ALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETAS

AGRONOMIJOS FAKULTETAS

Biologijos ir augalų biotechnologijos institutas

Rūta Sapožnikovienė

BEGONIJOS MIKRODAUGINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Studijų sritis: Technologijų mokslai

Studijų kryptis: Biotechnologija

Studijų programa: Agrobiotechnologija

Akademija, 2015

2

Magistro baigiamojo darbo valstybinė kvalifikacinė komisija:

(Patvirtinta Rektoriaus įsakymu Nr. 131–PA)

Agronomijos fakulteto studentų baigiamųjų darbų vertinimo komisijos įvertinimas:

....................................

Pirmininkas: Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Sodo augalų genetikos ir

biotechnologijos skyriaus vedėjas profesorius habil. dr. Vidmantas Stanys (mokslininkas-

praktikas)

Nariai:

Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Augalų fiziologijos laboratorijos vedėjas

profesorius habil. dr. Pavelas Duchovskis (mokslininkas-praktikas)

Agronomijos fakulteto prodekanas, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentas

dr. Aurimas Krasauskas (mokslininkas)

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto direktorė, profesorė dr. Natalija Burbulis

(mokslininkas)

Agronomijos fakulteto prodekanė, Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr.

Liuda Žilėnaitė (mokslininkas)

UAB „Euromediena“ direktorius Mindaugas Šilinskas (socialinis partneris-praktikas)

Vadovė

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto docentė dr. Aušra Blinstrubienė

Recenzentė

Biologijos ir augalų biotechnologijos instituto lektorė dr. Vaida Jonytienė

Oponentas

Žemės ūkio ir maisto mokslų instituto docentas dr. Romas Ruibys

3

Sapožnikovienė, R. Begonijos mikrodauginimas. Agrobiotechnologijos studijų programos

magistro darbas / Vadovė dr. A. Blinstrubienė; ASU. Akademija, 2015, 45 p.: 16 pav., 1

lentelė. Bibliogr.: 94 pavad.

SANTRAUKA

Magistrantūros studijų baigiamajame darbe pateikiama 2014–2015 metais Aleksandro

Stulginskio universiteto Agrobiotechnologijos laboratorijoje tirtų veiksnių, lemiančių

begonijos mikrodauginimą in vitro kultūroje, tyrimų rezultatai.

Darbo objektas – begonijos lapo segmentai auginti MS terpėje su skirtingais augimo

reguliatorių deriniais ir jų kiekiais.

Darbo metodai: begonijos organogenezei izoliuotų audinių kultūroje tirti naudoti lapų

segmentų eksplantai. Iš donorinių augalų paimti lapai 15 min. plauti po tekančiu vandeniu,

sterilinti 3 min. 10 % natrio hipochlorito tirpale, 1 min. – 70% etanolio vandeniniame tirpale,

3 kartus po 5 min. plauti steriliame distiliuotame vandenyje. Sterilūs lapai supjaustyti į 8–10

mm segmentus ir perkelti į Petri lėkšteles su Murashige ir Skoog (MS) terpe, kuri buvo

papildyta skirtingais augimo reguliatorių kiekiais. Terpės pH – 5,7 ± 0,1. Sterili lapo

segmentų kultūra auginta auginimo kambaryje, esant 50 µmol m-2

s-1

šviesos intensyvumui,

16/8 h (dieną/naktį) fotoperiodui, 22 ± 2oC temperatūrai ir 75% drėgniui.

Darbo rezultatai. Įvertinus begonijos izoliuotų lapo segmentų kultūros tyrimo

rezultatus nustatyta, kad eksplantai pridėtinius ūglius maitinamojoje terpėje be augimo

reguliatorių formavo nedideliu dažniu. Tirti citokininų bei citokininų ir auksino deriniai

maitinamojoje terpėje esmingai skatino begonijos ‘Pink Pride’ ir ‘Her Mejesty’ ūglių

formavimąsi in vitro. Siekiant indukuoti begonijos ‘Pink Pride’ organogenezę in vitro

tikslingiausia maitinamąją terpę papildyti 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR deriniais, o ‘Her Mejesty’ mg 1-1

NAR deriniais, o ‘Her Majesty’ −

2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR deriniais.

Intensyviausiai mikroūglių rizogenezė vyko maitinamojoje terpėje, papildytoje 0,1 mg l-1

NAR arba 0,1 mg l-1

ISR.

Raktažodžiai: augimo reguliatoriai, begonija, eksplantas, organogenezė, rizogenezė.

4

Sapožnikovienė, R. Micropropagation of begonia. Master thesis of Agrobiotechnology

study program / Supervisor dr. A. Blinstrubienė; ASU. Akademija, 2015, 45 p.: 16 pav., 1

lentelė. Bibliogr.: 94 pavad.

SUMMARY

The master work presents the results of factors affecting micropropagation of begonia.

Research was investigated at the Laboratory of Agrobiotechnology in 2014–2015.

Object of the work – leaf segments grown in MS medium with different growth

regulators combinations and concentrations.

Methods of the work – fot the isolated tissue culture research of begonia organogenesis

werw used leaf segment explants. Leafs of donor plant were washed under running water for

15 min. and sterilized with 10% sodium hypochlorite for 3 min., 1 min. – 70% ethanol, then

sterilized 3 times for 5 min. with sterile distilled water. Sterile leafs were cutted in 8–10 mm

segments and moved on Petri dish mith Murashige and Skoog (MS) nutrient medium

supplemented with different growth regulators concenrations. Medium pH – 5.7 ± 0.1. Sterile

leaf segments culture were grown in growing room when light intensity was 50 μmol m-2

s-1

,

photoperiod – 16/8 h (day/night), temperature 22±2oC and humidity 75%.

The results of the work – isolated leaf segments culture of begonia with low frequence

can form adventitious shoots in medium without growth regulators. Investigated cytokinin

and cytokinin and auxin combinations in nutrient medium essentialy promoted the formation

of shoots of begonia ‘Pink Pride’ and ‘Her Majesty’. To induse organogenesis in vitro of

begonia ‘Pink Pride’ purposeful to supplement nutrient medium with 1.0 mg 1-1

BAP + 0.1

mg 1-1

NAA or 2.0 mg 1-1

TDZ + 0.1 mg 1-1

NAR and ‘Her Majesty’ – 2.0 mg 1-1

BAP + 0.1

mg 1-1

NAA or 2.0 mg 1-1

TDZ + 0.1 mg 1-1

NAA. Rhysogenesis held intensive microshoot in

nutrient medium supplemented with 0.1 mg 1-1

NAA or 0.1 mg 1-1

ISA.

Key word: growth regulators, begonia, explant, organogenesis, rhysogenesis.

5

TURINYS

PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS .......................................................................................................... 6

TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS ...................................... 7

ĮVADAS ..................................................................................................................................... 8

1. LITERATŪROS ANALIZĖ ............................................................................................. 10

1.1. BEGONIJOS PAPLITIMAS IR REIKŠMĖ .............................................................................. 10

1.2. BEGONIJOS MORFOLOGINĖS IR BIOLOGINĖS SAVYBĖS .................................................... 11

1.3. AUGALŲ MIKRODAUGINIMAS ......................................................................................... 12

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS ............................................................................... 17

2.1. AUGIMO REGULIATORIŲ MAITINAMOJOJE TERPĖJE PARINKIMAS BEGONIJOS

REGENERACIJAI IN VITRO ....................................................................................................... 19

2.1.1. 6-benzilaminopurino (BAP) + 1-naftilacto rūgšties (NAR) poveikis ........................... 19

2.1.2. Tidiazurono (TDZ) + 1-naftilacto rūgšties (NAR) poveikis ......................................... 19

2.2. AUGIMO REGULIATORIŲ PARINKIMAS BEGONIJOS RIZOGENEZEI IN VITRO ...................... 19

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ ................................................................... 21

3.1. AUGIMO REGULIATORIŲ IR EKSPLANTO PADĖTIES ANT MAITINAMOSIOS TERPĖS POVEIKIS

BEGONIJOS REGENERACIJAI IN VITRO ..................................................................................... 21

3.1.1. Augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės poveikis begonijos

organogenezės dažniui .............................................................................................................. 21

3.1.2. Augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės poveikis begonijos

ūglių išeigai .............................................................................................................................. 27

3.2. AUGIMO REGULIATORIŲ POVEIKIS BEGONIJOS RIZOGENEZEI IN VITRO ........................... 33

IŠVADOS ................................................................................................................................ 36

LITERATŪRA ....................................................................................................................... 37

DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJA ...................................................................... 44

PRIEDAI ................................................................................................................................. 45

6

PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS

1. 3.1.1.1 pav. Meristeminiai židiniai begonijos izoliuotų lapų segmentų kultūroje (A –

adaksialinė pusė; B – abaksialinė pusė) (21 psl.)

2. 3.1.1.2 pav. Pridėtiniai ūgliai begonijos izoliuotų lapų segmentų kultūroje (A –

adaksialinė pusė, B – abakialinė pusė) (22 psl.)

3. 3.1.1.3 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ organogenezės dažniui (A –

adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (23 psl.)

4. 3.1.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ organogenezės dažniui (A –

adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (24 psl.)

5. 3.1.1.5 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui (A –

adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (25 psl.)

6. 3.1.1.6 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui (A

– adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (27 psl.)

7. 3.1.2.1 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto (A

– adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (28 psl.)

8. 3.1.2.2 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto (A

– adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (29 psl.)

9. 3.1.2.3 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (31 psl.)

10. 3.1.2.4 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė) (32 psl.)

11. 3.2.1 pav. Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ ūgliai įšaknydinimo terpėje (A – po

pasodinimo; B – praėjus 14 dienų po pasodinimo) (33 psl.)

12. 3.2.3 pav. Augimo reguliatorių poveikis begonijos ‘Pink Pride’ rizogenezei (34 psl.)

13. 3.2.4 pav. Augimo reguliatorių poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ rizogenezei (34 psl.)

14. 3.2.2 pav. Aklimatizuoti begonijos ‘Pink Pride’ (A) ir ‘Her Mejesty’ (B) augalai

regenerantai (35 psl.)

7

TERMINŲ IR SĄVOKŲ PAAIŠKINIMAI BEI SANTRUMPOS

Augimo reguliatoriai – tiek natūraliai randami fitohormonai, tiek sintetinės fiziologiškai

aktyvios medžiagos, veikiančios augalų raidą.

BAP – 6-benzilaminopurinas.

