biomarcadores proteicos: las plataformas de arrays de proteínas

UNIVERSIDADE DA CORUÑA

Biomarcadores Proteicos: Las plataformas de arrays de proteínas

Grupo de Proteómica

ProteoRed, PRB2-ISCIII INIBIC

Hospital Universitario de A Coruña

Lucía María Lourido Salas

Características:

• Muy sensible Bajo consumo de muestra

• No requiere la separación o depleción de proteínas abundantes Rapidez y automatización

Arrays de proteínas Introducción

Definición: soportes miniaturizados para monitorizar cientos de proteínas simultáneamente

2) Funcionales

Proteínas Lípidos/Carbohidratos

Fármacos

Proteínas

Proteínas Anticuerpos

1) Analíticos

DNA

Antígenos

Anticuerpos

Muestra

Antígenos

Muestra Muestra

Perfiles proteicos/diagnóstico Interacciones proteicas

Arrays de proteínas para la búsqueda de biomarcadores

Introducción

Proteínas Número de muestras/ensayo

Proteínas Número de muestras/ensayo

Formato plano:

Formato de esferas:

Antígenos Anticuerpos

Proteínas Autoanticuerpos

Proyectos

1

• Buscar autoanticuerpos en sueros de pacientes con artrosis

con potencial valor diagnóstico de la enfermedad.

2

• Identificar un panel de proteínas en suero que permitan

diagnosticar a los pacientes artrósicos.

Introducción

Human Protein Atlas- Proyecto Proteoma Humano

Selección del antígeno Clonaje Producción de fragmentos

bacteria

1. Generación

de fragmentos proteicos

Purificación de los fragmentos

Inmunización Anticuerpo (Ab) Purificación del Ab

2. Generación

del anticuerpo

Inmunofluorescencia Western blot Inmunohistoquímica Arrays de fragmentos

3.Validación

1



2



Proyectos Proyectos

Identificación de autoanticuerpos en OA


Diferentes arrays de antígenos

cDN

A

Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA)

α-tag

α-tag

Proteina expresada

cDN

A

Dirigida

No Dirigida

Arrays de fragmentos proteicos

Expresión in vitro

3840 fragmentos proteicos 80 proteínas completas

Suero con autoanticuerpos

Arrays planos

Arrays en esferas

Muestras

21 SANOS

OA

AR


Flujo de trabajo de los arrays de fragmentos proteicos Identificación de autoanticuerpos en OA

1) Cribado

3840 fragmentos proteicos

Leyenda:

Fragmentos proteicos

Suero con anticuerpos

2) Verificación

232 fragmentos proteicos

Pocillo 1

Pocillo 1

Pocillo 1

Spot1 Spot3840

Spot1 Spot3840

Spot1 Spot3840

Anticuerpo Anti-IgG humana marcado

Análisis: - IF> IFM+10x MAD - Test exacto de Fisher (p<0.05)

Expresión in vitro

de la proteína de

interés

Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA)

Labaer et al 2008

Etiqueta (GST)

Anti-GST DNA


80 proteínas completas

Labaer et al 2008


3) Purificación 4) Secuenciación

Construcción del NAPPA

1) Selección 2) Cultivo 7) Printing

07/02/2013

C) -IgG humana –Cy3

B) Añadir suero

tag

tag

tag

tag

IgG humana

IgG humana

A) Expresión

α-tag

cDN

A

α-tag

cDN

A

Proteina expresada

IVTT

D) Análisis

Flujo de trabajo de los NAPPA

Array


80 proteínas

Análisis:

-Normalización inter e intra array

- IF > background -Wilcoxon test (p< 0.05)

Resultados- Reactividad


Array de fragmentos proteicos NAPPA

Resultados- arrays de fragmentos proteicos Identificación de autoanticuerpos en OA

07/02/2013

• HOXD3 y LEPREL2 sólo mostraron reactividad en OA e IFRG15 sólo en individuos sanos.

• KCNJ6 mostró mayor

reactividad en OA que en AR.

• CCDC85C, KCNB2, and

ZNF784, menor reactividad en OA que en AR.

Resultados- NAPPA


• LEP, IGFBP6 and IGFBP4 presentaron mayor reactividad en OA que en muestras AR.

• CHST14, CD44, LEP y PCOLCE presentaron mayor reactividad en OA que en individuos sanos.

Muestras

Ab

s 4

50

nm

ELISA CHST14

Conclusiones

- Utilizando dos estrategias diferentes de arrays de antígenos, se han encontrado

autoanticuerpos en el suero de pacientes con artrosis con potencial valor diagnóstico de

la enfermedad.

