Leibniz -Institut für Pflanzenbiochemie | 12/12/2015
Bioaktive Inhaltsstoffe aus Pilzen Norbert Arnold
1
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
Evolutionär sehr alte Organismen
Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
2
Pilze: Großteil des Lebenskreislaufes unter der Oberfläche (Mycelium)
Pilzfruchtkörper (reproduktives Organ): ~ 1 Monat über der Oberfläche
Mycel: Armillaria bulbosa: 1 500 Jahre alt, über 10 000 kg, 15 ha
Armillaria ostoyae: 2 400 Jahre alt, 900 ha
3
Pilzfruchtkörper
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
Evolutionär sehr alte Organismen
Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
Lebensweise: Mykorrhiza, Saprophyten
4
Lebensweise
5
Saprophytische Pilze
Ernähren sich von
totem organischen
Material
geringe strukturelle
Diversität der Inhaltsstoffe
hohe Anzahl von
Fruchtkörpern pro Myzel
abbauenden Enzyme ↑
Mycorrhizapilze
Ernährung durch den
Mylorrhizpartner (Bäume)
hohe strukturelle
Diversität der Inhaltsstoffe
geringe Anzahl von
Fruchtkörpern pro Myzel
abbauenden Enzyme ↓
Pilzfruchtkörper als Quelle für neue Naturstoffe
Warum beschäftigen wir uns mit Pilzen ?
Evolutionär sehr alte Organismen
Erste mehrzellige Lebewesen, die das Land besiedelt haben
Lebenskreislauf: verschiedene Lebensräume, daher verschiedene Feinde
Hohe Spezialisierung: z.B. Mykorrhiza
Hohe biologische Diversität = hohe chemische Diversität
neue bioaktive Naturstoffe zu erwarten
6
Warum sind die Fruchtkörper einiger Pilzgattungen (hier: Mykorrhizapilze) attraktiv für
„pilzliche Parasiten“, andere hingegen nicht?
Verhindern Abwehrsubstanzen einen parasitischen Befall ?
Feldbeobachtung
7
Gattung Hygrophorus
8
Tricholomataceae (Ritterlingsartige)
~ 60 Arten in Europa
Symbiose (Mykorrhiza) mit Bäumen:
Fichte, Tanne, Eiche, Buche, Weide
essbar bis ungenießbar, aber nie giftig.
Name: Hygro - phorus
griechisch: ὑγρω - φορειν
feucht – tragen(d)
Schnecklinge : Pilzfruchtkörper mit schleimigen Überzug
z. T. Farbreaktion des Stieles und Hutes mit KOH
selten von parasitischen Pilzen befallen
Gattung Hygrophorus
9
Sect. Hygrophorus – Subsect. Chrysodonti H. chrysodon
Gelbzahn-Schneckling
Sect. Hygrophorus – Subsect. Pallidini H. penarius
Trockener Schneckling
Sect. Hygrophorus – Subsect. Hygrophorus H. eburneus
Elfenbein-Schneckling
H. cossus Verfärbender Schneckling
H. hedrychii
Birkenschneckling
H. gliocyclus Schleimberingter Schneckling
H. carpini
Hainbuchen-Schneckling
H. chrysaspis
Sect. Pudorini – Subsect. Erubescentes H. erubescens
Rasiger Purpurschneckling
H. russula Purpur-schneckling
H. capreolarius
Weinroter Schneckling
Sect. Pudorini – Subsect. Pudorini H. poetarum
Isabellrötlicher Schneckling
H. nemoreus Wald-Schneckling
H. pudorinus
Orange-Schneckling
Sect. Discoidei H. discoideus
Braunscheibiger Schneckling
H. unicolor Orangefalber Schneckling
H. lucorum
Lärchen- Schneckling
H. hypothejus Frostschneckling
Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Olivaceoumbrini H. olivaceoalbus
Natterstieliger Schneckling
H. persoonii
Olivgestiefelter Schneckling
H. latitabundus
Großer Kiefern-Schneckling
Sect. Olivaceoumbrini – Subsect. – Tephroleuci H. pustulatus
Schwarzpunktierter Schneckling
H. agathosmus
Mehliger Schneckling
10
Bioaktivitäts-geleitete Isolierung der Inhaltsstoffe
Isolierung und
Strukturaufklärung
Extraktion
Probenvorbereitung
In vitro Bioaktivitäts-
untersuchungen
Synthese
Derivatisierung
In vitro / in vivo
Tests
Rein-
substanz aktiv Leitstruktur
pharmako-
kinetische Studien
aktiv
Biosynthese-
untersuchungen
Biotests auf fungizide Wirkung
Botrytis cinerea
Graufäule, Grauschimmel
Erdbeeren, Weinrebe
Septoria tritici
Blattdürre
Weizen, Roggen
Phytophthora infestans
Kraut- und Knollenfäule
Kartoffel, Tomate
11
Biotest auf fungizide Wirkung – direkte Bioautographie
Cladosporium cucumerinum
Gurkenkrätze
Gurke, Kürbis
12
17
50 µg 400 µg 200 µg 100 µg
EtOAc Rohextrakt
EtOAc Rohextrakt nach DC-Entwicklung