Eksplantas – audinio ar organo dalis, savarankiškai auginama maitinamojoje terpėje ir

naudojama audinių kultūrai.

Genotipas – organizmo genų visuma, lemianti individo požymius bei savybes ir jų

kitimą ontogenezės metu.

IAR – 3-indolilacto rūgštis.

In vitro – procesai ar eksperimentai, atliekami mėgintuvėlyje.

MS – Murashige ir Skoog maitinamoji terpė.

NAR – α naftilacto rūgštis.

Sterilios sąlygos – augalų audinių kultūroje pasiekiamos autoklavuojant instrumentus,

kultūrų indus, terpę bei operacinėse dezinfekuojant įrenginių paviršius, juos nuvalant

alkoholiu ar kitu dezinfekuojančiu tirpalu.

Organogenezė – tai antžeminių ir požeminių organų formavimosi ir vystymosi procesas.

TDZ – tidiazuronas.

ISR – indolilsviesto rūgštis.

8

ĮVADAS

Begonijos genties augalai priklauso begoninių (Begoniaceae Agardh) šeimai. Tai gausi

žydinčių augalų gentis, kurioje suskaičiuojama iki 1500 rūšių, iš kurių daugiau kaip 200

įvesta į rinką komercinių augintojų (Brickell, 1996; Griffiths, 1997; Jankevičienė, 1998;

Marinelli, 2006; Kumaria, 2012). Kai kurios rūšys, pvz., Begonia semperflorens ir Begonia

rex, hibridai, pvz., Begonia tuberhybrida, Begonia elatior ir Begonia erythrophylla yra vieni

svarbiausių dekoratyvinių augalų. Šiandien komerciniams tikslams auginamos begonijos

dažniausiai yra hibridai (Smith et al., 1986).

Išskiriamos trys begonijų grupės: gumbinės, lapinės ir krūminės. Lapai įvairaus dydžio,

asimetriški (įžambiai širdiški arba įžambiai ovalūs). Begonijų yra smulkiažiedžių,

stambiažiedžių ar svyrančių. Žiedai įvairiaspalviai, pilnaviduriai, pusiau pilnaviduriai,

tuščiaviduriai (Lučinskienė, 1980). Begonijos plačiai auginamos kaip dekoratyvūs

kambariniai bei landšafto augalai, taip pat šis augalas vertinamas medicinoje bei maisto

gamyboje. Begonijos gali sukaupti didelius kiekius fruktozės. Brazilijoje ir Filipinuose

begonijos naudojamos kaip prieskoniniai augalai. Kinijoje, Indonezijoje ir Brazilijoje

begonijų lapai labai populiarūs kaip salotų ingredientas (Laferriere, 1992). Tam tikros

begonijų rūšys, pvz., Begonia gracilis, yra turtingos biologiškai aktyviais fitohormonais

(Doskotch et al., 1968; Laferriere, 1992).

Įprastai šie augalai dauginami vegetatyviškai, pvz., stiebų ir lapų auginiais, dalijant

krūmus bei sėklomis. Vegetatyvinis begonijų dauginimas buvo patobulintas taikant izoliuotų

audinių ir ląstelių kultūrų metodus, siekiant padidinti Begonia augalų produktyvumą, bei

devirusuoti augalus (Pierik, Tetteroo, 1987; Takayama, 1990; Mendi et al., 2009).

Įvairiose šalyse gėlininkystės produktų suvartojimo kiekiai labai skiriasi. Lyginant su

kitomis (valgomomis) sodininkystės kultūromis, gėlininkystės produktams reikia daugiau

investicijų, sudėtingesnių auginimo technologijų ir tikslesnės auginimo kontrolės.

Gėlininkystės produktų pelnas iš ploto vieneto yra daug didesnis nei kitų žemės ūkio produktų

Todėl svarbus sveikos sodinamosios medžiagos poreikis, ypač lapinių augalų pramonėje

(Marques, Caixeta, 2003; Chen et al., 2005; Xia et al., 2006).

Per pastaruosius tris dešimtmečius pasiekta nepaprastai daug biotechnologijų srityje

dauginant dekoratyvinius vazoninius augalus (Xia et al., 2006). Sukurti naujausi šiuolaikiniai

augalų dauginimo in vitro metodai padeda augintojams patenkinti augančią gėlininkystės

pramonės paklausą, tačiau kiekvieną in vitro technologiją būtina adaptuoti skirtingoms augalų

rūšims ir sukurti optimalias išorines ir vidines sąlygas konkrečių augalų rūšių audiniuose ir

9

ląstelėse saugomai genetinei programai realizuoti (Miller et al., 1992; Stanys,

Gelvonauskienė, 1995; Borkowska, 2001; Sara, 2012).

Hipotezė: begonijos mikrodauginimo efektyvumas didžiąja dalimi nulemiamas augimo

reguliatoriais ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės.

Tyrimo tikslas: sukurti karališkosios begonijos mikrodauginimo schemą.

Uždaviniai:

įvertinti augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės poveikį

begonijos organogenezei izoliuotų lapų kultūroje;

nustatyti auksinų tipo įtaką begonijos rizogenezei in vitro.

10

1. LITERATŪROS ANALIZĖ

1.1. Begonijos paplitimas ir reikšmė

Begonia pirmą kartą paminėta rašytiniuose šaltiniuose dar 1651 m. (Hernandez, 1651).

Begonija yra pavadinta botanikos mokslo korifėjaus, Prancūzijos mokslų patrono ir

administratoriaus Michel Begon vardu.

Begonija (Begonia L.) begoninių (Begoniaceae Agardh.) šeimos žolių, puskrūmių ir

krūmų gentis, tai yra šešta pagal dydį žydinčių augalų gentis (Frodin, 2004). Gentyje yra

vienamečiai ir daugiamečiai augalai aptinkami drėgnuose Centrinės ir Pietų Amerikos, bei

Azijos, Afrikos srityse, šalia upelių, drėgno miško paklotėje, kartais ant drėgno, žmogaus

veiklos nepaliesto miško medžių kamienų. Paprastai begoniniai augalai auga kartu su kitais

įvairiais taksonais, kurie klesti tose pačiose augimvietėse, pavyzdžiui, Orchidaceae,

Rubiaceae ir Zingiberaceae.

Gentyje yra įvairių augmenijos tipų, augančių jūros lygyje ir kalnų viršūnėse (iki 2500

m.) (Sands, 2001; Kiew, 2005; Hughes, 2008). Natūraliai augančios gamtoje begonijos yra

aptinkamos subtropinio klimato juostoje, išskyrus Australiją. Kai kurie augalai yra pasiskirstę

labai lokaliai. Vis dar yra atrandamos ir apibūdinamos naujos begonijų rūšys: B. lyman-

smithii Oašakoje (Meksika), B. ravenii Taivane (Peng et al., 1988), B. austrotaiwanensis Pietų

Taivane (Peng, Chen, 1990), B. mariannensis Trinidade (Wasshausen, McLellan, 1995), B.

siccacaudata Sulavesi (Indonezija), B. salesoplonsis ir B. jureiensis San Paule (Brazilija) ir

B. sillensis porūšis mengyangensis Junane (Kinija) (Tebbitt, Guan, 2002).

Augalų šeima, kuriai priklauso Begonia turi tris skirtingas gentis: Haplophragma,

Hillebrandia ir Symbegonia; kiekviena jų turi vos keletą rūšių. Didžiąją jų dalį yra labai

sunku auginti, kitaip nei daugelį kitų begonijų. Literatūroje yra skirtingų vertinimų dėl

begonijų rūšių skaičiaus. Remiantis naujausiais leidiniais, apytikris botaninių begonijų

skaičius siekia 1550, o hibridinių begonijų – 1500 (Wagner, 1999). Keletas šių rūšių ir

porūšių yra ties išnykimo riba. Vienas iš būdų jas išsaugoti yra sudaryti klonų kolekcijas arba

dauginti pasitelkiant audinių kultūros metodus.

Begonijų augalai yra vertinami medicinoje bei maisto gamyboje. Begonijos gali

sukaupti didelius kiekius fruktozės, dėl to jų skonis gali būti saldus. Brazilijoje ir Filipinuose

begonijos naudojamos kaip prieskoniniai augalai. Kinijoje, Indonezijoje ir Brazilijoje

begonijų lapai labai populiarūs kaip salotų ingredientas (Laferriere, 1992). Tam tikros

begonijų rūšys, pvz., Begonia gracilis, yra turtingos biologiškai aktyviais fitoharmonais

(Doskotch et al., 1968; Laferriere, 1992). Begonia gracilis yra gumbus formuojanti rūšis,

11

dažniausiai su tvirtais, tiesiais, nešakotais ir sultingais stiebais bei trumpais žiedkočiais

(Huxley, 1992). Nustatyta, kad šių begonijų gumbuose kaupiamos priešvėžinės medžiagos

(Doskotch, Hufford, 1970), šaknys naudojamos kaip vėmimą slopinanti, vidurius laisvinanti

priemonė (Laferriere et al., 1991; Laferriere, 1992).

1.2. Begonijos morfologinės ir biologinės savybės

Begonia gentį sudaro vienamečiai ar daugiamečiai, sausumos arba epifitiniai augalai,

turintys šakniagumbius arba šakniastiebius, lapai dažniausiai įžambaus pagrindo, žiedai

zigomorfiniai, vienalyčiai, vyriški žiedai dažniausiai turi 2 – 4 laisvus žiedsosčio segmentus,

kuokeliai aktinomorfiniai, silpnai ar stipriai zigomorfiniai, dažniausiai 8 ir daugiau. Dulkinės

dažniausiai kupolo ar valties formos. Moteriški žiedai paprastai turi 2 – 5 laisvus žiedsosčio

segmentus, 2 – 3 dulkinės inkstų ar pusmėnulio formos.

Daugelis begonijų veislių auginamos vazonuose ar sodinamos gėlynuose, pakabinamos

balkonuose. Begonijos lengvai susikryžmina, tad egzistuoja daug natūralių hibridų: B.

taipieiensis yra naujai aprašytas hibridas iš Taivano, gautas susikryžminus B. formosana ir B.

Aptera. Naujos veislės pasaulyje vis dar kuriamos. Jos gerai žinomos dėl spalvotos lapijos,

storų ir sultingų stiebų bei didelių efektingų žiedų (Peng, Sue, 2000; Chiang et al., 2001).

