección estable

Inconvenientes Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea) Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal) Requiere gran cantidad de plásmido

Inconvenientes Integración del transgen al azar en el genoma celular Niveles de expresión moderados Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

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1/10000 céls.

Colonias de células estables Se tripsinizan individualementeSe cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen

Transfección

Adición antibiótico

1 mes

2 días

1-2 semanas

Muerte masiva células no estables

2 semanas

2 meses

Clones estables: procedimiento de obtenciónClones estables: procedimiento de obtención

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Sin selección

muerte de células no expresoras

crecimiento de los clones estables

Cassettes de resistencia:NEO: Selección con G418 (0.1-1.0 mg/ml)HYG: Selección con Higromicina-B (10-300 mg/ml)PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml)

Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica

Clones estables: selección con antibióticoClones estables: selección con antibiótico

Con selección

aparición de clones resistentes

Tema 9.Tema 9.Sistemas de modificación celularSistemas de modificación celularTema 9.Tema 9.Sistemas de modificación celularSistemas de modificación celular

• IntroducciónIntroducción• Genes marcadoresGenes marcadores• Técnicas de introducción de ADN en las células animales en Técnicas de introducción de ADN en las células animales en

cultivocultivo TransfecciónTransfección

Métodos químicosMétodos químicos Métodos físicosMétodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estableEstablecimiento de líneas de expresión estable

Transducción: vectores viralesTransducción: vectores virales AdenovirusAdenovirus Retrovirus y LentivirusRetrovirus y Lentivirus

• Métodos de introducción de proteínasMétodos de introducción de proteínas

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Transducción: vectores viralesTransducción: vectores virales

AdenovirusAdenovirus

RetrovirusRetrovirus

LentivirusLentivirus

Herpes virusHerpes virus

Adeno-associated virusAdeno-associated virus

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común)

Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5’ (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb

Simetria icosahédrica (80-100 nm diámetro)

Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

Ciclo del AdenovirusCiclo del Adenovirus

Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibraEndocitosis del virusSale del endosoma y transloca al núcleoEl ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripciónLa transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

Genoma del AdenovirusGenoma del Adenovirus

Se transcriben las dos cadenas de ADN

Transcripción en dos fases: Early:Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN)Late:Late: (después de la replicación del ADN)

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

Vector AdenoviralVector Adenoviral

Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped).El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X)Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

VentajasVentajasInfectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficienciaInfectan tanto células en división como células que no se replicanElevados niveles de expresión de la proteínaSe pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica)El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico)Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala)Sistema homólogo para genes humanos

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Vectores virales: AdenovirusVectores virales: Adenovirus

InconvenientesInconvenientesLimitación en el tamaño del inserto (7-8 kb)Expresión transitoria de la proteína

AplicacionesAplicacionesTransducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínasObtención de proteína recombinante por sobre-expresión en células humanasTerapia génica “in vivo”

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Oncoretrovirus (retrovirus)

ej. Moloney Murine Leukemia Virus

Sólo infectan células en división

Lentivirus

ej. HIV

Infectan tanto células en división como quiescentes

RetrovirusRetrovirus

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA)

Codifica por una transcriptasa reversa (RTase:RTase: RNA-dependent DNA polymerase)

Sólo infecta a células en división

Se integra en el genoma de la célula

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Ciclo del retrovirusCiclo del retrovirusInfección célula diana

Genoma RNA copia DNA transporte al núcleo

Integración del ADN al cromosoma

Transcripción DNA viral mRNA

Traducción mRNA gag, pol, env

Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase

Partículas virales liberadas

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Construcción Vector Retroviral

¿Qué es imprescindible? 5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA) señal de empaquetamiento

No se necesita: gag, pol, env

estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada

para la producción de los viriones

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Promotor

Gag- proteínas estructurales internas de la cápsidePol- Rtase, integrasa, proteasaEnv- proteínas de la cápside

Genoma retroviral Vector retroviral

Promotor

Tamaño máximo del inserto 8kb

Construcción Vector Retroviral

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Obtención de los Retrovirus

Línea celular empaquetadora Producción de los retrovirus

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Vectores virales: RetrovirusVectores virales: Retrovirus

Ventajas:Ventajas:Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma)Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos)

Inconvenientes:Inconvenientes:Limitación tamaño inserto ( 8 kb)Dificultad de producción a gran escala de los retrovirusNo infecta células que no se repliquenLa inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercional

Aplicaciones:Aplicaciones:Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estableTerapia génica “ex vivo”

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LentivirusLentivirus

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Métodos de transfección de péptidos, Métodos de transfección de péptidos, proteínas o anticuerpos proteínas o anticuerpos

Microinyección

Electroporación

Lípidos catiónicos BioPorter® (Genlantis) Pro-Ject (Pierce)

“Carriers” de composición desconocida: Chariot (Active Motif) ProteoJuice (Novagen) TransPass™ P (New England Biolabs) BioTrek™ Protein Delivery Reagent (Stratagene)

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AplicacionesAplicaciones

Estudiar la función de la proteína introducida

Inhibir la actividad de una proteína celular endógena

Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida

Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas

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BioPORTER Reagent

www.genetherapysystems.com

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Pro-Ject Protein Transfection Reagent Pro-Ject Protein Transfection Reagent

http://www.piercenet.com/

Efficient protein delivery in hours instead of days.

This is a unique cationic lipid mixture which, when complexed with proteins or peptides, allows direct intracellular delivery of proteins, peptides, antibodies and other biologically active molecules. Pro-Ject Protein Complexes attach to negatively charged cell surfaces and either can directly fuse with the membrane and deliver the captured protein into the cell or be endocytosed by the cell and then fuse with the endosome, releasing the captured protein into the cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is noncovalent it does not interfere with the protein's biological activity.

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Chariot™Chariot™simple, efficient protein deliveryChariot™* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports

biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical

delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be

assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing.

This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory

proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives

& transient complementation.

The Chariot™ Advantage•Works in a variety of cell lines•Facilitates functional studies in living cells — no fixing required •Works in vivo (1) •Fast and efficient — 60-95% transfection in less than 2 hours •No need for expression of fusion proteins •Non-cytotoxic, serum independent