การตรวจเอกสาร

ลกษณะทวไปของปอเทอง ชอวทยาศาสตร : Crotalaria juncea วงศ : FABACEAE ชอสามญ : Sunn hemp, ปอเทอง

เปนพชดงเดมในเขตรอนมประมาณ 600 ชนด สวนใหญพบในทวปอเมรกา จดเปนพชตระกลถว (Leguminosae) (กรมพฒนาทดน, 2541) มชอสามญวา Sunn hemp ชอวทยาศาสตร คอ Crotalaria juncea เปนพชตระกลถวตามประวตครงแรกน าเขามาจากประเทศฟลปปนส กอนพ.ศ. 2485 ปลกครงแรกทแมโจ จงหวดเชยงใหม (กรมพฒนาทดน, 2550) ลกษณะทางพฤกษศาสตร ปอเทอง (Crotalaria juncea) เปนพชฤดเดยว ล าตนตงตรงแตกกงกานสาขามากสงประมาณ 180 - 300 เซนตเมตร ใบเปนใบเดยวยาวร ชอดอกเปนแบบราซม (racemes) ซงอยปลายกงกาน สาขา ประกอบดวยดอกยอย 8 -20 ดอก ดอกสเหลองมการผสมขามฝกเปนทรงกระบอกยาว 3 - 6 เซนตเมตร กวาง 1 - 2 เซนตเมตร หนงฝกมประมาณ 6 เมลด เมอเขยาฝกแกจะมเสยงดงเนองจากเมลดกระทบกนเมลดมรปรางคลายหวใจสน าตาลหรอด า เมลดหนงกโลกรมจะมเมลดจ านวน 40,000 - 50,000 เมลด หรอหนงลตรจะมประมาณ 34,481 เมลด (กรมพฒนาทดน, 2541) ลกษณะทางพชไร สภาพภมอากาศและดน ปอเทองขนไดดในสภาพอากาศทว ๆ ไป ทนแลง สภาพพนทเปนทดอน การระบายน าด (มกดา, 2548) ปอเทองสามารถขนไดในดนเหนยว ดนรวน ดนทราย หรอดนลกรง แตไมชอบขนในดนทชนและมน าขง พนธ มอยเพยงชนดเดยวทใชประโยชนอยในไทยขณะน (กรมพฒนาทดน, 2541)

ฤดปลก ในกรณทปลกเพอไถกลบเปนปยพชสดในรปแบบของพชหมนเวยนสลบกบพชหลก จะปลกในชวงตนฤดฝน กอนปลกพชหลกประมาณ 2.0-2.5 เดอน ในระบบพชแซมจะปลกพชหลกกอนประมาณ 1-2 สปดาห ในระบบพชเหลอมฤด จะปลกปอเทองในระยะใกลหรอรอการเกบเกยว แตในกรณทปลกเพอเกบเมลดพนธ จ าเปนอยางยงทจะตองก าหนดชวงปลกใหเหมาะสมมฉะนนจะไดผลผลตนอยหรอไมไดเลย โดยทวไปในภาคตะวนออกเฉยงเหนอจะปลกเดอนสงหาคม-กนยายน ในภาคกลางควรปลกปลายฤดฝนชวงเดอนกนยายน-ตลาคม (กรมพฒนาทดน, 2541)

การขยายพนธ ปอเทองขยายพนธโดยใชเมลด เมลดปอเทองงอกงาย มเปอรเซนตความ

งอกทวไปคอนขางสง การเตรยมดนและการปลก การเตรยมดนมความส าคญมากตอการใหผลตอบแทนทงในรป

ของปยพชสดและเมลดพนธ การปลก ทใชปฏบตกนม 3 วธดงน

1.ปลกแบบหวานเปนวธทสะดวก ประหยดเวลาและแรงงาน โดยการน าเอาเมลดพนธทเตรยมไวหวานลงในแปลงใหทว ในอตรา 5 กโลกรมตอไร

