ปญหาพเศษปรญญาตร

สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไมสกลหวายดวยดเอนเอเครองหมายชนด

Conserved Ortholog Set

Determination of Genetic Variation in Dendrobium Cultivars Using Conserved Ortholog Set

Type DNA Markers

โดย

นางสาวกญญารตน วงมะนาว

ควบคมและอนมตโดย

…………………………………………… วนท………เดอน……………..พ.ศ………

(รศ. ดร. จลภาค คนวงศ)

การตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไมสกลหวายดวยดเอนเอเครองหมายชนด

Conserved Ortholog Set

นางสาวกญญารตน วงมะนาว

บทคดยอ

Conserved Ortholog Set (COS) เปนดเอนเอเครองหมายทออกแบบมาจากมะเขอเทศ และ

Arabidopsis โดยพฒนามาจากกลมของยนทมการอนรกษในสวนของล าดบเบสและหนาทในพช

ชนสง ซงมการพฒนาดเอนเอเครองหมาย COS ใหสามารถน ามาใชกบพชชนสงหลายไดชนด ทงใน

ชนด สกล หรอวงศ ทเหมอนและตางกนได การศกษานมวตถประสงคเพอการตรวจสอบความ

แตกตางและศกษาความสมพนธของกลวยไมสกลหวาย 5 สายพนธดวยดเอนเอเครองหมาย

Conserved Ortholog Set จ านวน 10 เครองหมาย โดยน าไปท าปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส และ

น าไปตรวจสอบดวยเทคนคเจลอเลคโทรโฟลซส พบวา สามารถเพมปรมาณดเอนเอกลวยไมสกล

หวายและใหความแตกตางได 9 เครองหมาย (90%) และ น ามาจดกลมแสดงความสมพนธทาง

พนธกรรมจากการประเมนคาดชนความเหมอน (similarity index) ดวยโปรแกรม NTSYSpc version

2.20N โดยใชคาสมประสทธของ Dice วเคราะหจดกลมโดยวธ UPGMA มคาสมประสทธความ

เหมอนอยในชวง 0.68 ถง 0.85 สามารถจดกลมไดเปน 2 กลมใหญ ทคาสมประสทธความเหมอน

0.76 กลมท 1 ประกอบดวย (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x D. bigibbum และ

D. ’BOM17' มความใกลชดกนทางพนธกรรม D. ’Dang Saard’ และ D. ’Sanan White’ มความ

ใกลชดกนทางพนธกรรมมากทสด กลมท 2 คอ D. ’Ceasar’ (2N) ซงมลกษณะทางพนธกรรม

แตกตางไปจากพนธอน มคา Cophenetic correlation (r) เทากบ 0.71229 มคา Expected

Heterozygosity (He) เฉลยประมาณ 0.4978 มคา Polymorphism Information Content (PIC)

เฉลยประมาณ 0.4260 ซงสามารถน าไปใชประโยชนในการจ าแนกสายพนธกลวยไมสกลหวาย เปน

ประโยชนในการสรางแผนทโครโมโซมและปรบปรงพนธกลวยไมตอไป

ค าส าคญ : กลวยไมสกลหวาย, ดเอนเอเครองหมาย, Conserved Ortholog Set (COS)

ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวยาลยเกษตรศาสตร

อาจารยทปรกษา : รศ. ดร. จลภาค คนวงศ

ปทพมพ : 2554

จ านวนหนา : 42

Determination of Genetic Variation in Dendrobium Cultivars Using Conserved Ortholog Set

Type DNA Markers

Kanyarat Wangmanao

Abstract

Conserved Ortholog Set (COS) marker was designed from tomato and Arabidopsis by

set of genes that are conserved throughout higher plants. The COS markers can be used in

several plant species, genuses or families. This study aims to determine genetic variation in

Dendrobium cultivars using COS Type DNA markers. Ten COS markers were used to amplify

Dendrobium DNA by polymerase chain reaction (PCR), products were visualized in 1%

agarose gel electrophoresis. Nine COS markers (90%) can amplify DNA and detect

polymorphic band from 5 Dendrobium orchid cultivars. The similarity indices from 0.68 to o.85

were identified by the software NTSYSpc version 2.20N using Dice coefficient. Using UPGMA

cluster analysis, two major groups can be identified at the coefficient of 0.76. Group one

consisted of (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x D. bigibbum, D. ’Bom17’, D. ’Dang

Saard’ and D. ’Sanan White’. Group two was only a distinct D. ’Ceasar’ (2N). The correlation (r)

was 0.71229, expected heterozygosity (He) was 0.4978, polymorphism information content

(PIC) of 0.4260. The COS markers can be ued to identify cultivars of Dendrobium orchid and

are useful in breeding and mapping of Dendrobium orchid.

Key word : Dendrobium cultivars, DNA marker, Conserved Ortholog Set (COS)

Dee gree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of

Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University

Advisor : Assoc. Prof. Julapark Chunwongse, Ph.D.

Year : 2011

Page : 42

ค านยม

ดฉนขอกราบขอบพระคณรองศาสตราจารย ดร. จลภาค คนวงศ อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ

ทไดกรณาใหค าปรกษา แนะน า ใหความรและใหโอกาสในการท าปญหาพเศษครงน ตลอดจนตรวจแกไข

รปเลมปญหาพเศษฉบบนจนส าเรจลลวงไปไดดวยด และมความสมบรณมากยงขน ขอกราบ

ขอบพระคณอาจารยทกทานทไดอบรมสงสอนประสทธประสาทวชา จนประสบความส าเรจในการศกษา

ขอขอบพระคณแปลงปลกพช และหองปฏบตการ A 310 อาคารปฏบตการวจย

เทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม ท

เออเฟอสถานทท าการทดลอง อปกรณ เครองมอและความสะดวกตาง ๆ และขอบพระคณพ ๆ ทกทานใน

หองปฏบตการเทคโนโลยชวภาพดานพช ทกรณาใหความชวยเหลอ ใหค าแนะน าและใหก าลงใจตลอด

ระยะเวลาในการท าปญหาพเศษดวยดตลอดมา

ขอขอบพระคณสาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน ทไดกรณาให

งบประมาณสนบสนนการท าปญหาพเศษครงน

และสดทายนดฉนขอกราบขอบพระคณ บดา มารดา และทกคนทมสวนสนบสนน ใหก าลงใจ

และชวยเหลอดฉนจนประสบความส าเรจในวนน

กญญารตน วงมะนาว

7 มนาคม 2555

สารบญ

หนา

สารบญ -1-

สารบญตาราง - 2 -

สารบญภาพ - 3 -

ค าน า 1

วตถประสงค 2

ตรวจเอกสาร 3

อปกรณและวธการทดลอง 15

ผลการทดลอง 27

วจารณผลการทดลอง 33

สรปผลการทดลอง 35

เอกสารอางอง 36

ภาคผนวก 40

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ไพรเมอรทให polymorphic bands, ขนาดแถบดเอนเอ, 28

จ านวนแถบดเอนเอ, คา Expected Heterozygosity (He)

และคา Polymorphism Information Content (PIC)

ตารงผนวกท

1 รายละเอยดไพรเมอร COS 41

2 ผลการใหคะแนนแถบดเอนเอทง 9 ไพรเมอร 42

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 C₂_At1g03150 29

2 COS Marker T 1283 29

3 COS II Marker C₂_ At5g49830 29

4 T 1850 29

5 COS Marker T1490 30

6 C₂_At1g44575 30

7 COS Marker T 1536 30

8 C₂_At1g71950 30

9 COS Marker T 1153 31

10 C₂_At1g09760 31

11 Dendrogram แสดงผลการวเคราะหขอมลความแตกตางของ 32

แถบดเอนเอของกลวยไมทง 5 พนธ ดวยโปรแกรม

NTSYSpc version 2.20

การตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไมสกลหวายดวยดเอนเอเครองหมายชนด Conserved

Ortholog Set

Determination of Genetic Variation in Dendrobium Cultivars Using Conserved Ortholog Set

Type DNA Markers.

