bioaktive inhaltsstoffe aus pilzen · pilzfruchtkörper (reproduktives organ): ~ 1 monat über der...

Leibniz -Institut für Pflanzenbiochemie | 12/12/2015

Bioaktive Inhaltsstoffe aus Pilzen Norbert Arnold

1

Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe

Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?

Evolutionär sehr alte Organismen

Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben

Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde

2

Pilze: Großteil des Lebenskreislaufes unter der Oberfläche (Mycelium)

Pilzfruchtkörper (reproduktives Organ): ~ 1 Monat über der Oberfläche

Mycel: Armillaria bulbosa: 1 500 Jahre alt, über 10 000 kg, 15 ha

Armillaria ostoyae: 2 400 Jahre alt, 900 ha

3

Pilzfruchtkörper






Lebensweise: Mykorrhiza, Saprophyten

4

Lebensweise

5

Saprophytische Pilze

Ernähren sich von

totem organischen

Material

geringe strukturelle

Diversität der Inhaltsstoffe

hohe Anzahl von

Fruchtkörpern pro Myzel

abbauenden Enzyme ↑

Mycorrhizapilze

Ernährung durch den

Mylorrhizpartner (Bäume)

hohe strukturelle

Diversität der Inhaltsstoffe

geringe Anzahl von

Fruchtkörpern pro Myzel

abbauenden Enzyme ↓






Hohe Spezialisierung: z.B. Mykorrhiza

Hohe biologische Diversität = hohe chemische Diversität

neue bioaktive Naturstoffe zu erwarten

6

Warum sind die Fruchtkörper einiger Pilzgattungen (hier: Mykorrhizapilze) attraktiv für

„pilzliche Parasiten“, andere hingegen nicht?

Verhindern Abwehrsubstanzen einen parasitischen Befall ?

Feldbeobachtung

7

Gattung Hygrophorus

8

Tricholomataceae (Ritterlingsartige)

~ 60 Arten in Europa

Symbiose (Mykorrhiza) mit Bäumen:

Fichte, Tanne, Eiche, Buche, Weide

essbar bis ungenießbar, aber nie giftig.

Name: Hygro - phorus

griechisch: ὑγρω - φορειν

feucht – tragen(d)

Schnecklinge : Pilzfruchtkörper mit schleimigen Überzug

z. T. Farbreaktion des Stieles und Hutes mit KOH

selten von parasitischen Pilzen befallen

Gattung Hygrophorus

9

Sect. Hygrophorus – Subsect. Chrysodonti H. chrysodon

Gelbzahn-Schneckling

Sect. Hygrophorus – Subsect. Pallidini H. penarius

Trockener Schneckling

Sect. Hygrophorus – Subsect. Hygrophorus H. eburneus

Elfenbein-Schneckling

H. cossus Verfärbender Schneckling

H. hedrychii

Birkenschneckling

H. gliocyclus Schleimberingter Schneckling

H. carpini

Hainbuchen-Schneckling

H. chrysaspis

Sect. Pudorini – Subsect. Erubescentes H. erubescens

Rasiger Purpurschneckling

H. russula Purpur-schneckling

H. capreolarius

Weinroter Schneckling

Sect. Pudorini – Subsect. Pudorini H. poetarum

Isabellrötlicher Schneckling

H. nemoreus Wald-Schneckling

H. pudorinus

Orange-Schneckling

Sect. Discoidei H. discoideus

Braunscheibiger Schneckling

H. unicolor Orangefalber Schneckling

H. lucorum

Lärchen- Schneckling

H. hypothejus Frostschneckling

Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Olivaceoumbrini H. olivaceoalbus

