biologiczne skutki promieniowania jonizujĄcego › ~pluta › pl › dyd › pokl33 › pdf ›...

BIOLOGICZNE SKUTKI PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO

1


Materiał dydaktyczny dla Wydziału Fizyki Politechniki Warszawskiej w ramach bloku wykładów

pt.: „Podstawy Bezpieczeństwa Jądrowego i Ochrony Radiologicznej” Zadanie nr 33 „Modyfikacja kształcenia na Wydziale Fizyki w zakresie wykorzystywania technik i

technologii jądrowych w gospodarce narodowej” Projekt „Program Rozwojowy Politechniki Warszawskiej” współfinansowanego przez Unię Europejską w

ramach Europejskiego Funduszu Społecznego (Program Operacyjny Kapitał Ludzki)

Opracował

Dr Paweł Krajewski

Centralne Laboratorium Ochrony Radiologicznej

Warszawa

grudzieo 2009


2

Spis treści 1 Wybrane podstawowe informacje o organizacji materii żywej ............................................................... 4

1.1 Wstęp .............................................................................................................................................. 4

1.2 Organizm, tkanki, komórki .............................................................................................................. 4

1.3 Komórki zróżnicowane i niezróżnicowane ...................................................................................... 5

1.4 Podstawowe informacje o strukturach wewnątrzkomórkowych .................................................... 6

1.5 Budowa DNA, podwójna helisa, chromosomy, chromatyna........................................................... 7

1.6 Budowa DNA ................................................................................................................................. 10

1.7 Podwójna helisa ............................................................................................................................ 11

1.8 Chromatyna, chromosomy ........................................................................................................... 11

1.9 Powstawanie mutacji .................................................................................................................... 14

2 Oddziaływanie promieniowania na różnym poziomie organizacji materii żywej .................................. 16

2.1 Radioliza wody .............................................................................................................................. 16

2.2 Działanie bezpośrednie i działanie pośrednie ............................................................................... 16

2.3 Oddziaływanie promieniowania na białka .................................................................................... 17

2.4 Oddziaływanie promieniowania na lipidy ..................................................................................... 17

2.5 Oddziaływanie promieniowania na DNA ...................................................................................... 18

2.6 Uszkodzenia zasad ........................................................................................................................ 19

2.7 Pęknięcia nici DNA ........................................................................................................................ 19

2.8 DNA struktura najbardziej promieniowrażliwa ............................................................................. 19

2.9 Oddziaływanie promieniowania na komórki, wrażliwośd na promieniowanie komórek proliferujących i nieproliferujących ........................................................................................................... 20

2.10 Oddziaływanie promieniowania na tkanki, wrażliwośd tkanek na promieniowanie .................... 22

2.11 Oddziaływanie promieniowania na organizm, promieniowrażliwośd osobnicza, LD50................ 23

3 Skutki działania promieniowania jonizującego ..................................................................................... 26

3.1 Wstęp ............................................................................................................................................ 26

3.2 Skutki działania promieniowania na poziomie komórkowym (krzywa przeżywalności) ............... 26

3.3 Skutki stochastyczne i deterministyczne....................................................................................... 30

3.4 Szczegółowa charakterystyka skutków stochastycznych i deterministycznych ............................. 30

3.5 Zróżnicowana skutecznośd biologiczna różnych rodzajów promieniowania ................................ 33


3

4 Działania w celu ograniczenia lub zwiększenia skutków napromienienia ............................................. 34

4.1 Blokada tarczycy ........................................................................................................................... 34

4.2 Chelatory....................................................................................................................................... 35

4.3 Właściwa opieka medyczna i przeszczepy szpiku.......................................................................... 35

4.4 Radioprotektory ............................................................................................................................ 36

4.5 Radiouczulacze i związki radioochronne ....................................................................................... 37

5 Naprawa uszkodzeo popromiennych ** ............................................................................................... 38

5.1 Wstęp ............................................................................................................................................ 38

5.2 Uszkodzenia potencjalnie letalne i subletalne .............................................................................. 38

5.3 Naprawa przez wycinanie zasad ................................................................................................... 38

5.4 Naprawa dwuniciowych pęknięd DNA .......................................................................................... 39

5.4.1 Niehomologiczne łączenie kooców ...................................................................................... 39

5.4.2 Naprawa homologiczna ........................................................................................................ 39

5.5 Naprawa uszkodzeo popromiennych na poziomie komórek ........................................................ 40

5.6 Naprawa uszkodzeo popromiennych na poziomie tkanek............................................................ 40

6 Dozymetria biologiczna ......................................................................................................................... 40

6.1 Metody biologiczne umożliwiające określenie dawki pochłoniętej ............................................. 40

6.2 Metody dozymetrii biologicznej ................................................................................................... 41

6.2.1 Metody natychmiastowe ...................................................................................................... 41

6.3 Metody retrospektywne ............................................................................................................... 43

Bibliografia..................................................................................................................................................... 48


4

1 Wybrane podstawowe informacje o organizacji materii żywej

1.1 Wstęp

Wszystkie organizmy żywe składają się z wody i innych związków nieorganicznych orazzwiązków organicznych. Woda jest podstawowym składnikiem komórek i stanowi około 2/3 masy organizmu. Jest środowiskiem większości reakcji chemicznych zachodzących w komórce. Najwięcej wody znajduje się w limfie (95%), osoczu krwi (90%) i tkance nerwowej (88%), najmniej w szkliwie zębów (0,2%). Polarna budowa cząsteczki wody (nierównomierne rozłożenie ładunku elektrycznego), określa jej właściwości fizykochemiczne i powoduje, że jest ona doskonałym rozpuszczalnikiem innych substancji polarnych, soli i

substancji zdolnych do tworzenia wiązao wodorowych. Takie substancje nazywa się hydrofilowymi (dosłownie lubiącymi wodę), w przeciwieostwie do substancji hydrofobowych (nielubiących wody), które nie tworzą wiązao wodorowych i nie rozpuszczają się w wodzie. Substancje takie zbierają się na powierzchni wody lub tworzą skupiska, tak żeby powierzchnia ich kontaktu z wodą była jak najmniejsza

(np. węglowodory). Substancje posiadająceregion hydrofobowy i hydrofilowy nazywamy amfifilowymi (np. fosfolipidy) i w wodzie tworzą one micelle – sfery skierowane stroną hydrofilową na zewnątrz, a stroną hydrofobową do środka.

Opisane mechanizmy mają duże znaczenie dla zachowania się makrocząsteczek biologicznych, takich jak kompleksy lipidowe błon komórkowych i białka, których struktura wyższego rzędu wynika m.in. z oddziaływania z wodą.

Związki nieorganiczne występują najczęściej w postaci rozpuszczonych w wodzie kationów

(np. K+, Na+, Cu+, Ca2+, Cu2+ , Fe2+, Mg2+, Fe3+), anionów Cl‐, NO2‐, NO3‐, SO42‐, CO32‐, PO43‐) i rodników lub anio‐ i kationorodników (•OH, •NO, O2‐•, H2O•+).

Związki organiczne występują w postaci substancji drobnocząsteczkowych lub wielkocząsteczkowych (makrocząsteczki). Makrocząsteczki to zwykle biopolimery złożone z setek lubtysięcy mniejszych cząsteczek (monomerów). Najważniejsze z nich to węglowodany, lipidy, białka, ikwasy nukleinowe.

1.2 Organizm, tkanki, komórki

Organizmem nazywamy istotę żywą cechującą się procesami życiowymi (np. przemianą materii) i stanowiącą odrębną, samodzielną strukturę, zdolną do namnażania. Organizm może składad się z jednej komórki (jednokomórkowce, np. bakterie, niektóre glony i pierwotniaki) lub wielu komórek (organizmy wielokomórkowe, np. rośliny, zwierzęta, niektóre grzyby, glony i pierwotniaki). Budowy komórkowej nie mają wirusy i w związku z tym nie wykazują oznak życia poza komórkami

żywicieli. Zgodnie z obecnymi poglądami systematycznymi nie są więc klasyfikowane, jako organizmy żywe.

Komórka jest najmniejszą budulcową i funkcjonalną jednostką organizmu zdolną do przeprowadzania wszystkich podstawowych procesów życiowych. Komórki organizmów wielokomórkowych mogą tworzyd tkanki (organizmy tkankowe), a te z kolei tworzą narządy często połączone w układy.

Tkanką nazywamy zespół komórek o podobnej budowie, funkcjach, przemianie materii i o wspólnym pochodzeniu, a także ich wytworów (substancja międzykomórkowa, np. kolagen).

Przykładami tkanek są tkanka nabłonkowa, łączna, mięśniowa, nerwowa. Tkanki są elementami składowymi narządów i ich układów. Narządem nazywamy wyodrębnioną częśd organizmu wielokomórkowego, o określonym planie budowy, położeniu i funkcji fizjologicznej, złożoną z jednej lub


5

kilku tkanek (np. wątroba lub serce). Współdziałające i powiązane czynnościowo narządy tworzą układy (np. układ krwionośny, pokarmowy).

Komórki, tkanki i narządy różnią się promieniowrażliwością, co wpływa na promieniowrażliwośd całego organizmu.

1.3 Komórki zróżnicowane i niezróżnicowane

Różnicowaniem nazywamy proces przekształcania się komórek zarodkowych w tkanki. Komórki zarodkowe (macierzyste) powstające w czasie pierwszych podziałów po zapłodnieniu mają zdolnośd do potencjalnie nieograniczonej liczby podziałów i do różnicowania się do innych typów komórek.

Proces różnicowania jest sterowany genetycznie.

Pod względem możliwości różnicowania wyróżniamy cztery rodzaje komórek niezróżnicowanych *1+.

Komórki totipotencjalne, które mogą rozwinąd się we wszystkie typy komórek i utworzyd całyorganizm. Komórkom tym odpowiadają komórki embrionu do stadium 4‐8 komórek. Komórki pluripotencjalne, zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek, jednak nie są zdolne do utworzenia całego organizmu. Komórki pluripotencjalne występują w embrionach po czterech dniach od zapłodnienia, u płodu i w organizmie człowieka dorosłego. Komórki multipotencjalne, zdolne do różnicowania się w wiele typów komórek dojrzałych, lecz mniej różnorodnych niż w przypadku komórek pluripotencjalnych (w komórki tego samego listka zarodkowego). Komórki unipotencjalne, zdolne do różnicowania się tylko do jednego typu komórek, np. komórki skóry (keratynocyty), które dzieląc się odnawiają złuszczającą się warstwę naskórka.

Komórki niezróżnicowane występują w:

embrionach (zarodkach) ‐ są komórkami toti‐ lub pluripotencjalnymi, mogą się przekształcad we wszystkie typy komórek organizmu, płodach – także we krwi pępowinowej, są one multipotencjalne, organizmach dojrzałych (somatyczne komórki macierzyste) ‐ znajdują się w narządach dorosłych organizmów i odpowiedzialne są za ich regenerację; są to komórki unipotencjalne i mogą się przekształcad w komórki narządów, z których pochodzą.

Komórki niezróżnicowane stopniowo tracą zdolnośd podziałów i przekształcają się w komórki zróżnicowane (dojrzałe). Po ustaniu podziałów komórkowych wyróżnia się okres dojrzewania komórek, w czasie którego komórka wytwarza wszystkie niezbędne struktury oraz nabywa cech charakterystycznych dla danego typu komórek. Niekiedy komórki dojrzałe mogą się zacząd dzielid (np. limfocyty krwi), lecz liczba takich podziałów jest ograniczona.

Zdolnośd komórek niezróżnicowanych do dzielenia się czyni je szczególnie wrażliwymi na działanie promieniowania jonizującego. Jednocześnie ze względu na plastycznośd komórek niezróżnicowanych i ich zdolnośd do przekształcania się w inne rodzaje komórek, wszelkie zmiany genetyczne (mutacje), jakie mogą byd wywołane przez promieniowanie jonizujące, dotyczą nie pojedynczej „trafionej” komórki, a całego szeregu komórek, w które zróżnicuje się taka zmutowana komórka macierzysta. Jest to szczególne niekorzystne w przypadku napromienienia embrionów i płodów we wczesnych stadiach rozwoju. W odróżnieniu od komórek niezróżnicowanych, komórki dojrzałe są mniej wrażliwe na promieniowanie, a mutacje dotyczą tylko pojedynczych komórek.

Obecnośd somatycznych komórek macierzystych w organach osobników dorosłych umożliwia ich regenerację w przypadku napromienienia niskimi dawkami promieniowania.


6

1.4 Podstawowe informacje o strukturach wewnątrzkomórkowych

Komórka może stanowid samodzielny organizm jednokomórkowy lub może byd elementem składowym organizmu wielokomórkowego. Elementem oddzielającym komórkę od środowiska zewnętrznego jest błona komórkowa. U większości bakterii, sinic, roślin, grzybów błona komórkowa jest otoczona ścianą komórkową, która jest wytwarzana przez komórkę. Ściana komórkowa nie występuje w komórkach zwierzęcych. We wnętrzu większości komórek można wyróżnid jądro i cytoplazmę. Cytoplazma stanowi zasadniczą masę komórki. Płynna częśd cytoplazmy zwana cytozolem składa się z wody, białek, drobnocząsteczkowych związków organicznych i soli mineralnych. W cytozolu zawieszone są struktury wewnątrzkomórkowe (organelle), w których przebiegają różne procesy związane z funkcjami życiowymi komórki. Cytoplazma poprzecinana jest siecią włókien białkowych (cytoszkielet), która nadaje komórce sztywnośd i odpornośd mechaniczną i umożliwia jej ruch (np. ameba lub makrofagi).

Ogólny schemat budowy komórki eukariotycznej jest podobny dla wszystkich organizmów Rysunek 1.4-1.

Rysunek 1.4-1. Schematycznie przedstawiona budowa eukariotycznej komórki zwierzęcej i roślinnej

Z radiobiologicznego punktu widzenia najważniejszą częścią komórki jest jądro komórkowe znajdujące się zwykle w centralnej części komórki. Ponieważ jądro komórkowe zawiera większośd informacji genetycznej komórki, uszkodzenie tego organellum prowadzi często do śmierci komórki.

Woda zawarta w jądrze może pod wpływem promieniowania ulegad radiolizie, a powstające rodniki mogą bezpośrednio atakowad DNA. Stwierdzono także, że w przypadku wysokich dawek promieniowania śmiertelnośd komórek zwiększona jest przez wywołane przez promieniowanie uszkodzenie błon lizosomów. Lizosomy zawierają dużo jonów żelaza i postuluje się, że ich uwolnienie do cytoplazmy zwiększa liczbę uszkodzeo DNA i śmiertelnośd komórek *2+. Innym ważnym organellum jest mitochondrium. W mitochondriach zachodzi proces oddychania komórkowego, w trakcie którego związki organiczne (pirogronian) utleniane są do CO2 i H2O i wytwarzana jest energia, która jest magazynowana w postaci ATP. Intensywne procesy naprawy DNA powodują wyczerpanie zapasów ATP i w konsekwencji mogą doprowadzid do śmierci komórki. Ponadto zachwianie równowagi energetycznej mitochondriów może zapoczątkowad proces apoptotycznej śmierci komórki omówiony w Rozdziale 2.2.2.2.


7

1.5 Budowa DNA, podwójna helisa, chromosomy, chromatyna

Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) jest najważniejszą z punktu widzenia radiobiologii makrocząsteczką występującą w komórce. Struktura cząsteczki DNA opisana została w 1953 roku przez Watsona i Cricka [2]. Cząsteczka DNA jest liniowym polimerem złożonym z dwóch łaocuchów polinukleotydowych. Nukleotydy tworzące DNA składają się z trzech elementów: zasady azotowej, cukru i reszty kwasu fosforowego (Rysunek 1.5-1).

Rysunek 1.5-1. Budowa nukleotydu purynowego. Pokazana numeracja atomów węgla deoksyrybozy

W DNA występują cztery rodzaje zasad azotowych, tworzących dwie pary (Rysunek 1.5-2).

Rysunek 1.5-2. Parowanie zasad w DNA

W obrębie łaocucha nukleotydy połączone są wiązaniami fosfoestrowymi, a odpowiadające sobie zasady azotowe obu łaocuchów wiążą się wiązaniami wodorowymi. Oba łaocuchy polinukleotydowe owinięte są wokół siebie tworząc strukturę o charakterystycznym kształcie podwójnej spirali (α‐helisy, Rysunek 1.5-3). Liniowa sekwencja nukleotydów tworzy tzw. kod genetyczny, za pomocą którego zapisana jest informacja genetyczna. Całośd informacji genetycznej tworzy genom, charakterystyczny dla każdego żywego organizmu i obejmujący całą informację niezbędną dla powstania i prawidłowego funkcjonowania komórki. Genom wszystkich organizmów żywych i niektórych wirusów zbudowany jest z DNA. Przed podziałem komórek DNA w nich zawarty ulega podwojeniu, co umożliwia przekazanie pełnej informacji genetycznej komórkom potomnym.