Gumbinių begonijų yra platus spalvų pasirinkimas: balta, rožinė, raudona, oranžinė,

geltona ir kt. spalvos. Kiekviena begonija išaugina ir vyriškus, ir moteriškus žiedus, kurie

tribriaunėse dėžutėse subrandina smulkias sėklytes. Begonijos puikiai dauginasi stiebais ir

lapais, dalinant krūmą, sėklomis. Augalų selekcijos pagalba buvo sukurta daug efektingų šių

gėlių veislių. Subtropikų arba atogrąžų klimato juostose begonijos lauke gali būti auginamos

ištisus metus. Vidutinio klimato juostoje begonijos lauke auginamos kaip vienamečiai arba

kambariniai augalai, taip pat auginamos šiltnamiuose. Gumbinės begonijos vidutinio klimato

juostoje turi ramybės periodą, kurio metu gumbai laikomi vėsioje ir sausoje vietoje. Gumbinė

begonija požeminėje dalyje turi gumbus, kurie naudojami dauginimui. Lapinės begonijos

neturi gumbų, tačiau apatinė stiebo dalis sustorėjusi, kuri sėkmingai naudojama dauginimui.

Vegetatyviniam dauginimui auginiais gali būti naudojami lapai ar lapo dalys (Peng, Chen,

1991).

12

1.3. Augalų mikrodauginimas

Gėlių augintojams, auginant augalus komerciniais tikslais, labai svarbu gauti aukštos

kokybės sodinamąją medžiagą (Chebet et al., 2003). Audinių kultūros metodai vis plačiau

naudojami masiniam augalų dauginimui, ypatingai sodo ir dekoratyvinių augalų (Jain, 2002).

Augalų mikrodauginimą sudaro keturi pagrindiniai etapai: eksplanto parinkimas, jo

sterilinimas; ūglių proliferavimas maitinamojoje terpėje; mikroūglių įsišaknijimas ir

aklimatizacija.

Pirmojo etapo metu inicijuojama proliferuojanti kultūra. Augalų kultūros sėkmę

lemia augalo genotipas bei jo fiziologinė būklė. Genotipo skirtumus gali lemti skirtingas

endogeninių hormonų kiekis. Eksplantai, kurie buvo izoliuoti iš to paties genotipo ne vienodai

reaguoja kultūroje in vitro, tai lemia endogeninių hormonų kiekio skirtumas. Auginant

augalus optimaliomis sąlygomis, keičiant augimo reguliatorių ir maitinamųjų terpių sudėtį šis

disbalansas eliminuojamas (Duncan et al., 1985). Audinių kultūroje izoliuotų eksplantų

augimo sąlygos yra visiškai kontroliuojamos, tad jo raidą galima nukreipti pageidaujama

kryptimi. Eksplanto auginimo raidą in vitro lemia jo fiziologinė būklė. Augalo fiziologinė

būklė reguliuojama manipuliuojant aplinkos sąlygomis (temperatūra, apšvietimu, drėgme,

aprūpinimu maisto medžiagomis arba veikiant įvairiais fitohormonais bei jų deriniais).

Svarbu, kad į maitinamąją terpę būtų pasodinti sterilūs audiniai. Naudojamos įvairios

priemonės skirtingais mikrodauginimo etapais sterilios kultūros gavimui ir palaikymui.

Aseptinėmis sąlygomis auginamos augalo dalys, sodinamos į maitinamąją terpę, lengvai

pažeidžiamos mikroorganizmų, o jie stabdo ląstelių augimą, dėl išskiriamų toksinų, tad

kultūra sunyksta. Todėl sterilinimas būtinas ne tik maitinamosios terpės, bet ir naudojamo

augalo dalių. Sterilinimas yra atliekamas aseptinėmis sąlygomis laminare su steriliais

instrumentais.

Antrasis etapas apima ūglių proliferavimą maitinamojoje terpėje. Tai labai svarbus

ir augimo reguliatorių lemiamas procesas.

Eksplantų augimą ir vystymąsi in vitro lemia šie veiksniai: genetinės sąlygos, supanti

aplinka ir audinių kultūros terpę sudarantys komponentai, kuriais manipuliuoti yra

paprasčiausia. Audinių kultūros terpę sudaro: 95 % vandens, makroelementai ir

mikroelementai, augalų augimo reguliatoriai, vitaminai, cukrūs bei įvairios kitos lengvai

įsisavinamos organinės medžiagos. Dažniausiai audinių kultūros terpę sudaro apie 20

komponentų (Kiyowata et al., 1992).

Neorganiniai mineraliniai elementai. Kuomet augalai auginami in vivo jie reikalauja

didelio kiekio maisto medžiagų, o augalų audiniai auginami in vitro reikalauja makroelementų

13

ir mikroelementų derinių. Makrodruskų ir mikrodruskų pasirinkimas ir jų koncentracija

priklauso nuo augalo rūšies. MS (Murashige, Skoog, 1962) terpė yra viena populiariausių, nes

dauguma augalų reaguoja į ją palankiai; tačiau dėl aukšto druskų kiekio, ne visi augalai joje

gali augti ir vystytis optimaliai.

Maitinamojoje terpėje naudojami makroelementai: azotas (N) dažniausiai teikiamas

amonio formoje (NH4+) ir nitrato (NO3–) jonai; fosforas, magnis, kalcis, siera. Taip pat ir

mikrodruskos: boras (H3BO3), kobaltas (CoCl2∙6H2O), geležis (FeSO4∙7H2O), manganas

MnSO4∙H2O), molibdenas (MoO3), varis (CuSO4∙5H2O) ir cinkas (ZnSO4∙7H2O). Terpės

sudėtyje gali būti labai mažas kiekis jodido (Beyl, 2005).

Organiniai junginiai. Cukrus yra labai svarbi maitinamosios terpės dalis, lemianti

kultūros augimą ir vystymąsi. Daugelis augalų kultūrų dėl įvairių priežasčių negali efektyviai

vykdyti fotosintezės, tai lemia nepakankamai organizuotas ląstelinis ir audinių vystymasis,

chlorofilo stygius, ribota dujų apykaita bei CO2 kiekis audinių kultūros talpose,

nepakankamas apšvietimas. Dažniausiai naudojamas cukrus – sacharozė, koncentracija 20–

60 g l-1

, šis cukrus augaluose sintetinamas ir išnešiojamas natūraliai. Maitinamųjų terpių

gamyboje gali būti naudojama gliukozė, fruktozė, sorbitolis, maltozė. Cukraus koncentracija

parenkama priklausomai nuo eksplanto rūšies ir amžiaus. Pavyzdžiui, labai jauni eksplantai

reikalauja santykinai aukštos cukraus koncentracijos (>3%) (Coffin et al., 1976).

Vitaminai. Vitaminai, tai organinės medžiagos, kurios yra fermentų dalis arba

kofaktoriai svarbiausioms metabolizmo funkcijoms. Iš vitaminų tik tiaminas (B1 0,1–5,0 mg l-

1) yra labai svarbus audinių kultūroje, jis dalyvauja angliavandenių metabolizmo ir biosintezės

procesus. Jis dažniausiai dedamas į audinių kultūros terpę kaip tiamino hidrochloridas (HCl).

Nikotino rūgštis, žinoma kaip niacinas, vitaminas B3, ar vitaminas PP, sudaro dalį respiracinių

kofermentų. Jis naudojamas 0,1–5 mg l-1

koncentracijomis. MS terpė sudaryta iš tiamino HCl,

taip pat vitaminų: nikotino rūgšties ir piridoksino (vitamino B6) HCl formoje. Piridoksinas yra

svarbus kofermentas daugelyje metabolizmo reakcijų ir naudojamas terpėje koncentracijomis

nuo 0,1 iki 1,0 mg l-1

. Biotinas (vitaminas H) dažniausiai dedamas į terpę koncentracijomis

nuo 0,1 iki 1,0 mg l-1

, Kiti vitaminai, kurie yra naudojami terpėje, tai folio rūgštis (vitaminas

M), koncentracija – 0,1–0,5 mg l-1

, riboflavinas (vitaminas B2) – 0,1–10 mg l-1

, askorbo

rūgštis (vitaminas C) – 1,0–100 mg l-1

), pantoteno rūgštis (vitaminas B5) – 0,5–2,5 mg l-1

),

tokoferolis (vitaminas E) – 1–50 mg l-1

) ir para-aminobenzenkarboksirūgštis (0,5–1,0 mg l-1

)

(Gamborg, 1968).

Papildomai naudojamos ir kitos aminorūgštys: λ-gliutaminas, asparaginas, serinas,

prolinas. Jos naudojamos kaip sumažėjusio organinio azoto šaltinis, ypatingai somatinės

embriogenezės indukcijai ir palaikymui.

14

Sudėtiniai organiniai junginiai – tai grupė neapibrėžtų medžiagų: kazeino hidrolizatas,

kokosų pienas, apelsinų, pomidorų, vynuogių ir ananasų sultys, beržų sula, bananų terpė ir t.t.

Šie mišiniai dažnai naudojami, kuomet jokie kiti žinomi deriniai nenuliame sėkmingo augimo

ir vystymosi.

Kai kurie kompleksiniai organiniai junginiai yra naudojami kaip azoto šaltinis, tokie

kaip kazeino hidrolizatas, skirtingų amino rūgščių ir amonio (0,1–1,0 g l-1

), peptono (0,25–3 g

l-1

), triptono (0,25–2,0 g l-1

), ir salyklo ekstrakto (0,5–1,0 g l-1

) mišiniai. Šie mišiniai yra

sudėtingi, jų sudėtyje yra vitaminų ir amino rūgščių (Beyl, 2005).

Augalų augimo reguliatoriai. Naudojami žemomis koncentracijomis augalų augimo

reguliatoriai daro ženklų poveikį. Jie reguliuoja eksplantų ūglių ir šaknų vystymąsi, skatina

ląstelių dalijimąsi ir augimą. Kartais eksplantai gali būti autotrofiški ir augalų augimo

reguliatoriais apsirūpinti patys (Rout, Jain, 2004). Vieni svarbiausių augalų augimo

reguliatorių yra auksinai ir citokininai. Kai kurie augimo reguliatoriai, naudojami audinių

kultūroje, yra fitohormonai arba sintetiniai junginiai.

Auksinai yra svarbūs daugelyje augalo vystymosi procesų. Jie skatina ląstelių augimą,

tįsimą, apikalinį dominavimą, pridėtinių šaknų formavimąsi ir somatinę embriogenezę.