2. ปลกแบบโรยเปนแถว โดยใชเมลดโรยลงในแถว ระยะระหวางแถว 75 เซนตเมตร เมอโรยเมลดลงในแถวแลวกลบเมลดดวยดนบาง ๆ ใชอตราเมลด 3-5 กโลกรมตอไร การปลกโดยวธนคอนขางชาและสนเปลองแรงงานกวาวธแรก แตไดปอเทองทขนเปนแถวอยางมระเบยบ 3. ปลกแบบหยอดเปนหลมวธนลาชาและไมสะดวกในทางปฏบตอกทงยงสนเปลองแรงงาน ไมเปนทนยมใชในกรณทมเมลดพนธจ ากดมากใชระยะปลก 50x100 เซนตเมตร หยอด 2-3 เมลดตอหลม ใชอตราเมลด 1-3 กโลกรมตอไร หลงจากปอเทองออกดอกชวงอายประมาณ 50-60 วนกไถกลบ การไถกลบควรท าขณะทมความชนอยในดนพอสมควร

การปลกเพอเกบเมลดพนธ จะตองมการเตรยมดนทด โดยการไถ 1 ครง ทงไวประมาณ 1 สปดาห เกบวชพชในแปลงออกใหหมด และไถแปรตามหรอคราดอกครง เมอความชนในดนพอเหมาะกปลกได การปลกเพอเกบเมลดพนธท าไดหลายวธ ดงน 1. ปลกแบบโรยเปนแถว ระยะระหวางแถว 75-100 เซนตเมตร ใชอตราเมลด ประมาณ 3-5 กโลกรมตอไร 2. หยอดเปนหลม หลมละประมาณ 3-5 เมลด ระยะระหวางตน 50-75 เซนตเมตร ใชอตราเมลด 3-5 กโลกรมตอไร การดแลรกษา เมอปอเทอง 2-3 สปดาห ท าการแยกใหเหลอหลมละ 1-2 ตน พรวนดนกลบโคนตน ก าจดวชพช และใสปยทเนนฟอสฟอรสตามสตรทกรมวชาการเกษตรแนะน า คอ สตร 3-9-6 หรอสตรใกลเคยง ในอตรา 20-25 กโลกรมตอไร ปอเทองเปนพชทตอบสนองตอปยฟอสฟอรสไดด ดงนนอาจใชเพยงปยฟอสฟอรสหรอหนฟอสเฟตในอตรา 5-10 กโลกรมตอไร พนยาปองกนและก าจดวชพช เพอปองกนหนอนกนใบและฝก นอกจากนปอเทองยงมโรคทเกดจากไวรส โดยมแมลงเปนพาหะ ลกษณะอาการคอ ใบจะเลก ดอกเปนฝอย ไมตดฝก สามารถปองกนไดโดยหลกเลยงการปลกซ าพนทเดม ควรมการตรวจหนอนและแมลงใหทวแปลง ตงแตเรมออกดอกไปจนถงระยะตดเมลด โดยตรวจดตอนเชากอนมแสงแดด

การใชประโยชน ปลกเพอใชเปนปยพชสด นยมปลกเปนปยพชสดในสภาพพนทดอน โดยปลกในรปแบบของพชหมนเวยน โดยหวานหรอโรยเมลด กอนการปลกพชหลก เชน ขาวโพด มนส าปะหลง ออย เปนตน อยางนอย 2.0-2.5 เดอน แลวไถกลบปอเทองทอายประมาณ 50-60 วน ในขณะทดนยงมความชนแลวทงไว 7-10 วน กอนปลกพชหลก หรออาจปลกปลกในรปแบบของพชแซม โดยปลกระหวางแถวพชหลก ปลกหลงจากพชหลกประมาณ 1-2 สปดาห หรอในรปแบบการปลกพชเหลอมฤด โดยปลกปอเทองเปนพชทสอง ระหวางแถวของพชหลกในขณะทพชหลกยงไมไดเกบเกยว แตใกลระยะหรอรอเกบเกยว เพอเปนการประหยดเวลาตอเนองระหวางการปลกปอเทองเพอเปนปยพชสดกบพชหลก สามารถปลกพชหลกในเวลาถดไปไดทนฤดกาลในขณะดนมความชนอย และปอเทองจะเปนพเลยงใหกบพชหลกทปลกในระยะแรกเรม ปอเทองใหน าหนกสดประมาณ 1.5-3.0 ตน/ไร ใหธาตไนโตรเจนประมาณ 10-20 กโลกรม/ไร เทยบกบปยยเรยและแอมโมเนยซลเฟตไดประมาณ 23-48 และ 47-95 กโลกรม หรอมเปอรเซนต ไนโตรเจน, ฟอสฟอรส และโพแทสเซยม ประมาณ 2.00-2.95, 0.30-0.40 และ 2.20-3.00 ตามล าดบ อยางไรกตามน าหนกมวลชวภาพและปรมาณธาตอาหารขนกบปจจยของดนและการจดการ