8

Rysunek 1.5-3. Pierwszorzędowa struktura cząsteczki DNA o sekwencji ATCGCA i jej budowa przestrzenna (α‐helisa)

Genom eukariontów dzieli się na:

genom jądrowy –cząsteczki DNA występujące w jądrze i połączone z białkami jądrowymi; genom mitochondrialny – mały kolisty DNA zawarty w mitochondriach; plastydowy DNA – występujący w chloroplastach roślin i niektórych pierwotniaków kolisty fragment DNA.

Orientacyjną wielkośd genomu organizmów żywych i wirusów pokazano na Rysunek 1.5-4. Informacja genetyczna zawarta w genomie ułożona jest w dyskretne jednostki zwane genami. W 1866 r. czeski mnich Grzegorz Mendel opublikował wyniki serii doświadczeo z krzyżowaniem roślin. Stwierdził w nich, że cechy przenoszą się na kolejne pokolenia, jako wartości dyskretne (geny), i że każdy organizm dziedziczy po każdym z rodziców po jednej kopii genu. Jego prace ‐ zapomniane na ponad 50 lat ‐ stanowią dziś podstawę genetyki klasycznej (mendlowskiej). Genom człowieka został określony w ramach projektu HUGO (Human Genome Organization) *4+. Haploidalny genom człowieka zawiera około 3,2 x 109 par zasad DNA. Około 2,95 x 109 par zasad to euchromatyna (DNA kodujący geny). Tylko 1,2% DNA w rzeczywistości


9

koduje białka. Genom człowieka zawiera około 20000 ‐ 30000 genów. Geny występujące tylko w jednej kopii stanowią 75% genomu. Ludzki mitochondrialny DNA jest kolisty i ma wielkośd około 17000 par zasad. Koduje mniej niż 40 genów.

Rysunek 1.5-4. Orientacyjna wielkość genomu organizmów żywych i wirusów

Jądrowy DNA w komórkach eukariotycznych połączony jest z białkami jądrowymi i gęsto upakowany. Taką nukleinowo‐białkowa strukturę nazywamy chromatyną. W czasie podziału komórki poszczególne odcinki DNA jądrowego ulegają wielokrotnemu zwinięciu tworząc chromosomy. Liczba i wielkośd chromosomów jest cechą charakterystyczną każdego organizmu żywego (Rys. 5). Często zdarza się, że w wyniku działania promieniowania jonizującego DNA kodujący informację genetyczną ulega uszkodzeniu, zaś w czasie jego naprawy ulega zmianie informacja genetyczna. Zmiany takie nazywamy mutacjami; ich powstawanie i skutki omówione zostaną w rozdziale 2.2.2.2. Jeśli uszkodzony DNA nie zostanie naprawiony prowadzi to śmierci komórki .


10

Rysunek 1.5-5. Typowy kariotyp człowieka (22 pary chromosomów somatycznych i dwa chromosomy płci. Widoczne także trzy jądra interfazowe). Na zdjęcie nałożono sztuczne barwy w celu umożliwienia porównania chromosomów (zdjęcie dzięki uprzejmości dr Sylwestra Sommera, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej)

1.6 Budowa DNA

Kwasy nukleinowe są polimerami złożonymi z nukleotydów. Nukleotydy składają się z zasady azotowej (w DNA występują cztery zasady: cytozyna, tymina, adenina i guanina, a w RNA zamiast tyminy występuje uracyl), monosacharydu (w DNA występuje deoksyryboza, a w RNA ryboza) i reszty kwasu fosforowego. Zasady zwyczajowo oznacza się wielkimi pierwszymi literami ich nazw chemicznych (odpowiednio C, T, A, G i U). Łaocuch polinukleotydowy tworzy się przez połączenie dwóch nukleotydów resztą kwasu fosforowego tworzącego wiązanie fosfodiestrowe. Każda grupafosforanowa tworzy wiązanie estrowe z

grupą OH przy atomie węgla 5’ jednej cząsteczki deoksyrybozy i grupą OH przy atomie węgla 3’ drugiej cząsteczki deoksyrybozy. Kolejnośd nukleotydów określana jest mianem sekwencji nukleotydowej i tworzy informację genetyczną określającą budowę i funkcje komórki. DNA zbudowany jest z dwóch łaocuchów polinukleotydowych biegnących w przeciwnych kierunkach (patrz Rysunek 1.8-1). W DNA, reszty tyminy i cytozyny tworzą pary z położonymi w przeciwległych łaocuchach resztami adeniny i guaniny (T:A i C:G, patrz Rysunek 1.8-2). Pary te powiązane są wiązaniami wodorowymi.


11

1.7 Podwójna helisa

Przestrzenne położenie obu łaocuchów polinukleotydowych tworzących DNA zostało określone przez Watsona i Cricka w 1953 [1]. Model helisy DNA zaproponowany przez Watsona i Cricka nazywamy B-DNA i jest on najczęściej występującą formą DNA. Jednak późniejsze badania wykazały, że cząsteczka DNA może przybierad także inne formy przestrzenne. Oprócz B-DNA w przyrodzie występują prawdopodobnie jeszcze dwie formy DNA: A-DNA i Z-DNA (Rys. 1). Formy DNA różnią się zawartością wody, co może wpływad na

ich promieniowrażliwość.

1.8 Chromatyna, chromosomy

Chromatyna jest najważniejszym składnikiem jądra komórkowego. Składa się ona z DNA i białek. W chromatynie można wyróżnid obszary gęsto upakowane, określane jako heterochromatyna i obszary mniej skondensowane, określane jako euchromatyna. Z uwagi na większe upakowanie i obecnośd większej ilości białek, heterochromatyna jest bardziej odporna na działanie promieniowania jonizującego niż euchromatyna. DNA w komórce człowieka ma długośd około 2 m. Tak duża struktura musi zmieścid się w jądrze o przeciętnej średnicy około 5 µm. Jest to możliwe dzięki upakowaniu chromatyny. Wyróżnia się trzy poziomy organizacji chromatyny:

(1) nukleosomy – podstawową strukturę chromatyny składającą się z DNA i białek, przypominającą koraliki nanizane na nitkę (włókno podstawowe);

(2) selenoid – spiralne zwinięte włókna podstawowe;

(3) pętle selenoidowe – włókna solenoidowe przyczepione do białek macierzy jądrowej (Rys. 2).

W czasie podziału komórki chromatyna ulega dalszej kondensacji i tworzą się chromosomy

metafazowe w takiej postaci, jaką możemy zobaczyd w mikroskopie świetlnym w dzielących się

komórkach. Liczba chromosomów jest równa liczbie cząsteczek DNA tworzących genom organizmu (u człowieka jest równa 46).


12

Rysunek 1.8-1. Modele budowy cząsteczek A, B i Z DNA


13

Rysunek 1.8-2. Model organizacji chromatyny w komórkach ssaków


14

1.9 Powstawanie mutacji

Mutacją nazywamy zmianę informacji genetycznej zawartej w DNA. Występujące naturalnie izomery (tautomery) zasad azotowych lub pochodne zasad powstające w wyniku działania czynników zewnętrznych, takie jak promieniowanie, są niekiedy błędnie rozpoznawane w czasie syntezy DNA i wstawiane zamiast właściwych zasad (Rysunek 1.9-1) . Mutacje można podzielid w zależności od:

komórek w jakich powstają Mutacje somatyczne (powstają w komórkach somatycznych organizmu, mogą prowadzid do powstawania nowotworów). Mutacje generatywne (powstają w komórkach rozrodczych organizmu, mogą prowadzid do powstawania chorób dziedzicznych i wad wrodzonych). sposobu powstania Mutacje spontaniczne (wynikają z występowania form tautomerycznych zasad lub spontanicznych procesów deaminacji zasad). Mutacje indukowane (wynikają z powstawania uszkodzeo zasad lub zaburzeo struktury DNA w wyniku działania czynników zewnętrznych). wielkości Mutacje punktowe (jednonukleotydowe) Mutacje sekwencji (mutacje obejmujące od 2 do kilku milionów par zasad, np. delecje, insercje, inwersje). Mutacje chromosomowe (mutacje obejmujące całe chromosomy; np. delecje, duplikacje). wpływu na kodowaną informację Cicha: Mutacja nie zmienia znaczenia odczytanej informacji Missense: Mutacja zmieniająca znaczenie odczytanej informacji Odwrotna (Rewersja): Mutacja przywracającą oryginalną informację Nonsense: Mutacja uniemożliwiająca poprawne odczytanie informacji Zmiana Ramki Odczytu (ang. Frame shift): Mutacja zmieniająca informację Insercja/Duplikacja: Dodanie/podwojenie informacji.

Z chemicznego punktu widzenia mutacje są zmianą sekwencji nukleotydów w łaocuchu DNA i można je podzielid następująco:

Substytucja

Tranzycja: Zamiana puryny na purynę lub pirymidyny na pirymidynę. Na przykład: G na A, A na G, C na T, T na C. Transwersja: Zmiana puryny na pirymidynę lub pirymidyny na purynę. Na przykład: C na A, C na G, T na A, T na G. Insercja: Wstawienie jednej lub więcej zasad. Na przykład: AAGGCTT na AAGGTTTCTT. Delecja: Usunięcie jednej lub więcej zasad. Na przykład: CCGGTGCACA na CCGTGCACA.


15

Rysunek 1.9-1. Mutacje spontaniczne i indukowane. (A) Poprawne parowanie zasad G:C. (B) Błędne parowanie zasadG:T w wyniku występowania guaniny w formie enolowej. (C) błędne parowanie G:

Błędne parowanie zasad DNA wynikające z występowania form tautomerycznych zasad występuje z częstością około 10-6, z tego około 10-4

nie jest wykrywana przez sprawdzającą błędy polimerazę DNA. Częstośd mutacji spontanicznych wynosi zatem około 10-10.

Nie wszystkie mutacje muszą być szkodliwe dla organizmu. Większość mutacji nie wpływa na funkcjonowanie organizmu lub komórki, ponieważ nie zmieniają znaczenia kodowanej informacji genetycznej lub zachodzą w komórkach zróżnicowanych, które się nie dzielą.

Najniebezpieczniejsze są mutacje w komórkach macierzystych (np. komórkach pnia szeregu krwiotwórczego prowadzące do rozwoju nowotworów krwi) i takie, które prowadzą do zapoczątkowania podziałów (np. mutacje proto-onkogenów prowadzące do rozwoju nowotworów).


16

2 Oddziaływanie promieniowania na różnym poziomie organizacji materii żywej

2.1 Radioliza wody

Promieniowanie jonizujące przechodząc przez ośrodek, jakim jest żywa komórka powoduje jonizację tego ośrodka. Ilośd energii zdeponowanej przez promieniowanie o niskich wartościach liniowego przekazywania energii, takiego jak promieniowanie X lub , wynosi około 60 eV na zdarzenie. Jest to dużo więcej niż potrzeba do wywołania jonizacji cząsteczki wody (około 20eV). Pochłonięcie energii promieniowania przez cząsteczkę wody powoduje oderwania elektronu (1) lub wzbudzenie i rozpad cząsteczki wody na rodnik hydroksylowy ( OH) i rodnik wodorowy (H ) (2).

2.2 Działanie bezpośrednie i działanie pośrednie

Chemiczne i biologiczne efekty promieniowania jonizującego wynikają z dwóch typów oddziaływao: działania bezpośredniego i działania pośredniego.

Działaniem bezpośrednim nazywamy depozycję energii promieniowania bezpośrednio w makrocząsteczce biologicznej. Działanie pośrednie wynika z absorpcji energii promieniowania przez ośrodek otaczający makrocząsteczkę biologiczną, co prowadzi do powstania produktów pośrednich, które mogą atakowad makrocząsteczkę (Rysunek 2.2-1). W wyniku pojedynczej depozycji energii może powstad wiele produktów pośrednich, jednak są one generowane niejednorodnie, a ich zasięg ograniczony jest przez szybkośd dyfuzji. Ze względu na bardzo dużą reaktywnośd rodnika OH szacuje się, że aby mógł uszkodzid DNA musi on powstad nie dalej niż 3 nm od DNA. Udział efektu bezpośredniego w biologicznym działaniu promieniowania szacuje się na 30-40% [2].

Rysunek 2.2-1. Pośrednie i bezpośrednie działanie promieniowania


17

2.3 Oddziaływanie promieniowania na białka

Głównym rodnikiem uszkadzającym białka jest rodnik wodorotlenowy, jednak niektóremodyfikacje cząsteczek białkowych, takie jak utlenianie grup –SH mogą byd wywoływane bezpośrednio także przez anionorodnik ponadtlenkowy (O2). Chociaż działanie rodnika hydroksylowego na białka jest niespecyficzne, wewnątrzcząsteczkowy transfer elektronu preferuje tworzenie się określonych koocowych produktów przemiany białek. Łaocuch białka może zostad przerwany w miejscach występowania proliny. Często obserwuje się tworzenie mostków cysty nowych i tyrozylowych. Inny mechanizm działania wykazuje nadtlenoazotyn (ONOO-). ONOOpowstaje głównie w wyniku rekombinacji •NO i O2. W wyniku działania ONOO- następuje nit racja tyrozyny *3+.

Działanie promieniowania jonizującego na roztwory białek w warunkach tlenowych prowadzi przede wszystkim do fragmentacji cząsteczek białka, a napromienienie w warunkach beztlenowych,do agregacji. Główną przyczyną tego odmiennego przebiegu degradacji białek jest powstawanie w warunkach tlenowych rodników nadtlenkowych białek, których dalsze przemiany częściej prowadzą do rozrywania szkieletu cząsteczek. Poddanie aminokwasów działaniu rodnika hydroksylowego pokazało, że sześd z nich, kwas glutaminowy, izoleucyna, leucyna, lizyna, prolina i walina znacznie łatwiej niż pozostałe ulegają

peroksydacji [4]. Modyfikacje aminokwasów białkowych, zachodzące pod wpływem wolnych rodników prowadzą najczęściej do utraty funkcji białka.

2.4 Oddziaływanie promieniowania na lipidy

Rodnik hydroksylowy i inne silnie utleniające indywidua chemiczne powstające w czasie radiolizy wody, mogą oddziaływad z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi występującymi w błonach biologicznych, powodując ich peroksydację *5+. Proces peroksydacji jest inicjowany poprzez oderwanie wodoru od reszty nienasyconego kwasu tłuszczowego. Reakcję tę najczęściej inicjuje rodnik wodorotlenowy oraz rodniki nadtlenkowe (ROO•), alkoksylowe (RO•) i alkilowe (R•). W etapie propagacji powstały rodnik alkilowy reaguje z tlenem tworząc wolny rodnik nadtlenkowy, ROO•. Ten rodnik może reagowad z kolejną resztą nienasyconego kwasu tłuszczowego. W efekcie powstaje nadtlenek kwasu tłuszczowego ROOH oraz kolejny rodnik R•, który może wziąd udział w następnej reakcji peroksydacji (Rysunek 2.4-1).

Rysunek 2.4-1. Peroksydacja lipidów

Oprócz nadtlenków kwasów tłuszczowych powstają także produkty rekombinacji rodników, takie jak dimery fosfolipidów lub fosfolipidy zawierające reszty ketonowe i hydroksylowe. Może to wpływad na funkcje i integralnośd błony białkowo-lipidowej. Rodniki biorące udział w peroksydacji lipidów mogą też atakowad blisko położone cząsteczki białek (np. białka błonowe). Dalsze przemiany produktów peroksydacji, zachodzące m. in. na drodze -eliminacji prowadzą do rozpadu reszt wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i powstania kilku- lub kilkunastowęglowych fragmentów, między innymi różnych keto- i hydroksypochodnych. Produkty koocowe procesu peroksydacji lipidów, zwłaszcza aldehydy, są mniej reaktywne niż wolne rodniki i dzięki temu mogą w komórkach dyfundowad na znaczne odległości.


18

Najpowszechniej badanym produktem peroksydacji lipidów jest dialdehyd malonowy (MDA). Stwierdzono, że u osób zawodowo narażonych na niskie dawki promieniowania obserwuje się podwyższenie poziomu MDA w osoczu krwi *6+. Aldehydy powstające podczas peroksydacji lipidów powodują pęknięcia nici DNA *7+, są cytotoksyczne i działają mutagennie i kancerogennie *8+.

Produkty peroksydacji lipidów modyfikują właściwości fizyczne błon komórkowych.

Wprowadzenie polarnych grup nadtlenkowych, ketonowych, aldehydowych, czy wodorotlenowych do cząsteczek fosfolipidów, które znajdują się wewnątrz dwuwarstwy lipidowej błon, obniża hydrofobowośd lipidowego wnętrza błon komórkowych i zmienia organizację dwuwarstwy. Ostatecznym wynikiem może byd utrata integralności błon komórkowych *9+.