ค าน า

กลวยไมสกลหวายเปนพชทอยในวงศ Orchidaceae เปนไมตดดอกทมความส าคญทาง

เศรษฐกจทสรางรายไดสงในหลายประเทศ โดยเฉพาะประเทศไทยทมการสงออกกลวยไมตดดอกสกล

หวายเปนอนดบหนงของโลก เนองจากกลวยไมสกลหวายมสสนสวยงาม ราคาไมแพง และมระยะเวลา

การใชงานนานจงเปนทนยมของผบรโภค กลวยไมสกลหวายแตละพนธมลกษณะทางสณฐานวทยา

คลายคลงกนมาก จงไมสามารถจ าแนกความแตกตางระหวางพนธได ตองอาศยผ ทมความรและความ

ช านาญในการชวยจ าแนกพนธ แตการใชขอมลทางลกษณะทางสณฐานวทยาเพยงอยางเดยวในการ

จ าแนกพนธอาจไมเพยงพอจงจ าเปนตองใชลกษณะทางพนธกรรมในระดบจโนไทป โดยใชเทคนค

ทางดานชวโมเลกลมาชวยในการจ าแนกพนธ

เทคโนโลยดเอนเอเครองหมายสามารถใชบอกความสมพนธของสงมชวตทมววฒนาการจาก

บรรพบรษเดยวกนได (อรรตน, 2548) โดยมยนทเรยกวา Conserved Ortholog Set (COS) ซงมล าดบ

เบสทเหมอนกนในสงมชวตทมววฒนาการรวมกน แตจะมต าแหนงของ Intron ทแตกตางกนในสงมชวต

แตละชนด ซงจะพบยนนในพชชนสงแตจะแตกตางกนไปในพชแตละวงศ (Fulton และคณะ, 2002) มการ

ออกแบบไพรเมอรโดยน าฐานขอมลของ EST จากมะเขอเทศมาเปรยบเทยบกบ Arabidopsis ท าให

สามารถใชในการอางองเชอมโยงความสมพนธของยนในพชชนดตาง ๆ ได (Van Deynze และคณะ,

2007) โดยใชล าดบเบสจาก single-copy COS จาก Arabidopsis

การศกษาความหลากหลายของกลวยไมสกลหวายดวยดเอนเอเครองหมาย Conserved

Ortholog Sequence ทมการออกแบบรวมกนของมะเขอเทศ และ Arabidopsis ซงอยตางวงศกนกบ

กลวยไมและมววฒนาการทแตกตางกนมาก แตมยนทมการอนรกษไวจงท าใหสามารถน ามาใชในการ

บอกความแตกตางของสายพนธกลวยไมซงเปนพชใบเลยงเดยวได โดยใชเทคนคปฏกรยาลกโซโพล

เมอเรสและจดกลมเพอแสดงความสมพนธทางพนธกรรมของกลวยไมสกลหวาย 5 สายพนธ

วตถประสงค

เพอตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไมสกลหวายและศกษาความสมพนธของ

กลวยไมสกลหวาย 5 สายพนธ ดวยดเอนเอเครองหมายชนด Conserved Ortholog Set

การตรวจเอกสาร

กลวยไม (Orchid)

กลวยไมเปนพชใบเลยงเดยว (Subclass Monocotyledoneae) อยในวงศกลวยไม (Family

Orchidaceae) นบเปนวงศทใหญทสดวงศหนงของพชมดอก (Class Angiospermae) มอยประมาณ

17,000 – 35,000 ชนด (species) (Dressler, 1993) มอยดวยกนมากมายหลายสกล (genus) แตละสกล

มลกษณะรปราง สสน ทแตกตางกนไป ในขณะนสามารถจ าแนกชนดไดชดเจนเกอบ 19,000 ชนด

(Dressler, 1933) เจรญเตบโตไดในทกทวปยกเวนทวปแอนตารกตก รปแบบการเจรญเตบโตมหลายแบบ

เชน เจรญเตบโตบนกง ไม พนหน พนดน และทชนแฉะ ความแตกตางของชนดกลวยไมทพบในเขตรอน

(tropic) มกเปนกลวยไมประเภทองอาศย (epiphyte) สวนกลวยไมทอยในเขตอบอน (temperate) มก

เปนพวกกลวยไมดน (terrestial) (ครรชต, 2547)

กลวยไมสกลหวาย (Dendrobium) เปนกลวยไมสกลทใหญทสดมการแพรกระจายพนธออกไป

ในบรเวณกวางทงในทวปเอเชยและหมเกาะในมหาสมทรแปซฟก มจ านวนมากกวา 1,400 ชนด (บรรณ,

2534) กลวยไมสกลหวายเปนกลวยไมประเภททมลกษณะการเจรญเตบโตแบบซมโพเดยล คอ เปน

กลวยไมทมล าลกกลวย เมอล าตนเจรญเตบโตเตมทแลวจะแตกหนอเปนล าตนใหมและเปนกอ ใบแขง

หนามสเขยว มระบบรากกงอากาศ (semi-epiphyte) (ไพบลย, 2521) ดอกมลกษณะทว ๆ ไปของกลบ

ชนนอกคบนและคลางขนาดยาวพอ ๆ กนโดยกลบชนนอกบนจะอยอยางอสระเดยว ๆ สวนกลบชนนอกค

ลางจะมสวนโคนซงมลกษณะยนออกไปทางดานหลงของสวนลางของดอก ประสานเชอมตดกบฐาน หรอ

สนหลงของเสาเกสร และสวนโคนของกลบชนนอกคลางและสวนฐานของเสาเกสรซงประกอบกนนกจะ

ปดออกมา มลกษณะคลายเดอยทเราเรยกวา เดอยดอก ส าหรบกลบชนในทงสองกลบมลกษณะตาง ๆ

กนแลวแตชนดพนธของกลวยไมนน ๆ (บรรณ, 2534) ดอกกลวยไมเปนดอกสมบรณเพศ เมอไดรบการ

ผสมรงไขจะเจรญไปเปนฝกหรอผลเมอฝกแกจะแตกออกเพอใหเมลดปลวไปตกรอบ ๆ ตน เพอกระจาย

พนธ กลวยไมเปนไมตดดอกยอดนยม เนองจากมลกษณะดอกและสสนลวดลายสวยงาม เปนไมตดดอก

ทมอายการใชงานไดนาน กลวยไมเปนพชเศรษฐกจทมความส าคญของไทยเพราะเปนไมสงออกขาย

ตางประเทศท ารายไดเขาประเทศปละหลายพนลานบาท (กรมวชาการเกษตร, 2547)

ดเอนเอเครองหมาย (DNA marker)

ดเอนเอเครองหมาย (DNA marker) หมายถง ดเอนเอทใชเปนเครองหมายบงชความจ าเพาะ

ของสงมชวตในระดบชนดหรอตางชนดกน เปนดเอนเอทอยทต าแหนงหนงๆบนโครโมโซม (nuclear DNA)

หรอ ดเอนเอในออรแกเนลล (mitochondrial DNA หรอ chloroplast DNA) การทสามารถใชดเอนเอเปน

เครองหมายไดเนองจากความแปรปรวน (variation) ของนวคลโอไทดในโมเลกลของดเอนเอ หรอเกด

โพลมอรฟซม(polymorphism) ของล าดบเบสในโมเลกลของดเอนเอนนเอง (สรนทร, 2545) ซงดเอนเอ

เครองหมายสรางมาจากชนสวนดเอนเอ โดยน ามาตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรม(genetic

diversity) หรอความแปรปรวนทางพนธกรรม (genetic variation) ซงมประโยชนในการศกษาจโนมและ

การน าไปใชประโยชนตาง ๆ เชน การจดจ าแนกสงมชวต การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของ

สงมชวต การสรางprobe เพอตรวจสอบโรค การสรางแผนทโครโมโซม การหาต าแหนงยนทตองการบน

โครโมโซมและการแยกสกดยนโดยอาศยแผนทและการใชโมเลกลเครองหมายเพอชวยคดเลอกลกษณะท

ส าคญและคดเลอกยาก (อรรตน, 2548)

วธการตรวจสอบความแตกตางของดเอนเอ (DNA polymorphism) ท าไดโดยการหาล าดบเบส

ในโมเลกลของดเอนเอ (DNA sequencing) หรอตรวจสอบโดยใชเครองหมายดเอนเอ การใช ดเอนเอเปน

เครองหมายบงบอกความแตกตางของสงมชวต ทมาจากการตรวจลายพมพดเอนเอ (สรนทร, 2545)

ดเอนเอเครองหมายมหลายชนด บางชนดจะอาศยหลกการพนฐานทง PCR และ DNA

digestion เชน ดเอนเอเครองหมายชนด amplified fragment length polymorphism (AFLP) และดเอน