Kuomet auksinų koncentracija žema, terpė yra palanki šaknų iniciacijai, kuomet aukšta –

formuojamas kalius. Dažniausiai yra naudojami sintetiniai auksinai: α-naftilacto rūgštis

(NAR), 2,4 dichlorfenilacto rūgštis (2,4 D), idolilsviesto rūgštis (ISR), natūralus auksinas 3-

idolilacto rūgštis (IAR) (Heylen, Vendrig, 1988).

Citokininai skatina greitesnį ir optimalesnį ląstelių dalijimąsi, stimuliuoja meristeminių

židinių iniciaciją ir ūglių augimą in vitro. Dažniausiai naudojami citokininai yra zeatinas, 6-

benzilaminopurinas (BAP), 6-furfurilamino purinas (kinetinas), N6-izopentiladeninas (2iP).

Naudojami didesnėmis koncentracijomis (1–10 mg l-1

) jie skatina pridėtinių ūglių

formavimąsi, bet slopina šaknų formavimąsi. Skatina pažastinių ūglių regeneraciją pagal

priešingą apikalinį dominavimą reguliuojamą auksinų (Howell et al., 2003).

Giberelinų grupę sudaro apie 60 komponentų, iš kurių dažniausiai augaluose

aptinkamas GR3 (Sakamoto et al., 2001). Giberelinai yra rečiau naudojami audinių kultūroje.

Dažniausiai naudojamas G3, tačiau aukštoje temperatūroje jis skyla (autoklavuojant

prarandama 90 % biologinio aktyvumo). Giberelinai skatina tarpubamblių tįsimą, intensyvina

fotosintezę ir kvėpavimą, nukleorūgščių ir baltymų sintezę (Ahmed, 2011; Ahmed, 2012).

Abscizo rūgštis inhibuoja augimą, dalyvauja baltymų sintezėje, todėl plačiai aptinkama

augaluose (Roberts et al., 1990). Kultūroje in vitro ši rūgštis naudojama stimuliuoti embrionų

susidarymą iš kaliaus, pumpurų bei sėklų perėjimui į ramybės būklę skatinimui (Cowan et al.,

1997). Abscizo rūgštis augaluose reguliuoja lapų žiotelių varstymosi procesą (Liu et al.,

15

2001). Augalams ruošiantis žiemos periodui abscizo rūgšties kiekis augaluose palaipsniui

didėja ir taip augalai pasiruošia šaltajam sezonui (Bertrand et al., 1997).

Tirštikliai reguliuoja maitinamosios terpės konsistenciją, sudaro tinkamą aeraciją ir

optimalų maistinių medžiagų pasisavinimą. Terpėje jie naudojami koncentracijomis nuo 0,5

iki 1 %. Agaro koncentracija terpėje gali įtakoti eksplantų augimą. Jei terpė per kieta augalų

augimas slopinamas, jei per skysta – gali būti įtakojama augalų hiperhidrozė (Singha, 1982).

Organogenezės proceso metu kinta ląstelės ir audiniai, susiformuoja monopolinė

struktūra – ūglio, šaknies, žiedo užuomazga. Šių struktūrų indų sistema yra susijusi su

motininiais audiniais. Dažniausiai organogenezės pradžioje suformuojami maži pirminiai

ląstelių grupių dariniai, vadinami meristeminiais židiniais. Šie židiniai toliau vystosi į ūglio,

šaknies ar žiedo viršūnines meristemas (Burbulis ir kt., 2009).

Organogenezė turi tris pastovius etapus. Pirmojo etapo metu ląstelės įgyja savybę

vystytis; antrojo etapo metu įtakojama ląstelių raida, susiformuoja organo pradmuo;

trečiajame etape ląstelės suformuoja atitinkamus organus (Sugiyama, 1999; Banno et al.,

2001).

Optimaliomis sąlygomis susidarius meristeminiams audiniams po kurio laiko pastebimi

naujų organų pradmenys. Organogenezės kontrolei labai svarbūs yra fitohormonai –

nuliamentys susidariusių meristemų tolimesnį vystymąsi viena ar kita kryptimi arba

aprūpinant maitinamąją terpę egzogeniniais augimo reguliatoriais (Hicks, 1980; Evans et al.,

2003).

Trečiojo etapo metu vyksta ūglių įšaknijimas. Jis gali būti atliekamas in vitro ir ex

vitro. Mikroaugalus nesterilioje aplinkoje adaptuoti reikia palaipsniui. Trečiojo

mikrodauginimo etapo metu pakeičiama maitinamosios terpės sudėtis – du ar tris kartus

sumažinamas mineralinių druskų ir cukraus (iki 0,5–1%) kiekis ir pašalinami citokininai.

Šaknų susidarymo stimuliavimui naudojami auksinai: ISR, IAR, NAR (Matysiak, Novak,

1995; Matysiak, Novak, 2001).

Ketvirtasis etapas – mikroaugalų adaptavimas nesterilioje aplinkoje –

mikrodauginimo sėkmę apsprendžiantis žingsnis. Peck ir Cumming (1984) organogenezės

indukcijai panaudojo lapų segmentų eksplantus augintus ant standžios tepės. Informaciją apie

Begonia hiemalis skystos terpės kultūrą, kaip skatinančią pridėtinių pumpurų susidarymą

lapkočio eksplantuose, parengė Simmonds ir Werry (1987). Hvoslef-Eide, Saebo (1991)

išgavo kalių ir ląstelių suspensiją iš Begonia cheimantha naudojant raudonos spalvos apšvitą

ir išsiaiškino, kad tamsoje arba apšvietus plataus spektro šviesos bangomis eksplantai yra

linkę paspartinti organogenezę vietoje ilgesnio kaliaus augimo.

16

Nors skirtingų begonijų rūšių audinių kultūros metodai ir sąlygos yra panašūs, bet

augimo reguliatorių reikalavimai maitinamajai terpei yra skirtingi. Literatūroje nurodoma, kad

įvairios auksino ir citokinino koncentracijos arba jų junginiai yra reikalingi skirtingoms

rūšims (Burrit, Leung, 1996; Kiyokawa et al., 1996). Taigi, geros regeneracinės sistemos

plėtra kiekvienam genotipui yra labai svarbi (Kiyokawa et al., 1996).

17

2. TYRIMŲ METODAI IR SĄLYGOS

Tyrimo vieta. Tyrimai atlikti Aleksandro Stulginskio universiteto

Agrobiotechnologijos laboratorijoje 2014–2015 metais.

Tyrimo objektas. Karališkosios begonijos (Begonia rex Putz.) veislės ‘Pink Pride’ ir

‘Her Majesty’ (2.1 pav.).

2.1 pav. Karališkosios begonijos (Begonia rex Putz.) (A – ‘Pink Pride’; B – ‘Her Majesty’

Donorinių augalų auginimo sąlygos. Karališkosios begonijos (Begonia rex Putz.)

veislių ‘Pink Pride’ ir ‘Her Majesty’ donoriniai augalai auginti vegetaciniuose induose

auginimo kambaryje kontroliuojamomis sąlygomis: šviesos intensyvumas 50 µmol m-2

s-1

,

fotoperiodas 16/8 h (dieną/naktį), temperatūra 22/18oC (dieną/naktį).

Eksplantų auginimo sąlygos. Begonijos organogenezei izoliuotų audinių kultūroje tirti

naudoti lapų segmentų eksplantai. Iš donorinių augalų paimti lapai 15 min. plauti po tekančiu

vandeniu, sterilinti 3 min. 10 % natrio hipochlorito tirpale, 1 min. – 70 % etanolio

vandeniniame tirpale, 3 kartus po 5 min. plauti steriliame distiliuotame vandenyje. Sterilūs

lapai supjaustyti į 8–10 mm segmentus ir adaksialine ir abaksialine puse pasodinti į Petri

lėkšteles (2.2 pav.) su Murashige ir Skoog (MS) (2.1 lentelė) (Murashige ir Skoog, 1962)

terpe, kuri buvo papildyta skirtingais augimo reguliatorių kiekiais. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

Sterili lapo segmentų kultūra auginta auginimo kambaryje esant 50 µmol m-2

s-1

šviesos

intensyvumui, 16/8 h (dieną/naktį) fotoperiodui, 22 ± 2oC temperatūrai ir 75% drėgniui.

A B

18

2.2 pav. Karališkosios begonijos (Begonia rex Putz.) lapo segmentų kultūra in vitro

(A – adaksialinė pusė; B – abaksialinė pusė)

2.1. lentelė. Murashige ir Skoog (MS) maitinamosios terpės sudėtis

Medžiaga Kiekis mg l-1

Makroelementai

NH4NO3 1650

Ca(NO3)2·4H2O -

KNO3 1900

KCl -

(NH4)SO4 -

CaCl2·2H2O 400

MgSO4·7H2O 370

Na2SO4 -

H2PO4 170

NaH2PO4·4H2O -

NaH2PO4 -

Mikroelementai

CoCl2·6H2O 0,025

CuSO4·5H2O 0,025

H3BO3 6,20

KI 0,830

MnSO4·4H2O 22,30

MnSO4·H2O -

Na2MoO4·2H2O 0,25

ZnSO4·7H2O 8,60

FeSO4·7H2O 27,80

Fe2(SO4)3 -

Na2 EDTA·2H2O 37,30

Vitaminai

Mezoinozitas 100

Tiaminas HC1 0,10

Piridoksolis HC1 0,50

Nikotino rūgštis 0,50

Glicinas 2,00

Priedai

Sacharozė 10000-30000

Agaras 8000

pH 5,7± 0,1

A B

19

2.1. Augimo reguliatorių maitinamojoje terpėje parinkimas begonijos regeneracijai

in vitro

2.1.1. 6-benzilaminopurino (BAP) + 1-naftilacto rūgšties (NAR) poveikis

Tirti skirtingi citokinino BAP ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:

be augimo reguliatorių;

0,5 BAP mg l-1

1,0 BAP mg l-1

2,0 BAP mg l-1

3,0 BAP mg l-1

0,5 BAP mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

1,0 BAP mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

2,0 BAP mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

3,0 BAP mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

2.1.2. Tidiazurono (TDZ) + 1-naftilacto rūgšties (NAR) poveikis

Tirti skirtingi citokinino TDZ ir auksino NAR deriniai MS maitinamojoje terpėje:

be augimo reguliatorių;

0,5 TDZ mg l-1

1,0 TDZ mg l-1

2,0 TDZ mg l-1

3,0 TDZ mg l-1

0,5 TDZ mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

1,0 TDZ mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

2,0 TDZ mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

3,0 TDZ mg l-1

+0,1 NAR mg l-1

Maitinamoji terpė papildyta 30 g l-1

sacharozės ir 8 g l-1

agaro. Terpės pH – 5,7 ± 0,1.