2.5 Oddziaływanie promieniowania na DNA

DNA zbudowany jest ze szkieletu cukrowego: deoksyrybozy i reszt kwasu fosforowego oraz zasad azotowych: puryn i pirymidyn (patrz. Rozdział 2.2.1.1). Oba elementy składowe DNA mogą ulec uszkodzeniu w wyniku bezpośredniego i pośredniego działania promieniowania jonizującego. Najczęściej powstającymi uszkodzeniami DNA są oksydacyjne uszkodzenia zasad, utrata zasady, pęknięcia nici i wiązania krzyżowe. Częstośd występowania poszczególnych rodzajów uszkodzeo DNA po napromienieniu

dawką 1 Gy w porównaniu z częstością spontaniczną pokazana jest w Tabela 2.5-1 Tabela 2.5-1. Częstość występowania spontanicznych i popromiennych uszkodzeń DNA [10]

Rodzaj uszkodzenia Liczba powstających spontanicznie

uszkodzeo na komórkę w czasie jednej godziny

Liczba uszkodzeo wywoła-na w komórce przez 1 Gy

promieniowania X

Uszkodzenia zasad 1,25 x 103 105

Utrata zasady 1,5 x 103 950

Pęknięcie pojedynczoniciowe 5 x 103 1000

Pęknięcie podwójnoniciowe <1 40


19

2.6 Uszkodzenia zasad

Uszkodzenia oksydacyjne zasad są spowodowane atakiem rodników hydroksylowych, powstających w wyniku radiolizy wody. Najczęstszy jest atak rodnika OH na wiązanie pomiędzy atomami węgla C5 i C6 pirymidyn oraz atomami węgla C4 i C6 puryn (Rysunek 2.6-1). W zależności od lokalnych warunków tlenowych powstające produkty pośrednie mogą ulegad dalszemu utlenianiu lub redukcji. W wyniku kolejnych przemian powstają modyfikacje zasad o różnej stabilności i różnym znaczeniu biologicznym. Znanych jest ponad 200 oksydacyjnych modyfikacji zasad, które mogą byd wywoływane przez promieniowanie jonizujące.

Rysunek 2.6-1. Miejsca ataku rodnika OH na DNA

2.7 Pęknięcia nici DNA

Atak rodnika OH na szkielet cukrowy DNA prowadzi do oderwania atomu wodoru od deoksyrybozy. Atom wodoru może byd oderwany od każdego z atomów węgla deoksyrybozy, co w zależności od dostępności tlenu powoduje powstanie różnych produktów koocowych. W warunkach beztlenowych głównym celem ataku rodnikowego jest atom węgla C4’, natomiast w warunkach tlenowych zaatakowane mogą byd także inne atomy węgla (Rys. 3). W wyniku oderwania atomu wodoru i kolejnych reakcji powstają dwa rodzaje uszkodzeo DNA: pęknięcie wiązania fosfodwuestrowego i powstanie pojedynczoniciowego pęknięcia DNA lub otwarcie pierścienia deoksyrybozy i powstanie tak zwanego miejsca alkalilabilnego [11] (Patrz Rozdział

2.2.2.2).

2.8 DNA struktura najbardziej promieniowrażliwa

Wczesne badania przeprowadzone na jajach płazów, pierwotniakach i glonach jednokomórkowych z użyciem mikrowiązek wykazały, że jądro komórki jest bardziej wrażliwe na działanie promieniowania jonizującego niż cytoplazma. Późniejsze badania na komórkach ssaków potwierdziły te przypuszczenia, jednocześnie uściślając, że najbardziej promieniowrażliwą strukturą jest chromatyna, a przede wszystkim


20

DNA. Dowody potwierdzające ten fakt przedstawiono poniżej:

1. Wrażliwośd na promieniowanie wielu komórek roślinnych jest dobrze skorelowana ze średnią objętością interfazalnego DNA chromosomowego. Im większa objętośd kwasów nukleinowych w jądrze, tym większa jest promieniowrażliwośd komórek.

2. Komórki zabijane są przez radioaktywne analogi nukleotydów, stanowiących prekursory do syntezy DNA. Trytowana lub jodowana tymidyna, która wbudowywana jest podczas syntezy w cząsteczkę DNA, emituje cząstki α o bardzo małym zasięgu, a więc uszkodzenie ograniczone jest tylko do cząsteczki DNA.

3. Halogenki pirymidyn, a przede wszystkim strukturalne analogii tymidyny, które także wbudowywane są podczas syntezy w cząsteczkę DNA, zwiększają promieniowrażliwośd komórek w sposób proporcjonalny do ilości wbudowanego związku. Halogenki urydyny, które nie są wbudowywane w cząsteczkę DNA, nie mają takiego działania.

Czynniki modyfikujące działanie promieniowania, tj. omówione w Rozdziale 2.2.2.3 efekty ‐tlenowy, LET lub mocy dawki ‐ wpływają w podobny sposób na śmiertelnośd komórek i na uszkodzenia chromosomów. Wskazuje to, że uszkodzenia chromosomów są związane przyczynowo ze śmiercią komórki.

2.9 Oddziaływanie promieniowania na komórki, wrażliwość na promieniowanie komórek proliferujących i nieproliferujących

Biorąc pod uwagę procesy chemiczne, jakie zachodzą podczas napromieniowania i sposóbdziałania promieniowania na krytyczne struktury subkomórkowe, ilośd uszkodzeo wywołanych w komórkach przez określony typ promieniowania jest podobna w przeliczeniu na jednostkę dawki i jednostkę ilości DNA. Oznacza to, że z chemicznego punktu widzenia wrażliwośd komórek na promieniowanie jonizujące jest jednakowa. O koocowym skutku działania promieniowania decydują procesy, które zachodzą po napromieniowaniu, takie jak naprawa uszkodzeo DNA i aktywnośd proliferacyjna komórki. Procesy naprawy uszkodzeo DNA przedstawiono w Rozdziale 2.2.2.4, zaś w tym rozdziale omówiony zostanie wpływ aktywności proliferacyjnej na promieniowrażliwośd komórek.

Większośd komórek zróżnicowanych w naszym organizmie znajduje się w tak zwanej fazie spoczynkowej (G0), w której ich aktywnośd proliferacyjna jest zahamowana. Większośd komórek pozostanie w fazie G0 aż do śmierci. Nieliczne, na przykład limfocyty, zdolne są pod wpływem określonych bodźców do rozpoczęcia podziałów. Komórki dzielące się przechodzą złożony proces, zwany cyklem komórkowym, w trakcie którego następuje podwojenie materiału genetycznego zawartego w jądrze komórkowym i przygotowanie całej komórki do podziału.

Cykl komórkowy składa się z czterech faz: G1 – w trakcie której następuje przygotowanie dosyntezy DNA; S – fazy syntezy DNA; G2 – w trakcie której następuje przygotowanie do mitozy; M (mitoza) – właściwej fazy podziału komórki (Rys. 2). Przejście przez poszczególne fazy cyklu komórkowego regulowane jest genetycznie, a jego zaburzenie zwiększa promieniowrażliwośd komórek.

Faza cyklu komórkowego w jakiej znajduje się komórka napromieniona ma duże znaczenie dla jej wrażliwości na promieniowanie. Najbardziej wrażliwe są komórki w późnej fazie G2 i mitozie, najmniej ‐ w późnej fazie S. Wrażliwośd komórek w fazie G1 zmienia się: na początku komórki są stosunkowo oporne, a potem następuje ich uwrażliwienie (Rys 3). Przyczyny różnej wrażliwości komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego nie są do kooca poznane *6+. Wiąże się je ze zmianami organizacji chromatyny oraz ze zmianami zawartości tioli w komórce.


21

Rysunek 2.9-1. Schemat cyklu komórkowego. G0 - faza spoczynkowa; G1 - faza poprzedzająca syntezę DNA; S - faza syntezy DNA; G2 – faza poprzedzająca mitozę; M – mitoza. Ilość DNA w komórce schematycznie pokazano jako chromosom.

Rysunek 2.9-2. Wrażliwość komórek na promieniowanie w poszczególnych fazach cyklu komórkowego (na podstawie [7], zmienione)


22

2.10 Oddziaływanie promieniowania na tkanki, wrażliwość tkanek na promieniowanie

Wrażliwość tkanek na promieniowanie jonizujące jest uzależniona od wrażliwości tworzących je komórek i ich zdolności re-populacyjnej. Krzywa odpowiedzi na promieniowanie normalnych zdrowych tkanek ma kształt sigmoidalny podobny do odpowiedzi całego organizmu (Rysunek 2.11-1). Po napromienieniu większośd komórek tkanki umiera śmiercią interfazalną lub mitotyczną. W niektórych tkankach komórki umierają także śmiercią apoptotyczną (patrz Rozdział 2.2.2.2). Odpowiedź tkanki na promieniowanie zależy od:

1. promieniowrażliwości właściwej komórek, 2. kinetyki odnawiania tkanki, 3. budowy tkanki.

Promieniowrażliwośd indywidualnych komórek w obrębie tkanki różni się nieznacznie, co może byd spowodowane przez różne czynniki modyfikujące działanie promieniowania, np. efekt tlenowy omówiony w Rozdziale 2.2.2.3. Jeżeli w obrębie tkanki znajdzie się wystarczająco dużo komórek, które przetrwały napromienienie, mogą one zregenerowad całą tkankę. Skrajnym przypadkiem są tkanki nowotworowe, w których nawet jedna komórka, która przeżyła napromienienie może dad początek wznowie nowotworu. Ponieważ śmierd komórek następuje przede wszystkim w momencie podziału (patrz poniżej), tkanki o szybkiej kinetyce odnawiania (dużej zawartości komórek szybko dzielących się), np. śluzówka jelita, są bardziej wrażliwe od tkanek, w których komórki dzielą się rzadziej, np. mięśnie gładkie. Także tkanki zawierające dużo komórek niezróżnicowanych (patrz Rozdział 2.1.1.1), o dużym potencjale proliferacyjnym, są bardziej wrażliwe na promieniowanie niż tkanki zróżnicowane. Obserwacje te

pozwoliły na sformułowanie tzw. reguły Bergonié’go i Tribondeau, którzy zauważyli, że „Tkanki wydają się bardzie wrażliwe na promieniowanie, jeżeli ich komórki są mniej zróżnicowane, mają większy potencjał proliferacyjny i szybciej się dzielą”. Dodatkowym czynnikiem warunkującym wrażliwośd tkanek na promieniowanie jest budowa tkanki. Obserwacje kliniczne dowiodły, że tolerancja tkanek na promieniowanie zależy w dużej mierze od objętości tkanki, jaka została napromieniona. Przyjmuje się, że tolerancja tkanki na promieniowanie zależy od obecności wystarczającej liczby dojrzałych komórek zdolnych do podtrzymania funkcji fizjologicznych tkanki (organu). W niektórych organach (nerki, płuca) do podtrzymania funkcji fizjologicznych wystarczy, że nienapromienione pozostanie tylko 30% tkanki. Wynika to z modułowej budowy tych organów i obecności dużej liczby jednakowych jednostek funkcjonalnych (nefrony, pęcherzyki płucne), które mogą pracowad niezależnie od siebie. W tkankach, w których działanie całego organu zależy od współdziałania poszczególnych jednostek funkcjonalnych (np. neuronów w rdzeniu kręgowym) napromienienie niewielkiej części tkanki powoduje zaburzenie jej funkcji.

Próbę klasyfikacji tkanek pod względem promieniowrażliwości z uwzględnieniem ich budowy podjęli Wheldon i Michałowski *4+ (Tabela 2.10-1). Zaproponowany przez nich podział tkanek/narządów na tkanki o strukturze hierarchicznej (Typu H) lub elastycznej (Typu F) zakłada, że intensywnośd proliferacji komórek w tkance prawidłowej pozostaje pod kontrolą organizmu. W warunkach fizjologicznych utrata komórek jest równoważona odnową. Działanie promieniowania jonizującego powoduje zwiększoną utratę komórek macierzystych tkanki. W odpowiedzi dochodzi do przyspieszenia Re-populacji pozostałych komórek macierzystych i zrekompensowania straty. Narządy o budowie hierarchicznej składają się z komórek dojrzałych, dojrzewających (różnicujących się) i komórek macierzystych. Śmierd komórek macierzystych uniemożliwia odnowę komórek dojrzałych i dojrzewających. W tkance typu elastycznego, w której wszystkie komórki są równorzędne, wszystkie komórki mogą brad udział w odnowie tkanki.

Tabela 2.10-1. Klasyfikacja tkanek wg Wheldona i Michałowskiego [4]

Typ tkanki Budowa Odpowiedź na promieniowanie


23

Hierarchiczna Tkanka typu H (Błona śluzowa, naskórek, szpik kostny)

komórki dojrzałe komórki dojrzewające (różnicujące się) komórki macierzyste

Intensywnośd odczynu zależy od dawki i jest tym większa, im więcej zginęło komórek macierzystych. Czas ujawnienia się wczesnego odczynu popromiennego nie zależy od dawki i jest zależny od szybkości degradacji komórek dojrzałych.

Elastyczna Tkanka typu F (Ośrodkowy układ nerwowy)

Brak podziałów funkcjonalnych. Wszystkie komórki równorzędne

Intensywnośd odczynu i czas wystąpienia jest proporcjonalny do dawki

Koniecznośd uwzględnienia różnic w promieniowrażliwości tkanek spowodowała wprowadzenie czynnika wagowego tkanki lub narządu (WT) i pojęcia dawki efektywnej (E). Czynnik WT oznacza, jaki ułamek całości dawki stał się udziałem danej tkanki. Dawka efektywna (E) oznacza sumę ważonych dawek równoważnych od zewnętrznego i wewnętrznego napromienienia wszystkich tkanek i narządów i wyraża się wzorem (ponizej), w którym D oznacza dawkę, WR czynnik wagowy promieniowania, WT czynnik wagowy narządowy.

𝐸 = 𝐷𝑇𝑅 × 𝑊𝑇 × 𝑊𝑇

Przykładowe wartości współczynnika określone przez Międzynarodową Komisję Ochrony Radiologicznej przedstawia Tabela 2.10-2 [5]. Tabela 2.10-2. Czynnik wagowy WT ryzyka radiacyjnego dla tkanek człowieka [5] Tkanka/Narząd WT Gonady 0,20 Szpik kostny, jelito grube, płuca, żołądek 0,12 Pęcherz moczowy, gruczoły piersiowe, wątroba, przełyk, tarczyca 0,05 Skóra, powierzchnia kości 0,01 Pozostałe 0,05

Ponadto biorąc pod uwagę znaczenie tkanki i skutków jej napromieniowania dla całego organizmu możemy mówid o promieniowrażliwości względnej. Stosując takie podejście wprowadza się pojęcie narządu krytycznego, czyli takiego, który jest istotny dla organizmu i jest najbardziej uszkadzany przez dany rodzaj promieniowania w danych warunkach napromieniowania. Dla promieniowania X i gamma

narządami krytycznymi są szpik, gonady i soczewka oka, dla izotopu jodu – tarczyca, a dla

przyjętych doustnie izotopów alfa‐promieniotwórczych – śluzówka jelit.

2.11 Oddziaływanie promieniowania na organizm, promieniowrażliwość osobnicza, LD50

Działanie promieniowania jonizującego na cały organizm zostało dobrze udokumentowane dzięki badaniom na modelach zwierzęcych i pozwoliło na zrozumienie głównych przyczyn śmierci po napromienieniu całego ciała. Odniesienie tych badao do ludzi było możliwe dzięki doświadczeniom uzyskanym w trakcie radioterapii, a także w wyniku obserwacji osób napromienionych w czasie wybuchów w Hiroshimie i Nagasaki, mieszkaoców wysp Marshalla napromienionych w czasie opadu promieniotwórczego w 1954 roku i ofiar wypadków radiacyjnych. Dzięki tym badaniom wpływ promieniowania na organizm człowieka został także bardzo dobrze udokumentowany *1+. Staranne opisanie objawów występujących po napromienieniu, z uwzględnieniem rodzaju, nasilenia i czasu ich wystąpienia, ma znaczenie prognostyczne i pozwala na prawdopodobne określenie dalszego przebiegu choroby i w przybliżone oszacowanie dawki promieniowania pochłoniętej przez chorego. Napromienienie całego ciała dawkami większymi niż 100 mSv powoduje wystąpienie ostrego zespołu popromiennego

(ang. Acute Radiation Syndrome, ARS). Opisy przebiegu ARS u ludzi napromienionych różnymi dawkami promieniowania pozwoliły na wyodrębnienie kilku etapów choroby i różnego nasilenia jej objawów. Pierwsze objawy związane z napromienieniem całego ciała występują kilka do kilkunastu minut

po napromienieniu i nazywane są fazą prodromalną (zespołem zwiastunów). U ludzi cechują się zaburzeniami związanymi z funkcjonowaniem układu pokarmowego i nerwowego, takimi jak anoreksja,


24

nudności, bóle głowy, wymioty, biegunka, suchośd w jamie ustnej, odwodnienie i utrata wagi, zmęczenie, apatia, pocenie się, gorączka i obniżeniem ciśnienia krwi.