เอเครองหมายชนด cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) บางชนดอาศยความแตกตาง

ของล าดบเบสเพยง 1 เบส คอ single strandard conformation polymorphisms (SSCP) (อรรตน,

2548) นอกจากนยงมดเอนเอเครองหมายทเรยกวา Conserved Ortholog Set หรอ COS ทม

ความส าคญในการศกษาเปรยบเทยบจโนมระหวางพชตาง ๆ

Conserved Ortholog Set (COS)

Conserved Ortholog Set (COS) เปนดเอนเอเครองหมายทสรางมาจากยนทคดเลอกมาจาก

ยนทมการอนรกษในกลมสงมชวตทมววฒนาการใกลเคยงกน โดยจะมต าแหนงของ intron ทแตกตางกน

ไปในสงมชวตแตละชนด ซงยนเหลานจะยงคงอยในพชชนสง ซงจะแตกตางกนไปในพชทวงศตางกน

(Fulton และ คณะ, 2002) ซงสามารถน าไปประยกตเปนดเอนเอเครองหมายเพอการปรบปรงพนธพชและ

ในการเปรยบเทยบจโนม เพอวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมระวางพชชนดตาง ๆ การออกแบบ

ดเอนเอเครองหมาย COS จะเลอกยนทมต าแหนงเดยว (single-copy) ในจโนมของ Arabidopsis มา

เปรยบเทยบกบ expressed sequence tag (EST) และท านายต าแหนงของ intron จากนนออกแบบ

ไพรเมอรใหครอมบรเวณ intron นน ๆ และสามารถจะน าไปใชกบพชทมความหลากหลาย ล าดบเบสจาก

single-copy COS จาก Arabidopsis สามารถใชในการอางองเชอมโยงความสมพนธของยนในพชตาง ๆ

ได (Van Deynze และคณะ, 2007)

Fulton และคณะ (2002) ไดน าฐานขอมลของ EST จากมะเขอเทศมาเปรยบเทยบกบ

Arabidopsis เพอระบลกษณะของยนจ านวน 1025 ยน ซงมหนาทของยนทแตกตางกนไป และสามารถท

จะมาใชเพอศกษาความสมพนธทางววฒนาการของพชทงหมดดวย

Castelblanco และ Fregene (2006) ไดพฒนาดเอนเอเครองหมายเพอใหสามารถน ามาใชกบ

พชก าพรา (Orphan Crops) หรอพชทมการศกษาและวจยนอย โดยน าดเอนเอเครองหมายชนด COS

จ านวน 3 ยน ทไดจากกลวย คอ chalcone synthase (CHS), dihydroflavonol-4-reductase (DHRF)

และ drought responsive element binding factor 1 (DREB-I) ซงเปนยนทเกยวของกบการทนความ

แหงแลงได มาศกษาใน EST ของมนส าปะหลง พบวา สามารถจดกลมความสมพนธของยนนได อกทง

สามารถน าดเอนเอเครองหมาย COS ไปพฒนาและน าไปใชกบยนทสมพนธกนกบพชทสนใจได

Krutovsky และคณะ (2006) ไดน าสวนของ single-copy genes และ Conserved

Orthologous Set (COS) จาก Arabidopsis ขาว และ poplar มาใชกบสน 4 ชนด เพอหาล าดบเบสทเปน

Conserved Orthologous Set

Li และคณะ (2007) ไดพฒนาดเอนเอเครองหมายชนด Conserved Ortholog Set (COS)

เพอใหสามารถใชไดกวางขวางกบพชตางวงศกน ซงมจ านวนชดของยนนอย สามารถเพมปรมาณดเอนเอ

ได 15 เครองหมาย โดยม 9 เครองหมายทสามารถจ าแนกลกษณะภายนอกของพชวงศเดยวกนได 25

ชนด และ อก 15 วงศทตางกน ซงม 4 เครองหมายทสามารถน าไปใชกบพชวงศ Orobanchaceae

Quraishi และคณะ (2009) ไดน าขอมลล าดบเบสของกลมธญพชมาเปรยบเทยบเพอหาล าดบ

เบสทเปน Conserved Orthologous Set (COS) และใชเปนดเอนเอเครองหมาย COS ในการหายน QTL

ในขาวสาล โดยใชดเอนเอเครองหมายชนด COS 695 เครองหมาย พบวาม 1536 ต าแหนง โดยท

โครโมโซม 7A ของขาวสาลม ดเอนเอเครองหมายจ านวน 31 เครองหมาย ซงสามารถน ามาใชในการท า

แผนทเพอหาลกษณะทางปรมาณผลผลต และม 14 เครองหมาย ทสามารถแยกความแตกตางระหวางพอ

และแมพนธได

Van Deynze และคณะ (2007) ไดน า Conserved Orthologous Set จากมะเขอเทศ และ

Arabidopsis มาประยกตใชเปนดเอนเอเครองหมาย เพอใชในการท านายต าแหนงของ intron ในสงมชวต

ทแตกตางกน

ปยธดา (2552) ไดน าดเอนเอเครองหมาย COS จ านวน 47 เครองหมาย มาใชกบพช 4 ชนด คอ

มะเขอเทศ พรก แตงกวา และกลวยไม เพอการศกษาดเอนเอเครองหมายชนด COS ในพชใบเลยงคและ

พชใบเลยงเดยว โดยในมะเขอเทศสามารถเพมปรมาณดเอนเอได 47 เครองหมาย ในพรกสามารถเพม

ปรมาณดเอนเอได 31 เครองหมาย ในแตงกวาเพมปรมาณดเอนเอได 14 เครองหมาย และในกลวยไม

สามารถเพมปรมาณดเอนเอได 10 เครองหมาย

เทคนคทางชวโมเลกล

1. ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส (polymerase chain reaction, PCR)

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส (polymerase chain reaction, PCR) หรอพซอารเปนเทคนคทใชเพม

ปรมาณดเอนเอเปาหมายเปนการสงเคราะหดเอนเอโดยใชเอนไซมดเอนเอโพลเมอเรสซ ากนหลาย ๆ รอบ

เพอใหดเอนเอปรมาณเพมขนเปนทวคณ (สรนทร, 2545) ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรสเรยกอกชอหนงวา In

Vitro enzymatic gene amplification เทคนคนคนพบโดย Kary Mullis ในป ค.ศ. 1983 (วชรและมนตร,

2536)

ปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส ประกอบดวย DNA template ทตองการเพมปรมาณ, DNA

polymerase, deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) ทง 4 ชนด, primer และ MgCl₂ เพอชวยในการ

ท างานของเอนไซม หลกการเพมปรมาณดเอนเอดวยปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส เลยนแบบ

semiconservative replication (อรรตน, 2548) ซงในแตละรอบของพซอารจะม 3 ขนตอน ดงน

1.1 DNA denaturation อณหภม 90 องศาเซลเซยส – 95 องศาเซลเซยส ท าใหดเอนเอแยก

สาย และแตละสายท าหนาทเปนดเอนเอตนแบบส าหรบการเพมปรมาณตอไป

1.2 DNA annealing อณหภม 37 องศาเซลเซยส – 60 องศาเซลเซยส ท าใหไพรเมอรเขาจบกบ

ดเอนเอตนแบบ ณ ต าแหนงทม complementary sequence

1.3 DNA extention อณหภม 72 องศาเซลเซยส ท าให DNA polymerase สงเคราะห DNA

สายใหม โดยใช dNTPs ในปฏกรยาเปน substrate

2. เทคนคอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)

อเลกโทรโฟรซส (electrophoresis) เปนเทคนคทใชแยกโมเลกลของสารทมประจออกจากกน

โดยใชกระแสไฟฟา โดยใหสารทมประจนนเคลอนทผานตวกลางชนดหนงสารละลาย สารทมประจตางกน

จะเคลอนทไปในทศทางตรงกนขาม (สรนทร, 2545)

โมเลกลของดเอนเอประกอบดวยหมฟอสเฟตจ านวนมาก สารละลายของดเอนเอจงมประจเปน

ลบท pH เปนกลาง เมออยในสนามไฟฟาโมเลกลของดเอนเอจะเคลอนทจากขวลบไปยงขวบวก

(สรนทร, 2545)