2.2. Augimo reguliatorių parinkimas begonijos rizogenezei in vitro

Tirtas auksinų tipas MS maitinamojoje terpėje:

be augimo reguliatorių

0,1 NAR

0,1 IAR

0,1 ISR

20

Vertintas: ūglių susiformavimo dažnis (%);

ūglių kiekis iš eksplanto (vnt.);

įsišaknijusių mikroūglių dažnis (%).

Eksperimento metu buvo auginama po 60 kiekvieno varianto eksplantų, tyrimas atliktas

trimis pakartojimais.

Statistinė duomenų analizė. Duomenys statistiškai apdoroti kompiuterinėmis

programomis STAT 1,55 ir ANOVA iš programų paketo “SELEKCIJA“ (Tarakanovas,

Raudonius, 2003).

21

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZĖ

3.1. Augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės poveikis

begonijos regeneracijai in vitro

Tyrimo in vitro sėkmė priklauso nuo eksplanto tipo, padėties ant maitinamosios terpės ir

nuo kultūros auginimo sąlygų. Augalų eksplantų izoliavimas ir sodinimas sutrikdo maisto

medžiagų ir fitohormonų srautus, todėl nulemia eksplantų vystymąsi in vitro. Nustatyta, kad

eksplantai, auginami ant maitinamosios terpės abaksialine (apatine) puse, regeneruoja

struktūras mažesniu dažniu, lyginant su adaksialine (viršutine) puse auginamais eksplantais

(Garcia-Luis et al., 1999).

3.1.1. Augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės

poveikis begonijos organogenezės dažniui

Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ izoliuotų audinių kultūroje pirmieji meristeminiai

židiniai užfiksuoti praėjus 21 dienai po lapų segmentų izoliavimo (3.1.1.1 pav.)

3.1.1.1 pav. Meristeminiai židiniai begonijos izoliuotų lapų segmentų kultūroje

(A – adaksialinė pusė; B – abaksialinė pusė)

Po 30 auginimo dienų susiformavo ūgliai turintys du, tris tikruosius lapelius (3.1.1.2

pav).

A B

22

3.1.1.2 pav. Pridėtiniai ūgliai begonijos izoliuotų lapų segmentų kultūroje

(A – adaksialinė pusė, B – abakialinė pusė)

Maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių (kontrolė) izoliuoti lapo eksplantai

organogenines struktūras formavo 26,6 % dažniu (3.1.1.3 A pav.). Auginant izoliuotus lapų

segmentus adksialine puse, maitinamojoje terpėje, papildytoje 0,5 mg 1-1

BAP; 1,0 mg 1-1

BAP; 2,0 mg 1-1

BAP; 3,0 mg 1-1

BAP; 0,5 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR; 1,0 mg 1-1

BAP +

0,1 mg 1-1

NAR; 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR; 3,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR,

izoliuotų eksplantų organogenezės dažnis lyginant su kontrole buvo ženkliai didesnis, o

1,0 mg 1-1

BAP; 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR; 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR siekė

100 %.

Lapų segmentų, augintų maitinamosiose terpėse abaksialine puse, gebėjimas formuoti

organogenines struktūras kito priklausomai nuo augimo reguliatorių koncentracijos (3.1.1.3 B

pav.). Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ lapo eksplantai mažiausiai ūglių (15,4 %)

suformavo maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių. Didžiausias organogenezės dažnis

(86,2 %) iš begonijos ‘Pink Pride’ lapo eksplantų gautas maitinamojoje terpėje, papildytoje

2,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR. Vertinant augimo reguliatorių derinių poveikį, nustatyta,

kad mažiausias organogenezės dažnis buvo suformuotas derinyje 0,5 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR (50,8 %). Vertinant citokinino BAP poveikį organogenezės dažniui, lyginant su

kontrole, nustatyta, kad didžiausias (66,6 %) organogenezės dažnis buvo 2,0 mg l-1

BAP.

A B

23

3.1.1.3 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ organogenezės dažniui

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Vertinant eksplanto padėties ant maitinamosios terpės poveikį begonijos organogenezės

dažniui nustatyta, kad lapo segmentai, maitinamojoje terpėje auginti adaksialine puse,

organogenines struktūras indukavo didesniu dažniu nei abaksialine puse auginti eksplantai.

Tiriant citokinino TDZ įtaką begonijos ‘Pink Pride’ organogenezės dažniui, nustatyta,

kad adaksialine puse auginti eksplantai intensyviausiai pumpurus formavo citokinino TDZ ir

auksino NAR bei citokinino TDZ (2,0 mg 1-1

) poveikyje (organogenezės dažnis siekė nuo

91,7 iki 100 %) (3.1.1.4 A pav.).

Egzogeninio citokinino TDZ (0,5 mg 1-1

ir 3,0 mg 1-1

) poveikyje izoliuoti eksplantai

organogenines struktūras formavo vienodu dažniu (53,3 %).

A

B

24

Vertinant augimo reguliatorių derinių poveikį auginant izoliuotus lapų segmentus

abaksialine puse, nustatyta, kad mažiausias organogenezės dažnis buvo terpėje be augimo

reguliatorių (15,4 %) (3.1.1.4 B pav.).

3.1.1.4 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ organogenezės dažniui

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Maitinamojoje terpėje, papildytoje augimo reguliatorių 2,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR deriniu, nustatytas didžiausias (77,2 %) organogenezės dažnis. Taip pat efektyvus buvo

augimo reguliatorių 3,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR derinys, kurio poveikyje eksplantai

organogenines struktūras formavo 74,5 % dažniu. Esmingai mažiausias organogenezės dažnis

buvo užfiksuotas 0,5 ir 1,0 mg l-1

TDZ poveikyje, atitinkamai jis siekė 24,3 ir 26,8 %.

A

B

25

Karališkosios begonijos ‘Her Mejesty’ izoliuoti lapo eksplantai auginti adaksialine

puse, maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių organogenines struktūras formavo

mažiausiu dažniu (12 %) (3.1.1.5 A pav.). Kitose maitinamosiose terpėse organogenezės

dažnis kito priklausomai nuo augimo reguliatorių koncentracijos.

3.1.1.5 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Intensyviausiai organogenines struktūras karališkosios begonijos ‘Her Mejesty’ lapo

segmentai formavo auginami adaksialine lapo puse ant terpės, papildytos 2,0 mg l-1

BAP +

0,1 mg l-1

NAR (100 %). Papildžius terpę 3,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR deriniu

A

B

26

organogenezės dažnis taip pat buvo esmingai (81,8 %) didesnis lyginant su kontrole. Įvertinus

citokinino poveikį begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui nustatyta, kad labiausiai jį

skatino 2,0 mg l-1

BAP priedas, šiuo atveju organogenezės dažnis buvo 4,9% didesnis nei 1,0

mg l-1

BAP poveikyje ir 16,6 % didesnis nei 3,0 mg l-1

BAP poveikyje.

Vertinant augimo reguliatorių derinio BAP ir NAR poveikį begonijos ‘Her Mejesty’

organogenezės dažniui, nustatyta, kad maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių izoliuoti

eksplantai, auginti abaksialine lapo puse, organogenines struktūras formavo 8,2% dažniu

(3.1.1.5 B pav.). Tiriant citokinino BAP ir auksino NAR derinio poveikį organogenezės

dažniui, nustatyta, kad didinant augimo reguliatorių kiekį maitinamojoje terpėje,

organogenezės dažnis didėjo. Didžiausias (86 %) organogenezės dažnis nustatytas

maitinamojoje terpėje papildytoje 3,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR.

Tiriant citokinino TDZ įtaką begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui nustatyta,

kad auginti adaksialine puse lapo segmentai organogenines struktūras formavo mažiausiu

dažniu (12,0 %) maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių (3.1.1.6 A pav.).

Citokininas TDZ labiausiai organogeninių struktūrų formąvimąsi skatino derinyje su

auksinu NAR (organogenezės dažnis siekė nuo 87,6 iki 100 % ir 2,0 mg l-1

TDZ (100 %) bei

3,0 mg l-1

TDZ (90,3 %)). Maitinamojoje terpėje, papildytoje 0,5 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR organogenezės dažnis, lyginant su kontrole, buvo 40,5 %, 1,0 mg l-1

TDZ – 44,2 %,

0,5 mg l-1

TDZ – 21,3 % didesnis.

Tiriant citokinino TDZ įtaką begonijos ‘Her Mejesty’ lapo segmentų, augintų

abaksialine puse, organogenezės dažniui, lyginant su kontrole (8,2 %) nustatyta, kad

statistiškai patikimai didžiausias poveikis buvo derinyje su auksinu NAR (organogenezės

dažnis siekė nuo 43,7 iki 78,8 %). Egzogeninių maitinamosios terpės priedų 2,0 mg l-1

TDZ ir

3,0 mg l-1

TDZ poveikyje izoliuoti eksplantai organogenines struktūras formavo 41,3 ir

43,5 % didesniu dažniu, lyginant su kontrole.

27

3.1.1.6 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ organogenezės dažniui

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

3.1.2. Augimo reguliatorių ir eksplanto padėties ant maitinamosios terpės

poveikis begonijos ūglių išeigai

Maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių izoliuoti eksplantai vidutiniškai formavo

4,4 ūglius iš eksplanto (3.1.2.1 A pav.). Pierik (1997) teigia, kad citokininai dažnai naudojami

siekiant skatinti ūglių augimą ir vystymąsi, nes skatina ląstelių dalijimąsi, ypač jei naudojami

kartu su auksinais; tuo tarpu auksinai skatina ląstelių tįsimą, audinių didėjimą, pridėtinių ir

A

B

28

pažastinių ūglių ir kaliaus formavimąsi. Vertinant augimo reguliatorių derinio BAP ir NAR

poveikį begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto, nustatyta, kad daugiausiai ūglių

suformavo izoliuoti eksplantai auginti terpėje, papildytoje 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR

– vidutiniškai 63,2 ūglius iš eksplanto, tačiau didinant BAP kiekį maitinamojoje terpėje ūglių

kiekis iš eksplanto ženkliai sumažėjo. Esmingai mažiausias ūglių kiekis iš eksplanto

susiformavo maitinamojoje terpėje su 0,5 mg 1-1

BAP (20,4 vnt.), tuo tarpu Simmonds (1984)

teigia, kad 0,1 mg l -1

BAP nulėmė didžiausią begonijos ūglių kiekį iš eksplanto.