Natterstieliger Schneckling

H. persoonii

Olivgestiefelter Schneckling

H. latitabundus

Großer Kiefern-Schneckling

Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Tephroleuci H. pustulatus

Schwarzpunktierter Schneckling

H. agathosmus

Mehliger Schneckling

10

Bioaktivitäts-geleitete Isolierung der Inhaltsstoffe

Isolierung und

Strukturaufklärung

Extraktion

Probenvorbereitung

In vitro Bioaktivitäts-

untersuchungen

Synthese

Derivatisierung

In vitro / in vivo

Tests

Rein-

substanz aktiv Leitstruktur

pharmako-

kinetische Studien

aktiv

Biosynthese-

untersuchungen

Biotests auf fungizide Wirkung

Botrytis cinerea

Graufäule, Grauschimmel

Erdbeeren, Weinrebe

Septoria tritici

Blattdürre

Weizen, Roggen

Phytophthora infestans

Kraut- und Knollenfäule

Kartoffel, Tomate

11

Biotest auf fungizide Wirkung – direkte Bioautographie

Cladosporium cucumerinum

Gurkenkrätze

Gurke, Kürbis

12

13

Aufbringen der Extrakte/Substanzen auf DC-Platten

14

Besprühen mit Sporen von Cladosporium cucumerinum

15

Keimung und Myzelwachstum (2 Tage, 25°C)

16

Auswertung und Dokumentation

17

50 µg 400 µg 200 µg 100 µg

EtOAc Rohextrakt

EtOAc Rohextrakt nach DC-Entwicklung

Tageslicht 365 nm 254 nm Nach Inkubation

Direkte Bioautographie

Strukturaufklärung

Massenspektrometrie: Summenformel

NMR-Spektoskopie: 1H, 13C

Optische Spektroskopie: UV, CD

Hygrophorus eburneus

HO

O

O

HO

O

O

HO

O

O

HO

O

O

HO

O

O

HO

O

O

20

4-Oxo-2-alken Fettsäuren

HO

O

O

HO

O

O

HO

O

O

(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid

(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid

(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid

21

HO

O

O HO

O

O

(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid (1) (2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid (5)

HO

O

O

HO

O

O

(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11,17-trienoic acid (2) (2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid (6)

HO

O

O

HO

O

O

(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9,17-trienoic acid (3) (E)-4-oxooctadeca-2,17-dienoic acid (7)

HO

O

O

HO

O

O

(E)-4-oxohexadeca-2-enoic acid (4) (E)-4-oxooctadeca-2-enoic acid (8)

4-Oxo-2-alken Fettsäuren

Synthese

O

b

1

O

a

H

O

O

c

2

HO

O

O4

NaO

O

O

d

3

Gewächshaustests

Feldversuche

Solanum tuberosum infiziert mit Phytophthora infestans

25

Hygrophorone

1'000

ng

500

ng

1'500

ng

6'000

ng

4'000

ng

2'000

ng

2'500

ng

8'000

ng

O

OR1

OR2

O

n

R3

26

Hygrophorone

O

OR1

OR2

O

n

R3

O

OR1

OR2

OR3

CnH2n+1

4

56

1: R1 = Ac

2: R1 = Ac

3: R1 = H

4: R1 = Ac

5: R1 = Ac

6: R1 = H

7: R1 = H

8: R1 = Ac

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = Ac

n = 12

n = 12

n = 12

n = 14

n = 14

n = 14

n = 12

n = 12_

R3 = Ac

R3 = H

R3 = Ac

R3 = Ac

R3 = H

R3 = Ac

R3 = H

R3 = Ac

O

OR1OR2

OR3

CnH2n+14

56

_9: R1 = H

10: R1 = H

11: R1 = Ac

12: R1 = H

13: R1 = Ac

14: R1 = Ac

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = H

R2 = Ac

n = 14

n = 16

n = 14

n = 14

n = 14

n = 14_

R3 = H

R3 = H

R3 = H

R3 = Ac

R3 = Ac

R3 = Ac

O

OR

OH

O

CnH2n+14

56

19: R = Ac20: R = H

21: R = Ac

n = 12n = 12n = 14

O

C12H25

O

OR

OH4

56

17: R = Ac18: R = H

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

27

Neue Hygrophoron-artige Verbindungen aus H. abieticola

Pseudohygrophoron A12

Pseudohygrophoron B12

O

OR1OR2

O

n

R3

Hygrophorone

Biosyntheseuntersuchungen

28

Verfütterungsexperimente mit 13C markierten Substanzen

13 C-NMR Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance, Kernresonanzspektrometrie)

O

OH

HO

HO OH

OH

D-glucose

H3C COOH

O

H3C SCoA

O

pyruvic acid

acetyl-CoA

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

HO

pentenomycin

anhydrofructose

hygrophorone B12

BA glucan

metabolismglycolysis

OH

OH

OHO? ?

