CLASSIFICAZIONE ENZIMI

Alcuni tra i principali meccanismi di catalisi enzimatica: •acido base•covalente•elettrostatica e da ione metallico

STRUTTURA ENZIMI

Piruvato carbossilasiRNA polimerasi

DNA polimerasi (E. coli)ATP sintetasi

Glutammina sintetasi

Fosfofruttochinasi

pHForza ionica(conc. di sali)

Effetto del mezzo sulla velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: temperatura, forza ionica e pH

Vengono studiate le interazionitra enzimi, proteine, e il mezzo.

Queste interazioni stabilizzano o menola struttura dell’enzima in studio, influenzando la catalisi.

Temperatura

Saggio enzimatico in vitro: concentrazioni di sali e pH del tampone di dosaggio; temperatura di dosaggio – parametri che devono essere standardizzati.

Le proteine, quindi anche gli enzimi, hannoconformazioni 3D complesse strettamente legate alla loro funzionalità: le strutture secondaria e terziaria sono dovute ad interazioni deboli tra atomicoinvolti nel legame peptidico e tra i gruppi –R degli AA costituenti ( idrofobiche, elettrostatiche, legamiidrogeno, forze van Der Waals), in relazione al mezzo acquoso e all’ambiente.

TEMPERATURA E VELOCITA’ ENZIMATICA

In tutte le reazioni chimiche, cinetica di reazione e temperatura sono strettamentecollegate: aumento di T aumento di velocità di reazione.

In termini probabilistici, incrementi di T aumentano i moti delle particelle, le collisioni e urti “utili” per abbassare l’E att. e favorire lo stato di transizione della reazionechimica: questo è valido anche per le reazioni catalizzate dagli enzimi.

Secondo la reazione di Arrhenius: K = Ae-E*/RT

E*: 1,7-70 Kj M-1

Q10 ≈ 2

In concomitanza: T oltre una certa sogliadenaturano la proteina dotata di attivitàenzimatica – diminuzione delle U enz. A temp. > 40-50°C - drastica riduzione.

Esistono enzimi più o meno stabili allealte temperature:isoenzimi termostabili e termolabili; enzimi che sono stabili a 80-100°C (Taq polimerasi); a T <10°C, attività molto rallentata

dipende dalla strutturaspecifica delle proteineenzimatiche

K2 = A2e-Ea2/RTE sat.

50 °C

FORZA IONICA E VELOCITA’ ENZIMATICA

In generale: effetto simile a quello dato dalla concentrazione di sali sulle macromolecole biologiche e, in particolare, le proteine: la solubilità di una proteina a bassa forza ionica aumenta con l’aumentare della forza ionica. Adalta forza ionica, la proteina precipita (salting out).

-Gli ioni dei sali sciolti in una soluzione acquosa interferiscono con i legami a idrogeno tra H2O (mezzo acquoso) e proteine : modificano le interazioni intra-molecolari che stabilizzano le proteine, quindi la loro conformazione e solubilità:

alterano le interazioni H2O-enzima (proteina); “sottraggono” H2O all’enzima e quindi

ne diminuiscono la solubilità: precipitazione.

aumentano e stabilizzano le interazioni H2O-enzima;aumentano la solubilità nel

mezzo acquoso.

Effetti che dipendono dal tipo di sale (specie ionica), concentrazione del sale, eanche dalla proteina - principio alla base della precipitazione frazionata.

Ioni “chaotropici” o denaturanti:

-Ioni “cosmotropici” o stabilizzanti:

Forza ionica, I = ½ cizi2

pH E VELOCITA’ ENZIMATICA

La [H+] può influire significativamente sulla catalisi enzimatica.

Un enzima proteico è suscettibile sia ai cambiamenti conformazionali legati al grado di ionizzazione

e carica, a diversi pH, dei gruppi –R degli AA che lo compongono sia al grado di protonazione di gruppi –R specifici presenti sul sito attivo e determinanti per la catalisi enzimatica. A pH estremi le proteine precipitano e così molti enzimi si denaturano.