2.1 ตวกลางทใชเคลอนทผานของดเอนเอ

2.1.1 อะกาโรสเจล (agarose gel) เปนโพลเมอรของ D-galactose สลบกบ 3,6 –

anhydrogalactose แยกไดจากวน (agar) เนองจากอะกาโรสจบตวกบสารตาง ๆ ไดนอยมาก จงนยมใช

เปนตวกลางในการท าอเลกโทรโฟรซส การเตรยมท าไดงายและไมมอนตรายเมอเทยบกบโพลอะครลาไมด

(สรนทร, 2545)

2.1.2 โพลอะครลาไมดเจล (polyacrylamide gel) เกดจากการรวมตวของอะครลาไมด

(acrylamide) และบสอะครลาไมด (N,N’-methylene bisacrylamide หรอเรยกสน ๆ วา bisacrylamide)

โมเลกลเดยวมารวมตวกนเกดเปนโพลอะครลาไมด ซงมลกษณะเปนรางแหเปนโมเลกลทสงเคราะหขน

ทางเคม จงมความสม าเสมอควบคมขนาดได ไมท าปฏกรยากบสารเคมใด มความใส มความคงตวของ

pH อณหภม และม ionic strength กวาง สามารถปรบขนาดชองในโพลเมอรไดจงเหมาะสมส าหรบเปน

ตวกลางในการแยกโมเลกลของโปรตนและดเอนเอ (สรนทร, 2545)

2.2 ปจจยทมผลตอการเคลอนทของโมเลกลดเอนเอ

2.2.1 ขนาดของโมเลกล อตราการเคลอนทของโมเลกลดเอนเอเปนสดสวนผกผนกบ log₁₀

ของจ านวนเบส ดงนน โมเลกลขนาดใหญมการเคลอนทชากวาดเอนเอทมขนาดเลก (อรรตน, 2548)

2.2.2 รปรางโมเลกลของดเอนเอ ดเอนเอมรปรางหลายแบบ ไดแก supercoiled nicked

circular และ เสนตรง plasmid DNA ตามธรรมชาตมรปรางแบบ supercoiled ในบางสภาพ โมเลกล

supercoiled DNA คลายเกลยวและอยในสภาพ relaxed หร nicked circular ซงรปรางทแตกตางกนม

ผลตออตราการเคลอนทของดเอนเอเมอเปรยบเทยบการเคลอนทของโมเลกลทมน าหนกเทากนแตรปราง

ตางกน พบวา supercoiled เคลอนทไดเรวสดรองลงมา คอ linear และ relaxed circular ชาทสด

(อรรตน, 2548)

2.2.3 เปอรเซนตและชนดของเจล ถาเพมความเขมขนหรอเปอรเซนตเจลโมเลกลดเอนเอจะ

เคลอนทไดชาลง โดยเจลทนยมใชกบกรดนวคลอกคอโพลอะครลาไมดเจล (polyacrylamide gel) และ

อะกาโรสเจล (agarose gel) โดยโพลอะครลาไมดเจลใชแยกดเอนเอทมเอนเอทมขนาดโมเลกลเลก

ระหวาง 6-1,000 คเบส สวนอะกาโรสเจลใชแยกดเอนเอทมขนาดโมเลกลใหญประมาณ 100 คเบสจนถง

กวา 50,000 คเบส (สรนทร, 2545)

2.2.4 แรงเคลอนไฟฟา (voltage) ถาเพมแรงเคลอนไฟฟาดเอนเอจะเคลอนทเรวขน ในการแยก

ขนาดดเอนเอโดยวธอเลกโทรโฟลซสน ตองใชแรงเคลอนไฟฟาทเหมาะสม ถาใชแรงเคลอนไฟฟาสงเกนไป

ดเอนเอจะเคลอนทเรว แตการแยกตวจะไมด ถาใชแรงเคลอนไฟฟาต าเกนไปดเอนเอจะเคลอนทชา

แยกตวไดด แตแถบดเอนเอจะไมคมชดเพราะเกดการแพร(diffusion) ของดเอนเอ (สรนทร, 2545)

2.2.5 บฟเฟอรทใช ชนดของบฟเฟอรมผลตอการเคลอนทของดเอนเอบฟเฟอรทนยมใชม 3 ชนด

คอ TAE (Tris-acetate, EDTA), TBE (Tris-borate, EDTA) และ TPE (Tris-phosphate, EDTA) ซงม

ขอดและขอเสยตางกน TBE นยมใชทความเขมขน 0.5 เทา ใชแยกดเอนเอไดด มความสามรถเปน

บฟเฟอร (buffering capacity) ไดด แตสามรถเกดปฎกรยากบอะกาโรสเจลได จงไมเหมาะถาตองการน า

ดเอนเอกลบมาใชอก TAE ใชไดทวไปและใชไดดในกรณทตองการน าดเอนเอกลบมาใชอก แตมความ

สามารถในการเปนบฟเฟอรต า จงไมควรใชในกรณทท าอเลกโทรโฟรซสเปนเวลานานมากหรอควรใหม

การหมนเวยนของบฟเฟอร (recirculation) สวน TPE มความสามรถเปนบฟเฟอรไดด แยกดเอนเอไดเรว

แตไมเหมาะถามการสกดดเอนเอจากเจลและตกตะกอนดวยเอธานอล เพราะจะเกดการการตกตะกอน

ของฟอสเฟตดวย (สรนทร, 2545)

การศกษาความสมพนธทางพนธกรรมดวยดเอนเอเครองหมายทางชวโมเลกล

การศกษาความสมพนธทางพนธกรรมระหวางสงชวต โดยใชดเอนเอเครองหมายทางชโมเลกล

สามารถจ าแนกสายพนธ ตรวจสอบความแตกตางระหวางจโนไทปของสงมชวตแตละชนดได โดยประเมน

คาความถของอลลล และองคประกอบของความแปรปรวนทางพนธกรรม เพอบอกความหลากหลายทาง

พนธกรรมภายในประชากรหรอระหวางประชากรทท าการศกษา ซงดเอนเอเครองหมายทใชในการ

ตรวจสอบความแตกตางทางพนธกรรมม 2 ชนด คอ 1.) ดเอนเอเครองหมายชนด dominant ไดแก RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA), ซงสามารถน ามาประยกตใชกบสงมชวตชนดแฮพลอยดได

2.) ดเอนเอเครองหมายชนด codominant ไดแก allozyme, RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism) และ SSR (Simple Sequence Repeats) ซงสามารถใชกบสงมชวตชนดแฮพลอยด

หรอดพลอยดกได ภายใตสมมตฐานการกระจายตวอยางอสระของดเอนเอเครองหมายแตละต าแหนง

(no linkage) และความถของอลลลแตละต าแหนงอยในสภาพสมดลประชากรของ Hardy-Weinberg

สามารถน าดเอนเอเครองหมายแตละชนดมาใชในการตรวจสอบความแตกตางในระดบชวโมเลกล เพอจด

กลมแสดงความสมพนธทางพนธกรรม และวเคราะหความหลากหลายทางพนธกรรมของสงมชวตแตละ

ชนดได (Kosman and Leonard, 2005)

การประเมนคาดชนความเหมอนเพออางองความสมพนธทางพนธกรรม

การจดกลมแสดงความสมพนธทางพนธกรรม เพอศกษาความใกลชดทางพนธกรรม จากการ

ประเมนคาดชนความเหมอน (similarity index) โดยใชคาสมประสทธ (coefficient) แตละชนดทแตกตาง

กน ขนอยกบชนดของดเอนเอเครองหมายแตละชนด และระดบชดโครโมโซมของสงมชวตทท าการศกษา

(Kosman and Leonard, 2005)

การประเมนคาดชนความเหมอนจากการแปลงขอมลแบบไบนาร โดยต าแหนงทปรากฏแถบด

เอนเอใหคาเปน 1 ถาไมปรากฏแถบดเอนเอใหคาเปน 0 หลงจากนนน ามาวเคราะห ความสมพนธของด

เอนเอในรปของคาดชนความเหมอน โดยใชคาสมประสทธแตละชนดซงมวธการค านวณทแตกตางกน

ดงน

1. Simple matching coefficient

นบแถบดเอนเอทไมปรากฏในต าแหนงทเปนโฮโมโลกสซงสามารถใชกบดเอนเอเครองหมายชนด

dominant (RAPD และ AFLP) เพราะลกษณะการไมปรากฏแถบดเอนเอ ณ ต าแหนงดเอนเอเครองหมาย

นนๆ เปนลกษณะจโนไทปแบบ homologous recessive

2. Jaccard coefficient

นบเฉพาะแถบดเอนเอทปรากฏ สวนทไมปรากฏแถบดเอนเอไมนบใหเปนขอมลสญหาย เพราะ

ถาขอมลของแถบดเอนเอเกด false-positive หรอ false-negative จะท าใหประเมนคาดชนความเหมอน