ปลกเพอเกบเมลดพนธ การปลกปอเทองเพอเกบเมลดพนธนยมปลกในสภาพพนทดอน โดยปลกหมนเวยนกบพชหลกในชวงฤดฝน ขอควรระวงในการผลตเมลดพนธปอเทองกคอ ตองปลกในชวงทเหมาะสมและหลกเลยงฝนปรมาณมากในชวงทเรมออกดอก ตดฝกและเกบเกยว มฉะนนจะไมไดผลผลตหรอไดนอยมาก เพราะปอเทองจะถกรบกวน โดยศตรพชมาก อายเกบเกยวประมาณ 120-150 วน ใหผลผลตเฉลย 80-120 กโลกรม/ไร

ปลกเพอใชในอตสาหกรรม ท ากระดาษโดยใชล าตนแหงสงโรงงานท ากระดาษ ซงเปนเยอ

กระดาษด (กรมพฒนาทดน, 2541)

ไฟโตพลาสมา ไฟโตพลาสมา (phytoplasma)เปนจลนทรยโปรคารโอท เดมรจกกนในชอของ มายโค พลาสมา (Mycoplasma-like organism ; MLO) จดอยใน Class Mollicutes (สพฒน,2528 ; Freundt, 1981) ในป ค.ศ. 1995 เปลยนชอเปนเชอไฟโตพลาสมาและจดอยในยนส Phytoplasma โดยขอตกลงของ International Committee on Systematic Bacteriology (ICSB, 1995) และตอมาในป ค.ศ. 1997 ไดมการเสนอใหจดล าดบโดยมชอยนสเปน Candidatus Phytoplasma เชนเดยวกบทมรายงานในเชอไฟโคพลาสมา 4 ชนด คอ Ca. phytoplasma aurantifolia, Ca. Phytoplasma australiense, Ca. Phytoplasma Australia และ Ca. phytoplasma fraxini (ICSB, 1997) ในปจจบนมการศกษาความสมพนธทางววฒนาการและสามารถจดจ าแนกเชอไฟโตพลาสมาไดถง 27 ชนด (Lee และคณะ, 1994, 2000 and Seemuller และคณะ, 1994, 1998) ในการจดกลมเชอไฟโตพลาสมา อาศยขอมลล าดบนวคลโอไทดของยน โดยขอตกลงของ International Research Program on Comparative Mycoplasmology (IRPCM, 2004) ทท าการศกษาเชอไฟโตพลาสมาไดจดจ าแนกไวใน Class : Mollicutes Order : Acholeplasmatales Family : Acholeplasmataceae ประกอบดวย 2 ยนส คอ Phytoplasma และ Acholeaplasma

