CARATTERISTICHE E ASPETTICARATTERISTICHE E ASPETTI DEL BATTERIO Legionellag

Dott Attilio BertolottiDott. Attilio BertolottiLaboratorio Sanità Pubblica

ASL della Provincia di Mantova

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PremessaPremessaGeneralitàFattori di rischioFattori di rischioPatogenicitàSistemi di controlloPrevenzionePrevenzioneCampionamentoAnalisi

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LegionellaLegionella

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Legionella morfologiaLegionella morfologia

Bacillo Gram-negativogAerobioM bilMobileDimensioni variabili 1,5 – 5 µm , µ48 specie, 70 sierogruppiL i ll hilLegionella pneumophila

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Le colorazioniLe colorazioni

Gram positivoGram positivo

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Le colorazioniLe colorazioni

Gram negativo

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LegionellosiLegionellosi

In Europa e in USA Nel 2011 vi sonoIn Europa e in USA vengono infettate

Nel 2011 vi sono stati 4897 casi in

circa 40.000 persone ogni anno

Europa (UE) di malattia dei p g

riconducibili a viaggi e soggiorni

legionari con tasso di mortalità 10%viaggi e soggiorni

alberghieri,infezioni nosocomiali

di mortalità 10%

10nosocomiali

DiffusioneDiffusione

Acqua superficiale e di faldaAcqua superficiale e di faldaReti distribuzioneImpianti idriciImpianti di climatizzazionepPiscineFontaneFontaneTerreno umido

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RiproduzioneRiproduzione

• Tra i 25°C e i 42°C in habitat acquatici• Tra i 25°C e i 42°C in habitat acquatici caldi

• In ambiente naturale anche all’interno di protozoi ciliatiprotozoi ciliati

• Nel biofilm degli impianti idrici

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biofilmbiofilm

Legionella pneumonie è un batterio t t i ti t b tt ipatogeno opportunistico; questo batterio

utilizza il biofilm generato da altri microrganismi per proteggersi, nutrirsi e prolificarsi; approfitta poi, della presenzaprolificarsi; approfitta poi, della presenza dei protozoi e delle amebe ancorate al biofilm per colonizzarne la struttura edbiofilm per colonizzarne la struttura ed utilizzandoli quale veicolo di diffusione

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Legionella in biofilm14

g

Tetrahymena15

Tetrahymena

A th bAcathamoeba

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Fattori di rischio eFattori di rischio e patogenicità

• Microrganismo• Ospite• Ambiente• Ambiente

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Fattori di rischio e patogenicità

• Penetrazione nell’ospite• Entro l’organismog• Legionellosi: la malattia dei legionari, la febbre

di Pontiacdi Pontiac

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Penetrazionenell’ospite

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Penetrazione nell’ospitePenetrazione nell ospite

legionelle infettanti macrofagi20

legionelle infettanti macrofagi

RiproduzioneRiproduzione

Ameba con legionellaAmeba con legionella

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LegionellosiLegionellosigg

la malattia dei legionarila malattia dei legionarila malattia dei legionarila malattia dei legionari

la febbre di Pontiacla febbre di Pontiac

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Sistemi di controllo: Sistemi di controllo: la disinfezionela disinfezione

Mezzi fisiciMezzi fisici

Mezzi chimiciMezzi chimiciMezzi chimiciMezzi chimici

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Disinfezione con mezziDisinfezione con mezziDisinfezione con mezzi Disinfezione con mezzi fisici:fisici:

TemperaturaTemperaturaRadiazione UVRadiazione UVRadiazione UVRadiazione UVFiltrazioneFiltrazione

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Disinfezione con mezziDisinfezione con mezzi chimici

Agenti ossidanti Agenti non ossidantiDi i f tt ti i iIpoclorito

Biossido di cloro

Disinfettanti organici

ClorammineOzonoOzonoBromo

25Perossido di idrogeno

Prevenzione e controllo della contaminazione del sistema idrico: metodi

Quando? Commenti

• Ricerca della Legionella nell'impianto idrico Nelle strutture recettive: in presenza di 1 o più casi Rischio elevato di infezioni nosocomiali nel caso in cuiIn ospedale: monitoraggio periodico nei reparti ad altorischio

la concentrazione di legionelle sia ≥103UFC/L

Trattamento termico: • Aumento della T° dell'acqua calda a 70-80°C continuativamente per tre giorni consecutivi con scorrimento per 30 minuti al giorno (shock termico)