Objawy te stopniowo zanikają (faza utajona), a następnie przechodzą w okres objawów chorobowych, którego przebieg zależy od dawki promieniowania. Przy dużych dawkach rzędu 50 Gy śmierd następuje w ciągu 24‐48 godzin w wyniku uszkodzenia układu nerwowego i krwionośnego powodującego objawy składające się na zespół mózgowy. Przy średnich dawkach rzędu >10 Gy śmierd następuje w ciągu kilku dni w wyniku intensywnych krwawieo związanych z uszkodzeniem śluzówki jelit. Ten rodzaj śmierci określamy, jako wywołany zespołem żołądkowo‐jelitowym. Przy małych dawkach rzędu 2,5‐5 Gy śmierd następuje w ciągu kilu tygodni i spowodowana jest przez załamanie się hematopoezy w wyniku uszkodzenia szpiku. Ten rodzaj śmierci określamy, jako wywołany zespołem szpiku kostnego. Chociaż ostry zespół popromienny rozwija się u wszystkich osobników napromienionych, jego nasilenie jest różne u poszczególnych osobników. Osobniki bardzo młode i stare są bardziej wrażliwe niż osobniki dorosłe. Stwierdzono także większą wrażliwośd na promieniowanie samców niż samic. Oprócz dawki pochłoniętej nasilenie objawów popromiennych zależy od wrażliwości osobniczej. Na wrażliwośd osobniczą składa się szereg czynników fizjologicznych i niefizjologicznych, które mogą modyfikowad działanie promieniowania. Wyróżnid można czynniki genetyczne (dziedziczne), tj. polimorfizmy i defekty genów naprawy uszkodzeo DNA, genów kontroli cyklu komórkowego oraz czynniki pozagenetyczne, tj. wiek, płed, ogólny stan zdrowia, nawyki żywieniowe, styl życia (np. palenie papierosów). U ludzi znanych jest 18 różnych zespołów dziedzicznych warunkujących nadwrażliwośd na promieniowanie jonizujące. W wielu przypadkach poznano za pomocą metod biologii molekularnej mechanizmy leżące u podstawy zwiększonej wrażliwości (Tabela 2.11-1).

Rysunek 2.11-1 przedstawia typową zależnośd pomiędzy dawką promieniowani a liczbą osobników zabitych przez napromienienie całego ciała. Typowa krzywa ma kształt sigmoidalny, a z jej przebiegu można wyznaczyd dawkę letalną 50% (LD50). Koncepcja LD50 powstała na potrzeby badao toksykologicznych i oznacza dawkę substancji chemicznej, czynnika fizycznego lub materiału, która powoduje śmierd połowy badanej populacji w określonym czasie.

Rysunek 2.11-1. Typowy przebieg krzywej przeżywalności po napromienieniu całego ciała

Tabela 2.11-1. Dziedziczne zespoły chorobowe warunkujące nadwrażliwość na promieniowanie jonizujące [2]

Choroba Mechanizm, Wrażliwośd na Predyspozycja do


25

uszkodzenie prom. jonizujące

występowania nowotworów

Xeroderma pigmentosum wariant TLS (+) Skóry Ataksja‐telangiektazja (AT) sygnalizacja DSB (++++) Białaczki, chłoniaki Ataksja‐telangiektazja (AT) sygnalizacja DSB (+) Piersi

Zespół podobny do AT sygnalizacja DSB (++++) Nie Zespół Nijmegen sygnalizacja DSB (++++) Chłoniaki

Niedokrwistośd Fanconiego Naprawa wiązao krzyżowych i HR (++) Białaczki, rak

płaskonabłonkowy, piersi Zespół Rothmunda‐Thompsona HR/TLS (+) Kostniako‐mięsaki

Zespół Cockayne’a NER/TCR (+) Nie Zespół Wernera HR/TLS (+++) Mięsaki

Ciężki złożony niedobór odporności V(D)J/NHEJ ? Chłoniaki Zespół Ligazy IV NHEJ (++++) Nie

Zespół Seckla sygnalizacja (+++) Nie DSB

Wrodzona dyskeratoza metabolizm telomerów (++) Niedokrwistośd aplastyczna

Niepolipowaty rak jelita grubego MMR (+)

Jelita grubego, śluzówki macicy, jelita cienkiego,

dróg moczowych i żółciowych, jajnika

Rak piersi i rak jajnika HR (+) Piersi, jajnika

Zespół Li‐Fraumeni sygnalizacja DSB Podwyższone ryzyko

nowotworów popromiennych

Piersi, mózgu, Białaczki, mięsaki

Siatkówczak rodzinny sygnalizacja DSB Podwyższone ryzyko

nowotworów

popromiennych

Mięsaki, czerniaki, nowotwory mózgu

Zespół nabłoniaków znamionowych Szlak SHH

Podwyższone ryzyko

nowotworów

popromiennych

Skóry

AT ‐ ataksja‐telangiektazja, DSB – podwójnoniciowe pękniecie DNA, HR ‐ rekombinacja homologiczna, MMR ‐ naprawa błędnie sparowanych zasad, NER – naprawa z wycięciem nukleotydu, NHEJ nie‐homologiczne łączenie kooców, SHH – brak polskiego odpowiednika (ang. sonic hedgehog, dosł. szlak jeża Sonica), TCR ‐ naprawa związana z transkrypcją, TLS ‐ synteza poprzez uszkodzenia matrycy.

Badania na modelach zwierzęcych i analiza wypadków radiacyjnych pozwoliły określid dawki LD50 dla niektórych ssaków (Tab. 2).

Tab. 2. Masa ciała i LD50 dla wybranych zwierząt poddanych napromienieniu na całe ciało (na podstawie [3].

Masa ciała (kg) LD50

Mysz 0,025 7

Szczur 0,2 6,75

Małpa (rezus) 2,8 5,25

Pies 12 3,7 Człowiek 70 4

Napromienienie organizmu dawką LD50 powoduje wystąpienie fazy prodromalnej, głównie nudności i wymiotów, po której następuje okres utajenia. W ciągu około miesiąca rozwija się zespół szpiku kostnego, którego nasilenie zależy od osobnika i który u 50% populacji kooczy się śmiercią. Nasilenie objawów popromiennych, a co za tym idzie także wartośd LD50, można modyfikowad w pewnym zakresie stosując odpowiednią opiekę medyczną. Przeszczepy szpiku pozwalające na dodatkowe modyfikowanie efektów napromienienia całego ciała i pozwalające uratowad ludzi napromienionych dawkami rzędu 8‐10 Gy zostały omówione w rozdz. 2.2.2.2.


26

3 Skutki działania promieniowania jonizującego

3.1 Wstęp

Skutki biologiczne związane z działaniem promieniowania na poziomie subkomórkowym opisano szczegółowo w Rozdziale 2.2.2.2. Tu należy tylko podkreślid, że działanie promieniowania jonizującego na makrocząsteczki biologiczne może wynikad z bezpośredniej depozycji energii w makrocząsteczce lub z ataku reaktywnych indywiduów chemicznych powstających w wyniku radiolizywody.

Skutkiem takiego oddziaływania są oksydacyjne modyfikacje makrocząsteczki, prowadzące zreguły do jej uszkodzenia. Oksydacyjne uszkodzenia DNA mogą prowadzid do śmierci komórki lub do powstawania mutacji, czyli zmiany informacji genetycznej zawartej w komórce. Diagram na Rys. 1 przedstawia możliwe koleje losu napromienionej komórki.

Rysunek 3.1-1. Możliwe koleje losu komórki napromienionej

3.2 Skutki działania promieniowania na poziomie komórkowym (krzywa przeżywalności)

Skutki działania promieniowania na komórki określa się zwykle testem klonowania in vitro. Polega on na wysianiu na szalki odpowiedniej liczby komórek napromienionych i policzeniu kolonii tworzonych przez te komórki po określonym czasie wzrostu, zależnym od szybkości podwajanie komórek (z reguły około 2 tygodnie). Po uwzględnieniu wydajności klonowania (procent komórek nienapromienionych tworzących klony) można określid procent komórek przeżywających dla danej dawki promieniowania.

Wrażliwośd komórek przedstawia się zwykle jako zależnośd procenta lub ułamka komórek przeżywających od dawki promieniowania (krzywe przeżywalności). Typowy przebieg krzywej przeżywalności dla promieniowania o niskich i wysokich wartościach LET przedstawiony jest na Rysunek 3.2-1. Krzywe przeżywalności po napromienieniu promieniowaniem o niskich wartościach LET mają wyraźne ramię przy niskich zakresach dawek, a następnie stają się prostoliniowe. Po napromienieniu promieniowaniem o wysokich wartościach LET krzywe przeżywalności mają przebieg prostoliniowy.


27

Rysunek 3.2-1. Krzywe przeżywalności komórek ssaków po napromienieniu promieniowaniem o dużej i małejwartości LET. Model liniowo-kwadratowy (A), model wielu tarcz (B) (na podstawie [1], zmienione)

Obecnie najczęściej używane są dwa modele opisujące przebieg krzywych przeżywalności: model wielu tarcz i model liniowo‐kwadratowy. Model wielu tarcz (1) zakłada, że krzywe przeżywalności mają nachylenie początkowe (D1) odpowiadające śmierci komórek wynikającej z pojedynczego zdarzenia i nachylenie koocowe (D0) odpowiadające śmierci komórek wynikającej z wielu zdarzeo, wielkośd ramienia krzywej opisana jest parametrem ekstrapolacji (n). Inną miarą szerokości ramienia krzywej jest dawka quasi‐progowa Dq oznaczająca dawkę, przy której prostoliniowa częśd krzywej przeżywalności przetnie prostą równoległą do osi dawek przeprowadzoną przez punkt 1. D1 odpowiada dawce, która zmniejsza przeżywalnośd komórek z 1 do 0,37, a D0 odpowiada dawce, która zmniejsza przeżywalnośd komórek z 0,1

do 0,037 lub z 0,01 do 0,0037. Ponieważ dla wyższych dawek krzywe przeżywalności są linią prostą D0 odpowiada dowolnej dawce zmniejszającej przeżywalność o 63%. Dawkę D0 nazywa się także średnią dawką letalną, odpowiadającą dawce promieniowania, która średnio powoduje jedno letalne zdarzenie na jedną tarczę. Zależnośd między parametrami Dq, D0 i n opisuje równanie

𝑆 = 1− 1− 𝑒−𝐷/𝐷𝑜 𝑛

𝑙𝑜𝑔𝑒𝑛 =𝐷𝑞𝐷𝑜

Model wielu tarcz jest obecnie wypierany przez model liniowo‐kwadratowy, który zakłada, że krzywe przeżywalności mają dwie składowe, jedną proporcjonalną do dawki a drugą do kwadratu dawki. U podstaw tego modelu leży założenie, że (i) uszkodzenia powodujące śmierd komórki powstają w wyniku oddziaływao subletalnych, (ii) przynajmniej dwa subletalne zdarzenia są konieczne do śmierci komórki, (iii) uszkodzenie subletalne może powstad w wyniku przejścia jednego lub dwóch fotonów (cząstek). Model ten poparty jest obserwacjami doświadczalnymi *2+:

a. Śmierd komórki spowodowana jest przez nienaprawione podwójnoniciowe pęknięcie (DSB) DNA, które powstaje w wyniku jednego zdarzenia lub nałożenia się na siebie dwóch pęknięd pojedynczoniciowych; lub


28

b. Śmierd komórki spowodowana jest przez aberrację chromosomową, która powstaje w wyniku jednego zdarzenia (pęknięcie chromatydy) lub nałożenia się na siebie dwóch niezależnych pęknięd (translokacje).

Model ten można opisad wzorem (2), w którym S oznacza frakcję komórek przeżywających dawkę D zaś α i β oznaczają stałe.

𝑆 = 𝑒−𝛼𝐷−𝛽𝐷2

Model liniowo‐kwadratowy zakłada, że krzywe przeżywalności ciągle się zaginają, co nie jestzgodne z ich rzeczywistym przebiegiem w zakresach większych dawek, jednak bardzo dobrze opisujeprzebieg krzywych w zakresach małych dawek.

Oba modele zakładają istnienie obszaru niskich dawek (ramię krzywej przeżywalności), w których śmiertelnośd komórek przeliczona na dawkę jednostkową jest mniejsza niż po napromienieniu wyższą dawką. W tym obszarze dawek śmierd wynika prawdopodobnie z nagromadzenia się zdarzeo, które same w sobie nie są letalne, ale stają się letalne gdy znajdują się blisko siebie, lub z powstawania uszkodzeo, które nie są letalne, ale stają się letalne gdy zwiększa się ich ilośd i zmniejsza się wydajnośd procesów naprawczych.

Zjawisko to zostało wykorzystane w radioterapii, gdzie często stosuje się niskie dawki promieniowania podawane w odstępach czasu w celu oszczędzenia komórek zdrowych (terapia frakcjonowana). Jeśli dawka jest tak dobrana, że uszkodzenia subletalne mogą zostad naprawione przed podaniem następnej dawki, krzywe przeżywalności nabierają charakteru linii prostych, ponieważ ramię krzywej przeżywalności powtarza wiele razy (Rys. 3). Terapia frakcjonowana działa

oszczędzająco zarówno na komórki normalne, jak i nowotworowe, ale działanie to jest mniejsze na szybko proliferujące komórki nowotworowe niż na komórki normalne.

Rysunek 3.2-2. Efekt oszczędzający dawki frakcjonowanej (A) w porównaniu z dawką jednokrotną (B) (na podstawie[1], zmienione)

Komórki, które nie zdołają naprawid uszkodzeo powstających w wyniku napromienienia giną.

Tabela 3.2-1 charakteryzuje różne rodzaje śmierci komórkowej, jaką mogą umierad komórki po


29

napromienieniu. W Rozdziale 2.2.2.2 dwa najczęściej występujące rodzaje śmierci interfazowej omówiono bardziej szczegółowo. Tabela 3.2-1. Rodzaje śmierci popromiennej komórek [3]

Rodzaj śmierci Opis

Apoptoza (występuje w interfazie) Komórki kurczą się, chromatyna ulega kondensacji i fragmentacji. Cała komórka rozpada się na fragmenty otoczone błoną.

Nekroza (występuje w interfazie) Komórka pęcznieje i błona komórkowa się rozpada. Zawartośd komórki wylewa się na zewnątrz. Chromatyna nie ulega kondensacji

Katastrofa mitotyczna (występuje w mitozie)

Występuje w czasie lub zaraz po mitozie. Spowodowana błędną segregacja chromosomów. Komórki często zawierają mikrojądra.

Starzenie się (występuje w interfazie)

Komórki metabolicznie aktywne bez oznak uszkodzenia, nie dzielą się jednak, a jedynie zwiększają swoją objętośd.

Autofagia (występuje w interfazie)

Prawdopodobnie odmiana apoptozy. Komórka sama trawi swoje organelle.

Śmierd komórki może nastąpid już w czasie pierwszego podziału (śmierd mitotyczna), są jednak komórki, które dzielą się jeszcze raz lub dwa razy, zanim zginą. Komórki, które się nie dzielą umierają śmiercią interfazową. Śmierd mitotyczna komórki spowodowana jest przez zaburzenia morfologii chromosomów, tak zwane aberracje chromosomowe.

Aberracje chromosomowe dzielimy na chromatydowe (dotyczące jednej chromatydy) i chromosomowe (obejmujące obydwie chromatydy). W innym systemie aberracje chromosomowe są dzielone na trwałe (np. translokacje) i nietrwałe (np. dicentryki), w zależności od tego czy mogą utrzymywad się przez kolejny cykl komórkowy, czy nie. Na Rys. 4A pokazano powstawanie jednej z najgroźniejszych aberracji – chromosomu dicentrycznego i fragmentu acentrycznego. Chromosom dicentryczny powstaje w wyniku połączenia się dwóch chromosomów. Razem z chromosomem dicentrycznym powstaje fragment acentryczny, który nie zawiera centromeru i w czasie mitozy nie jest segregowany do jądra komórkowego. Fragment taki obserwuje się najczęściej jako mikrojądro.

Rysunek 3.2-3. Powstawanie aberracji chromosomowych: (A) dicentryki, (B) translokacje

Chromosomy dicentryczne prowadzą do śmierci komórki. Istnieją jednak aberracje, które nie są niebezpieczne dla życia komórki. Różnego rodzaju przemieszczenia w obrębie jednego chromosomu (inwersje chromosomowe) lub pomiędzy chromosomami (translokacje) nie muszą prowadzid do śmierci


30

komórek, a nawet nadają komórce nowe cechy. Jedną z najbardziej znanych jest translokacja pomiędzy chromosomem 9 i 22, która występuje w 95% przypadków przewlekłej białaczki szpikowej. Przeniesienie części chromosomu 9 na chromosom 22 powoduje powstanie nowego białka, które rozpoczyna proces nowotworzenia. Badania osób, które przeżyły wybuch bomby w Hiroszimie i Nagasaki wykazały, że promieniowanie może byd przyczyną występowanie tej aberracji [4].

Komórki, które naprawiły uszkodzenia DNA prawdopodobni przeżyją. Jednak tak jak pokazano na Rysunek 3.2-3, częśd z nich naprawi uszkodzenia błędnie, co prowadzi do powstawania mutacji (patrz Rozdział

2.2.2.2). Jeżeli mutacje powstaną w genach podstawowego metabolizmu komórkowego (ang. housekeeping genes), komórki zginą, jeżeli w rejonach mniej ważnych ‐ komórki przeżyją.

