bahan dan metode - repository.ipb.ac.id · pengikatan dan pemangkasan tanaman mulai diikat pada...
TRANSCRIPT
9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan sejak Februari 2011 sampai Agustus 2011.
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Institut Pertanian Bogor di Cikabayan,
Dramaga dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman,
Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Survei dan Identifikasi Virus yang Menginfeksi Mentimun
Pengambilan Sampel Sampel berasal dari pertanaman mentimun milik petani di desa Situgede,
Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor. Daun mentimun yang dikumpulkan
sebagai sampel adalah daun yang menunjukkan gejala terserang virus. Sampel
daun dibedakan berdasarkan tipe gejalanya yaitu bintik kuning, mosaik kuning,
mosaik hijau, mosaik hijau-kuning, mosaik hijau keriting, mosaik kuning-hijau-
keriting, dan keriting.
Deteksi Virus pada Sampel Daun dari Lapangan
Infeksi virus diidentifikasi dengan metode ELISA tidak langsung (indirect
ELISA) dengan menggunakan beberapa antiserum yaitu antiserum untuk CMV,
ZYMV, SqMV, WMV, dan TRSV. Penggunaan beberapa jenis antiserum
tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis-jenis virus yang menyerang tanaman
mentimun di lapangan. Pengujian ini juga untuk menentukan isolat SqMV yang
akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.
Perbanyakan Inokulum SqMV
Inokulum SqMV diperbanyak pada tanaman mentimun dengan cara
penularan mekanis. Isolat SqMV diperoleh dari sampel daun yang positif
terinfeksi SqMV dan memiliki titer virus paling tinggi. Cairan perasan tanaman
(sap) ditularkan pada tanaman mentimun yang berumur tujuh hari setelah tanam.
10 Sap tanaman dipersiapkan dengan menggerus sebanyak 0.2 g daun dalam bufer
fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi dilakukan pada kotiledon
tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600 mesh) dengan cara
mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon dengan menggunakan
jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan aquades mengalir (Bos
1990). Tanaman yang telah diinokulasi dipelihara dan diamati gejala yang timbul.
Setelah empat belas hari, daun yang menunjukkan gejala dipanen dan diawetkan
menggunakan nitrogen cair lalu disimpan pada suhu -80 0C.
Penanaman dan Pemeliharaan Tanaman Mentimun
Penanaman Benih
Media tanam disiapkan yaitu berupa campuran tanah dan pupuk kandang
(1:1) yang telah disterilkan dengan mengunakan otoklaf. Polybag berukuran 35
cm x 35 cm diisi dengan media sebanyak tiga per empat bagian. Benih mentimun
yang akan ditanam terlebih dahulu direndam dalam fungisida selama 1 jam lalu
ditiriskan. Benih lalu ditanam pada polibag yang telah disiapkan dalam kondisi
basah. Benih ditanam pada kedalaman 3 cm dengan letak calon akar (bagian yang
runcing) berada di bagian bawah.
Benih mentimun yang digunakan berasal dari toko pertanian, terdiri dari
lima varietas yaitu Vario F1, Calista F1, Venus, Yupiter, dan Japan file.
Penggunaan varietas-varietas tersebut didasarkan pada varietas yang banyak
digunakan oleh petani, mudah diperoleh, dan banyak dikonsumsi masyarakat.
Pemupukan dan Penyiraman
Pupuk NPK 15:15:15 diberikan dua tahap. Tahap pertama diberikan 1
minggu setelah inokulasi. Pemupukan tahap kedua diberikan ketika tanaman
memulai masa generatif yaitu ketika terjadi pemunculan bunga pertama. Pada
masa pengisian buah, tanaman disemprot dengan pupuk Gandasil B. Penyiraman
dilakukan setiap pagi hari. Air diberikan pada tanaman di dalam polibag sehingga
air tidak dapat tersimpan. Penyiraman harus diberikan sesuai kebutuhan tanaman
dan memenuhi standar waktu, cara, dan jumlah yang tepat.
11 Pengikatan dan Pemangkasan
Tanaman mulai diikat pada umur 2 minggu setelah tanam (MST). Batang
mentimun diikat pada tali sehingga tanaman dapat merambat (Gambar 2a).