In caso di infezioni da Legionella sp. e in presenza dimassiva contaminazione dell'impiantoQuando si mette in funzione il sistema idrico

Indispensabili controlli microbiologici, da ripetereperiodicamenteControlli periodici della temperatura in punti perifericirappresentativi dell'impiantoscorrimento per 30 minuti al giorno (shock termico)

oppure • Mantenimento di una temperatura tra i 55-60°C nella rete dell'acqua calda

rappresentativi dell'impianto.Controlli microbiologici in presenza di uno o più casi

Clorazione: In caso di infezioni da Legionella sp. e in presenza di Disinfezione sistemica, con una concentrazione • Iperclorazione shock: immettere cloro nell'acqua fino ad ottenere concentrazioni di cl residuo di 20-50 mg/L. Periodo di contatto: 2 ore con 20mg/L oppure 1 ora con 50mg/L. oppure • Iperclorazione continua: aggiungere cloro in modo che la concentrazione residua sia compresa tra 1 3

massiva contaminazione dell'impianto disinfettante residua. Azione corrosiva del cloro sulle tubature Minimizza la colonizzazione di legionella nei punti distali

che la concentrazione residua sia compresa tra 1-3 mg/L.

• Raggi ultravioletti Misura di riserva applicabile in circostanze particolari Metodo relativamente costoso. I raggi UV hanno soloun effetto locale e sono possibili contaminazioni distali

• Ionizzazione rame/argento In presenza di contaminazione da Legionella spnell'impianto idrico o come misura preventiva inalternativa alla disinfezione termica

Facile applicazione e non influenzato dalla T°dell'acqua Verificare che la concetrazione degli ioni Cu e Ag non superi la CMA prevista dalla legislazione vigente

• Perossido d’idrogeno e argento stabilizzati In presenza di contaminazione da Legionella sp Tecnica recente che necessita di ulteriori confermenell'impianto idrico o come misura preventiva inalternativa alla disinfezione termica o con cloro.

sperimentali

• Biossido di cloro In presenza di contaminazione da Legionella spll'i i t id i i ti i

Indicato per contrastare la crescita di biofilmT i t h it di lt i i f

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nell'impianto idrico o come misura preventiva inalternativa alla disinfezione termica oall’iperclorazione.

Tecnica recente che necessita di ulteriori confermesperimentali

PrevenzionePrevenzionePrevenzionePrevenzioneLi id ISS EWGLILinee guida ISS e EWGLI (European Working Group for

Legionella Infections)

Corretta progettazione reti idricheAccurata pulizia e disinfezione dei filtri dei condizionatoriAccurata manutenzioneSostituzione tubature obsoleteD l ifi i d i diff i d ll dDecalcificazione dei diffusori delle docceSvuotamento e disinfezione dei serbatoi di accumuloMonitoraggio periodico della presenza di legionellaMonitoraggio periodico della presenza di legionellanegli impianti di climatizzazione

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Procedure per il campionamento

Impianti idrici (circuito acqua calda)I i ti id i i ( i it f dd )Impianti idrici (circuito acqua fredda)Impianti di climatizzazionepFontaneA hi tApparecchiature Docce

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Docce

Modalità di prelievoModalità di prelievo

AcquaqDepositiI t i iIncrostazioniFiltri

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Legionella: dove campionareLegionella: dove campionareNel corso degli ultimi tempi il nostroNel corso degli ultimi tempi il nostrolaboratorio ha isolato Legionelle da vari siti :alberghi, ospedali, case di riposo, abitazioni private,i li i i ti ti i di i bilit ipiccoli impianti sportivi, case di riabilitazione e recupero

sia dai punti terminali della rete didistribuzione dell’acqua calda e fredda (docce, rubinetti), sia da serbatoi d’accumulo, sia da incrostazioni e biofilm presenti nei bulbi e nei rompigetto.In ambiente ospedaliero e stata isolata anche da sitipparticolarmente a rischio come sale operatorie e reparti per dialisi