เชอไฟโตพลาสมารายงานครงแรกโดย Doi และคณะ เมอป ค.ศ.1967 โดยศกษาโรคเตยแคระของหมอน โรคพมแจของมนฝรงและโรคเหลองแอสเตอร และพบวาเชอไฟโตพลาสมาเปนสาเหตโรคพชทสรางความเสยหายใหกบพชหลาย ๆ ชนดอกดวย เชน มะพราว ยาสบ ล าไย ออย ขาว หญาบางชนด เปนตน คณสมบตและลกษณะของเชอไฟโตพลาสมา การศกษาลกษณะสณฐานวทยาอาศยการตรวจเนอเยอทออาหารพชทถกเชอเขาท าลาย และในเยอเยอของแมลงพาหนะดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอน ซงพบวามลกษณะสณฐานวทยาเชน เดยวกบ Mycoplasma โดย Hayflick and Chanock (1965), Hull (1971) และ Hull (1972) ไดอธบายคณสมบตของเชอมายโคพลาสมา ดงน ไมมผนงเซลล เซลลหมเมมเบรน 3 ชน มชวงหางประมาณ 7.5-10 นาโนเมตร สามารถเจรญบนอาหารเลยงเชอได สามารถถกยบย งการเจรญโดยเตตราไซคลน (tetracycline) ทมความเขมขนต าและแอนตบอด (antibody) ของตวเองเทานน มความตานทานตอสารปฏชวนะบางชนดเชน เพนนซลลน ขนาดของเซลลทเลกทสดทใชในการขยายพนธจะอยใน ชวง 100-150 นาโนเมตร เกอบทกสปชส (species) สามารถแยกไดยกเวน M. laidlawii ตองการ sterol และโปรตนในการเจรญ มายโคพลาสมาเทาทพบในปจจบนไมสามารถเปลยนเปนแบคทเรยได องคประกอบหลกทมอยภายในเซลลไฟโตพลาสมาไดแก สารพนธกรรม (DNA และ RNA) ไซโตพลาสซม (cytoplasm) ไรโบโซม (ribosome) ท าใหเซลลมรปรางไมแนนอน (pleomorphic หรอ polymorphism) มรปรางตงแตกลม (spherical bodies) ร เปนแทงยาว เปนเกลยว เปนเสนยาว ๆ (elongated forms หรอ filamentous) จนถงแตกเปนเสนสาย หรออาจมรปรางคลายผลฝรง มรปรางตอกนคลายลกปด (bead string) มเสนผานศนยกลาง 0.2-0.8 ไมครอน จนกระทงเปนเสนสายยาวถง 3 ไมโครเมตร ขยายพนธโดยการแตกหนอ (budding) และมการแบงตวจากหนงเปนสอง (binary fission) (McCoy, 1984; สพฒน, 2528; สวณ, 2532; พรทพย, 2533) สามารถพบเชอไฟโตพลาสมาในเซลลพชท sieve element, parenchyma และ companion cell ของ phloem มรปรางแตกตางกนออกไปแลวแตชนดของเชอและพช มขนาดเสนผาศนยกลางตงแต 50-800 ไมโครเมตร มเยอหมเซลล (membrane) 3 ชน โดย 2 ชนนอกเปนชนทบแสงของอเลคตรอน (electron dense layer) ถดเขาไปเปนชนโปรงแสงของอเคตรอน ภายในเซลลจะพบสาร

พนธกรรมทงดเอนเอ (DNA) และอารเอนเอ (RNA) พบเมลดคลายไรโบโซม (70s ribosome) และ fibrillar flame work และไมสามารถตานทานความรอนและการเปลยนแปลงของแรงดนออสโมตก (osmotic pressure) อยางรวดเรว ในประเทศไทยพบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมาเปนครงแรกเมอ พ.ศ.2513 ในงาทเปนโรคแตกพมฝอย (phyllody) (ดวงใจ, 2513) ปจจบนพบวาเชอไฟโตพลาสมาท าใหเกดโรคกบพชไดมากกวา 200 ชนด (ธระ,2532) มรายงานเกยวกบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมาในพชเศรษฐกจทส าคญหลายชนด ไดแ ขาว ออย งา ล าไย พชตระกลถว และไมดอกไมประดบ รวมทงวชพชในแปลงปลกพชซงเปนแหลงสะสมโรคทส าคญ การเพมปรมาณเชอไฟโตพลาสมา ไฟโตพลาสมาสามารถเพมปรมาณไดโดยการแตกหนอ (budding) (พรทพย, 2533; McCoy, 1984) และมการพบการแบงตวจากหนงเปนสอง (binary fission) ซงทงสองวธเปนการเพมปรมาณของเซลลโดยทไมอาศยเพศ ท าใหอตราการกลายพนธต ากวาจลนทรยชนดอน ๆ ทสามารถสบพนธโดยอาศยเพศ เชน แบคทเรยและเชอรา อกทงยงเปนเชอสาเหตโรคทไมสามารถเลยงบนอาหารสงเคราะห แตเปนจลนทรยทมความไวตอสารปฏชวนะพวกเตตราซยคลน (tetracycline) แตตานทานตอเพนนซลลน การเจรญเตบโตของเชอไฟโตพลาสมาในพช เชอไฟโตพลาสมาเปนเชอสาเหตโรคทพบไดในบรเวณทออาหารของพช (Lee และคณะ, 1992; Raychaudhuri และ Mitra, 1993) ซงในเซลลจะประกอบดวยน าตาล เกลอตาง ๆ กรดอะมโน ระดบ pH ตลอดจนความดนออสโมตก (osmotic potential) ซงเปนสารจ าเปนส าหรบเชอไฟโตพลาสมา (McCoy, 1984) ท าใหเปนขอจ ากดการแพรกระจายของเชอในตนพช สงผลถงแมลงพาหะทจะถายทอดโรคจงตองเปนแมลงปากเจาะดดเทานน การเคลอนยายของเชอสามารถพบไดทกสวนของพช เพราะเชอเคลอนทไปพรอมกบการเคลอนยายอาหารของพช