คลาดเคลอนจากความเปนจรง สามาถน าไปใชในการวเคราะหขอมลของดเอนเอเครองหมายชนด

codominant (allozyme, RFLP และ microsatellite)

3. Nei-Li หรอ Dice coeffient

นบแถบดเอนเอทปรากฏ โดยใหน าหนกของแถบดเอนเอทปรากฏมากกวาแถบดเอนเอทไม

ปรากฏ สามารถใชกบขอมลดเอนเอเครองหมายชนด codominant (RFLP และ microsatellite)

(Anonymous, 2003)

การวเคราะหคาดชนความเหมอนโดยใชคาสมประสทธ Dice สามารถใชไดทงขอมลทวเคราะห

ดวยดเอนเอเครองหมายชนด dominant (RAPD, AFLP และ ISSR) และดเอนเอเครองหมายชนด

codominant (RFLP และ microsatlelite) ในสงมชวตชนดแฮพลอยด ดพลอยด หรอ โพลพลอยด สวนคา

สมประสทธ Jaccard สามารถใชกบขอมลดเอนเอเครองหมายชนด SSR ในสงมชวตชนดโพลพลอยด

และคาสมประสทธ simple matching ใชกบขอมลการวเคราะหลายพมพดเอนเอในสงมชวตชนด

แฮพลอยด เมอขอมลทน ามาใชในการประเมนผลมความสมบรณ แมวาจะใชคาสมประสทธตางชนดกน

กจะไดรปแบบแสดงความสมพนธทางพนธกรรมระหวางสงมชวตออกมาเหมอนกน แตถาใชคา

สมประสทธตางชนดกน ไดรปแบบแสดงความสมพนธทางพนธกรรมออกมาตางกนนน อาจเกดขนมาจาก

สาเหตอนซงไมคอยมปรากฏ (Kosman and Leonard, 2005)

อปกรณและวธการ

1.การสกดดเอนเอกลวยไม

สกดดเอนเอจากกลวยไมสกลหวาย 5 สายพนธ คอ (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’)

x D. bigibbum, D. ’Ceasar’ (2N), D. ’Dang Saard’, D. ’Sanan White’ และ D. ’BOM17’ จากแปลง

ทดลองภาควชาพชสวน คณะเกษตรก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน

การสกดดเอนเอ ดวยวธ DNA Microprep ดดแปลงจาก Fulton และคณะ (1995)

1.1 น าใบออนของกลวยไมมาตดเปนชนเลก ๆ เตม Extraction buffer (0.35 M Sucrose, 0.1 M

Tris base, 5 mM EDTA, pH 7.5, 1% PVP (Polyvinyl Pyrrolidone), 1% sodium

metabisulfite) 2.7 มลลลตร บดในโกรงจนละเอยด

1.2 กรองดวยผาขาวบางใสในหลอดขนาดใหญ น าสารละลายทกรองใสในหลอด microtube 1.5

มลลลตร น าไปตกตะกอนดวยเครอง Centrifuge ความเรวรอบ 5,000 รอบ/นาท เปนเวลา

4 นาท

1.3 เทสวนใสทง แลวเตม Extraction buffer 350 ไมโครลตร เขยาท าใหตะกอนละลาย เตม

nuclei lysis buffer (0.2 M Tris base, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl₂, 2% CTAB, pH 7.5) 350

ไมโครลตร และเตม 5% sakosyl 100 ไมโครลตร พลกกลบหลอดใหเขากน

1.4 บมไวท 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 – 60 นาท พลกหลอดทก ๆ 10 นาท

1.5 เตม chloroform : isoamyl (24:1) 700 ไมโครลตร พลกหลอดขนลงประมาณ 200 ครงจน

เขากน น าไปปนเหวยงดวยเครอง Centrifuge ทความเรวรอบ 1,200 รอบ/นาท เปนเวลา

10 นาท

1.6 ดดสวนใสดานบน ประมาณ 500 ไมโครลตร ใสหลอดใหม

1.7 เตมไอโซโพรพานอล (Isopropanol) ทเยนลงไป 500 ไมไครลตร พลกกลบหลอดไปมาจน

เปนเนอเดยวกน สงเกตจะพบดเอนเอทตกตะกอน จากนนน าไปปนเหวยงใหตกตะกอนดวย

เครอง Centrifuge ทความเรวรอบ 10,000 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท

1.8 เทไอโซโพรพานอลทง แลวเตม 70 % เอธานอล 500 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงให

ตกตะกอนดวยเครอง Centrifuge ทความเรวรอบ 12,00 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท

1.9 เท 70% เอธานอลทง แลวน าไป dry pellet ท 65 องศาเซลเซยส จนแหง

1.10 ละลายดเอนเอดวย TE buffer (10 mM Tris, pH 8.0,1 mM EDTA, pH 8.0) 100

ไมโครลตร ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท

1.11 เตม 3 M NaOAC 10 ไมโครลตร และเตม 95% เอธานอล ทเยน 200 ไมโครลตร พลก

กลบหลอดใหเขากน น าไปปนเหวยงใหตกตะกอน ทความเรวรอบ 12,000 รอบ/นาท เปน

เวลา 5 นาท

1.12 เทสวนใสทง ลางตะกอนดวย 70% เอธานอล 500 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงให

ตกตะกอน ทความเรวรอบ 12,000 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาท

1.13 เทสวนใสทง ตากดเอนใหแหงท 65 องศาเซลเซยส จากนนละลายตะกอนดเอนเอดวย

TE buffer 50 ไมโครลตร บมท 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท จนตะกอนดเอน

ละลายหมด

2.การตรวจสอบความเขมขนและคณภาพของดเอนเอ

2.1 วธวดคาการดดกลนแสงอลตราไวโอเลตโดยใช spectrophotometer

2.1.1 ใช TE buffer เปน blank 1.2 ไมโครลตร และ lambda in TE ปรมาตร 1.2 ไมโครลตร

2.1.2 ตรวจสอบดเอนเอทง 5 ตวอยาง ใชปรมาตร 1.2 ไมโครลตร ตรวจสอบคณภาพความ

บรสทธของดเอนเอไดดวยโดยเปรยบเทยบคา OD₂₆₀ / OD₂₈₀ ประมาณ 1.8 ถาคามากแสดงวาอาจม

อารเอนเอปนและถาต ามาก แสดงวามการปนเปอนของโปรตนหรอฟนอล และ เปรยบเทยบคา OD₂₆₀ /

OD₂₃₀ เพอวดการปนเปอนของสารอน ๆ ควรมคาประมาณ 1.8 หรอสงกวาน

2.3 ตรวจสอบความเขมขนดเอนเอทสกดไดจากขอ 1.13 เปรยบเทยบกบดเอนเอมาตรฐานดวย

เทคนคอเลกโตรโฟรซส

2.3.1 ใชดเอนตวอยาง 2 ไมโครลตร ผสมกบ TE dye 8 ไมโครลตร (7% glycerol, 10X NEB

(1 M Tris – base, 10 mM EDTA, 125 mM sodium acetate), 0.01% SDS, 0.03%

BPB in TE buffer) ผสมใหเขากน

2.3.2 ตรวจสอบดเอนเอตวอยางโดยผานตวกลาง คอ 1% อะกาโรส ใน 1X TAE buffer (40

mM Tris base, 20 mM acetate, 2 mM EDTA, pH 8) ผานสนามไฟฟา ความตาง

ศกด 100 โวลล เปนเวลา 30 นาท โดยตรวจสอบพรอมกบดเอนเอมาตรฐาน คอ

lambda marker 100 นาโนกรมตอไมโครลตร ปรมาตร 10 ไมโครลตร

2.3.3 ยอมเจลดวยเอทธเดยมโบรไมดเปนเวลา 15 นาท จากนนลางเอทธเดยมโบรไมดใน

น าเปลา เปนเวลา 5 นาท

2.3.4 ถายรปเจล เพอน าไปประมาณคาความเขมขนของดเอนเอตวอยางทสกดได

3.วธการปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรส (Polymerase chain reaction, PCR)