Esempio: Se un enzima esplica la sua azione catalitica grazie alla presenza di un’ istidina e di una cisteina nel sito attivo svolgendo un attacco nucleofilo sul substrato in trasformazione oppure un altro enzima trasforma S in P mediante un’interazione di tipo elettrostatico attraverso un aspartato ouna lisina, opportunamente dislocati sul sito attivo, il grado di protonazione dei gruppi in gioco altera la catalisi: esisteranno solo stretti intervalli di pH per permettere l’interazione ES ottimale. Forma attiva dell’enzima a intervalli di pH che vengono definiti sperimentalmente.Esistono intervalli di pH ottimale. Il pH influenza i parametri cinetici Vmax e Km dell’enzima e può variare anche lo stato di ionizazzione del substrato S.

Effetto del pH del mezzo sulla velocità di alcuni enzimi

chimotripsinacolinesterasi

pepsina papainaVel

oci

tà i

niz

iale

Vel

oci

tà i

niz

iale

pH e velocità enzimatica

Struttura, meccanismo di catalisi e dipendenza dal pH dell’Adenosina Deaminasi (ADA)

Struttura, meccanismo di catalisi e dipendenza dal pH dell’Adenosina Deaminasi (ADA)

Struttura:Struttura:

La reazione catalizzata dalle adenosina aminoidrolasiè stata trovata sia in organismi procariotici che eucariotici. Nei mammiferi esistono due isoforme principali di ADA, ADA1 e ADA2. ADA1 è legata alla regolazione della risposta immunitaria e

alla patogenesi della SCID. Altre patologie sono state associate sia al deficit che alla sovra-espressione di ADA.

Metalloproteina, con un atomo di Zn come cofattore, legato al sito catalitico. Struttura conservata nell’evoluzione. L’ADA umanaè una proteina globulare,con peso molecolare in media circa 40,000Da, con struttura sec. /, detta a barile, tipica anche di altre idrolasi,il sito attivo è una tasca centrale, in corrispondenza del tratto C-terminale dei foglietti .

Catalisi:Catalisi:Nel sito catalitico dell’ADA sono stati individuati alcuni gruppi-R di AA critici e probabilmente coinvolti nella catalisi enzimatica: Asp295, Asp296, Glu217, Hys238, Gly184 (Wilson et al. 1991).

Effetto del pH:Effetto del pH:Esistono varie isoforme e proteine in diversi organismi; l’ADA ha un pH ottimale intorno a 6.5-7.5. Questo è dovuto alla ionizzazione di gruppi -R di AA favorente la catalisi. Agli estremi di pH si ha denaturazione e perdita di attività completa per alterazione dei legami deboli e attrazioni ioniche che stabilizzano la struttura 3D dell’enzima.

pH

V0 pH ottimale ADA

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Riepilogo Esercitazioni Enzimi

in surnatante di omogenatodi tessuto muscolare e siero: Valutazione della concentrazione di LDH serica e muscolare, U/ml nei due campionia confronto. Substrato: sodio piruvatoCoenzima (co-substrato): NADH Tampone fosfato pH 7, temperatura e forza ionica costantiEnzima costante, campione diluito opportunamente. Lettura 340nm (NADH)

Determinazione dei parametri cinetici Km e Vmax dell’enzima ADA:Calcolo della V0 a varie concentrazioni di S, adenosina sia < che > Km attesa.S (adenosina): 5, 10, 20, 40, 60, 80 M.Tampone fosfato pH 7, temperatura e forza ionica costanti Enzima a concentrazione costante. Lettura 265nm (adenosina, no inosina).

Dipendenza dal pH della V0 dell’ADA:

Calcolo della V0 a pH variabile nel mezzo.Substrato a concentrazione costante S ≈ Km, 40 MTampone fosfato a pH variabile: pH 5, 6, 7, 8, 9, 10.Temperatura e forza ionica costantiEnzima a conc costante. Lettura 265 nm (adenosina, no inosina).

Saggio enzimatico in condizioni saturanti della LDH