การถายทอดเชอไฟโตพลาสมา เชอไฟโตพลาสมาสามารถถายทอดได 3 วธ คอ 1. การถายทอดโดยฝอยทอง ไดมรายงานการถายทอดเชอสาเหต โรคแตกพมฝอยของงาและปอเทองโดยการใชฝอยทอง (dodder 3 species คอ Cuscuta campestris, Cuscuta subinclusa, Cuscuta odorata) ไปยงพงพวยท าใหเกดอาการดอกเขยวและแตกพมฝอย (สภาพร, 2533) ขอส าคญคอฝอยทองตองเกาะพชทงสองชนดและมชวตอยไดจงจะประสบความส าเรจ 2. การถายทอดโดยแมลงพาหะ ตดไปกบแมลงพาหะพวกทเปน phloem-feeding เชน เพลยจกจน (leaf hopper) เพลยกระโดด (plant hopper) และเพลยไกฟา (phyla) เปนตน โดยในประเทศไทยไดมรายงานถงการถายทอดโดยแมลงพาหะในกลมของเพลยจกจน (Matsumuratetrix hierogly phicus. Mat) ถายทอดโรคใบขาวของออย (ธระ, 2532) 3. การถายทอดโดยตดไปกบสวนขยายพนธ การทาบกง ตดตา (grafting) ท าไดโดยเชอมตอระบบเซลลทออาหาร ในพชตระกลเดยวกนหรอชนดเดยวกน ซงสามารถใชเวลาถายทอดเชอไดในเวลาไมนาน บางกรณการถายทอดเชอสามารถเกดขนไดแมไมเกดการเชอมตอ (graft union) ของเนอเยอทงสอง (Bos, 1983) การถายทอดโรคโดยวธกล เชน ตดไปกบเครองมอทางการเกษตร ไมวาจะเปน กรรไกร มด หรอไถ เปนไปไดนอยมาก เนองจากคณสมบตของเชอชนดนทไมทนทานตอสภาพแวดลอมภายนอกและสามารถสลายตวไดงายเมออยเดยว ๆ และการเกบรกษาเชอไฟโตพลาสมาในสภาพมชวตสามารถท าไดโดยการเกบในพชอาศย เชน พงพวย (Catharanthus roseus L.) โดยใชฝอยทองถายทอดเชอจากตนเปนโรคสพงพวยปกต แลวเกบไวในสภาพเรอนทดลองปองกนแมลง (Alma และคณะ, 1996) หรอในระบบเพาะเลยงเนอเยอพชอาศย (Davies และ Clark, 1994) ซงเกบรกษาเชอไวไดนานถง 3 ป โดยพบวาปรมาณเชอในพชทเพาะเลยงเนอเยอสงกวาในสภาพแปลงธรรมชาต เชอไฟโตพลาสมามการสบพนธแบบไมอาศยเพศ (Asexual reproduction) โดยการแตกหนอ (Budding) (พรทพย, 2533 และ McCoy, 1984) ภายในทออาหารของพชอาศย เชอไฟโตพลาสมาอาจมรปรางเปนแบบดมเบล เนองจากการยดตวออกเมอมการแบงตวจากหนงเปนสองเซลล (ไพโรจน, 2525)

ลกษณะอาการของพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา เชอไฟโตพลาสมาเปนสาเหตของโรคพชจ านวนมาก พชทถกเชอไฟโตพลาสมาเขาท าลายสามารถแสดงอาการใหเหนไดแตกตางกนไป ประกอบดวย