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Legionella: cosa campionareLegionella: cosa campionare

acqua del circuito d’acqua calda e fredda quando la temperatura è superiore ai 20°C, incrostazioni e biofilm da tubazioniincrostazioni e biofilm da tubazioni,serbatoi, rompigetto dei rubinetti, bulbi doccia, rubinetti, doccette con tubi flessibili pendenti,depositi da serbatoi d’accumulodepositi da serbatoi d accumulo,piscine (vasche e spogliatoi),acqua di condensa e filtri in impianti di condizionamento

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Legionella: come campionareLegionella: come campionare

Tutti i campionamenti devono essere condotti in condizioni diTutti i campionamenti devono essere condotti in condizioni disicurezza per gli Operatori che dovranno utilizzare i Dispositividi Protezione Individuali previsti (guanti, maschere filtranti, occhiali protettivi).ACQUA tili b tti li t ili it i i 1 litACQUA: utilizzare bottiglie sterili con capacita minima 1 litro,in polietilene (monouso) o in vetro ( autoclave per 15’ a 120°C)utilizzare bottiglie incartate esternamente per prelievi ad immersione (es. piscine/serbatoi).In un sistema di distribuzione l’acqua dovrà essere campionata nei puntidistali della rete (rubinetti-docce) e nei serbatoi di accumulo( )e/o scambiatori di calore.La scelta dei punti e le tecniche di campionamento sono in funzione degli obiettivi dell’indagine

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degli obiettivi dell indagine

Legionella: come campionareg pPre-flush: un prelievo effettuato dal rubinetto appenaaperto, senza scorrimento dell’acqua e senza flambatura ( 2 litri) p , q ( )indicativo della contaminazione di quel tratto terminale

Post-flush: un ulteriore successivo prelievo dopo averallontanato parti mobili (rompigetto), pulito meccanicamente ilpunto di sbocco, flambato esternamente e aver fattoscorrere l’acqua per almeno 5’. Annotare la temperatura nel

òverbale di prelievo. Questo campionamento può essereindicativo di una colonizzazione all’interno dell’impianto

U li “ i t ” li d ll t b tti liUn prelievo “misto” raccogliendo nella stessa bottiglia unaprima parte in pre-flush e una seconda in post-flush, (2 litri), rappresentativo di una realistica situazione all’uso.Questo tipo di prelievo appare indicato per le verifiche post

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Questo tipo di prelievo appare indicato per le verifiche postbonifica e per le indagini di valutazioni del rischio

Legionella: come campionare• Rompigetto/incrostazioni/bulbi docce: se possibile asportare inmodo asettico con strumenti idonei (spatole, pinzette, tamponi) etrasferire in contenitori sterili di adatte dimensioni con l’aggiunta diggalcuni ml di acqua distillata sterile. Altrimenti consegnare allaboratorio le parti intere avendo cura di lasciare all’interno l’acquad’origine, trasferendo in sacchetti sterili (tipo presto-chiuso peralimenti).• Piscine, cisterne, serbatoi, pozzi : prelievo per immersione conbottiglie sterilizzate in apposite buste/carta autoclavabile.

f• Tamponi: passare le superfici con un tampone sterile, conmovimenti rotatori, ed inserirlo direttamente in provetta con terreno di

mantenimento• Filtri: asportare i filtri soprattutto se umidi e non sostituiti di• Filtri: asportare i filtri, soprattutto se umidi e non sostituiti direcente, inserendoli in sacchetti di plastica sterili, con l’aggiunta di5-10 ml di acqua distillata sterile.• Acqua di condensa: prelevarne la massima quantità possibile con

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• Acqua di condensa: prelevarne la massima quantità possibile consiringhe o pipette sterili.

Acqua fredda o caldaDepositi in serbatoiIncrostazioni in tubature e depositiTamponi effettuati su rubinetti rompi getto ecc.p p gAcqua di condensa degli impianti da aria condizionata Filtri di impianti di alimentazioneAcqua di sgocciolamento da torri di raffreddamentoI campioni vanno conservati a temperatura ambiente, al riparo della luceluce

ACQUA Da 1 a 5 litri raccolti in recipienti sterili. Se acqua clorata aggiungere tiosolfato di sodio al 10% (0,1 per 100 ml di acqua). Flambare il punto di prelievo, dopo aver fatto scorrere l’acqua per almeno 5 minuti solo se si desidera esaminare l’acqua dell’intero impianto