Pemangkasan dilakukan terhadap wiwilan (kuncup daun yang hanya
menghasilkan daun). Cabang anakan diatur agar tidak mengganggu tanaman di
dekatnya, caranya adalah dengan memangkas bagian pucuk cabang anakan
sehingga pertumbuhan diarahkan pada pembesaran buah.
Pemanenan
Mentimun yang ditanam dapat berbuah pada usia 32 sampai 50 hari
tergantung varietas (Lampiran 1). Buah yang dipanen untuk kepentingan
konsumsi adalah buah yang telah matang penuh ditandai dengan warna hijau yang
seragam (Gambar 2b). Pemetikan dapat dilakukan dengan memotong sebagian
tangkai atas. Pemetikan dapat dilakukan dengan bantuan gunting atau pisau
sehingga bidang potong rata dan beraturan. Pemetikan dapat dilakukan setiap hari,
karena proses pematangan buah berlangsung 7 sampai 10 hari setelah bunga
mekar. Buah yang dipanen dengan kepentingan sebagai benih adalah buah
mentimun yang tua, ditandai dengan warna kulit buah sudah putih atau kuning
tergantung varietas.
Gambar 2 Tanaman merambat pada tali yang disediakan (a) ; Buah mentimun siap
panen (b)
b a
12
Jumlah tanaman terserang
Jumlah tanaman
Inokulasi SqMV pada Lima Varietas Mentimun
Inokulasi dilakukan pada tanaman berusia 7 hari setelah tanam. Sumber
inokulum adalah daun sampel tanaman yang telah diuji dan positif terinfeksi
SqMV. Tahapan inokulasi diawali dengan persiapan sap tanaman. Sebanyak 0.2 g
daun digerus dalam bufer fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi
dilakukan pada kotiledon tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600
mesh) dengan cara mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon
dengan menggunakan jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan
aquades mengalir (Bos 1990). Tahapan inokulasi dilakukan terhadap lima
varietas tanaman. Jumlah tanaman yang diinokulasi adalah 10 tanaman untuk
setiap varietas.
Pengamatan dilakukan terhadap masa inkubasi dan kejadian penyakit. Masa
inkubasi adalah waktu gejala pertama kali muncul setelah tanaman diinokulasi.
Kejadian penyakit untuk setiap varietas dihitung dengan menggunakan rumus
sebagai berikut:
% kejadian penyakit = x 100%
Pengamatan terhadap perkembangan penyakit mosaik dilakukan dengan
mengamati perkembangan gejala yang muncul dan pengukuran titer virus pada
masa vegetatif, masa berbunga, dan masa berbuah. Pengukuran titer virus
dilakukan dengan metode indirect-ELISA.
Deteksi SqMV Terbawa Benih
SqMV dilaporkan sebagai patogen terbawa benih. Pada penelitian ini
dilakukan pengujian untuk mengetahui jumlah benih yang membawa SqMV.
Pengujian terhadap benih dibedakan menjadi dua bagian yaitu pengujian terhadap
benih yang dibeli dari toko pertanian (F1) dan pengujian terhadap benih dari
tanaman percobaan di rumah kaca (F2). Benih diuji dengan metode growing-on
test yaitu benih ditumbuhkan pada media tanam di tempat pembibitan hingga
berusia 7 hari setelah tanam (Gambar 3). Bagian tanaman (bibit) yang digunakan
untuk pengujian adalah daun pertama yang muncul.
13
Jumlah benih terinfeksi
Jumlah benih yang ditanaman
Total benih yang diuji untuk setiap varietas mentimun berjumlah 30 benih.
Deteksi SqMV dilakukan dengan metode DIBA (Dot Immunobinding Assay).
Persentase virus terbawa benih dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% virus terbawa benih = x 100%
Gambar 3 Benih ditanam pada baki persemaian (growing on test)
Metode Indirect-ELISA
Metode ELISA tidak langsung dilakukan berdasarkan prosedur umum
Indirect ELISA (Agdia Inc, Indiana USA). Teknik deteksi diawali dengan tahapan
persiapan antigen. Antigen disiapkan dengan menggerus 0.2 g daun mentimun
dalam plastik tebal dan ditambah GEB (General Extract Buffer) pH 7.4.