1. มการแตกยอดมากกวาปกตจนมลกษณะคลายไมกวาด ดงนนอาจเรยกอาการแบบนไดวา โรคพมไมกวาด (witches’ broom) ลกษณะทเหนเดนชดคอ ยอดหรอตาขางทแตกออกมานนจะไมเจรญเตบโต กลบชะงกงนหลงจากแตกออกมาไดไมนานนก ปลองสน ใบมขนาดเลกมากจนแทบไมเหนลกษณะของใบอยางใบอยางเดนชด เชน ในกรณของโรคพมไมกวาดของล าไย ยอดทแตกออกมามกมลกษณะคอนขางแขงกวาปกต และคอนขางเปราะ พชทแสดงอาการของโรคอาจเปนไดทงไมเนอแขง เชน ล าไย apple จนทน เปนตน หรอไมลมลก เชน มนฝรง มะเขอเทศ หรอถวเหลองกได 2. อาการเหลอง อาการแบบนมกพบทใบ แตบางครงกพบทกลบดอกไดเชนกน อาการเหลองนมกจะท าใหสบสนกบอาการทเกดจากเชอไวรสไดมาก ทเหนไดชดคอ สวนคลอโรฟลด ของพชจะถกท าลาย ท าใหใบมสซดมากกวาปกต เชน โรคเหลองเตยของขาว หรอบางครงมสขาวไปทงใบกได เชน ในโรคใบขาวของออย อาการทพบในดอกมกท าใหสกลบดอกซดไมมสตามปกต เชน มสเหลองซดหรอสเขยวออน เชน โรค aster yellow ของเบญจมาศและแอสเตอร เปนตน 3. อาการเตยแคระ อาการนพบคกบอาการเหลอง ตนทเปนโรคจะไมเจรญเตบโต เชน โรคแคระของหมอน บางครงอาจพบวาสวนของยอดหรอเยอเจรญจะเรมตาย และลามลงไปดานลาง ท าใหตนไมทรดโทรม 4. อาการดอกเขยว (virescence) อาการแบบนจะพบสวนทสวนของกลบดอกเทานน โดยจะมสเขยวเหมอนกบสของใบ เชน โรค Sesamum phyllody หรอ Strawberry phyllody (ประสาทพร, 2527; Martha และคณะ, 1989; Hsu และคณะ, 1990; Overman และคณะ, 1992 และ Marcone และคณะ, 1996)

การปองกนและก าจดโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา ก าจดแมลงพาหะน าโรค เพลยจกจน หรอเพลยกระโดด ใชสารปฏชวนะ เชน สารออกซเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด หรอ คลอโรเตตราไซคลน ไบซลเฟต จมแชรากพชในอตราเขมขน 10-1000 ppm หรอฉดเขาสตนโดยตรงแลวแตชนดของพช การปฏบตอน ๆ คลายวธการควบคมโรคทเกดจากไวรส (ไพโรจน, 2525) ท าลายพชทเปนโรคทง โดยการถอน เผา เมอพบพชทแสดงอาการ ท าลายแหลงทมเชอโรคอย โดยก าจดวชพชและพชอาศย เพอปองกนไมใหพชหลกตดเชอในฤดปลก ท าความสะอาดเครองมอเครองใชทางการเกษตร โดยท าการฆาเชอดวยความรอน หรอสารเคม ใชชนสวนพชทปราศจากโรค หลกเลยงสถานททมประวตการเกดโรค ท าการควบคมสถานทเพาะปลกพช ใหปราศจากโรค ไมน าชนสวนพชทเปนโรคเขาสแปลงปลก การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา เดมใชคณสมบตทางชววทยา เชน การศกษาลกษณะอาการของโรคทเกดบนใบพช แมลงพาหะ การตอบสนองตอสารปฏชวนะเตตราไซคลนของพชอาศย ถาพบพชทสงสยวาถกเชอโรคเขาท าลายมอาการดขนเมอใหเตตราไซคลน เชอโรคพชนนอาจจะเปนเชอไฟโตพลาสมาได (McCoy และคณะ, 1989) วธการดงกลาวใหผลทไมแนนอนและใชเวลาในการหาขอสรปนาน ตอมาไดมการพฒนาเทคนคทางดานกลองจลทรรศนอเลคตรอน สามารถน ามาใชในการตรวจหาเชอไฟโตพลาสมาในเนอเยอพชดวยสารเรองแสงบางชนด เชน 4,6-diamidino-2-phehylindole (DAPI) (Seemuller, 1976) แตทงสองวธจะใหผลชดเจนเมอเนอเยอพชมเชอในปรมาณมาก จงเปนขอจ ากดประการหนงส าหรบเชอไฟโตพลาสมาทพบเฉพาะในทออาหารของพชเทานน สงผลใหพบปรมาณเชอไดนอยเมอเปรยบเทยบกบเชอสาเหตโรคพชชนดอน ๆ ทสามารถเขาท าลายพชไดทกสวน และทงสองวธนไมเฉพาะเจาะจง ไมสามารถบอกชนดของเชอไฟโตพลาสมาไดเพราะเมอดดวยกลองจลทรรศนอเลคตรอนเหนเพยงรปรางภาย นอก ซงเชอไฟโตพลาสมาแตละชนดทเขาท าลายพชตางชนดกน เมอดรปรางภายนอกจะพบวาเหมอนกน สวนผลของ DAPI จะเหนเพยงวาทบรเวณทออาหารของพชมดเอนเอซงนาจะเปนของเชอไฟโตพลาสมา แตไมสามารถบอกไดวาเปนเชอไพโตพลาสมาชนดใด (Harrison, และคณะ, 1996) เทคนควธการดานซรมวทยาทงโพลโคลนอลแอนตบอด (polyclonal antibody) และโมโนโคลนอลแอนตบอด (monoclonal antibody) ไดน ามาใชในการศกษาตรวจเชอไฟโตพลาสมาในรปแบบของ ELISA (Enzyme-Link Immunosorbent Essay) แตมกประสบปญหาในการแยกเชอไฟ