DEPOSITI Prelevare l’acqua dallo scarico o quella dal fondo dopo averlo sufficientemente svuotatosufficientemente svuotato

INCROSTAZIONI Raccogliere il materiale da tubi o serbatoi in recipienti sterili

TAMPONI Raccogliere il materiale da superfici e trasferire i tamponi in apposite provette contenenti circa 5 ml di acqua dell’impianto stesso

35FILTRI Depositarli in sacchetti di plastica

Dopo il prelievo

TrasportoTrasportoTrasportoTrasporto

Tecniche analiticheTecniche analitiche

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Conservazione, trasporto e consegna del campione al laboratorio, in tutte la fasi successive al prelievo, il campione deve essere mantenuto in condizioni tali da prevenirne l’alterazione o comunque da potere influire

i i lt ti d l litisui risultati del processo analitico.Consegnare il campione al laboratorio nel più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e comunque non oltre le 48 ore dal campionamentocampionamento.Se la consegna avviene entro le 24 ore dal campionamento, il trasporto del campione deve avvenire, fino alla consegna in laboratorio, a temperatura ambiente e al riparo dalla lucetemperatura ambiente e al riparo dalla luce.Se la consegna avviene tra le 24-48 ore dal campionamento il trasporto del campione deve avvenire, fino alla consegna in laboratorio, a temperatura di 5 ± 3°C e sempre al riparo dalla luce In questo caso iltemperatura di 5 ± 3 C e sempre al riparo dalla luce. In questo caso il campione di acqua calda deve essere raffreddato direttamente dopo il prelievo

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Legionella: analisi microbiologica2 litri è, in genere, la quantità minima da filtrare; quantitàmaggiori possono essere utilizzate e possono richiedere l’utilizzogg p pdi più membrane.Terminata la filtrazione la membrana viene posta in uncontenitore sterile di idonee dimensioni contenentecontenitore sterile di idonee dimensioni contenenteda 5 a 10 ml di acqua campione o di diluente al fine del distacco e della omogenizzazione dei microrganismi che vi sono rimasti trattenuti, che avviene con una energica agitazione passando al vortex perche avviene con una energica agitazione passando al vortex pernon meno di due minuti (metodo nazionale standard).Il campione cosi ottenuto rappresenta il concentrato dautilizzare per l’inoculo Questa fase e forse la più critica diutilizzare per l’inoculo. Questa fase e forse la più critica ditutto il processo e può influire in maniera significativa sullapercentuale di recupero delle cellule batteriche.

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Legionella: analisi microbiologicaLegionella: analisi microbiologica

Semina su terreni di coltura:aliquote da 0,1 a 0,5 ml sono inoculate su piastre di t di lt l tti MWY GVPC (29)di terreno di coltura selettivo MWY o GVPC (29)distribuendo sulla superficie in maniera omogenea con una spatola sterilecon una spatola sterile oppure direttamente la membrana filtrante se utilizzata tecnica ISOtecnica ISOIncubazione delle piastre a (36―1)°C in termostato, in ambiente umido

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in ambiente umido

Legionella: analisi microbiologicag gLettura con identificazione presuntiva: le colonie di Legionellain genere non crescono prima di 3 gg di incubazione su terrenoin genere non crescono prima di 3 gg di incubazione su terrenoselettivo; si presentano di piccole dimensioni, di colore bianco grigio,leggermente convesse, con margini regolari, e

tt tt id i il ti i tt t i li tsoprattutto evidenziano il tipico aspetto a vetro smerigliatoquando osservate allo stereo microscopio con luce laterale abassa intensità. La lettura va eseguita ad intervalli di 2-3 gg,fino al decimo giorno di incubazione.Le colonie con queste caratteristiche sono consideratesospette e vanno trasferite sia su BCYE- agarp gbase (o Agar Sangue/MK) sia su BCYE+ con supplemento (cisteinae ferro) per la crescita differenziale, incubandoleper 24+24 h a 36°C.

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per 24+24 h a 36 C.

La presenza di crescita sul terreno con cisteina e l’assenza di crescita sul terreno colturale che ne è privo consentono di identificare il microrganismo isolato comeidentificare il microrganismo isolato comePRESUNTA LEGIONELLA

CONFERMA: test di agglutinazione

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