Perbandingan daun dengan GEB adalah 1:10 (b/v). Sebanyak 100 µl antigen
diisikan pada sumuran plat mikrotiter, kemudian diinkubasi semalaman pada suhu
4 0C. Setelah inkubasi, cairan dalam plat mikrotiter dibuang dan diisi dengan 100
µl bloking solution yaitu skim milk 2%. Penggunaan bloking solution berfungsi
untuk menutupi bagian sumuran yang tidak berikatan dengan antigen virus. Plat
mikrotiter lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0C kemudian dicuci
menggunakan 200 µl PBST (phosphate buffer saline tween-20) sebanyak lima
kali.
Tahap deteksi selanjutnya adalah menyiapkan antiserum SqMV yaitu
dengan mengencerkan antiserum SqMV dalam conjugate buffer dengan
perbandingan 1:200. Sebanyak 100 µl antiserum diisikan ke dalam setiap
sumuran plat mikrotiter lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 0C. Plat
mikrotiter dicuci kembali dengan PBST sebanyak lima kali. Masing-masing
14 sumuran lalu diisi dengan 100 µl campuran antibodi kedua (goat anti rabbit-IgG,
Agdia). Antibodi ini telah dilabel dengan phosphatase dan diencerkan dalam
conjugate buffer dengan perbandingan 1:5000. Plat mikrotiter diinkubasi kembali
selama 2 jam pada suhu 37 0C lalu dicuci dengan PBST.
Tahap deteksi selanjutnya adalah mengisi plat mikrotiter dengan 100 µl
substrat PNP (paranitrophenyl phosphate) dan diinkubasi selama 30 sampai 60
menit pada suhu ruang. Apabila warna berubah kuning, maka reaksi segera
dihentikan dengan 50 µl NaOH 3 M. Hasil ELISA diukur dengan menggunakan
ELISA reader (Bio-rad model 550 microplate reader) pada panjang gelombang
405 nm. Hasil ELISA dinyatakan positif jika nilai absorbans sampel yang diuji 2
kali lebih besar dari nilai kontrol negatif tanaman sehat (Matthews 1993).
Metode DIBA (Dot Immunobinding Assay)
Metode DIBA dilakukan berdasarkan Mahmood et al. 1997 dalam Opriana
2009. Membran nitroselulosa (HybondTM –P, Amersham Bioscience UK)
sebelum digunakan direndam dalam metanol 100% selama 10 detik dan dikering
anginkan. Jaringan daun tanaman yang diduga terinfeksi SqMV digerus dalam
tris buffer saline (TBS) dengan perbandingan 1:10 (b/v) (TBS: Tris-HCl 0.02 M
dan NaCl 0.15 M, pH 7.5). Cairan perasan tanaman tersebut selanjutnya
diteteskan ke atas membran nitroselulosa sebanyak 10 µl. Setelah tetesan sampel
kering, membran direndam di dalam 10 ml larutan blocking non fat milk 2%
dalam TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2%.
Membran kemudian diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang dengan
kecepatan 50 rpm selama 2 jam dengan menggunakan shaker (EYELA multi
shaker MMS). Membran kemudian dicuci 5 kali dengan dH2O, tiap pencucian
berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran
selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung antibodi SqMV 5 µl
ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran
diinkubasi semalam pada suhu kamar sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm.
Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan Tween 0,05% dalam TBS
(TBST). Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung
15 konjugat 5 µl (goat anti rabbit-IgG, Agdia) ditambah non fat milk dengan
konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi selama 60 menit sambil
digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran selanjutnya dicuci kembali dengan
TBST, kemudian membran direndam selama 5 menit dalam substrate buffer
(Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M dan MgCl 5 mM) yang mengandung nitro blue
tetrazolium (NBT) 66 µl dan bromo chloro indolit phosphate (BCIP) 30 µl. Bila
reaksi positif akan terjadi perubahan warna putih menjadi ungu pada membran
nitroselulosa yang telah ditetesi cairan perasan tanaman dan reaksi dapat
dihentikan dengan merendam membran dengan dH2O.