3.3 Skutki stochastyczne i deterministyczne

Depozycja energii przez promieniowanie jonizujące jest procesem losowym i nawet przy bardzo niskich dawkach istnieje pewne prawdopodobieostwo, że w tarczy komórkowej zdeponowana zostanie wystarczająca ilośd energii, żeby spowodowad zmiany w komórce lub jej śmierd. Śmierd jednej lub kilku komórek nie ma znaczenia z punktu widzenia danej tkanki lub całego organizmu. Jeżeli jednak w komórce zajdą zmiany genetyczne prowadzące do nabycia przez nią nowych cech, takich jak zdolnośd do nieograniczonej liczby podziałów, skutki dla całego organizmu lub przyszłych pokoleo mogą byd bardzo istotne (nowotwory, zmiany dziedziczne). Takie skutki działania promieniowania nazywamy

stochastycznymi. Nawet dla bardzo niskich dawek promieniowania istnieje niewielkie, ale skooczone, prawdopodobieostwo wystąpienia skutku stochastycznego.

Częstośd występowania skutków stochastycznych zwiększa się wraz ze wzrostem dawki promieniowania, ale ostrośd skutku pozostaje taka sama (nowotwór albo się rozwinie, albo nie rozwinie). Z klinicznego punktu widzenia czas potrzebny do ujawnienia się skutków stochastycznych jest długi ‐ kilka lub kilkanaście lat, a nawet całe pokolenie.

Wraz ze wzrostem dawki promieniowania liczba zabitych komórek ciągle wzrasta i chociaż początkowo nie obserwuje się żadnych zmian, powyżej pewnego progu zmiany w tkankach wywołane przez promieniowanie mogą byd wykryte metodami klinicznymi. Powyżej tego progu, nasilenie skutków

działania promieniowania stale rośnie, aż do całkowitego zniszczenia tkanki lub organizmu. Takie skutki działania promieniowania nazywamy deterministycznymi. Skutki deterministyczne występują dużo szybciej niż skutki stochastyczne, często są obserwowane już kilka minut po napromienieniu.

Oba rodzaje skutków działania promieniowania muszą byd uwzględnione z punktu widzenia ochrony radiologicznej, a jej głównym zadaniem powinno byd ograniczenie nasilenia skutków deterministycznych i zmniejszenie prawdopodobieostwa wystąpienia skutków stochastycznych.

3.4 Szczegółowa charakterystyka skutków stochastycznych i deterministycznych

Z definicji skutki deterministyczne mają dawkę progową, poniżej której działanie promieniowania jest równoważone przez odnowę komórek i niewidoczne klinicznie. Powyżej tego progu nasilenie objawów (odpowiedź tkanki/organizmu) rośnie wraz z dawką promieniowania. Dla ogółu populacji krzywa zależności nasilenia objawów od dawki ma kształt sigmoidalny (patrz wyjaśnienie promieniowrażliwości osobniczej i pojęcia LD50, Rozdział 2.2.1.3), a jej nachylenie zależy od rozrzutu wrażliwości osobniczej. Dawka progowa jest różna dla różnych skutków deterministycznych. Na przykład dawka progowa dla

rumienia popromiennego wynosi 3‐5 Gy, a dla nekrozy skóry około 50 Gy.

Tabela 3.4-1. przedstawia równoważniki dawek progowych dla niektórych objawów klinicznych związanych z ostrym zespołem popromiennym.


31

Tabela 3.4-1. Objawy kliniczne związane z ostrym zespołem popromiennym [5]

Równoważnik dawki (Sv)

Skutek kliniczny

< 0,25 Brak

0,25 ‐ 0,50 Możliwe zmiany hematologiczne

0,50 ‐ 1,00 zmiany hematologiczne, lekkie uszkodzenia

1,00 ‐ 2,00 Silne uszkodzenia, możliwa niewydolnośd, nudności/wymioty w ciągu 24 h

2,00 ‐ 4,00 Silne uszkodzenia, pewna niewydolnośd, możliwa śmierd

> 4,00 50% prawdopodobieostwa śmierci

Ostry zespół popromienny opisany został w Rozdziale 2.2.1.3. Przy dawkach poniżej 5 Gy śmierd spowodowana jest przez załamanie się hematopoezy w wyniku uszkodzenia szpiku (zespół szpiku kostnego). Tabela 3.4-2. przedstawia objawy dwóch typowych skutków deterministycznych, jakimi są zespół szpiku kostnego i przeżycie po napromienieniu różnymi dawkami promieniowania *6+. Tabela 3.4-2. Objawy skutków ostrego zespołu popromiennego w zakresie dawek dla zespołu szpiku kostnego

Dawka (Gy) Nasilenie fazy prodromalnej

Objawy Przeżycie

< 0,25 Brak Brak Pewne

0,25 ‐1,00 Słabe Niewielki spadek liczby komórek krwi Prawie pewne

1,00‐2,00 Słabe do średnie Wyraźne zmiany liczby komórek krwi Prawdopodobne

2,00‐3,50 Średnie Średnie do ostrych zmian liczby komórek

krwi Możliwe

3,50 ‐5,50 Średnie do

ostrego Ostre uszkodzenie szpiku.

Słabe uszkodzenie jelit Prawdopodobna śmierd w

ciągu 3‐6 tygodni

5,50‐8,00 Ostre Ostre uszkodzenie szpiku. Średnie uszkodzenie jelit

Śmierd w ciągu 2‐3 tygodni

8,00‐10,00 Ostre Ostre uszkodzenie szpiku.

Ostre uszkodzenie jelit Śmierd w ciągu 1‐2,5

tygodni

Efekty deterministyczne związane z występowaniem ostrego zespołu popromiennego zostały opisane w Rozdziale 2.2.1.3. Inne skutki deterministyczne promieniowania obejmują:

1. Efekty skórne. 2. Utrata włosów. Dawka progowa 3Gy 3. Rumieo. Występuje niedługo po napromienieniu. Dawka progowa 6 Gy 4. Mokre złuszczanie. Występuje po około 10 dniach. Spowodowane śmiercią komórek skóry

właściwej. Dawka progowa około 10 Gy; 5. Nekroza. Występuje po pary miesiącach. Uszkodzenie naczyo i rozpad tkanki. Dawka progowa

około 30 Gy, 6. Zadmę. Dawka progowa około 2‐4 Gy; 7. Uszkodzenie gonad 8. Okresowa bezpłodnośd mężczyzn. Dawka progowa 0,1 Gy 9. Trwała bezpłodnośd mężczyzn. Dawka progowa 5‐6 Gy 10. Trwała bezpłodnośd kobiet. Dawka progowa 7 Gy

Czas do wystąpienia efektów deterministycznych wynosi od kilku godzin do kilku miesięcy i zależy od wrażliwości tkanki napromienionej. Jeszcze dłuższy okres utajenia mają skutki stochastyczne.

Skutki stochastyczne dzieli się na somatyczne i genetyczne. Skutki somatyczne występują w


32

komórkach somatycznych i dotyczą tylko jednego organizmu. Skutki genetyczne występują w komórkach rozrodczych i powodują zmiany w następnych pokoleniach. Skutki somatyczne są to późne skutki napromieniowania dawkami promieniowania, które nie zabijają komórek, ale wywołują w nich powstawanie mutacji. Najważniejsze z nich to indukowane napromieniowaniem nowo twory złośliwe. Większośd informacji o takich skutkach pochodzi z badao grupy około 100000 ludzi napromieniowanych w wyniku wybuchu bomby atomowej w Hiroszimie i Nagasaki. Chociaż powstawanie nowotworu jest procesem wieloetapowym, pierwszym etapem jest zmiana jednej lub kilku komórek, które następnie

sukcesywnie przekształcają się i rozrastają w nowotwór, który jesteśmy w stanie wykryd. Nowotwór, który można wykryd dostępnymi dzisiaj metodami zawiera około miliona komórek. Nowotwory indukowane przez promieniowanie mogą występowad prawie we wszystkich tkankach ludzkiego ciała. Ich cechą charakterystyczną jest długi czas utajenia, zależnośd od wieku osobnika napromieniowanego (młodsze organizmy charakteryzuje większa radiowrażliwośd). Najkrótszy czas utajenia mają białaczki (7‐10 lat), podczas gdy nowotwory mózgu, piersi, płuc i tarczycy mają okres

utajenia 20‐30 lat. Bezsprzeczny jest związek pomiędzy napromieniowaniem a następującymi nowotworami: białaczka, rak skóry, mięśniaki, rak kości, rak tarczycy, rak płuc, rak żołądka. Ryzyko życiowe śmierci z powodu nowotworu indukowanego promieniowaniem po równoważniku dawki skutecznej 1 Sv pokazuje Tabela 3.4-3 [7]. Tabela 3.4-3. Ryzyko życiowe śmierci z powodu nowotworu indukowanego promieniowaniem po równoważniku dawki skutecznej 1 Sv

Ryzyko życiowe śmierci z powodu nowotworu indukowanego promieniowaniem [%]

Nowotwory lite

Mężczyźni 9

Kobiety 13

Dzieci (dziewczynki) 18

Dzieci (chłopcy) 26

Średnie dla dorosłych 11

Średnie dla dzieci 22

Białaczki

Obie płcie 1

Badania na zwierzętach jasno wskazują, że promieniowanie wywołuje efekty genetyczne. Ryzyko związane

z wystąpieniem indukowanych przez promieniowanie zmian genetycznych ocenia się na 0,6 x 10‐2/Sv [8]. Analiza danych uzyskanych w Hiroszimie i Nagasaki oraz obserwacje kobiet poddanych radioterapii w

czasie ciąży wykazały, że promieniowanie wywiera też niekorzystne działanie na płód.

Wczesny okres rozwoju płodu cechuje się intensywnym namnażaniem się komórek i przyjmuje się, że promieniowanie może wywoływad u płodu zarówno skutki deterministyczne (poronienia, wady rozwojowe i opóźnienie rozwoju), jak i stochastyczne (nowotwory i choroby dziedziczne). Najczęściej obserwowaną zmianą jest mikrocefalia i zahamowanie wzrostu. Ocenia się, że równoważnik dawki progowej dla tego skutku wynosi około >100 mSv. Najnowsze dane wskazują, że ostre opóźnienie umysłowe związane z napromienieniem zależy od momentu, w którym nastąpiło napromienienie płodu i przyjmuje się, że iloraz inteligencji IQ obniża się o 30 jednostek na 1 Gy promieniowania pomiędzy 8‐15 tygodniem ciąży *8+.

Działanie promieniowania na płód zależy głównie od wielkości dawki i stadium rozwoju płodu. Napromienienie w czasie zagnieżdżania się zarodka (0‐14 dni po zapłodnieniu) powoduje zazwyczaj jego obumarcie. Napromienienie w czasie organogenezy (do 6 tygodnia ciąży) powoduje przeważnie śmierd zarodka i wady rozwojowe. Po tym okresie promieniowanie powoduje głownie zmiany w układzie


33

nerwowym, zaś wrażliwośd płodu spada. Przyjmuje się, że prawdopodobieostwo wystąpienia skutków popromiennych na dawkę jednostkową jest większe dla ludzi narażonych na promieniowanie w łonie matki, niż dla tych, którzy byli napromienieni jako dorośli.

3.5 Zróżnicowana skuteczność biologiczna różnych rodzajów promieniowania

Oddziaływanie promieniowania z materią i pojęcie liniowego przekazywania energii (LET) zostały omówione poprzednio w punlcie 2.1.7. Badania biologiczne wykazały, że promieniowanie o różnych wartościach LET ma różne działanie biologiczne w przeliczeniu na jednostkę dawki pochłoniętej. Na przykład dawka 1 Gy neutronów zabija więcej komórek nowotworowych niż dawka 1 Gy promieniowania X. W celu umożliwienia porównywania działania różnych rodzajów promieniowania National Bureau of Standards wprowadziło w 1954 roku pojęcie względnej skuteczności biologicznej (ang. relative biological

effectiveness, RBE). Jako standard przyjęto skutecznośd promieniowania X 250 kV, a RBE zdefiniowano jako stosunek dawki promieniowania X 250 kV do dawki badanego promieniowania koniecznych do wywołania określonego efektu biologicznego (np. poziomu śmiertelności LD50).

RBE promieniowania zależy od kilku czynników:

(1) Badanego modelu biologicznego i kryterium odpowiedzi (ang. end point). Ponieważ wartośd RBE zależna jest od promieniowrażliwości badanego obiektu, będzie ona inna dla całego organizmu, którego promieniowrażliwośd zależy od jego najbardziej promieniowrażliwego elementu, a inna od poszczególnych tkanek lub rodzajów komórek. W przypadku komórek z uwagi na inny przebieg krzywej przeżywalności (Rys. 2) dla promieniowania o niskich wartościach LET i promieniowania o wysokich wartościach LET, wartości współczynnika RBE mierzone w obszarze ramienia krzywej są większe niż w obszarze prostoliniowym.

(2) Dawki promieniowania. Dla pojedynczej dawki wartośd RBE zależy od zastosowanej dawki. Dla niskich dawek wartości RBE są większe ze względu na występowanie ramienia krzywej przeżywalności dla komórek napromienionych promieniowaniem X 250 kV.

(3) Mocy dawki i jej frakcjonowania. Frakcjonowanie dawki pochłoniętej pozwala części komórek na naprawę uszkodzeo DNA i uniknięcie śmierci. Ponieważ efekt frakcjonowania dawki jest dużo mniejszy dla promieniowania o wyższych wartościach LET niż promieniowania o niższych wartościach LET, wartośd współczynnika RBE rośnie wraz z liczbą dawek i zmniejszaniem się pojedynczej dawki pochłoniętej. Podobnie wartośd współczynnika RBE rośnie wraz ze zmniejszaniem się mocy dawki.

(4) Rodzaj (LET) promieniowania. Wartośd RBE rośnie wraz ze wzrostem wartości LET promieniowania do około 100 keV/μm. Powyżej tej wartości skutecznośd biologiczna zmniejsza się. Działanie promieniowania o różnych wartościach LET zostało szczegółowo omówione w rozdziale 2.2.2.3.

Różnice w skuteczności biologicznej różnych rodzajów promieniowania i ich zależnośd od omówionych powyżej czynników spowodowały, że bezpośrednie użycie współczynnika RBE w codziennej praktyce ochrony radiologicznej jest zbyt złożone i konieczne jest znalezienie prostszego sposobu uwzględnienia tych zależności.

Międzynarodowa Komisja Ochrony Radiologicznej wprowadziła w tym celu wagowy współczynnik promieniowania (WR). WR określony został na podstawie wyników eksperymentalnych z uwzględnieniem stochastycznych skutków biologicznych o szczególnym znaczeniu z punktu widzenia ochrony radiologicznej, takich jak wywoływanie nowotworów i zmian genetycznych. WR definiuje się jako względna skutecznośd biologiczna promieniowania mierzona dla niskich dawek i przy niskich mocach dawki. Przykładowe wartości współczynnika WR podajeTabela 3.5-1. Tabela 3.5-1.Wartości współczynnika WR dla różnych rodzajów promieniowania

Rodzaj promieniowania Czynnik wagowy promieniowania (WR) 1


34

Fotony 1

Elektrony 1

Protony 2

Cząstki α, Ciężkie jony 20

Neutrony Zaleca się stosowanie wartości ciągłych w zależności od energii neutronów. Wartośd maksymalną wynoszącą 20 osiąga się przy energii neutronów

około 1 MeV. Przykładowe wartości podano poniżej

< 10 keV 5

10 keV – 100 keV 10

> 100 keV – 2 MeV 20

> 2 MeV – 20 MeV 10

1 Na podstawie [9]

Wielkość otrzymana przez pomnożenie dawki pochłoniętej przez czynnik wagowy promieniowania (1) określana jest jako dawka równoważna promieniowania (H) i wyrażana w Siwertach (Sv).

𝐻 = 𝐷 × 𝑊𝑅 (1)

4 Działania w celu ograniczenia lub zwiększenia skutków napromienienia

Najlepszym i najprostszym sposobem ograniczenia skutków napromienienia ludzi promieniowaniem jonizującym lub narażenia na substancje radioaktywne jest zmniejszenie dawek ekspozycyjnych. W wielu wypadkach, np. zamachy terrorystyczne z użyciem „brudnych bomb”, zamknięcie dostępu do skażonego terenu jest w pełni wystarczające. Konieczne jest tez prowadzenie szeroko zakrojonej akcji uświadamiającej sposób działania i skutki narażenia na promieniowanie, co może pozwolid na uniknięcie kradzieży przemysłowych lub terapeutycznych źródeł promieniowania.

Pomimo powziętych środków ostrożności i akcji informacyjnej, może się jednak zdarzyd, że dojdzie do przypadkowej ekspozycji na promieniowanie. Osobnym zagadnieniem jest także ekspozycja zawodowa (np. likwidatorzy skażeo) i terapeutyczna. W takich przypadkach powinno się podjąd działania w celu ograniczenia skutków narażenia.