3.1.2.1 pav. BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

A

B

29

Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ izoliuotų eksplantų didžiausias ūglių kiekis (32,7

vnt.) gautas maitinamojoje terpėje, papildytoje citokinino 2,0 mg l-1

BAP ir auksino 0,1 mg l-1

NAR deriniu (3.1.2.1 B pav.).

Mažiausias ūglių kiekis iš eksplanto, auginant juos abaksaline puse, nustatytas

maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių – 2,1 vnt. (3.1.2.1. B pav.). Tiriant citokinino

BAP įtaką ūglių kiekiui, buvo nustatytas, kad 1,0 mg l-1

ir 2,0 mg l-1

BAP didino ūglių kiekio

išeigą maitinamojoje terpėje, atitinkamai 23,6 ir 26,9 vnt.

Vertinant egzogeninių augimo reguliatorių derinio TDZ + NAR poveikį begonijos

‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto, kuomet lapo segmentai auginti adaksialine puse,

lyginant su kontrole, nustatyta, kad daugiausiai ūglių (62,5 vnt.) formavo eksplantai, auginti

terpėje, papildytoje 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR (3.1.2.2 A pav.).

3.1.2.2 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

A

B

30

Vertinant citokinino TDZ įtaką ūglių išeigai nustatyta, kad esmingai patikimai

daugiausiai (52,4 vnt. iš eksplanto) ūglių suformavo eksplantai auginti terpėje papildytoje

2,0 mg l-1

TDZ. Maitinamojoje terpėje be augimo reguliatorių izoliuoti eksplantai auginti

abaksialine puse, vidutiniškai formavo 2,1 ūglius iš eksplanto (3.1.2.2 B pav.).

Vertinant TDZ ir auksino poveikį nustatyta, kad esmingai mažiausią ūglių kiekį iš

eksplanto formavo eksplantai auginti abaksialine puse maitinamojoje terpėje, papildytoje

0,5 mg l-1

TDZ. Vertinant egzogeninių augimo reguliatorių derinio TDZ ir NAR poveikį

begonijos ‘Pink Pride’ ūglių kiekiui iš eksplanto, nustatyta, kad didinant TDZ kiekį terpėje,

didėjo ir ūglių iš eksplanto išeiga. Esmingai didžiausias ūglių kiekis gautas terpėje,

papildytoje 2,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR (28,1 vnt.).

Izoliuoti ‘Her Mejesty’ eksplantai, auginti maitinamojoje terpėje adaksialine puse be

augimo reguliatorių, vidutiniškai formavo 2,4 ūglius iš eksplanto (3.1.2.3 A pav.). Vertinant

egzogeninių augimo reguliatorių derinio BAP ir NAR poveikį begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių

kiekiui iš eksplanto, nustatyta, kad daugiausiai ūglių suformavo eksplantai auginti terpėje,

papildytoje 2,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR (63,2 vnt.). Esmingai mažiausias (18,2 vnt.)

ūglių kiekis iš eksplanto susiformavo maitinamojoje terpėje su 0,5 mg l-1

BAP.

Abaksialine puse auginti izoliuoti lapo eksplantai, maitinamojoje terpėje be augimo

reguliatorių vidutiniškai formavo 1,2 ūglius iš eksplanto (3.1.2.3 B pav.). Vertinant augimo

reguliatorių BAP ir NAR poveikį bebonijos ‘Her Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto,

nustatyta, kad daugiausiai ūglių suformavo terpėje, papildytoje 1,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR ir 2,0 mg l-1

BAP + 0,1 mg l-1

NAR, atitinkamai 21,8 ir 20,9 vnt., tačiau didinant BAP

kiekį augimo reguliatorių derinyje ūglių kiekis iš eksplanto mažėjo.

31

3.1.2.3 BAP ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Vertinant egzogeninių augimo reguliatorių derinio TDZ ir NAR poveikį begonijos ‘Her

Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto, nustatyta, kad daugiausiai ūglių (62,5 vnt.) formavo

eksplantai, auginti adaksialine lapo segmento puse terpėje papildytoje 2,0 mg l-1

TDZ + 0,1

mg l-1

NAR (3.1.2.4 A pav.) didinant citokinino kiekį iki 3,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR,

ūglių kiekis iš eksplanto ženkliai mažėja (33,3 vnt.). Mažiausias ūglių kiekis iš eksplanto

buvo gautas kontroliniame variante – 2,4 vnt.

A

B

32

3.1.2.4 pav. TDZ ir NAR poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių kiekiui iš eksplanto

(A – adaksialinė pusė, B – abaksialinė pusė)

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

Auginant izoliuotus lapų segmentus abaksialine puse ant maitinamosios terpės ir

vertinant augimo reguliatorių derinio TDZ ir NAR poveikį begonijos ‘Her Mejesty’ ūglių

kiekiui iš eksplanto, nustatyta, kad daugiausiai ūglių formavo eksplantai, auginti terpėje

papildytoje 2,0 mg l-1

TDZ + 0,1 mg l-1

NAR (3.1.2.4 B pav.). Tik citokininų priedas

maitinamojoje terpėje (2,0 mg l-1

TDZ ir 3,0 mg l-1

TDZ) įtakojo statistiškai patikimai didelę

ūglių išeigą 32,4 ir 29,5 vnt. Vertinant augimo reguliatorių poveikį, esmingai mažiausias ūglių

kiekis iš eksplanto, gautas izoliuotus eksplantus auginant terpėje su 0,5 mg l-1

TDZ ir

1,0 mg l-1

TDZ, atitinkamai tik 11,6 ir 10,6 vnt iš eksplanto.

A

B

33

3.2. Augimo reguliatorių poveikis begonijos rizogenezei in vitro

Rizogenezė – sudėtingai kontroliuojamas morfogenezės procesas, kurio metu susidaro

šaknys. Žolinių augalų šaknų formavimasis in vitro gali būti gana lengvai indukuojamas. Tai

kontroliuoja daug tarpusavyje susijusių veiksnių: aplinkos veiksniai (šviesa, temperatūra,

drėgmė ir kt.), augalo ir eksplanto fiziologinė būklė, genotipas, organogeninė hormoninė

reguliavimo sistema (Sliesaravičius, Stanys, 2005). Citokininai stabdo šaknų vystymąsi, todėl

reikalingas subkultivavimas maitinamojoje terpėje be citokininų priedo. Auksinai skatina

šaknų susidarymą, bet stabdo jų augimą, todėl rizogenezės paskatinimui naudinga terpę

papildyti aktyvia medžio anglimi, nes ji absorbuoja augimo reguliatorius, kurie slopina

įsišaknijimą (Bigot, 1981).

Susiformavę tirtų begonijų ūgliai buvo perkelti į įšaknydinimo terpę. Begonijos

rizogeninių struktūrų formavimasis prasidėjo 14 dienų po ūglių pasodinimo (3.2.1 pav.).

3.2.1 pav. Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ ūgliai įšaknydinimo terpėje

A – po pasodinimo; B – praėjus 14 dienų po pasodinimo

Karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ mikroūgliai šaknis statistiškai patikimai formavo

maitinamosiose terpėse, papildytose 0,1 mg l-1

NAR arba 0,1 mg l-1

ISR (3.2.2 pav.).

Mažiausias rizogenezės dažnis (25 %) nustatytas terpėje be augimo reguliatorių.

Maitinamojoje terpėje, papildytoje 0,1 mg l-1

IAR eksplantai rizogenines struktūras formavo

41,7 % didesniu dažniu lyginant su kontrole.

A B

34

3.2.2 pav. Augimo reguliatorių poveikis begonijos ‘Pink Pride’ rizogenezei

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014 – 2015 m.

Vertinant begonijos ‘Her Mejesty’ rizogeninių struktūrų formavimąsi nustatyta, kad

papildžius maitinamąją terpę auksinais esmingai patikimai didėjo rizogenezės dažnis (3.2.3

pav.). Papildžius maitinamąją terpę 0,1 mg l-1

NAR (100 %) arba 0,1 mg l-1

ISR

organogenezės dažnis siekė 100 %, 0,1 mg l-1

IAR – 93,3 %. Mažiausias rizogenezės dažnis

(33,3 %) buvo nustatytas kontroliniame variante.

3.2.3 pav. Augimo reguliatorių poveikis begonijos ‘Her Mejesty’ rizogenezei

Agrobiotechnologijos laboratorija, 2014–2015 m.

35

Po 4 savaičių begonijos regenerantai, turintys gerai išvystytą šaknų sistemą perkelti į

vegetacinius indus ir auginti augimo kambaryje (3.2.4 pav.).

3.2.4 pav. Aklimatizuoti begonijos ‘Pink Pride’ (A) ir ‘Her Mejesty’ (B)

augalai regenerantai

Komerciškai svarbių augalų dauginimo in vitro sėkmę lemia augimo reguliatorių

deriniai maitinamojoje terpėje ir eksplanto tipas priklausomi nuo augalo rūšies (Geier, 1977;

Hasegawa, 1979; Skirvin, Chu, 1979; Geier et al., 1983; Takayama, 1983; Rout et al., 1989;

Dillen et al., 1996; Hosoki, Kajino, 2003; Preil, 2003; Rout, Jain, 2004). Begonijos gali būti

dauginamos sėklomis arba vegetatyviškai: šakniastiebiais ar gumbais. Taip pat gali būti

dauginamos dirbtinai iš mažų auginių in vitro sąlygomis. Mokslininkų teigimu, tai yra

veiksmingas ir praktiškas metodas (Cachiţă, Sand, 2000). Skirtingų Begonia genotipų

(Begonia semperflorens, Begonia rex, Begonia elatior ir begonijos hibridas) regeneracija in

vitro indukuota panaudojant lapų ir lapkočių segmentus MS terpėje, papildytoje BAP

(Takayama, 1990; Espino et al., 2004). Tuo tarpu kiti mokslininkai Teixeira (2003), Nhut su

bendraautoriais (2005; 2006) ir Rout su bendraautoriais (2006) sėkmingai regeneravo

begonijos ūglius in vitro MS maitinamojoje terpėje, papildytoje 0,2 mg l-1

IAR + 0,2 mg l-1

BAP. Mūsų tyrimų rezultatai rodė, kad begonijos ‘Pink Pride’ izoliuoti lapo segmentai

statistiškai patikimai intensyviau formavo organogenines struktūras maitinamojoje terpėje,

papildytoje 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg 1-1

NAR

deriniais, o ‘Her Majesty’ − 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg

1-1

NAR deriniais. Tiriant izoliuotų lapo segmentų padėties įtaką ant maitinamosios terpės

nustatyta, kad efektyviau organogenines struktūras formavo eksplantai auginti adaksialine

lapo puse.