3.1 น าดเอนเอมาปนเหวยงดวยเครอง Centrifuge ทความเรวรอบ 10,000 รอบ/นาท เปนเวลา

5 นาท

ดเอนเอกลวยไมทใชส าหรบท าปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส ดงน

1. (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x D. bigibbum

2. D. ’Ceasar’ (2N)

3. D. ’Dang Saard’

4. D. ’Sanan White’

5. D. ’BOM17'

3.2 เตรยมปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรส ปรมาตร 20 ไมโครลตร โดย 1 ปฏกรยาประกอบดวย

DNA 5 ไมโครลตร

10X PCR buffer 2 ไมโครลตร

1 mM dNTP 2 ไมโครลตร

25 mM MgCl₂ 1.2 ไมโครลตร

10 µM Primer F 1 ไมโครลตร

10 µM Primer R 1 ไมโครลตร

Taq DNA Polymerase (1U) 1 ไมโครลตร

dH₂O 6.8 ไมโครลตร

ปรมาตรรวม 20 ไมโครลตร

3.3 น าเขาเครองควบคมอณหภมอตโนมต (PCR) (PTC-200 version 4.0, MJ Reserch, ประเทศ

สหรฐอเมรกา) ใชโปรแกรม PCR gradient

DNA denaturaration 94 องศาเซลเซยส 30 วนาท

Annealing 45 องศาเซลเซยส หรอ 55 องศาเซลเซยส 30 วนาท

Extention 72 องศาเซลเซยส 1 วนาท

จ านวนรอบ 35 รอบ

3.4 น าไปตรวจสอบพรอมกบดเอนเอมาตรฐานททราบขนาด 10 ไมโครลตร ดเอนเอมาตรฐานท

ใช คอ 1 Kb ladder (Fermentas, USA) โดยผานตวกลาง 1% อะกาโรส ใน 1X TAE

buffer ผานสนามไฟฟา ทความตางศกย 100 โวลล เวลา 30 นาท

3.5 น าไปถายรปเพอน าไปประมาณขนาดของดเอนเอทไดจากการเพมปรมาณดวยปฏกรยา

ลกโซโพลเมอเรส

ไพรเมอรทใชในการท าปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส จ านวน 10 ไพรเมอร ดงน

อณหภม 45 องศาเซลเซยส

1. C₂_ At1g03150

2. COS Marker T1283

3. COS Marker T1490

4. COS II Marker C₂_ At5g49830

5. T1850

อณหภม 55 องศาเซลเซยส

6. C₂_ At1g44575

7. C₂_ At1g71950

8. COS Marker T1536

9. COS Marker T1153

10. C₂_ At1g09760

ทมา : www.sgn.cornell.edu

4.การวดขนาดดเอนเอ

วดขนาดดเอนเอดวยโปรแกรม Photo - Capt version 99.01 มขนตอนดงน

4.1เปดโปรแกรม Photo - Capt version 99.01

4.2 คลกเลอกImage Quantification

4.3 คลกเลอก Molecular weight

4.4 คลกเลอก Lane definition ก าหนดจ านวน Lane คลกท separation แลวลากใหครบ 25

Lane

4.5 คลกเลอก detection of bands โดยลากเสนตรงในแนวนอนกงกลาง band ทจะวดขนาด

ทงหมด

4.6 คลกเลอก Marker values เพอก าหนดขนาดของ Marker

4.7 คลกเลอก M.W. Result เลอก select all

4.8 อานขนาดของ band ทตองการวด

5.การวเคราะหขอมล

5.1 จดกลมแสดงความสมพนธทางพนธกรรมของกลวยไมสกลหวาย 5 พนธ โดยใชดเอนเอ

เครองหมายชนด Conserve Ortholog Sequence

5.1.1 แปลงขอมลใหเปนแบบไบนาร ในการวเคราะหขอมลความแตกตางของดเอนเอ (DNA

Polymorphism) ในต าแหนงทปรากฏแถบดเอนเอใหคาปน 1 ถาไมปรากฏแถบดเอนเอจะใหคาเปน 0

5.1.2 น าขอมลแบบไบนารประเมนคาดชนความเหมอน (Similarity index) โดยใชคา

สมประสทธ Dice (Dice’s coefficient) (Nei and Li, 1979) ท าการวเคราะหจดกลมโดยวธ UPGMA

(Unweighed pair-group method using arithmetic average) โดยใชโปรแกรม NTSYSpc version

2.20 โดยการใชคา Cophenetic correlation ซงเปนคาทสามารถบงบอกวาการจดกลมทได อยในเกณฑ

ดหรอไม (Rohlf, 1997) และสราง Dendrogram โดยถาคา r ≥ 0.9 ถอเปน Dendrogram ทดมาก ถาคา

r อยระหวาง 0.8-0.9 หมายถงด ถาคา r มากกวา 0.7 แตนอยกวา 0.8 ถอวาเปน Dendrogram ทยง

ยอมรบได แตถาคา r ≤ 0.7 ถอวา Dendrogram นนไมควรน ามาใชในการจดกลมหาความสมพนธของ

สงมชวตนน ๆ (Rohlf, 1995)

6.ค านวณคา Expected Heterozygosity (He) และ Polymorphism Information Content (PIC)

ดวยโปรแกรม PowerMarker version 3.25

6.1 บนทกขอมลในโปรแกรม Exel และเปลยนไฟลเปนนามสกล .txt

6.2 เปดโปรแกรม PoweMarker version 3.25

6.3 คลกเลอก file และเลอก New project

6.4 ตงชอไฟลใหมและท าการบนทกขอมล

6.5 คลกเลอก Dataset แลวเลอกไฟลทเปลยนนามสกล .txt

6.6 กด Next และเลอกท cul เลอก Catergorical Level 1 colum

6.7 เลอก cul แลว กด Next เลอก This database is haplotype data และกด finish

6.8 คลกเลอก Analysis เลอก summary

6.9 เลอก summary statistics เพอวเคราะหคา He และคา PIC

6.10 เลอก Open computed tables in Excel

สถานทและระยะเวลาท าการทดลอง

สถานทท าการทดลอง : A 310 ศนยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร และฝายปฏบตการวจย

และโรงเรอนปลกพชทดลอง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาท าการทดลอง เดอนมนาคม พ.ศ. 2554 ถง เดอนมกราคม พ.ศ.2555

ผลการทดลอง

จากการตรวจสอบการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรสของดเอนเอกลวยไม

สกลหวายทง 5 สายพนธดวยดเอนเอเครองหมาย COS ทงหมด 10 เครองหมาย และแยกขนาดดเอนเอ

ดวยเทคนคอเลกโทรโฟรซส ในสนามไฟฟาทมความตางศกย 100 โวลล เปนเวลา 30 นาท พบวา ม 9

เครองหมาย ทใหความแตกตางกน (polymorphic band) จ านวน 27 แถบ มขนาดของแถบดเอนเออย

ในชวงประมาณ 289-1188 คเบส (bp) (ตารางท1) โดยดเอนเอเครองหมายใหจ านวนแถบดเอนเอสงสด

คอ T1850 จ านวน 5 แถบ (ภาพท 1-3) สวนดเอนเอเครองหมาย T1536 ไมแสดงความแตกตางของแถบ

ดเอนเอในกลวยไมสกลหวายทน ามาทดสอบ (monomorphic band)

เมอน าขอมลเกยวกบขนาดและจ านวนแถบของดเอนเอทสงเคราะหไดจากดเอนเอเครองหมาย

COS ทง 9 เครองหมาย ทงหมด 27 แถบ มาวเคราะหหาความสมพนธทางพนธกรรมในรปของดชนความ

เหมอน (Similarlity Index, SI) ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.20N โดยใชคาสมประสทธของ Dice

(Dice’s coefficient) ใหผลในรปของ Dendrogram (ภาพท 4) พบวา สามารถจดจ าแนกกลมกลวยไม

สกลหวายทง 5 สายพนธได มคาสมประสทธความเหมอนอยในชวง 0.68 ถง 0.85 โดยคาสมประสทธท

0.76 แบงเปน 2 กลมใหญ กลมท 1 ประกอบดวย (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x

D. bigibbum, D. ’Dang Saard’, D. ’Sanan White’, D. ’BOM17' กลมท 2 คอ D. ’Ceasar’ (2N) และ

น ามาวเคราะหการจดกลมโดยวธ UPGMA (Unweighed pair-group method using arithmetic

average) ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.20N โดยใชคา cophenetic correlation (r) พบวามคา