2

1

3 4

5 67

18

17

Mögliche Biosynthese von Hygrophoron B12

29

1. Dokumentation

Verfütterungsexperimente

30

31


2. Vorbereitung

32


3. Probenvorbereitung

33


4. Verimpfung

34


35


5. Dokumentation

36


O

SCoA

[U-13C6]-glucose

[2-13C]-acetate

hygrophorone B12

O

OH

OH

1

4

2

3

5

OH

17

18

6

168

7

37

Beobachtetes Isotopenmuster

O

SCoA

[U-13C6]-glucose

[2-13C]-acetate

O

O

O

O

1

4

2

3

56

Hygrophorone B12

O

OH

OH

1

4

2

3

5

OH

17

18

C12H25 C12H25O

O

O

C12H25

6

OH

OH

168

7

38

Beobachtetes Isotopenmuster

4-oxooctadec-2-enoic acid

HO

(E)

O

SCoA

hygrophorone B12

O

O

O

(Z)

O

OH1

1

4

4

O

OH

OH

1

4

2

3

5

OH

17

18

6

6

6

OH

chrysotrione B homologue

O

O

1

4

2

3

5

O

17

18

6

reduction to hydroxyl group (C-4 & C-6)hydroxylation at C-5

intramolecular condensationoxidation to carbonyl group (C-6)

E/Z isomerizationhydroxylation at C-6

17

18

17

18

5

5

Biosynthese von Hygrophoron B12

39

40

Hygrophorus hyacinthinus Quel.

daylight uv light (365 nm)

41

DC-Vergleich mit Cortinarius brunneus

H. hyacinthinus Cortinarius brunneus

TLC: BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1

42

β-Carbolin-Alkaloide in Hygrophorus spp.

uv 254 nm uv 365 nm

NH

N

NH

N

Me

1-Methyl-9-H-carboline

Harman

9H-pyrrido[3,4-b]indole

Norharman

43

R = H: Norharman

R = CH3: Harman

NH

N

R

Algizide Aktivität von Harman and Norharman

Spirulina laxissima

Norharman

Harman

Scenedesmus rubescens

100 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg 100 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg

NH

NCl CH3

I

Nostocarbolin

β-Carbolin-Alkaloide aus Cortinarius brunneus

NH

N

HO

COOH

CH3

NH

N

COOHHO

NH

NH

HO

COOH

CH3

NH

NH

HO

COOH

3-(7-Hydroxy-9H--carboline-1-yl)propanoic acid

Brunnein A

Brunnein C

Brunnein B

44

45

* Paul G. Becher, Julien Beuchat, Karl Gademann, Friedrich Jüttner (2005) - Nostocarboline: Isolation and Synthesis of a New Cholinesterase Inhibitor fromNostoc 78-12A, J. Nat. Prod., 68, 1793-1795.

Bioaktivität – Hemmung der Acetylcholinesterase

NH

N

COOH

CH3HO

Nostocarboline * Brunnein A

NH

NCl CH3

I

in vitro Assay zur AChE-Hemmung (Methode nach Ellman)

versus

46

Vorkommen der β-Carbolinalkaloide in Hygrophorus spp.