B A

36

IŠVADOS

2014–2015 m. Aleksandro Stulginskio universiteto Agrobiotechnologijos laboratorijoje

atlikus begonijos mikrodauginimo tyrimus galima teikti tokias išvadas:

1. Tirti citokininų bei citokininų ir auksino deriniai maitinamojoje terpėje esmingai

skatino karališkosios begonijos ‘Pink Pride’ ir ‘Her Majesty’ ūglių formavimąsi izoliuotų lapų

segmentų kultūroje.

2. Tirtų begonijos veislių lapo audiniai statistiškai patikimai intensyviau ūglius

formavo auginant eksplantus adaksialine puse ant maitinamosios terpės.

3. Siekiant indukuoti begonijos ‘Pink Pride’ organogenezę in vitro tikslingiausia

maitinamąją terpę papildyti 1,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ + 0,1 mg

1-1

NAR deriniais, o ‘Her Majesty’ − 2,0 mg 1-1

BAP + 0,1 mg 1-1

NAR arba 2,0 mg 1-1

TDZ

+ 0,1 mg 1-1

NAR deriniais.

4. Intensyviausiai mikroūglių rizogenezė vyko maitinamojoje terpėje, papildytoje

0,1 mg l-1

NAR arba 0,1 mg l-1

ISR.

37

LITERATŪRA

1. AHMED, A. B. A.; RAO, A. S.; RAO, M. V.; TAHA, R. M. 2011. Effect of picloram,

additives and plant growth regulators on somatic embryogenesis of Phyla modiflora (L.)

Brazilian Archives of Biology and Technology, vol. 54, p. 7–13.

2. AHMED, A. B. A.; RAO, A. S.; RAO, M. V.; TAHA, R. M. 2012. Production of

gymnemic acid depends on medium, explants, PGRs, color lights, temperature,

photoperiod, and sucrose sources in batch culture of Gymnema sylvestre. The Scientific

World, vol. 897867, p. 1–11.

3. BANNO, H., IKEDA, I., NIU, Q. W., CHUA, N. H. 2001. Over expression of

Arabidopsis ESR1 induces initiation of shoot regeneration. The Plant Cell, vol. 13, p.

2609–2618.

4. BEYL, C. A. 2005. Getting started with tissue culture: Media preparation, sterile

technique, and labaratory equipment. CRC Press LLC, p. 21–28.

5. BERTRAND, A.; ROBITAILLE, G.; CASTONGUAY, Y.; NADEAU, P.; BOUTIN, R.

1997. Changes in ABA and gene expression in cold-acclimated sugar maple. Tree

Physiology, vol. 17, p. 31–37.

6. BIGOT, C. 1981. Multiplication vegetative in vitro de Begonia×hiemalis. Agronomie,

vol. 1, p. 433–440.

7. BJOWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. 1990. Plant tissue culture: theory and practice.

Developments in Crop Science. The Netherlands, p. 25–32.

8. BORKOWSKA, B. 2001. Morphological and physiological characteristics of

micropropagated strawberry plants rooted in vitro or ex vitro. Scientia Horticulturae, vol.

89, p. 195–206.

9. BRICKELL, C. 1996. A-Z encyclopedia of Garden plants. London. 1080 p.

10. BURBULIS, N. 2009. Augalų genetinės įvairovės kūrimas somatinių audinių kultūroje:

mokomoji knyga. Akademija, 64 p.

11. BURRIT, D. J.; LEUNG, W. M. 1996. Organogenesis in cultured petiole explants of

Begonia x erythrophylla: the timing and specificity of the inductive stimuli. Journal of

Experimental Botany, vol. 47, p. 557–567.

12. CACHIŢĂ, C.D.; SAND, C. 2000. Biotehnologie vegetală. Baze teoretice şi practice,

vol. 1, p. 8–10.

38

13. CHANG, H. S.; CHAKRABARTY, D.; HAHN, E. J.; PAEK, K. Y. 2003.

Micropropagation of calla lily (Zantedeschia albomaculata) via in vitro shoot tip

proliferation. In Vitro Cell Development Biological Plant, vol. 39, p. 129–134.

14. CHEBET, D. K.; OKENO, J. A.; MATHENGE, P. 2003. Biotechnological approaches to

improve horticultural crop production. Horticultural biotechnology in vitro culture and

breeding, vol. 625, p. 473–477.

15. CHEN, J.; MCCONNELL, D. B.; HENRY, R. J.; NORMAN, D. J. 2005. The foliage

plant industry. Horticultural Review, vol. 31, p. 45–110.

16. COFFIN, R.; TAPER, C. D.; CHONG, C. 1976. Sorbitol and sucrose as carbon source

for callus culture of some species of the Rosaceae. Canadian Journal of Botany, vol. 54,

p. 547–551.

17. COWAN, A. K.; RICHARDSON, R. G.; MAUREL, J. C. G. 1997. Stress-induced

abscisic acid transients and stimulus-response-coupling. Physiologia Plantarum, vol. 3, p.

491–499.

18. DILLEN, W.; DIJKSTRA, I.; OUD, J. 1996. Shoot regeneration in long-term callus

cultures derived from mature flowering plants of Cyclamen persicum Mill. Plant Cell

Reports, vol. 15, p. 545–548.

19. DOSKOTCH, R. W.; HUFFORD, C. D. 1970. Hexanor-cucurbitacin D, a degraded

cucurbitacin from Begonia tuberhybrida. Canadian Journal of Chemistry, vol. 48,

p.1787–1788.

20. DOSKOTCH, R. W.; MAKIK, M. Y.; BEAL, J. L. 1968. The isolation and

characterization of the antitumor principle from Begonia tuberhybrida. Lloydia, vol. 31,

424 p.

21. DUNCAN, D.R.; WILLIAMS, M.E.; ZEHR, B. E. 1985. The production of callus

capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea mays genotypes.

Planta, vol. 165, p. 322–332.

22. ESPINO, F. J.; LINACERO, R.; RUEDA, J.; VÁZQUEZ, A. M. 2004. Shoot

regeneration in four Begonia genotypes. Biologia Plantarum, vol. 48, p. 101–104.

23. EVANS, D. E.; COLEMAN, J. O. D.; KEARNS, A. 2003. Plant Cell Culture. Bios

Scientific Publishers, 194 p.

24. FRODIN, D. G. 2004. History and concepts of big plant genera. Taxon, vol. 53, p. 753–

776.

25. GAMBORG, O. L.; MILLER, R. A.; OJIMA, K. 1968. Nutrient requirementsof

suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, vol.50, p. 151–

158.

39

26. GARCIA-LUIS, A.; BORDON, Y.; MOREIDA-DIAS, J. M.; MOLINA, R. V.;

GUARDIOLA, J. L. 1999. Explant orientation and polarity determine the morphogenic

response of epicotyl segments of troyer citrange. Annals of Botany. p. 715–723.

27. GEIER, T.; KOHLENBACH, H. W.; REUTHER, G. 1983. Hand book of plant cell

culture. New York. p. 352–374.

28. GEIER, T. 1977. Morphogenesis and plant regeneration from cultured organ fragments of

Cyclamen persicum. Horticultural biotechnology in vitro culture and breeding, vol. 78,

p. 167–174.

29. GRIFFITHS, M. 1997. Index of garden plants. London, The Macmillan Press LTD. 866

p.

30. HASEGAWA, P. M. 1979. In vitro propagation of rose. Horticulture Science, vol. 14, p.

610–612.

31. HEYLEN, C.; VENDRIG, J. C. 1988. The influence of different cytokinins and auxins

on flower neoformation in thin cell layers of Nicotiana tabacum L. Plant Cell Physiology,

vol. 29, p. 665–671.

32. HERNANDEZ, F. 1651. Nova Plantarum, Animalium et Mineralium Mexicanorum

Historia. Rome: B. Deuersini et Z. Masotti.

33. HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in tissue culture and the problem of

organ determination. The Botanical Review, vol. 46, p. 1–23.

34. HOSOKI, T.; KAJINO, E. 2003. Shoot regeneration from petioles of coral bells

(Heuchera sanguinea Engelm.) cultured in vitro, and subsequent planting and flowering

ex vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, vol. 39, p. 135–138.

35. HOWELL, S. H.; LALL, S.; CHE, P. 2003. Cytokinins and shoot development. Trends

Plant Science, vol. 8, p. 453–459.

36. HUGHES, M. 2008. An annotated checklist of Southeast Asian Begonia. 164. Royal

Botanic Garden Edinburgh, vol 39, p. 98–113.

37. HUXLEY, A. 1992. Dictionary of gardening. Macmillan. p. 337–339

38. HVOSLEF-EIDE, A. K.; SAEBO, A. 1991. Effect of light quality on establishment of

cell suspension cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, vol. 50, p.

27–43.

39. JAIN, S.M. 2002. Feeding the world with induced mutations and biotechnology. In

Proceeding International Nuclear Conference 2002 – Global trends and Perspectives,

Bangi, Malaysia. p. 1–14.

40. JANKEVIČIENĖ, R. 1998. Botanikos vardų žodynas. Vilnius, Botanikos instituto

leidykla. 523 p.

40

41. KIEW, R. 2005. Begonias of Peninsular Malaysia. Malaysia. 308 p.

42. KIYOKAWA, T.; KIKUCHI, Y.; KAMADA, H.; HARADA, H. 1996. Genetic

transformation of Begonia tuberhybrida by Ri rol genes. Plant Cell Reports, vol. 15, p.

606–609.

43. KIYOWATA, S.; SHIMADA, Y.; KAMADA, H. 1992. Plant Tissue Culture Letters,

vol. 9, p. 90–93.

44. KUMARIA, S. 2012. In vitro regeneration of Begonia rubrovenia var. Meisteri C. B.

Clarke - A rare and endemic ornamental plant of Meghalaya, India. Indian Journal of

Biotechnology, vol. 11, p. 300–303.

45. LAFERRIERE, J. E. 1992. Begonia as food and medicine. Economic Botany, vol. 46, p.

114–116.

46. LAFERRIERE, J. E.; WEBER, C. W.; KOHLHEPP, E. A. 1991. Use and nutritional

composition of some traditional mountain pima plant foods. Journal Ethnobiology, vol.