4.1 Blokada tarczycy

Blokada tarczycy jest najlepiej znanym i udokumentowanym działaniem ograniczającym działanie promieniowania. W 1986 na wniosek specjalistów z Centralnego Laboratorium Ochrony Radiologicznej podawano bezpłatnie wszystkim obywatelom, szczególnie dzieciom, w całej Polsce roztwór jodu i jodku potasu (KI) (płyn Lugola) w celu zmniejszenia wchłaniania radioaktywnego izotopu jodu (131I) z opadów promieniotwórczych powstałych w wyniku wybuchu i pożaru elektrowni atomowej w Czarnobylu. Nadmiar jodu podany w płynie Lugola skutecznie powstrzymał wbudowywanie radioaktywnych izotopów jodu w hormony tarczycowe ‐ tyroksynę i trójjodotyroninę. Profilaktyką jodową objęto wtedy w Polsce 18,5 mln ludzi. Podobne działania podjęte zostały także w innych krajach objętych opadem, na Ukrainie jod otrzymało około 1,6 mln osób, na Białorusi 46 tys., a w Rosji 55 tys. Krótkotrwałe podawanie jodu dorosłym i dzieciom jest w zasadzie bezpieczne. U około 2% ludzi obserwuje się lekkie skutki uboczne, takie jak zapalenie ślinianek, zaburzenia pokarmowe, reakcje uczuleniowe, wysypka i przejściowy hipotyroizm. Czasami obserwuje się nadwrażliwośd na jod. Jedyne niebezpieczeostwo związane z podawaniem jodu wynika z jego toksyczności. Jod spożyty doustnie ma działanie drażniące śluzówki jamy


35

ustnej i przewodu pokarmowego. Przy masywnych zatruciach przyczyną zgonu jest niewydolnośd krążenia, niewydolnośd nerek, lub zachłystowe zapalenie i obrzęk płuc. Jednorazowa dawka śmiertelna jodu określona została na 1‐4 gramów, jest to jednak dużo więcej niż podaje się w celach profilaktycznych. Analiza danych uzyskanych po wypadku w Czarnobylu pozwoliła Amerykaoskiej Administracji Żywności i Leków (FDA) na opracowanie szczegółowych zaleceo dotyczących podawania jodu w celach profilaktycznych (Tabela 4.1-1). Tabela 4.1-1. Dawki jodku potasu rekomendowane przez FDA w celu blokowania tarczycy w przypadku wypadków radiacyjnych [5]

Grupa wiekowa Przewidywana dawka ekspozycyjna na

tarczycę [cGy] Dawka KI [mg]

Dorośli > 40 lat1 ≥500 130

Dorośli 18‐40 lat ≥10

Młodzież 12‐18 lat

≥5

65 Dzieci 3‐12 lat Dzieci 3‐12 lat

Dzieci 1 miesiąc ‐3 lata 32

Dzieci < 1miesiąca 16

Kobiety w ciąży i karmiące 130

1 Dorośli powyżej 40 lat powinni podlegad profilaktyce jodowej tylko w przypadkach znacznej ekspozycji (>500 cGy+, w przeciwnym razie może się u nich rozwinąd hipotyroizm.

Działanie ochronne jodu trwa około 1 doby, dlatego w celu osiągnięcia optymalnego działania profilaktycznego powinien byd podawany codziennie. Zalecenia FDA nieznacznie różnią się od zaleceo opracowanych przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) *6+, która zaleca podawanie dawki 130 mg KI także młodzieży powyżej 12 lat i rekomenduje podawanie jodu już przy przewidywanej dawce ekspozycyjnej > 1 cGy.

4.2 Chelatory

Działania ochronne prowadzi się także przy zatruciach plutonem. Toksycznośd plutonu i jegoizotopów wynika zarówno jego własności chemicznych jak i radiacyjnych. Z chemicznego punktu widzenia toksycznośd plutonu jest podobna do toksyczności ołowiu i innych metali ciężkich, tak więc główne zagrożenie dla zdrowia wynika z jego własności radiacyjnych. Izotopy plutonu 238Pu i 239Pu podczas rozpadu emitują wysokoenergetyczne promieniowanie α, które może uszkadzad komórki będące w bezpośrednim sąsiedztwie. Ponieważ zasięg cząstek α plutonu jest niewielki, największe szkody powodują, jeżeli pluton wniknie do wnętrza organizmu. Główną drogą wnikania plutonu do organizmu są drogi oddechowe, a głównymi organami docelowymi są kości i wątroba. Departament Energii USA (U.S. Department of Energy) szacuje, że zwiększenie sumarycznego ryzyka zgonu z powodu wystąpienia nowotworu od wdychanego plutonu wynosi 3×10−8

pCi−1 [7] W przypadku zatrucia plutonem zaleca się

postępowanie podobne do postępowania w przypadku zatrud innymi metalami ciężkimi. W przypadku skażeo zewnętrznych zaleca się miejscowe stosowanie chelatora ‐ kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA). Podawanie aerozolu DTPA zaleca się także w przypadku podejrzenia o wdychanie plutonu w celu zmniejszenia depozytów płucnych. DTPA używany był z powodzeniem także jako chelator zwiększający wydalanie plutonu z moczem w przypadkach skażeo wewnętrznych ludzi *8+.

4.3 Właściwa opieka medyczna i przeszczepy szpiku

Podstawowym działaniem zmniejszającym niekorzystne skutki działania promieniowania w przypadku napromienienia całego ciała jest zapewnienie właściwej opieki medycznej. Zapewnienie podstawowej opieki medycznej może zwiększyd szansę przeżycia nawet 2 krotnie (wzrost LD50 z około 3 do około 5 Gy, a zapewnienie intensywnej opieki medycznej nawet 3‐krotnie (LD50 około 11 Gy) *9+. Zabiegi intensywnej


36

opieki medycznej konieczne są w przypadku ekspozycji na większe dawki promieniowania i w celu polepszenia komfortu i wydłużenia życia pacjenta. W zależności od przebiegu zespołu szpikowego zaleca się podawanie cytokin, transfuzje krwi lub przeszczep szpiku kostnego. W przypadku ekspozycji na wysokie dawki zespół szpikowy może pojawid się już w ciągu kilku godzin po napromienieniu i ma zwykle ostry przebieg. Przeszczep szpiku jest wskazany przy poważnych początkowych objawach, takich jak ostra limfopenia w ciągu pierwszego tygodnia i trombopenia zbliżającej się dc poziomu zerowego w ciągu 10 dni. Dawców przeszczepu szpiku dobiera się zazwyczaj spośród rodzeostwa biorcy. I tak, chory posiadający jednego brata lub siostrę posiada ok. 25% prawdopodobieostwa zgodności w zakresie antygenów HLA, posiadający dwoje rodzeostwa 44% troje ‐ 58% i czworo ‐ 68%. Istnieje również możliwośd doboru dawcy zgodnego w zakresie antygenów HLA spośród osób niespokrewnionych.

Doświadczenia zdobyte przy leczeniu likwidatorów skażeo po wybuchu w Czarnobylu i ofiar wypadku w Tokaimura pozwoliły określid optymalne warunki dla przeszczepu szpiku kostnego. Przeszczepy powinny byd brane pod uwagę u ludzi narażonych na dawki od 7 do 10 Gy, którzy nie wykazują objawów dużych poparzeo popromiennych i objawów toksyczności narządowej. Rozległe poparzenia i toksycznośd narządowa źle rokuje i większośd pacjentów pomimo udanego przeszczepu i ustąpienia objawów zespołu szpikowego umiera przed upływem roku *10+. Najczęstszymi powikłaniami po przeszczepie szpiku kostnego są: choroba przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzucanie przeszczepu, zakażenia.

4.4 Radioprotektory

Zwiększające się znaczenie radioterapii w leczeniu nowotworów zintensyfikowało poszukiwania związków chemicznych, które chroniłyby zdrowe komórki przed promieniowaniem, jednocześnie nie zmniejszając skuteczności terapii. Idealny związek radioochronny powinien spełniad następujące wymagania:

1. ‐ powinien byd szybko wchłaniany i kierowany do organów docelowych; 2. ‐ powinien mied inną skutecznośd w stosunku do komórek nowotworowych i zdrowych; 3. ‐ nie powinien mied efektów ubocznych; 4. ‐ powinien mied niską toksycznośd; 5. ‐ nie powinien mied niepożądanego działania w przypadku wielokrotnego podawania; 6. ‐ działad krótko po podaniu; 7. ‐ powinien byd skuteczny w odniesieniu do różnych rodzajów promieniowania (X, gamma, neutrony); 8. ‐ powinien byd skutecznym zarówno w przypadku terapii pojedynczą dawką, jak i terapii

frakcjonowanej.

Chociaż w ciągu kilku ostatnich dekad przebadano kilkadziesiąt tysięcy związków pod kątem ich działanie radioochronnego i znaleziono wiele, które takie działanie przejawiają, większośd pozostała w fazie badao laboratoryjnych na zwierzętach. Głównymi przyczynami tego niepowodzenia są wysoka toksycznośd większości związków i jednakowe działanie na komórki zdrowe i nowotworowe.

Jedynym związkiem, który został dopuszczony do użycia klinicznego przez FDA jest amifostyna (WR‐ 2721). Związek ten został dopuszczony jako lek zmniejszający skutki uboczne radioterapii. Związki radioochronne zostały szczegółowo omówione w Rozdziale 2.2.2.3 pkt 5. W Tab. 2 przedstawiono wybrane związki, które w badaniach na zwierzętach wykazywały najlepszą skutecznośd przy stosunkowo niskiej toksyczności. Tabela 4.4-1. Radioprotektory [11]

Związek Toksycznośd LD50 (mg/kg)

Dawka ochronna (mg/kg)

WMD1

Cysteina 1700 1200 1,7

Metyloetyloamina 200 150 1,7

Cystamina 220 150 1,7

AET 480 400 2,1


37

WR‐638 1120 500 2,0

WR‐2721 950 500 2,7

WR‐36899 1120 450 2,2

WR‐77913 3574 2200 2,0

WR‐151327 785 315 1,9

Glutation 4000 4000 1,3

1 Współczynnik modyfikacji dawki (WMD) określa się jako stosunek dawki promieniowania w obecności badanego związku do dawki promieniowania w nieobecności badanego związku koniecznych do wywołania określonego efektu biologicznego (np. poziomu śmiertelności LD50).

4.5 Radiouczulacze i związki radioochronne

Niektóre związki chemiczne zmieniają wrażliwośd organizmu i komórek na promieniowanie jonizujące. Radiouczulacze są to związki zwiększające wrażliwośd na promieniowanie jonizujące.

Radiouczulacze stosowane w radioterapii, a ich działanie oparte jest na założeniu, że komórki nowotworowe są uczulane bardziej niż komórki zdrowe. W praktyce klinicznej znalazły zastosowanie dwa typy związków: halogenki pirymidyn i związki działające na komórki w hipoksji. Halogenki pirymidyn (np. 5‐jododeoksyurydyna (IdU) i 5‐bromodeoksyurydyna (BrdU)) są wbudowywane w DNA tak jak zwykłe zasady pirymidynowe, jednak ich obecnośd osłabia wiązania łaocucha DNA i czyni go bardziej podatnym na działanie promieniowania jonizującego. Komórki nowotworowe szybciej się dzielą i wbudowują więcej halogenków pirymidyn, co bardziej uwrażliwia je na działanie promieniowania niż komórki normalne. Oba halogenki uczulają komórki podobnie, jednak DNA z wbudowaną IdU jest mniej podatny na uszkodzenia wywoływane przez światło flourescencyjne i w związku z tym ma mniejsze działanie uboczne. Podjęto próby zastosowania IdU do leczenia glejaków i mięsaków, jednak badania te znajdują się w fazie badao klinicznych.

Działanie drugiej grupy radiouczulaczy oparte jest na założeniu, że w tkankach nowotworów litych znajduje się więcej komórek w hipoksji niż w tkankach normalnych, a ich usunięcie zwiększy wrażliwośd całego guza. Są to związki wykazujące powinowactwo do elektronów, a ich działanie polega na utrudnianiu chemicznej naprawy DNA i utrwaleniu uszkodzenia. Z klinicznego punktu widzenia idealny radiouczulacz selektywnie uczula komórki w hipoksji, jest stabilny chemicznie i wolno metabolizowany, rozpuszczalny w wodzie i lipidach, działa przez cały cykl komórkowy, jest skuteczny także przy niskich dawkach promieniowania.

Najlepiej poznane i stosowane klinicznie były pochodne imidazolu, m.in.. misonidazol, które w badaniach na zwierzętach wykazywały współczynnik modyfikacji dawki wynoszący 1,8, jednak w praktyce klinicznej nie spełniły oczekiwao i zostały wycofane z użycia.

Wśród związków działających radioochronnie możemy wyróżnić związki działające na poziomie komórkowym i na poziomie całego organizmu. Substancje działające na poziomie całego organizmu, chociaż nie zmieniają wrażliwości komórek, to mogą chronid cały organizm zmniejszając podaż i dostępnośd tlenu w narządach. Ponieważ komórki w warunkach hipoksji są mniej wrażliwe na promieniowanie jonizujące, ograniczenie dostępności tlenu w tkankach najbardziej narażonych na jego działanie ma działanie radioochronne. Grupa związków działających na poziomie komórek jest heterogenna. Można tu zaliczyd związki hamujące procesy śmierci komórek (np. związki o działaniu przeciwapoptotycznym), stymulujące proliferację (np. czynniki wzrostowe). Do tej grupy należą też „prawdziwe radioprotektory”, a więc związki działające na poziomie subkomórkowym. Są to przede


38

wszystkim związki zawierające grupy tiolowe (‐SH) oraz antyoksydanty (Tab. 2).

Badania struktury i reaktywności związków tiolowych pozwoliły na określenie budowy cząsteczki optymalnego związku o działaniu radioochronnym. Powinien to byd związek liniowy mający grupę tiolową na jednym koocu, a na drugim grupę o silnych własnościach zasadowych (tj. grupaaminowa lub guanidyna). Obie grupy mogą byd przedzielone łaocuchem węglowym zawierającym dwa lub trzy atomy

węgla. Działanie związków tiolowych polega na usuwaniu wolnych rodników wytwarzanych przez promieniowanie jonizujące i ułatwieniu chemicznej naprawy DNA poprzez dostarczenie atomu wodoru. Wydajnośd związków radioochronnych jest podobna do skuteczności efektu tlenowego i jest największa dla promieniowania o niskich wartościach LET, a najmniejsza dla promieniowania o wysokich wartościach LET, co potwierdza wolnorodnikową teorię działania tych związków. Zastosowanie radioprotektorów w radioterapii zostało omówione w rozdz. 2.2.2.2.

5 Naprawa uszkodzeo popromiennych **

5.1 Wstęp

Promieniowanie jonizujące powoduje powstawanie uszkodzeo DNA i innych składników komórki. Uszkodzenia DNA naprawiane są przez wyspecjalizowane enzymy naprawcze, specyficznie rozpoznające określony rodzaj uszkodzenia. Uszkodzenia takie, jeśli nie zostaną naprawione, mogą prowadzid do zahamowania procesów przetwarzania informacji genetycznej i ‐ w niektórych przypadkach ‐ do śmierci komórki. Jeżeli zostaną naprawione błędnie, prowadzid mogą do powstawania zmian informacji genetycznej, których skutkiem często są niekorzystne procesy biologiczne, takie jak starzenie się komórek i całego organizmu lub procesy nowotworzenia. W tym rozdziale zostaną omówione mechanizmy naprawy uszkodzeo popromiennych.

5.2 Uszkodzenia potencjalnie letalne i subletalne

DNA jest najważniejszą tarczą komórkową dla działania promieniowania jonizującego (patrz Rozdział 2.2.1.3). Uszkodzenia DNA wywołane przez promieniowanie możemy podzielid na trzy grupy:

(1) Uszkodzenia letalne, które są nieodwracalne i niemożliwe do naprawy i bezwzględnie prowadzą do śmierci komórki;

(2) Uszkodzenia potencjalnie letalne, których naprawa zależy od warunków po napromienieniu. Umieszczenie komórek ssaków po napromienieniu w warunkach, w których następuje zahamowanie ich wzrostu i wydłuża się czas do podziału powoduje znaczący wzrost przeżywalności w stosunku do komórek, które rosły w warunkach optymalnych. Przyjmuje się, że wydłużenie czasu między podziałami umożliwia naprawę uszkodzeo, które w normalnych warunkach nie zdążą byd naprawione i spowodują śmierd komórki;

(3) Uszkodzenia subletalne, które w normalnych warunkach są naprawiane w czasie kilku godzin po napromienieniu. Uszkodzenia subletalne mogą się przekształcid w letalne, jeżeli np. komórki zostaną napromienione po raz drugi w krótkim czasie.