Brunnein A wurde ausschliesslich in Arten

der Sektion Olivaceoumbrini gefunden

Harman und Norharman kommen ubiquitär

innerhalb von Hygrophorus vor

= chemotaxonomischer Marker

der Gattung Hygrophorus

= chemotaxonomischer Marker der

Sektion Olivaceoumbrini

47

N-Glukosyl-Indol-Derivative aus Cortinarius brunneus

N

O

O

OHHO

OH

HO

25

8

3

9

4

6

71'

2'

3'4'

5'6'

N

O

O

OHHO

OH

HO

25

34

6

71'

2'

3'4'

5'6'

8

N

O

OH

O

OHHO

OH

HO

25

8

34

6

71'

2'

3'4'

5'6'

9

N

O

O

O

OHHO

OH

HO

25

8

34

6

71'

2'

3'4'

6'5'

9

10

48

Bioaktivität von N-Glucosyl-(1H-indol-3-yl)-essigsäure

N

O

OH

O

OHHO

OH

HO

NH

O

OH

in Pflanzen natürlich vorkommendes

Phytohormon aus der Gruppe der Auxine

wirkt schon in kleinsten Mengen

stimuliert in geringen Konzentrationen

Wachstum von Pflanzen/Wurzeln

inhibiert in hohen Konzentrationen Wachstum von

Pflanzen/Wurzeln

Indol-3-yl-essigsäure (IES)

49

NH

O

OH

N

O

OH

O

OHHO

OH

HO

Auxinassay - A. thaliana Wurzelspitzenwachstum (10 d)

Molekulare Analyse: 2 Sektionen

Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.

Morphologie: 1 Sektion

Sekt. Amarescentes:

C. infractus

C. subtortus

Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.

Cortinarius subtortus - infractus

Unterschiede im Sekundärmetabolitenmuster?

50

(Iso)-Chinolin-Alkakloide aus Cortinarius subtortus

NH

COOH

HO

O

N

COOH

HO

NH2

N

COOH

HO

6-Hydroxyquinoline-8-carboxylic acid

4-Amino-6-hydroxyquinoline-8-carboxylic acid

7-Hydroxy-1-oxo-1,2-dihydroisoquinoline-5-carboxylic acid

51

Hemmung des Mycelwachstums von Colletotrichum coccodes

Myzelwachstumsinhibierungsassay - Co. coccodes (6 dpi)

-20

0

20

40

60

80

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

Konz. [µM]

Inh

ibie

run

g [

%]

63

64

65

156

N

COOH

HO

N

COOH

HO

NH2

NH

COOH

HO

O

NH

OH2

+

SO4-

1

8-Quinolinol hemisulfate

N

COOH

HO

8-Hydroxyquinoline-6-carboxylic acid

(Iso)-Chinolin-Alkaloide als Antiseptika

N

OH

2

+

SO4-

1

54

Cortinarius infractus (Pers.) Fr.

N

N+

O

HO

Cl-

N

N+

O

Cl-

10-hydroxy-infractopicrin

Infractopicrin

55

Bioaktivität – Hemmung der Cholinesterase

Molekulare Analyse: 2 Sectionen

Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.

Morphologie: 1 Section

Sect. Amarescentes:

C. infractus

C. subtortus

Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.

Cortinarius subtortus - infractus

Sektion Infracti*

C. infractus

Indol-Alkaloide**

NH

COOH

HO

O

N

COOH

HO

NH2

N

COOH

HO

Sektion Subtorti*

C. subtortus

(Iso-)Chinolin-Alkaloide

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

Leibniz-Institut für Pflanzenbiochmie | Norbert Arnold | 12/12/2015 57

A. Otto

E. Bette

T. Dräger

A. Laub

Dr. T. Teichert

Dr. L. Lübken

Dr. A. Porzel (NMR)

Dr. J. Schmidt (Massenspektrometrie)

Dr. W. Brandt (CD Berechnungen)

Prof. Dr. B. Westermann (Synthese)

Prof. Dr. L. Wessjohann (Synthese)

References

Teichert, A., Lübken, T., Schmidt, J., Porzel, A., Arnold, N. & Wessjohann, L. (2005) - Unusual bioactive 4-oxo-2-alkenoic fatty acids

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