Tageslicht 365 nm 254 nm Nach Inkubation
Direkte Bioautographie
Strukturaufklärung
Massenspektrometrie: Summenformel
NMR-Spektoskopie: 1H, 13C
Optische Spektroskopie: UV, CD
20
4-Oxo-2-alken Fettsäuren
HO
O
O
HO
O
O
HO
O
O
(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid
(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid
(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid
21
HO
O
O HO
O
O
(E)-4-oxohexadeca-2,15-dienoic acid (1) (2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11-dienoic acid (5)
HO
O
O
HO
O
O
(2E,11Z)-4-oxooctadeca-2,11,17-trienoic acid (2) (2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9-dienoic acid (6)
HO
O
O
HO
O
O
(2E,9E)-4-oxooctadeca-2,9,17-trienoic acid (3) (E)-4-oxooctadeca-2,17-dienoic acid (7)
HO
O
O
HO
O
O
(E)-4-oxohexadeca-2-enoic acid (4) (E)-4-oxooctadeca-2-enoic acid (8)
4-Oxo-2-alken Fettsäuren
25
Hygrophorone
1'000
ng
500
ng
1'500
ng
6'000
ng
4'000
ng
2'000
ng
2'500
ng
8'000
ng
O
OR1
OR2
O
n
R3
26
Hygrophorone
O
OR1
OR2
O
n
R3
O
OR1
OR2
OR3
CnH2n+1
4
56
1: R1 = Ac
2: R1 = Ac
3: R1 = H
4: R1 = Ac
5: R1 = Ac
6: R1 = H
7: R1 = H
8: R1 = Ac
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = Ac
n = 12
n = 12
n = 12
n = 14
n = 14
n = 14
n = 12
n = 12_
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
R3 = H
R3 = Ac
O
OR1OR2
OR3
CnH2n+14
56
_9: R1 = H
10: R1 = H
11: R1 = Ac
12: R1 = H
13: R1 = Ac
14: R1 = Ac
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = H
R2 = Ac
n = 14
n = 16
n = 14
n = 14
n = 14
n = 14_
R3 = H
R3 = H
R3 = H
R3 = Ac
R3 = Ac
R3 = Ac
O
OR
OH
O
CnH2n+14
56
19: R = Ac20: R = H
21: R = Ac
n = 12n = 12n = 14
O
C12H25
O
OR
OH4
56
17: R = Ac18: R = H
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
27
Neue Hygrophoron-artige Verbindungen aus H. abieticola
Pseudohygrophoron A12
Pseudohygrophoron B12
O
OR1OR2
O
n
R3
Hygrophorone
Biosyntheseuntersuchungen
28
Verfütterungsexperimente mit 13C markierten Substanzen
13 C-NMR Spektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance, Kernresonanzspektrometrie)
O
OH
HO
HO OH
OH
D-glucose
H3C COOH
O
H3C SCoA
O
pyruvic acid
acetyl-CoA
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
HO
pentenomycin
anhydrofructose
hygrophorone B12
BA glucan
metabolismglycolysis
OH
OH
OHO? ?
2
1
3 4
5 67
18
17
Mögliche Biosynthese von Hygrophoron B12
29
O
SCoA
[U-13C6]-glucose
[2-13C]-acetate
hygrophorone B12
O
OH
OH
1
4
2
3
5
OH
17
18
6
168
7
37
Beobachtetes Isotopenmuster
O
SCoA
[U-13C6]-glucose
[2-13C]-acetate
O
O
O
O
1
4
2
3
56
Hygrophorone B12
O
OH
OH
1
4
2
3
5
OH
17
18
C12H25 C12H25O
O
O
C12H25
6
OH
OH
168
7
38
Beobachtetes Isotopenmuster
4-oxooctadec-2-enoic acid
HO
(E)
O
SCoA
hygrophorone B12
O
O
O
(Z)
O
OH1
1
4
4
O
OH
OH
1
4
2
3
5
OH
17
18
6
6
6
OH
chrysotrione B homologue
O
O
1
4
2
3
5
O
17
18
6
reduction to hydroxyl group (C-4 & C-6)hydroxylation at C-5
intramolecular condensationoxidation to carbonyl group (C-6)
E/Z isomerizationhydroxylation at C-6
17
18
17
18
5
5
Biosynthese von Hygrophoron B12
39
41
DC-Vergleich mit Cortinarius brunneus
H. hyacinthinus Cortinarius brunneus
TLC: BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1
42
β-Carbolin-Alkaloide in Hygrophorus spp.
uv 254 nm uv 365 nm
NH
N
NH
N
Me
1-Methyl-9-H-carboline
Harman
9H-pyrrido[3,4-b]indole
Norharman
43
R = H: Norharman
R = CH3: Harman
NH
N
R
Algizide Aktivität von Harman and Norharman
Spirulina laxissima
Norharman
Harman
Scenedesmus rubescens
100 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg 100 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg
NH
NCl CH3
I
Nostocarbolin
β-Carbolin-Alkaloide aus Cortinarius brunneus
NH
N
HO
COOH
CH3
NH
N
COOHHO
NH
NH
HO
COOH
CH3
NH
NH
HO
COOH
3-(7-Hydroxy-9H--carboline-1-yl)propanoic acid
Brunnein A
Brunnein C
Brunnein B
44
45
* Paul G. Becher, Julien Beuchat, Karl Gademann, Friedrich Jüttner (2005) - Nostocarboline: Isolation and Synthesis of a New Cholinesterase Inhibitor fromNostoc 78-12A, J. Nat. Prod., 68, 1793-1795.