5.3 Naprawa przez wycinanie zasad

Indukowane przez promieniowanie uszkodzenia zasad eliminowane są z DNA na drodze naprawy przez

wycinanie zasad (ang. Base Excision Repair, BER) [1,2]. Szybkośd naprawy BER różni się w zależności od wieku. U młodych osobników intensywnośd naprawy niektórych zmodyfikowanych zasad DNA jest większa niż u starszych. I tak, wycinanie uracylu (jego obecnośd w DNA jest istotnym


39

źródłem mutacji G:C→T:A) jest najwyższe w spermatogoniach młodych zwierząt i spada wraz z wiekiem. Naprawa poszczególnych uszkodzeo wydaje się byd jednak regulowana odrębnie i spadek aktywności naprawczej wraz z wiekiem nie jest regułą. Zaobserwowano np., że u myszy tempo naprawy 8‐oxoG w mitochondriach wzrasta u starszych osobników, ale w jądrach komórkowych pozostaje na podobnym poziomie podczas życia zwierzęcia. Nierównowaga w naprawie DNA może byd również przyczyną nowotworzenia, albowiem w czasie działania systemu BER powstają produkty pośrednie, takie jak miejsca pozbawione zasady i przerwy w łaocuchu DNA, które są dużo bardziej toksyczne dla komórki niż niektóre uszkodzone zasady. Nadprodukcja niektórych enzymów tego szlaku naprawy w komórkach ssaków zwiększa niestabilnośd mikrosatelitarną i poziom mutacji. W niektórych tkankach nowotworowych obserwuje się natomiast obniżenie szybkości wycinania 8‐oksyG, co także może prowadzid do zwiększenia poziomu mutacji *3+.

5.4 Naprawa dwuniciowych pęknięć DNA

Wykrycie podwójnoniciowego pęknięcia DNA (DSB) powoduje w komórkach aktywację szlaków sygnalizacyjnych prowadzących do uruchomienia mechanizmów kontrolujących przejście przez poszczególne fazy cyklu komórkowego i zatrzymanie podziału komórki oraz aktywację mechanizmów naprawy uszkodzenia. Naprawa DSB uszkodzeo przebiega według dwóch głównych mechanizmów opisanych poniżej.

5.4.1 Niehomologiczne łączenie końców

W komórkach ssaków niehomologiczne łączenie kooców (NHEJ) jest najważniejszym mechanizmem naprawy DSB *4+. Naprawa NHEJ wymaga, żeby wolne kooce DNA znajdowały się blisko siebie. NHEJ jest procesem, w którym dwa wolne kooce DNA łączone są ze sobą po usunięciu części DNA w okolicy uszkodzenia, tak aby powstała sekwencja komplementarna; następuje w związku z tym utrata informacji genetycznej. NHEJ może byd więc procesem prowadzącym do powstawania mutacji, a niektóre zespoły chorobowe charakteryzujące się brakiem białek NHEJ, cechują się także podwyższonym ryzykiem zapadalności na nowotwory. NHEJ konieczna jest też do właściwego przebiegu przegrupowania genów łaocuchów przeciwciał (rekombinacja V(D)J) w limfocytach B i T. Mutanty pozbawione aktywności najważniejszych białek NHEJ cechują się wysoką promieniowrażliwością i zespołem ciężkiego złożonego niedoboru odporności (SCID), co jest spowodowane upośledzeniem naprawy DSB i brakiem funkcjonalnych limfocytów B i T.

5.4.2 Naprawa homologiczna

Alternatywnym mechanizmem naprawy DSB jest naprawa przez rekombinację homologiczną (HR) *5+. W odróżnieniu od naprawy NHEJ, która może występowad we wszystkich fazach cyklu komórkowego, warunkiem koniecznym do wystąpienia HR jest istnienie drugiej identycznej nici DNA (chromatyda siostrzana), dlatego HR występuje tylko z późnej fazie S i fazie G2 cyklu komórkowego. Dzięki wykorzystaniu homologicznej nici DNA jako matrycy, naprawa przez HR jest procesem bezbłędnym. Jednak powstająca w koocowej fazie HR struktura, złożona z dwóch skrzyżowanych i połączonych nici DNA, może byd przecięta na dwa różne sposoby, powodując powstanie dwóch różnych produktów: z crossing‐over lub bez crossing‐over. Produkt bez crossing‐over jest odtworzeniem wyjściowej sekwencji DNA z niewielką wstawką sekwencji chromatydy siostrzanej, natomiast produkt z crossingover jest zupełnie nową sekwencją DNA, w której częśd DNA chromatydy macierzystej zamieniona jest przez sekwencje chromatydy siostrzanej. Powstanie produktu z crossing‐over zwiększa różnorodnośd genetyczną komórek mitotycznych, ale może prowadzid do niekorzystnych procesów biologicznych, jak. utrata heterozygotyczności i aktywacja onkogenów.

Chociaż NHEJ jest procesem prowadzącym do utraty części informacji genetycznej i w konsekwencji do mutacji, w komórkach organizmów wielokomórkowych jest to podstawowy mechanizm naprawy DSB.


40

Błędy powstające w wyniku NHEJ w tkankach zróżnicowanych nie stanowią prawdopodobnie istotnego zagrożenia dla całego organizmu. Natomiast takie błędy powstające w komórkach dzielących się mogą prowadzid do niekorzystnych procesów, w tym do nowotworzenia.

We wczesnych stadiach rozwoju zarodkowego HR jest podstawowym procesem naprawy DSB [6]. Naprawa DSB jest niezbędna do utrzymania integralności genomu, a jej upośledzenie często prowadzi do destabilizacji DNA i powstawania translokacji, duplikacji, delecji części genomu, które z kolei przyśpieszają procesy nowotworzenia. Mutacje lub polimorfizmy genów naprawy DSB znajdywane są w wielu tkankach nowotworowych, a niektóre zespoły chorobowe charakteryzujące się brakiem białek naprawy DSB, cechują się także podwyższonym ryzykiem zapadalności na nowotwory .

5.5 Naprawa uszkodzeń popromiennych na poziomie komórek

Nienaprawione na drodze chemicznej uszkodzenia DNA muszą zostad naprawione na drodze biologicznej. Naprawa uszkodzeo popromiennych na poziomie komórkowym (naprawa enzymatyczna) jest najważniejszym etapem naprawy uszkodzeo popromiennych i występuje w czasie od kilku minut do kilku godzin po napromienieniu.

5.6 Naprawa uszkodzeń popromiennych na poziomie tkanek

Naprawa uszkodzeo popromiennych na poziomie tkanek ogranicza się w zasadzie do eliminacji komórek uszkodzonych. W przypadku, kiedy repopulacja komórkowa jest szybsza niż eliminacja komórek uszkodzonych nastąpi odnowa tkanki i przywrócenie funkcji. W przypadku masywnego uszkodzenia komórek i/lub słabej repopulacji może dojśd do martwicy tkanki. W przypadku niewielkiego uszkodzenia i słabej repopulacji może dojśd do zastąpienia komórek uszkodzonej tkanki przez inne tkanki, na przykład tkankę łączną. Zastąpienie tkanek funkcjonalnych narządu tkanką łączną (zwłóknienia popromienne) jest częstym powikłaniem po radioterapii.

6 Dozymetria biologiczna

6.1 Metody biologiczne umożliwiające określenie dawki pochłoniętej

Po wystąpieniu zdarzenia, w wyniku którego ludzie zostali narażeni na działanie promieniowania jonizującego lub materiału radioaktywnego, powstaje konieczność określenia liczby osób narażonych, wielkości narażenia i oszacowania skutków zdrowotnych.

Określenie skażenia ciała jest stosunkowo prostym zadaniem, z uwagi na dostępną technologię umożliwiającą wykrycie i pomiar ilościowy nawet niewielkich ilości materiału radioaktywnego zawartego w ciele człowieka (np. Licznik Promieniowania Ciała Człowieka, Licznik Promieniowania Tarczycy lub pomiar aktywności próbek krwi lub moczu, patrz moduł 2.4.2). Dużo trudniejsze jest odtworzenie dawki pochłoniętej w przypadku narażenia na promieniowanie jonizujące. Powszechne zastosowanie detektorów indywidualnych jest drogie i trudne do przeprowadzenia, powstaje więc koniecznośd opracowania metody umożliwiającej ocenę dawki pochłoniętej na podstawie zmian zachodzących w organizmie człowieka.

Opracowany przez Narodowy Instytut Zdrowia (National Health Institute) w USA system zarządzania wypadkami radiacyjnymi (Radiation Event Medical Management) zawiera estymator dawki (REMM Dose Estimator) oparty na trzech metodach oszacowania dawki:

1. Ocenie czasu wystąpienia wymiotów


41

2. Ocenie kinetyki zaniku limfocytów 3. Ocenie częstości występowania chromosomów dicentrycznych.

Dwie pierwsze są metodami opartymi na obserwacjach klinicznych, natomiast trzecia jest metodą laboratoryjną, wchodzącą zakres dozymetrii biologicznej. Podczas gdy metody kliniczne biorą pod uwagę odpowiedź całego organizmu, dozymetria biologiczna jest metodą, która pozwala na ocenę natężenia czynnika uszkadzającego DNA (np. dawki pochłoniętej promieniowania) na podstawie zmian w komórkach lub tkankach człowieka (np. komórkach krwi obwodowej lub szpiku kostnego, kościach czy szkliwie zębów). Chociaż dozymetria biologiczna nie mierzy bezpośrednio radioaktywności lub natężenia promieniowania, a jedynie wybrane skutki koocowe jego działania na organizm człowieka, to korelacja tych skutków z badaniami modelowymi pozwala na oszacowanie dawki pochłoniętej. Możliwośd prostej i wiarygodnej oceny dawki metodami dozymetrii biologicznej powoduje, że stała się ona dzisiaj niezbędnym elementem ochrony radiologicznej i bezpieczeostwa jądrowego.

6.2 Metody dozymetrii biologicznej

Metody dozymetrii biologicznej można podzielid na metody natychmiastowe i retrospektywne.

6.2.1 Metody natychmiastowe

Metody natychmiastowe umożliwiają ocenę dawki w krótkim czasie po napromienieniu. Są one oparte na pomiarze zjawisk przemijających, związanych z powstawaniem uszkodzeo DNA. Zaletą tych metod jest pomiar zjawisk bezpośrednio związanych z ekspozycją na promieniowanie. Jednocześnie jest to także ich ograniczeniem, ponieważ procesy naprawy uszkodzeo DNA zachodzące komórce po napromienieniu eliminują przyczynę powstawania tych zjawisk i powodują, że metod natychmiastowych nie można użyd retrospektywnie.

6.2.1.1 Test kometowy

Test kometowy jest stosunkowo nową i czułą metodą oznaczania uszkodzeo DNA na poziomie pojedynczych komórek. Zawiesinę badanych komórek w agarozie o niskiej temperaturze krzepnięcia nanosi się na podstawowe szkiełko mikroskopowe i po zestaleniu się warstwy agarozowej komórki poddaje się lizie w obecności detergentu i elektroforezie niskonapięciowej. Po elektroforezie preparat zobojętnia się i barwi barwnikiem fluorescencyjnym interkalującym DNA. Wybarwiony DNA ocenia się przy uzyciu mikroskopu fluorescencyjnego, oceniając uszkodzenia DNA. Zastosowanie wysokiego pH i stężenia soli w procesie lizy i elektroforezy powoduje oddysocjowanie większości białek macierzy jądrowej oraz rozerwanie wiązao wodorowych pomiędzy nidmi DNA, co powoduje częściową relaksację superzwinięcia nici DNA, jeszcze bardziej ułatwioną przez obecnośd pęknięd nici. Po przyłożeniu napięcia nici DNA są wywlekane z jądra w kierunku anody, powodując powstawanie tzw. "ogona" komety. Częśd DNA, która nie uległa uszkodzeniu, pozostaje związana z macierzą jądrową tworząc "głowę" komety. Całośd oglądana przy uzyciu mikroskopu fluorescencyjnego przypomina kometę. DNA komórek nieuszkodzonych nawet po przyłożeniu napięcia pozostaje w obrębie jądra komórki (głowa komety) związany z macierzą jądrową (Rysunek 6.2-1).

Test kometowy łączy w sobie zalety metod elektroforetycznych z możliwościami metod cytogenetycznych. Ze względu na prostotę wykonania i małą inwazyjnośd, do przeprowadzenia testu wystarczy kropla krwi z palca. W ostatnim czasie wzrasta zainteresowanie tą metodą jako narzędziem do badania narażenia populacji ludzkich na określone czynniki środowiskowe lub endogenne *1+.


42

Rysunek 6.2-1 .Komórka kontrolna (A) i napromieniona dawką 3 Gy promieniowania X (B) (zdjęcia dr M. Kruszewski ICHTJ)

Z uwagi na swoją czułośd i możliwośd mierzenia uszkodzeo DNA w pojedynczych komórkach test kometowy znalazł szerokie zastosowanie do badania genotoksyczności (za czynniki genotoksyczne uważa się związki chemiczne, które powodują uszkodzenia DNA i/lub zmieniają replikację lub przekazywanie materiału genetycznego) in vitro i in vivo. Może byd użyty do badania genotoksyczności praktycznie we wszystkich typach komórek eukariotycznych, pod warunkiem, że z badanego materiału można otrzymad zawiesinę komórek. Test kometowy używany jest do oceny uszkodzeo DNA w limfocytach krwi obwodowej ludzi poddanych działaniu różnych czynników, np. zanieczyszczenie środowiska, narażenie zawodowe na czynniki chemiczne i promieniowanie jonizujące. Ze względu na niski koszt i znikomą inwazyjnośd, test kometowy wydaje się byd idealną metodą do badao przesiewowych. Szybkośd procesów naprawy pęknięd DNA wykrywanych tą metodą powoduje jednak, że zastosowanie tego testu w ocenie pochłoniętych dawek promieniowania jest ograniczone i stosuje się go przede wszystkim do oceny narażenia chronicznego (Rysunek 6.2-2).

Rysunek 6.2-2. Naprawa uszkodzeń DNA wywołanych przez dawkę 5 Gy promieniowania X w limfocytach krwiobwodowej człowieka


43

6.2.1.2 Test ognisk histonu γH2AX

W odróżnieniu od testu kometowego, który mierzy wpływ pęknięd nici DNA na superzwinięcie chromatyny, test ognisk histonu γH2AX pozwala na określenie liczby podwójnoniciowych pęknięd nici DNA (DSB) na podstawie występowania skupisk (ognisk) charakterystycznych białek w miejscach uszkodzeo. Histony są białkami składowymi chromatyny, bezpośrednio związanymi z nidmi DNA. W momencie powstania DSB jeden z histonów (H2AX) ulega fosforylacji, dając γH2AX. Reakcja ta jest specyficzna i występuje tylko w miejscu powstania DSB. Obecnośd histonu γH2AX można wykryd metodami immunofluorescencyjnymi. Liczba ognisk odpowiada liczbie DSB. W skrócie, test polega na umieszczeniu komórek na szkiełku podstawowym, utrwaleniu i dodaniu przeciwciała specyficznie wiążącego się z histonem γH2AX. Z reguły przeciwciało takie jest wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym i możne jego obecnośd wykryd bezpośrednio przy użyciu mikroskopu (Rysunek 6.2-3).

Rysunek 6.2-3. Ogniska histonu γH2AX w jądrach komórek jajnika chomika chińskiego. Komórki kontrolne (A),komórki napromienione dawką 1 Gy promieniowania X (B) zdjęcia dzięki uprzejmości dr Marii Wojewódzkiej, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej)

Podobnie jak w przypadku testu kometowego, wadą tego testu jest szybkie zanikanie ognisk w wyniku naprawy DSB, co uniemożliwia jego użycie w dozymetrii retrospektywnej. Zaletą tego testu jest natomiast wysoka specyficznośd, ponieważ histon H2AX ulega fosforylacji tylko w momencie wystąpienia DSB *2+.

6.3 Metody retrospektywne

W dozymetrii retrospektywnej wykorzystuje się zarówno metody oparte na pomiarze zjawisk biologicznych jak i zjawisk fizyko‐chemicznych. Metody biologiczne, takie jak metoda mikrojądrowa, oznaczanie częstości występowania wymian odcinków chromatyd siostrzanych lub aberracji chromosomowych pozwalają na określenie częstości powstawania zmian genetycznych w wyniku nieprawidłowej naprawy DNA. Metoda fizyko‐chemiczna, taka jak spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) pozwala wykryd w tkankach cząsteczki chemiczne posiadające niesparowane elektrony (rodniki). Zaletą wymienionych metod jest możliwośd badania trwałych skutków działania promieniowania. Eliminacja komórek (tkanek) z takimi zmianami z organizmu jest stosunkowo powolna. Czułośd metod biologicznych określa się na 0,1‐0,5 Gy, a metody EPR na 0,1 Gy.

6.3.1.1 Metoda mikrojądrowa

Test mikrojądrowy jest metodą cytogenetyczną pozwalającą na wykrywanie podwójnoniciowych pęknięd DNA i uszkodzeo wrzeciona podziałowego ujawniających się po podziale komórek. Mikrojądro powstaje, jeżeli w czasie mitozy cały chromosom lub fragment chromosomu nie zostanie rozdzielony pomiędzy dwa jądra potomne. Według klasyfikacji zaproponowanej przez Fenecha i wsp. *3+ mikrojądro powinno byd mniejsze niż ⅓ wielkości normalnego jądra, (2) wyraźnie oddzielone od jądra, i (3) podobnie wybarwione jak jądro komórki. Mikrojądra stosunkowo łatwo liczy się przy użyciu mikroskopu i ich liczenie nie wymaga dużego doświadczenia. Początkowo mikrojądra liczono w czasie normalnych podziałów komórki,


44

następnie zaczęto stosowad cytochalazynę B, która blokuje podział cytoplazmy (cytokinezę) i zaczęto liczyd mikrojądra w komórkach dwujądrzastych (Rysunek 6.3-1Rys. 4). Zastosowanie cytochalazyny B podwyższyło czułośd metody i ją uprościło. Ostatnio wprowadzono kolejną modyfikację testu mikrojądrowego polegającą na połączeniu go z metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (patrz poniżej). Odpowiedni dobór sond pozwala na stwierdzenie czy mikrojądro zawiera cały chromosom, czy fragment acentryczny.