- Los niveles de inmunorrreactividad frente a HOXD3, LEPREL2, CHST14, CD44, LEP y

PCOLCE están incrementados en pacientes artrósicos con respecto a controles sanos.

- La inmunorreactividad frente KCNJ6, IGFBP4, IGFBP6 y LEP está incrementada en

pacientes artrósicos con respecto a pacientes con artritis reumatoide, mientras que la

inmunorreactividad para los antígenos CCDC85C, KCNB2 y ZNF784 está disminuida.

1



2



Proyectos Proyectos

Identificación de potenciales marcadores séricos en OA

Descubrimiento

LC-MS/MS (cartílago, líquido sinovial, bibliografía)

Gran número de proteínas identificadas

Pocas muestras analizadas

Arrays de anticuerpos en suspensión

Proteínas seleccionadas

Mayor número de muestras analizadas

Verificación

Suero

Validación de proteínas en suero

Muestras


Cribado Control K/L2 K/L3 K/L4 AR APs

Número de pacientes

96 118 112 58 288 288

Verificación Control K/L2 K/L3 K/L4 AR APs

Número de pacientes

92 43 31 122 192 192

OA=288

OA=196

Muestras

Primera cohorte: N= 960

Segunda cohorte: N= 672

Flujo de trabajo


Distribución

Marcaje con biotina

C) Creación del array E) Cuantificación

SAPE

A) Muestras

Biotina B) Marcaje

D) Incubación

SAPE: estreptavidina-ficoeritrina

Análisis

• Modelo de regresión lineal (edad, sexo, BMI) p<0.05

Estudio

Diseño del array

960 muestras 672 muestras

Proteínas candidatas

Proteínas validadas

174 anticuerpos

78 proteínas diana

106 anticuerpos

46 proteínas diana

I. Fase de cribado II. Fase de verificación

288 OA

96 Controles

288 AR 288 APs

196 OA

92 Controles

192 AR 192 APs

OA vs AR OA vs APs

OA vs Ctrl

4 26

10

4

2

OA vs AR OA vs APs

OA vs Ctrl

13 15

1

3

2

3

Diseño del array



Resultados: Diagnóstico de artrosis de rodilla


Cribado

Verificación

Panel para diagnóstico de OA

Resultados: Diagnóstico de artrosis de rodilla

Resultados: Severidad radiográfica en OA (grado K/L) C

RIB

AD

O

VER

IFIC

AC

IÓN

APOA1, GC e ITIH1 posibles marcadores de OA radiográfica

Objetivo 4: Identificación de potenciales marcadores séricos en OA

* p<0.05

Resultados: Severidad radiográfica en OA (grado K/L)

S100A6 marcador de severidad radiográfica en OA

Objetivo 4: Identificación de potenciales marcadores séricos en OA

* p<0.05

CR

IBA

DO

V

ERIF

ICA

CIÓ

N

13

3

1

2

15 3

C3

GC S100A6

ITIH1

APOA1

LEP

OA vs AR OA vs APs

OA vs Controles sanos


Resultados: Comparación OA, AR y APs


OA vs AR OA vs APs

* * * *

* p<0.05

Resultados: C3 distingue pacientes OA, AR y APs

C3 potencial marcador específico de OA

Conclusiones

- De todas las proteínas del panel, sólo la S100A6 está aumentada en todos los grados K/L

radiográficos con respecto a los controles sanos, por lo que esta proteína podría ser

indicadora del daño radiográfico de la artrosis de rodilla.

- De todas las proteínas del panel, sólo la proteína C3 permite diferenciar los pacientes

artrósicos de los controles sanos y de las dos enfermedades reumáticas (artritis

reumatoide y artritis psoriásica) analizadas, indicando el potencial de esta proteína como

biomarcador específico para el diagnóstico de la artrosis de rodilla.

- Se ha identificado un panel de 6 proteínas formado por APOA1, GC, ITIH1, S100A6 y C3,

cuyos niveles en suero permiten diferenciar pacientes con artrosis radiográfica de rodilla

de controles sanos.

Proteomics Group ProteoRed-PRB2/ISCIII

Cristina Ruiz-Romero Dr. Francisco J.

Blanco

Rheumatology Division INIBIC-Hospital Universitario de A

Coruña

Valentina Calamia

Patricia Fernández-

Puente

Beatriz Rocha

María Camacho

Nancy M. Parra

Lucía González

Dr. Peter Nilsson

Dr. Jochen Swenck

Dr. Frauke Henjes

Dr. Burcu Ayoglu

Cecilia Hëlltrom

Gracias por vuestra atención!

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