เทากบ 0.71229

การวเคราะหคา Expected Heterozygosity (He) โดยใชโปรแกรม PowerMarker version 3.25

จากขอมลความถของอลลลแตละต าแหนง พบวามคา He อยในชวง 0.7200 ถง 0.3200 โดยดเอนเอ

เครองหมายทมคา He สงสดคอ T1850 มคา He เทากบ 0.7200 โดยมคาเฉลยประมาณ 0.4978

(ตารางท 1) และ การวเคราะหคา Polymorphism Information Content (PIC) โดยใชโปรแกรม

PowerMarker version 3.25 จากขอมลความถของอลลลแตละต าแหนง พบวามคา PIC อยในชวง

0.6720 ถง 0.2688 โดยดเอนเอเครองหมายทมคา PIC สงสด คอ T1850 มคา PIC เทากบ 0.6720 โดยม

คาเฉลยประมาณ 0.4260 (ตารางท 1)

ตารางท 1 ไพรเมอรทให polymorphic bands, ขนาดแถบดเอนเอ, จ านวนแถบดเอนเอ, คา Expected

Heterozygosity (He) และคา Polymorphism Information Content (PIC)

Primer Size (bp) No. of bands คา He คา PIC

1.C₂_ At1g03150 599, 343 2 0.4800 0.3648

2.COS Marker T1283 863, 744, 659 3 0.3200 0.2688

3.COS Marker T1490 885, 702, 324 3 0.3200 0.2688

4.COS II Marker C₂_ At5g49830 686, 465 2 0.4800 0.3648

5.T1850 579, 516, 495, 412, 294 5 0.7200 0.6720

6.C₂_ At1g44575 894, 571, 289 3 0.6400 0.5632

7.C₂_ At1g71950 787, 566, 329, 299 4 0.6400 0.5632

8. COS Marker T1153 1188, 988, 598 3 0.3200 0.2688

9 .C₂_ At1g09760 847, 405 2 0.5600 0.4992

คาเฉลย 3 0.4978 0.4260

C₂_At1g03150 T 1283

M D16 D74 D20 D52 B17 M D16 D74 D20 D52 B17

C₂_At5g49830 T 1850

M D16 D74 D20 D52 B17 M D16 D74 D20 D52 B17

ภาพท1 แถบดเอนเอแสดงความแตกตางของกลวยไม 5 พนธ โดยใชไพรเมอร C₂_At1g03150,

T1283, C₂_At5g49830 และ T 1850

Marker = 1Kb ladder

1500

1000

750

500

250

1500

1000

500

750

250

1500 1500

250 250

1000 1000

750 750

500 500

T1490 C₂_At1g44575

M D16 D74 D20 D52 B17 M D16 D74 D20 D52 B17

T 1536 C₂_At1g71950

M D16 D74 D20 D52 B17 M D16 D74 D20 D52 B17

ภาพท2 แถบดเอนเอแสดงความแตกตางของกลวยไม 5 พนธ โดยใชไพรเมอร T1490,

C₂_At1g44575, T1536 และ C₂_At1g71950

Marker = 1Kb ladder

1500

1500

1000

750

250

500

1000

750

500

250

1500

1000

750

500

250

250

500

750

1000

1500

T 1153 C₂_At1g09760

M D16 D74 D20 D52 B17 M D16 D74 D20 D52 B17

ภาพท3 แถบดเอนเอแสดงความแตกตางของกลวยไม 5 พนธ โดยใชไพรเมอร T1153 และ

C₂_At1g09760

Marker = 1Kb ladder

250

1500

1000

750

500

1500

1000

750 500

250

ภาพท4 Dendrogram แสดงผลการวเคราะหขอมลความแตกตางของแถบดเอนเอของกลวยไมทง 5 พนธ

ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.20

D16 = (Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x D. bigibbum

D74 = D. ’Ceasar’ (2N)

D20 = D. ’Dang Saard’

D52 = D. ’Sanan White’

B17 = D. ‘BOM17'

วจารณผลการทดลอง

จากการตรวจสอบการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรสของดเอนเอกลวยไม

ทง 5 สายพนธ ดวยดเอนเอเครองหมาย COS ทงหมด 10 ไพรเมอร พบวา ดเอนเอเครองหมาย T 1536

ใหแถบดเอนเอทไมมความแตกตางกน (monomorphic band) จงไมสามารถน ามาใชในการตรวจสอบ

ความแตกตางระหวางจโนไทปได

การเกดแถบดเอนเอในแตละต าแหนง เกดจากการทไพรเมอรสามารถเขาจบกบดเอนเอ และ

สามารถเพมปรมาณดเอนเอของกลวยไมสกลหวายในแตละพนธได ซงในบางต าแหนงเกดแถบดเอนท

เหนผลไมชดเจน จงจ าเปนตองมการปรบเปลยนอณหภมและองคประกอบอนๆในขนตอนการท าปฏกรยา

ลกโซโพลเมอรเรส ใหเหมาะสมตอการเกดปฏกรยา และเนองจากดเอนเอเครองหมาย COS เปนดเอนเอ

เครองหมายทมาจากจโนมของ Arabidopsis และมะเขอเทศ จงท าใหไพรเมอรเขาจบกบดเอนเอของ

กลวยไมสกลหวายไดยาก เพราะอยตางวงศกนกบกลวยไมสกลหวาย จงท าใหในบางต าแหนงเกดแถบด

เอนเอทยงไมคมชดมากนก

เมอน าขอมลความแตกตางของแถบดเอนเอทไดจาก ดเอนเอเครองหมาย COS ทง 9 ไพรเมอร

มาวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรม ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.20N โดยใชคาสมประสทธของ

Dice วเคราะหจดกลมโดยวธ UPGMA มคาสมประสทธความเหมอนอยในชวง 0.68 ถง 0.85 สามารถจดกลม

ไดเปน 2 กลมใหญ ทคาสมประสทธความเหมอน 0.76 กลมท 1 ประกอบดวย (Dendrobium ’Sri Racha’ x

D. ’Snowfire’) x D. bigibbum และ D. ’Bom17’ มความใกลชดกนทางพนธกรรม D. ’Dang Saard’ และ

D. ’Sanan White’ มความใกลชดกนทางพนธกรรมมากทสด กลมท 2 คอ D. ’Ceasar’ (2N) ซงมลกษณะ

ทางพนธกรรมแตกตางไปจากพนธอน เมอน ามาวเคราะหคา cophenetic correlation พบวามคาเทากบ

0.71229 แสดงวาการจดกลมอยในเกณฑทยงยอมรบได

จากการประเมนคา Expected Heterozygosity (He) โดยมคาเฉลยประมาณ 0.4978 ซงเปน

คาทไมสง แสดงวากลวยไมสกลหวายทง 5 สายพนธ มความหลากหลายทางพนธกรรมนอย และคา

Polymorphism Information Content (PIC) มคาเฉลยประมาณ 0.4260 แสดงวาดเอนเอเครองหมาย

COS บอกความแตกตางระหวางจโนไทปของดเอนกลวยไมสกลหวายไดในระดบปานกลาง

ดงนนการตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไมสกลหวายทง 5 สายพนธดวยดเอนเอ

เครองหมาย COS สามารถน ามาใชในการจ าแนกกลวยไมสกลหวายไดแต condition ในการท าปฏกรยา

ท าไดยากเนองจากเปนดเอนเอเครองหมายทมการพฒนามาจากยนของ Arabidopsis และ มะเขอเทศ

ซงอยตางวงศกน ท าใหมความจ าเพาะนอย ในการเพมปรมาณดเอนเอ จงควรใชดเอนเอเครองหมาย

COS ทมการพฒนามาจากพชทอยในวงศใกลเคยงกน เปนพชใบเลยงเดยว เชน ขาว ขาวฟาง หรอ

กลวยไมสกล Phalaenopsis เปนตน จะท าใหมความจ าเพาะมากขน

สรปผลการทดลอง

จากการใชดเอนเครองหมาย COS มาใชในการตรวจสอบความแตกตางของสายพนธกลวยไม

สกลหวายทง 5 สายพนธได จ านวน 10 ไพรเมอร พบวา ม 9 ไพรเมอร ทสามารถเพมปรมาณดเอนเอและ

ใหความแตกตางได (polymorphic band) คอ C₂_ At1g03150, COS Marker T1283, COS

MarkerT1490,COS II Marker C₂_ At5g49830, T1850, C₂_ At1g44575, C₂_ At1g71950,COS

Marker T1153และC₂_ At1g09760 คดเปน 90 % ของไพรเมอรทงหมดทใชในการตรวจสอบ

วเคราะหความสมพนธทางพนธกรรม ดวยโปรแกรม NTSYSpc version 2.20N สามารถจดกลม

ไดเปน 2 กลมใหญ โดยมคาสมประสทธความเหมอนอยในชวง 0.68 ถง 0.85 กลมท 1 ประกอบดวย

(Dendrobium ’Sri Racha’ x D. ’Snowfire’) x D. bigibbum, D. ’BOM17’, D. ’Dang Saard’ และ