Bioaktivität – Hemmung der Acetylcholinesterase
NH
N
COOH
CH3HO
Nostocarboline * Brunnein A
NH
NCl CH3
I
in vitro Assay zur AChE-Hemmung (Methode nach Ellman)
versus
46
Vorkommen der β-Carbolinalkaloide in Hygrophorus spp.
Brunnein A wurde ausschliesslich in Arten
der Sektion Olivaceoumbrini gefunden
Harman und Norharman kommen ubiquitär
innerhalb von Hygrophorus vor
= chemotaxonomischer Marker
der Gattung Hygrophorus
= chemotaxonomischer Marker der
Sektion Olivaceoumbrini
47
N-Glukosyl-Indol-Derivative aus Cortinarius brunneus
N
O
O
OHHO
OH
HO
25
8
3
9
4
6
71'
2'
3'4'
5'6'
N
O
O
OHHO
OH
HO
25
34
6
71'
2'
3'4'
5'6'
8
N
O
OH
O
OHHO
OH
HO
25
8
34
6
71'
2'
3'4'
5'6'
9
N
O
O
O
OHHO
OH
HO
25
8
34
6
71'
2'
3'4'
6'5'
9
10
48
Bioaktivität von N-Glucosyl-(1H-indol-3-yl)-essigsäure
N
O
OH
O
OHHO
OH
HO
NH
O
OH
in Pflanzen natürlich vorkommendes
Phytohormon aus der Gruppe der Auxine
wirkt schon in kleinsten Mengen
stimuliert in geringen Konzentrationen
Wachstum von Pflanzen/Wurzeln
inhibiert in hohen Konzentrationen Wachstum von
Pflanzen/Wurzeln
Indol-3-yl-essigsäure (IES)
Molekulare Analyse: 2 Sektionen
Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.
Morphologie: 1 Sektion
Sekt. Amarescentes:
C. infractus
C. subtortus
Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.
Cortinarius subtortus - infractus
Unterschiede im Sekundärmetabolitenmuster?
50
(Iso)-Chinolin-Alkakloide aus Cortinarius subtortus
NH
COOH
HO
O
N
COOH
HO
NH2
N
COOH
HO
6-Hydroxyquinoline-8-carboxylic acid
4-Amino-6-hydroxyquinoline-8-carboxylic acid
7-Hydroxy-1-oxo-1,2-dihydroisoquinoline-5-carboxylic acid
51
Hemmung des Mycelwachstums von Colletotrichum coccodes
Myzelwachstumsinhibierungsassay - Co. coccodes (6 dpi)
-20
0
20
40
60
80
100
0,001 0,01 0,1 1 10 100
Konz. [µM]
Inh
ibie
run
g [
%]
63
64
65
156
N
COOH
HO
N
COOH
HO
NH2
NH
COOH
HO
O
NH
OH2
+
SO4-
1
8-Quinolinol hemisulfate
N
COOH
HO
8-Hydroxyquinoline-6-carboxylic acid
(Iso)-Chinolin-Alkaloide als Antiseptika
N
OH
2
+
SO4-
1
54
Cortinarius infractus (Pers.) Fr.
N
N+
O
HO
Cl-
N
N+
O
Cl-
10-hydroxy-infractopicrin
Infractopicrin
Molekulare Analyse: 2 Sectionen
Garnica, S.; Weiss, M.; Oertel, B.; Oberwinkler, F. (2005) - Can. J. Bot. 2005, 1457–1477.
Morphologie: 1 Section
Sect. Amarescentes:
C. infractus
C. subtortus
Moser, M. in: Singer, R. (1986) – The Agaricales in modern taxonomy. Koeltz.
Cortinarius subtortus - infractus
Sektion Infracti*
C. infractus
Indol-Alkaloide**
NH
COOH
HO
O
N
COOH
HO
NH2
N
COOH
HO
Sektion Subtorti*
C. subtortus
(Iso-)Chinolin-Alkaloide
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
Leibniz-Institut für Pflanzenbiochmie | Norbert Arnold | 12/12/2015 57
A. Otto
E. Bette
T. Dräger
A. Laub
Dr. T. Teichert
Dr. L. Lübken
Dr. A. Porzel (NMR)
Dr. J. Schmidt (Massenspektrometrie)
Dr. W. Brandt (CD Berechnungen)
Prof. Dr. B. Westermann (Synthese)
Prof. Dr. L. Wessjohann (Synthese)
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