11, p. 93–114.

47. LAFERRIERE, J. E. 1992. Begonia as food and medicine. Economic Botany, vol. 46, p.

114­116.

48. LIU, L.; MCDONALD, A. J. S.; STADENBERG, I.; DAVIES, W. J. 2001. Abscisic acid

in leaves and roots of willow: significance for stomatal conductance. Tree Physiology,

vol. 21, p. 759–764.

49. LUČINSKIENĖ, A. 1980. Kambarinės lapinės gėlės. Vilnius, Mokslas, 147 p.

50. MARINELLI, J. 2006. Augalai. KEW, Londonas. p. 382–483.

51. MARQUES, R. W. C.; CAIXETA FILHO, J. V. 2003. Avaliaçao da sazonalidade do

mercado de flores e plantas ornamentais no Estado de Sao Paulo. Revista Brasileira de

Horticultura Ornamental, vol. 9, p. 143–160.

52. MENDI, Y.Y.; CURUK, P.; KOCAMAN, E.; UNEK C.; ELDOGAN, S.; GENCEL, G.;

CETINER, S. 2009. Regeneration of begonia plantlets by direct organogenesis. African

Journal of Biotechnology, vol 8, p. 1860–1863.

53. MILLER, A. R.; SCHEERENS, J. C.; CHANDLER, C. K. 1992. Enhanced strawberry

seed germination through in vitro culture of cut achenes. Journal of the American Society

for Horticultural Science, vol. 117, p. 313–316.

54. MURASHIGE, T., SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, vol. 15, p. 473–497.

55. NHUT, D. T.; HAI, N. T.; HUYEN, P. X.; HUONG, D. T. Q.; HANG, N. T. T.;

TEIXEIRA DA SILVA, J. A. 2005. Thidiazuron induces high frequency shoot bud

41

formation from Begonia petiole transverse thin cell layer culture. Propagation of

Ornamental Plants, vol. 5, p. 149–155.

56. NHUT, D. T.; HAI, N. T.; SON, P. D. T.; HUYEN, P. X.; HANG, N. T. T. 2006. Thin

cell layer technology and bioreactor culture in rapid propagation of Begonia tuberous.

Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture. Nong Lam

University Ho Chi Minh City. p. 127–130.

57. PECK, D. E.; CUMING, B. G. 1984. In vitro propagation of Begonia tuberhybrida from

leaf section. Horticultural Science, vol. 19, p. 395–397.

58. PENG, C. I.; CHEN, Y. K. 1990. Begonia austrotaiwanensis (Begoniaceae), a new

species from southern Taiwan. Journal of Arnold Arboetum, vol. 71, p. 567–574.

59. PENG, C. I.; CHEN, Y. K. 1991. Hybridity and parentage of Begonia buimontana

Yamamoto (Begoniaceae) from Taiwan. Annals of the Missouri Botanical Garden, vol.

78, p. 995–1001.

60. PENG, C. I.; CHEN, Y. K.; YEN, H. F. 1988. Begonia raveni (Begoniaceae), a new

species from Taivan. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany &

Herbarium, vol. 29, p. 217–222.

61. PENG, C. I.; SUE, C.Y. 2000. Begonia x taipensis (Begoniaceae), a new natural hybrid

in Taiwan. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany & Herbarium,

vol. 41, p. 151–158.

62. PIERIC, R. L. M., TETTEROO F. A. A. 1987. Vegetative propagation of Begonia

venosa Skani in vitro from inflorescence explants. Plant Cell, Tissue and organ Culture,

vol. 10, p. 135–142.

63. PIERIK, R. L. M. 1997. In vitro culture of higher plants. The Netderlands, Kluwer

Academic Publishers, 202 p.

64. PIERIK, R. L. M.; TETTEROO F. A. A. 1987. Vegetative propagation of Begonia

venosa Skani in vitro from inflorescence explants. Plant Cell, Tissue and organ Culture,

vol. 10, p. 135–142,

65. PREIL, W. 2003. Micropropagation of ornamental plants. In: Laimer M, Rucker W,

editors. Plant tissue culture 100 years since Gottlieb Haberlandt. New York. p. 115–

133.

66. ROBERTS, D. R.; FLINN, B. S.; WEBB, D. T.; WEBSTER, F. B.; SUTTON, B. C.

1990. Abscisic acid and indole-3-butyric acid regulation of maturation and accumulation

of storage proteins in somatic embryos of interior spruce. Physiologia Plantarum,vol. 78,

p. 355–360.

42

67. ROUT, G. R.; MOHAPATRA, A.; JAIN, S. M. 2006. Tissue culture of ornamental pot

plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotechnology

Advances, vol. 24, p. 531–560.

68. ROUT, G. R.; DEBATA, B. K.; DAS, P. 1989. In vitro mass scale propagation of Rosa

hybrida cv. Landora. Current Science, vol. 58, p. 876–878.

69. ROUT, G. R.; JAIN, S. M. 2004. Micropropagation of ornamental plants cut flowers.

Propagation Ornamental Plants, vol. 4, p. 3–28.

70. SAKAMOTO, T.; KOBAYASHI, M.; ITOH, H.; TAGIRI, A.; KAYANO, T.;

TANAKA, H.; IWAHORI, S.; MATSUOKA, M. 2001. Expression of a gibberellin 2-

oxidase gene around the shoot apex is related to phase transition in rice. Plant

Physiology, vol. 125, p. 1508–1516.

71. SANDS, M. J. S. 2001. Begoniaceae in the Flora Malesiana region. In: L.G. Saw, L.S.L.

Chua & K.C. Khoo (eds), Taxonomy: The cornerstone of biodiversity: proceedings of the

Fourth International Flora Malesiana Symposium. Kuala Lumpur, 301 p.

72. SARA, K. 2012. Effect of explant type and growth regulators on in vitro

micropropagation of Begonia rex. International Research Journal of Applied and Basic S

ciences, vol. 3, p. 896­901.

73. SĂVULESCU, T. 1955. Flora Republicii Populare Române. Poland, Krakow. p. 8–10.

74. SIMMONDS, J. A.; WERRY, T. 1987. Liquid shake culture for improved

micropropagation of Begonia hiemalis. Horticultural Science, vol. 22, p. 122–124.

75. SIMMONDS, J. 1984. Induction, growth and direct rooting of advetitious shoots of

Begonia hiemalis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, vol. 3, p. 283–289.

76. SINGHA, S. 1982. Influence of agar concentration on in vitro shoot proliferation of

Malus sp. ‘Almeyʼ and Pyrus communis ‘Seckelʼ. Journal, American Society for

Horticultural Science, vol. 107, p. 657–660.

77. SKIRVIN, R. M.; CHU, M. C. 1979. In vitro propagation of ‘Forever Your’ rose.

Horticultural Science, vol. 14, p. 608–610.

78. SLIESARAVIČIUS, A.; STANYS, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Vilnius,

p. 234.

79. SMITH, L. B.; WASSHAUSEN, D. C.; GILDIG, J.; KAREGEANNES, C. E. 1986.

Begoniaceae Part 1 Illustrated Key. Smithsonian Institution Press, Washington D.C. p.

250–269.

80. SONEA, V.; PAVEL, A.; AILINCĂI N ŞELARU, E. 1979. Floricultură. Didactică şi

Pedagogică Publishing House. Bucharest, p. 241-242.

43

81. STANYS, V. 1997. In vitro kultūra augalų selekcijoje. Kintamumas ir stabilumas:

Agrarinių mokslų habilitacinis darbas. Babtai. 120 p.

82. STANYS, V.; GELVONAUSKIENE D. 1995. Screening of apple seedlings in embryonic

phase for the resistance to scab in cotyledon culture. Žemes ūkio mokslai, nr. 1, p. 57–61.

83. STRNAD, M.; SHMÜLLING, T. 2001. Regulation of plant growth by cytokinin.

Institute of Experimental Botany, Academy of Sciences of the Czech Republic, vol. 98, p.

10487–10492.

84. SUGIYAMA, M. 1999. Organogenesis in vitro. Plant Biology, p. 61–64.

85. TAKAYAMA, S. 1983. Begonia. Handbook of plant cell culture. New York. p. 253–283.

86. TAKAYAMA, S., 1990. Begonia. Handbook of plant Tissue culture. Macmillan. New

York. p. 253–283.

87. TARAKANOVAS, P.; RAUDONIUS, S. 2003. Agronominių tyrimų duomenų statistinė

analizė taikant kompiuterines programas ANOVA, STAT, SPLIT-PLOT iš paketo

SELEKCIJA ir IRRISTAT. Akademija (Kėdainių r.), 57 p.

88. TEBBIT, M. C.; GUAN, K.Y. 2002. Emended circumscription of Begonia sillensis

(Begoniaceae) and description of a new subspecies from Yunnan, China, vol. 12, p. 133–

136.

89. TEBBITT, M. C. 2005. Begonias: cultivation, identification, and natural history.

Portland, Oregon, U.S.A. p. 15–19.

90. TEIXEIRA DA SILVA, J.A. 2003: Thin Cell Layer technology in ornamental plant

micropropagation and biotechnology. African Journal of Biotechnology, vol. 2, p. 683–

691.

91. WAGNER W.W. 1999. The French begonia Society. The Begonian, vol, 66, p. 172–175.

92. WASSHAUSEN, D. C.; MCLELLAN. T. 1995. Begonia mariannensis (Begoniaceae), a

new species from Trinidad, West-Indies. Brittonia. p. 21–23.

93. XIA, Y.; DENG, X.; ZHOU, P.; SHIMA, K.; TEIXEIRA DA SILVA, J. A. 2006. The

world floriculture Industry: Dynamics of Production and Markets. Floriculture,

Ornamental and Plant Biotechnology. Advances and Tropical Issues, vol. 4, p. 336–347.

94. ZHU, M.; XU, A.; YUAN, M. 1990. Effects of amino acid on callus differentiation in

barley anther culture. Plant Cell Tissue, Organ Culture, vol. 22, p. 201–204.

44

DARBO APROBACIJA IR PUBLIKACIJOS

SAPOŽNIKOVIENĖ, R. 2015. Begonijos organogenezės indukcija in vitro. Jaunasis

mokslininkas 2015: studentų mokslinė konferencija: pranešimų rinkinys. Akademija

(Kauno r.), p. 125—127 (priedas Nr.1).

45

PRIEDAI

46

PRIEDAS Nr.1

47

48