D. ’Sanan White’ กลมท 2 คอ D. ’Ceasar’ (2N) เมอน ามาวเคราะหคา cophenetic correlation พบวา

มคาเทากบ 0.71229

ดงนนขอมลในการศกษาครงนน าไปใชประโยชนในออกแบบไพรเมอรทมความจ าเพาะตอ

กลวยไมสกลหวายเพอน าไปใชประโยชนในการจ าแนกสายพนธกลวยไมสกลหวาย เปนประโยชนในการ

สรางแผนทโครโมโซม และเปนประโยชนในการปรบปรงพนธกลวยไมตอไป

เอกสารอางอง

กรมวชาการเกษตร. 2547. เอกสารวชากลวยไม, เอกสารวชาการล าดบท 1/2547

กระทรวงเกษตรและสหกรณ. โรงพมพชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย,

กรงเทพฯ. 152 น.

ครรชต ธรรมศร. 2550. เทคโนโลยการผลตกลวยไม. อมรนทรพรนตงแอนดพบลชชง จ ากด (มหาชน),

กรงเทพฯ. 283 น.

ทพวลย อยชา. 2549. ดเอนเอเครองหมายชนด microsatellite ทใชในการจ าแนกพนธ

และตรวจสอบพนธประวตกลวยไมสกลหวายพนธการคา. วทยานพนธปรญญาโท

มหาวยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพ. 109 น.

บรรณ บรณะชนบท. 2534. กลวยไมสกลหวาย. 95 น.

ปยธดา งอกงาม. 2552. การศกษาดเอนเอเครองหมายชนด COS ในพชใบเลยงคและพชใบเลยงเดยว.

ปญญาพเศษปรญญาตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, นครปฐม. 61 น.

ไพบลย ไพรพายฤทธ. 2521. ต ารากลวยไมส าหรบผ เรมเลน. หางหนสวนสามญนตบคคล อาทรการ

พมพ, กรงเทพฯ. 431 น.

วชร อตถทพพหลคณ และมนตร อตถทพพหลคณ. 2536. ทฤษฎการประยกตใชประโยชน

PCR Technology. คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยมหดล, กรงเทพฯ. 208 น.

สรนทร ปยะโชคณากล. 2545. จโนมและเครองหมายดเอนเอ : ปฏบตการอารเอพดและ

เอเอฟแอลพ. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 116 น.

อรรตน มงคลพร. 2548. เครองหมายโมเลกลเพอการปรบปรงพนธพช. จรลสนทวงศการพมพ,

กรงเทพฯ. 95 น.

Anonymous. 2003. Measures of genetic diversity. pp. 1-24. In GCP’s Training course on

“Plant genetic diversity analysis and marker-assisted breeding”: 20 August-4

September 2005. Center for Agricultural Biotechnology (CAB) Kasetsart University.

Kampaeng Sean Campus, Nakhon Pathom, Thailand.

Castelblanco, W. and M. Fregene. 2006. SSCP-SNP-based Conserved Ortholog set (COS)

Markers for Comparative Genomics in Cassava (Manihot esculenta Crantz).

Plant Molecular Biology Reproter. 24 : 229-236

Dressler, R.L. 1981. The orchids, Natural history and classification, Harvard Univ. Press,

Massachusetts.

Folton, T.M., J. Chunwong and S.D. Tanksley. 1995. Microprep Protocol for Extraction

of DNA from Tomato and Other Herbaceous Plant. Plant Molecular Biology Reproter.

13 : 207 - 209

Folton, T.M., R.V. Hoeven, N.T. Eannetta and S.D. Tanksley. 2002. Identification,

Analysis and Ultilization of Conserved Ortholog set for Comparative Genomics in

Higher Plant. The Plant Cell. 14 : 1457 - 1467

Kosman, E. and K.J. Leonard. 2005. Similarity coefficients for molecular markers in

Studies of genetic relationships between individuals for haploid, diploid and

polyploid species. Mol. Ecol. 14: 415-424.

Krutovsky, K.V., C.G. Elsik, M. Matvienko, A. Kozik and D.B. Neale. 2006.

Conserved ortholog sets in forest trees. Tree Genetics and Genome. 3 : 61-70

Li, M., J. Wunder, G. Bissoli, E. Scarponi, S. Gazzani, E. Barbaro and C. Varotto. 2008.

Development of COS Genes as Universally Amplifiable Markers for Phylogenetic

Reconstructions of Closely Related Plant Species. The Willi Henning Society. 24 : 727-

745

Nei, M. and W. Li. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of

restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 5269-5273.

Rohlf, F.J. 1997. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System

Version 2.1. Exeter Software. (Computer program). Setanket, New York.

Quraishi, U.M., M. Abouk, S. Bolot, C. Pont, M. Throude, N. Guilhot, C. Confolent,

F. Bortolini, S. Praud, A. Murignexux, G. Charmet and J. Salse. 2009. Genomics in

Cereals: from Genome-Wide Conserved Orthologous Set (COS) Sequences to

Candidate Genes for Trait Dissection. Funct Integr Genomics. 9 : 473–484

Van Deynze, A.E., K. Stoffel, R.C. Buell, A. Kozik, J. Liu, E.V.D. Knapp and D. Francis.

2007.Diversity in Conserved Genes in Tomato. BMC Genomics. 8: 465

ภาคผนวก

ตารางผนวกท 1 รายละเอยดไพรเมอร COS

1 C2_ At1g03150 6 80.60 SGN-M6485

2 COS Marker T1283 MFP1 protein [Lycopersicon esculentum] 3 149.00 SGN-M1894

3 COS Marker T1490 ACE (adhesion of calyx edges) [Arabidopsis thaliana] 3 161.50 SGN-M2041

4 COS II Marker C2_ At5g49830 3 167.50 SGN-M9018

5 T1850 putative cyclic nucleotide-regulated ion channel 3 44.00 SGN-M2318

[Arabidopsis thaliana]

6 C2_ At1g44575 6 39.20 SGN-M4649

7 C2_ At1g71950 6 46.50 SGN-M7032

8 COS Marker T1536 unknown protein [Arabidopsis thaliana] 3 151.00 SGN-M2076

9 COS Marker T1153 unknown protein; 27363-23366 [Arabidopsis thaliana] 3 168.00 SGN-M1799

10 C2_ At1g09760 3 133.50 SGN-M6564

ทมา : www.sgn.cornell.edu

ท ไพรเมอร ยน โครโมโซม ต าแหนง(cM) No. SGN

ตารางผนวกท 2 ผลการใหคะแนนแถบดเอนเอทง 9 ไพรเมอร

primer

size

พนธกลวยไม

หวายแคระ Ceasar 2n Dang Saard

Sanan White

บอม 17

C₂_ At1g03150 599 1 1 1 1 1

343 0 1 0 0 1 863 1 1 1 1 1 T1283 744 1 0 1 1 1 659 0 1 0 0 0

C₂_ At5g49830 686 0 1 0 0 1

465 1 1 1 1 1 579 1 0 1 1 1 T1850 516 0 1 0 0 0 495 1 0 0 0 0 412 1 1 0 0 1 294 0 0 1 1 0 885 1 1 1 1 1 T1490 702 1 0 0 0 0 324 1 0 0 0 0 894 0 1 0 0 1 C2_At1g44575 571 1 1 1 1 1 289 1 1 1 1 1 787 1 1 1 1 1 C2_At1g71950 566 0 1 1 0 0 329 0 1 1 0 0 299 0 0 0 1 0 1188 1 1 1 0 1 T 1153 988 0 0 0 1 0 598 1 1 1 1 1 C2_At1g09760 847 1 0 1 1 1 405 0 0 0 1 0