Rysunek 6.3-1. Schematyczne przedstawienie przebiegu testu mikrojądrowego bez zastosowania cytochalazyny B (A) i z zastosowaniem cytochalazyny B (B)

Dla celów dozymetrii biologicznej test mikrojądrowy wykonuje się z reguły na limfocytach krwi

obwodowej (Rys. 5). Znane są jednak modyfikacje tego testu wykonywane na komórkach nabłonka

worka policzkowego, erytrocytach lub komórkach szpiku kostnego.

6.3.1.2 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych

Metodą wymiany chromatyd siostrzanych (ang. sister chromatid exchange, SCE) bada się częstośd występowania wzajemnych, symetrycznych wymian fragmentów pomiędzy identycznymi sekwencjami DNA obu chromatyd w chromosomie *4+. Wymiana fragmentów chromatyd siostrzanych jest możliwa do oceny w płytkach metafazalnych uzyskanych z hodowli komórek prowadzonych w obecności bromodeoksyurydyny (BrdU). Po dodaniu BrdU do dzielących się komórek (stymulowane limfocyty) jest ona wbudowywana w nid DNA w czasie syntezy. Ponieważ przed podziałem mitotycznym DNA zawarty w

komórce jest podwajany, ta nowa połowa DNA zawiera wbudowaną BrdU. W czasie podziału ta połowa segregowana jest do jednej z komórek potomnych. Obecnośd BrdU w DNA można wykryd stosując specjalne metody barwienia. Drugi podział przebiega podobnie i w drugiej mitozie obserwuje się symetryczne wymiany pomiędzy chromatydami zawierającymi BrdU i tymi, które BrdU nie zawierają (Rys. 6).


45

Rysunek 6.3-2 . Schematyczne przedstawienie przebiegu testu wymian siostrzanych. Chromatydę wyznakowaną BrdU przedstawiono kolorem białym

Przyczyny występowania SCE nie są do kooca wyjaśnione. Jest to prawdopodobnie proces naturalny (crossing‐over) zwiększający zróżnicowanie genetyczne. W preparatach kontrolnych występuje 4‐5 SCE na komórkę. Przyjmuje się, że więcej niż 14 wymian na komórkę nie jest stanem normalnym. Obecnie metoda wychodzi z użycia i jest używana głównie do badania cytotoksyczności związków chemicznych in vitro. Wadą tej metody jest brak korelacji z dawką pochłoniętą promieniowania [5].

6.3.1.3 Metoda aberracji chromosomowych

Aberracje chromosomowe powstają w wyniku błędnej naprawy DSB. Jeżeli w komórce występują jednocześnie dwa lub więcej DSB, wolne kooce nici w trakcie procesu naprawy mogą zostad błędnie połączone. Koniec nici należącej do jednego chromosomu może zostad połączony z koocem nici należącej do innego chromosomu (translokacje międzychromosomowe) lub z innym koocem nici należącej do tego samego chromosomu (translokacje wewnątrzchromosomowe). Ponieważ przywrócona zostaje ciągłośd nici DNA, zmiany takie, o ile nie prowadzą do śmierci komórki, są trwałe i mogą byd przekazywane w czasie podziału komórkom potomnym. Czynniki genotoksyczne indukują uszkodzenia, które ujawniają się jako aberracje tylko wtedy, gdy w komórce następuje replikacja DNA. Do badao narażenia ludzi wykorzystuje się zwykle limfocyty krwi obwodowej, ale w badaniach in vitro można stosowad też inne komórki, na przykład komórki jajnika chomika chioskiego (CHO) lub fibroblasty płuc chomika (komórki V79). Jeżeli stosuje się komórki w fazie G0 (limfocyty) konieczne jest stymulowanie ich do podziałów komórkowych, przez podanie odpowiedniego antygenu (fitochemaglutynina). Po około 48 godzinach dodaje się do hodowli limfocytów kolcemidu, substancji blokującej tworzenie się wrzeciona podziałowego i rozchodzenie się chromosomów w czasie mitozy. W ten sposób podział komórki jest zablokowany na początku mitozy, co pozwala na ocenę wszystkich chromosomów (Rysunek 6.3-3).

Rysunek 6.3-3. Schematyczne przedstawienie przebiegu testu aberracji chromosomowych

Klasyczna analiza aberracji chromosomowych w komórkach metafazalnych pozwala na wykrycie


46

dostrzegalnych przy użyciu mikroskopu zmian w liczbie (aberracje numeryczne) i morfologii chromosomów (aberracje strukturalne). Aberracje numeryczne zwykle są nieprzydatne dla potrzeb dozymetrii biologicznej, z uwagi na często występujące artefakty związane z preparatyką komórek. Natomiast aberracje strukturalne, takie jak złamania chromosomów i chromatyd, chromosomy pierścieniowe lub chromosomy dicentryczne i fragmenty acentryczne są z powodzeniem wykorzystywane do szacowania dawki pochłoniętej. Najlepszą korelację pomiędzy występowaniem określonego typu aberracji i dawką pochłoniętą uzyskuje się dla chromosomów dicentycznych i właśnie ocena częstości występowania tych aberracji jest dzisiaj stosowana najczęściej. Niestety powstanie chromosomu dicentrycznego prowadzi zwykle do śmierci komórki, co powoduje, że komórki zawierające dicentryki są stosunkowo szybko eliminowane z krwioobiegu. Stanowi to pewne utrudnienie przy oceni dawki pochłoniętej, zwłaszcza w dłuższym czasie po napromienieniu. Główną wadą metody aberracji chromosomowych jest jej duża pracochłonnośd i koniecznośd zatrudnienia do oceny preparatów wysokokwalifikowanego personelu. Istotnym ulepszeniem metody aberracji chromosomowych jest wprowadzenie metody hybrydyzacji in situ z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (FISH), która pozwala na wykrywanie niedostrzegalnych bez takiego barwienia translokacji fragmentów chromosomów.

6.3.1.4 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization, FISH) jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. Odpowiednie przygotowanie komórek do badania wymaga usunięcia cytoplazmy i utrwalenia jąder komórkowych na szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całośd podawana jest krótkotrwałej denaturacji w podwyższonej temperaturze, która powoduje rozerwanie się wiązao wodorowych pomiędzy nidmi DNA. Następnie preparat poddaje się kilkugodzinnej hybrydyzacji, w czasie której fluorescencyjnie wyznakowane odcinki znanego DNA (sonda) wiążą się z komplementarnymi odcinkami badanego DNA. Nadmiar niezhybrydyzowanej sondy usuwa się przez kilkukrotne płukanie preparatu. Tak przygotowany preparat można analizowad przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda FISH może być wykorzystana do badania wielu typów komórek i tkanek. W dozymetrii wykorzystuje się ją przede wszystkim do badania aberracji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej. Metodę FISH stosuje się w przypadkach, gdy zawodzi klasyczna analiza cytogenetyczna, ponieważ umożliwia ona dużo dokładniejszą analizę translokacji. W ostatnich latach gwałtownie rozwija się technika wielokolorowej FISH (ang. multicolor FISH, m‐FISH), w której każdy chromosom hybrydyzuje z sondą wyznakowaną innym kolorem. Dzięki wyznakowaniu wszystkich chromosomów, technika ta umożliwia zbadanie translokacji złożonych z fragmentów kilku chromosomów (Rysunek 6.3-4). Metoda FISH, a szczególnie m‐FISH stanowi istotny postęp w analizie aberracji chromosomowych, i z pewnością będzie coraz szerzej stosowana w dozymetrii biologicznej. Głównym ograniczeniem szerszego zastosowania m‐FISH jest obecnie jej wysoki koszt i koniecznośd zastosowania specjalnych wspomaganych komputerowo systemów analizy obrazu.

Rysunek 6.3-4. Chromosomy człowieka wybarwione metodą m‐FISH. Komórka napromieniona dawką2 Gy jonów węgla o energii 11,4 MeV. Wyraźnie widoczne translokacje w obrębie chromosomu 3 i 10 (zdjècie dzięki uprzejmości dr Sylwestra Sommera, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej)


47

6.3.1.5 EPR

Dozymetria metodą elektronowego paramagnetycznego rezonansu (EPR) przebojem wkroczyła na pole dozymetrii biologicznej w latach 90‐tych. Metoda ta polega na pomiarze ilości stałych rodników tworzących się w ciele człowieka pod wpływem promieniowania jonizującego. Najbardziej przydatny do tego celu okazał się hydroksyapatyt (Ca10 (PO4)6(OH)2) zawarty w kościach i szkliwie zębów. Szczególnie szkliwo zębów jest przydatne dla celów dozymetrii biologicznej, ponieważ zawiera bardzo dużo hydroksyapatytu (96%), tworzy się w dzieciostwie i, w odróżnieniu od kości, przez resztę życia człowieka nie ulega przebudowie ani odnowie. Węglany zawarte w hydroksyapatycie pod wpływem promieniowania jonizującego przekształcają się w anionorodniki węglanowe (CO2•‐). Trwałośd takich rodników ocenia się na 107

lat *2+. Przygotowanie próbki obejmuje oddzielenie korzenia zęba od jego korony i usunięcie z niej dentyny. Dentyna zawiera więcej substancji organicznej (30%) niż szkliwo (2%) i jej obecnośd może zaburzyd otrzymane wyniki. Po oddzieleniu dentyny szkliwo kruszy się i rozciera na proszek, co poprawia wykrywanie sygnału EPR. Tak przygotowany materiał mierzy się w spektrometrze EPR w paśmie X. Dawkę pochłoniętą określa się na podstawie wielkości piku sygnału charakterystycznego dla CO2•‐. Metoda ta została z powodzeniem użyta do określenia dawki pochłoniętej w wypadkach radiacyjnych, m.in. w Czarnobylu, Białymstoku czy w basenie rzeki Techa, a także u mieszkaoców Hiroszimy i Nagasaki.

Czułość metody szacuje się na 0,1 Gy.


48

Bibliografia Rozdział 1 [1] G J. Pan, ZY. Chang, HR. Schöler, D. Pei, Cell Research 12 (2002) 321‐329. [2] HL. Persson, T. Kurz, JW. Eaton, UT. Brunk, Biochem J. 389 (2005) 877‐84. [3] JD. Watson, FHC. Crick, Nature 171 (1953), 737‐738. [4] http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml Rozdział 2 [1] MM. Janiak, A. Wójcik, Medycyna zagrożeń i urazów radiacyjnych, Wydawnictwo Lekarskie PZWL,2004. [2] MH. Bourguignon, PA. Gisone, MR. Perez, S. Michelin, D. Dubner, M. Di Giorgio, ED. Carosella, Eur.J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 32 (2005) 351‐368. [3] JJ. Broerse, T MacVittle (eds), Response of Different Species to High Dose Total‐Body Irradiation,Maretinus Nijhoff, Amsterdam 1984. [4]. TE. Wheldon, AS. Michalowski, J. Kirk, Br. J. Radiol. 55 (1982) 759‐766. [5] 1990 ICRP Recommendations of the International Commission on Radiological Protection, ICRP Publication 60, Ann. ICRP 21/1‐3. Pergamon Press, Oxford, 1991. [6] TM. Pawlik, K.Keyomarsi, Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (2004) 928‐42. [7] EJ. Hall, AJ. Giaccia, Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2006. Rozdział 3 [1] HE. Poulsen, H. Prieme, S.Loft, Eur. J. Cancer Prev. 7 (1998) 9‐16. [2] JF. Ward, WF. Blakely, EI.Joner, Radiat Res. 103 (1985) 383‐92. [3] SS.Wallace, Radiat Res. 150 (19985) S60‐79. [4] MA. Siddiqi, E. Bothe, Radiat Res. 112 (1987 ) 449‐63. [5] Guidance on Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent in Radiation Emergencies, Food andDrug Administration, Washington, 2001, http://www.fda.gov/cder/guidance/4825fnl.pdf [6] World Health Organization Guidelines for Iodine Prophylaxis following Nuclear Accidents: Update1999, WHO, Geneva, 1999, http://www.who.int/ionizing_radiation/pub_meet/Iodine_Prophylaxis_guide.pdf [7] Toxicological profile for uranium. U.S. Department of Health and Human Services. Public HealthService. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. (1999} Atlanta, USA. [8] VF. Khokhryakov, AP. Belyaev, TI. Kudryavtseva, AE. Schadilov, GS. Moroz, VA. Shalaginov, Radiat.Prot. Dosimetry 105 (2003) 499‐502. [9] Guidance on Radiation Received in Space Activities, NCRP Report No. 98, 1989 [10] JK. Waselenko, TJ. MacVittie, WF. Blakely, N. Pesik, AL. Wiley, WE. Dickerson, H. Tsu, DL. Confer,N. Coleman, T. Seed, P. Lowry, JO. Armitage, N. Dainiak, Ann. Intern. Med. 140 (2004) 1037‐1051. [11] EA. Bump, K. Malaker, Radioprotectors: Chemical, Biological, and Clinical Perspectives, CRC Press, New York, 1997 Rozdział 4 [1] EJ. Hall, AJ. Giaccia, Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2006. [2] H. Nagasawa, JB. Little, Cancer Res., 52 (1992) 6394‐6396. [3] EA. Bump, K. Malaker, Radioprotectors: Chemical, Biological, and Clinical Perspectives, CRC Press, New York, 1997. [4] CKK. Nair, DK. Parida, T. Nomura, J. Radiat. Res., 42 (2001) 21–37. [5] ICRP 103. International Commission on Radiological Protection. The 2007 Recommendations ofthe International Commission on Radiological Protection, Publication 103, Ann. ICRP 37. ElsevierScience, Oxford, 2007. [6] UNSCEAR 2000. Sources and Effects of Ionizing Radiation. Report to the General Assembly, withscientific annexes. United Nations, New York, 2000. [7] ICRP 60. International Commission on Radiological Protection. 1990 Recommendation of the International Commission on Radiological Protection. Publication 60. Ann. ICRP, 21/1‐3, PergamonPress, Oxford, 1991.


49

[8] S. Wolff, Science 245 (1989) 575. [9] EJ. Calabrese, LA.Baldwin, Hum. Exp. Toxicol. 19 (2000) 41‐75. [10] SZ. Liu, Human Ecol. Risk Assess. J. 4 (1998) 1217‐1254. [11] LE. Feinendegen, H. Muhlensiepen, VP. Bond, CA. Sonhaus, Health Physics 52, (1987) 663‐669. Rozdział 5 [1] AR. Collins, AA. Oscoz, G. Brunborg, I. Gaivão, L. Giovannelli, M. Kruszewski, CC. Smith, R. Stetina, Mutagenesis 23 (2008):143‐51. [2] Szumiel I. Analysis of DNA Double‐Strand Breaks by Means of γ‐H2AX Foci. w: G. Obe, Vijayalaxmi, Ed.; Chromosomal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health. Springer‐Verlag, Berlin, Heidelberg, 2007, 145‐160. [3] M. Fenech, WP. Chang, M. Kirsch‐Volders, N. Holland, S. Bonassi, E. Zeiger, Mutat Res. 534 (2003) 65‐75. [4] Wójcik A., G. Obe, Sister‐Chromatid Exchanges w: G. Obe, Vijayalaxmi, Ed.; Chromosomal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health, Springer‐Verlag, Berlin, Heidelberg, 2007, 271‐283. [5] HP. Schwarcz, Nucl. Tracks 10 (1985) 865–867. Rozdzial 6 [1] EJ. Hall, AJ. Giaccia, Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2006. [2] KH. Chadwick, HP. Leenhouts, Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 33 (1978) 517‐529. [3] JM. Brown, LD. Attardi, Nat. Rev. Cancer 5 (2005) 231‐7. [4] M. Holmberg, Leuk. Res. 16 (1992) 333‐6. [5] ICRP 60. International Commission on Radiological Protection. 1990 Recommendation of the International Commission on Radiological Protection. Ann. ICRP, 21/1‐3, Publication 60. Pergamon Press, Oxford, 1991. [6] AW. Hayes, Principles and methods of toxicology: 4th Edition, CRC Press, Philadelphia, 2001. [7] UNSCEAR. United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation. Sources and effects of ionizing radiation. UNSCEAR 2000. Report to the General Assembly, with scientific annexes. United Nations, New York, 2000. [8] UNSCEAR. United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation. Hereditary Effects of Radiation: UNSCEAR 2001 Report to the General Assembly, with scientific annex. United Nations, New York , 2001. [9] ICRP 92. International Commission on Radiation Protection. Relative biological effectiveness (RBE), quality factor (Q) and radiation weighting factor (WR). ICRP publication 92, Oxford, Elsevier Science Ltd., 2003.

biologiczne skutki promieniowania jonizujĄcego › ~pluta › pl › dyd › pokl33 › pdf ›...

Documents