โตพลาสมาใหบรสทธและมปรมาณมากเพยงพอทจะนาใชในการฉดสตวทดลอง เพอชกน าใหรางกายสตวทดลองสรางแอนตบอด (Errampalli และ Fletcher, 1993; Shen และ Lin, 1993) บางครงพบวาอาการผดปกตของพชทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา มลกษณะอาการคลายการขาดธาตอาหารของพชและสาเหตจากสงไมมชวตอน ๆ ดงนนจงตองท าการถายทอดโรค และศกษาลกษณะอาการของโรคในแพงพวย เนองจากแพงพวยเปนพชอาศยทดของเชอไฟโตพลาสมา โดยจะแสดง อาการดอกเขยวภายในเวลา 1-2 สปดาห หลงจากไดรบเชอ และเชอสามารถเพมปรมาณไดดในแพงพวย สามารถน าไปตรวจสอบเชอโดยวธอน ๆ ตอไป (สภาพร, 2542) เมอมการพฒนาเทคนคทางดานพนธวศวกรรม มการประยกตและเทคนคตาง ๆ มาใชในการศกษาเชอไฟโตพลาสมา เชน PCR (Polymerase Chain Reaction) และ Hybridization ท าใหการวนจฉยโรคและชวยในการจดจ าแนกเชอไดอยางถกตองรวดเรว แตอยางไรกตามขอมลพนฐานทางดานชววทยาและสณฐานวทยาของเชอไฟโตพลาสมา กยงมความจ าเปนทจะน ามาประกอบการตรวจวนจฉยเพอความถกตองแมนย า นาเชอถอ การตรวจเนอเยอพชดวยกลองจลทรรศน 1. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนแบบ dark field หรอ phase contrast 2. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนฟลออเรสเซนต 3. การตรวจเชอดวยกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบล าแสงสองผาน (TEM) การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนคทางซรม (Serology)

1. Enzyme-linked immunosorbent assay 2. Immunogold-labelling

การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนคทางโมเลกล

1. Polymerase chain reaction 2. DNA probe

การตรวจเชอไฟโตพลาสมาดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reacrtion (PCR) มความส าคญในการใชเพมปรมาณดเอนเอเปาหมายโดยการสกดดเอนเอจากเนอเยอพชทเปนกรดมาท าปฏกรยาในหลอดทดลอง เนองจากพบวายนทควบคมขอมลการสงเคราะหยน16S rDNA (16S rDNA gene) มลกษณะอนรกษ (conserved) ในเชอไฟโตพลาสมาจงไดมการสงเคราะหไพรเมอร (primer) ซงเปนดเอนเอเรมตนสายสนๆ ทมล าดบ นวคลโอไทดเปนเบสคสมกบดเอนเอตนแบบ ไพรเมอรนไดมาจากโคลนของ MLO หรอจากล าดบนวคลโอไทดบางสวนของยน 16S rDNA มายโคพลาสมาในสตวและของไฟโตพลาสมา (Lee และคณะ, 1993) จนถงปจจบนนกวทยาศาสตรทดลองและพฒนาไพรเมอรขนมาเปนจ านวนมากเพอใชในการเพมปรมาณยนของเชอไฟโตพลาสมาเพอประโยชนในการตรวจเชอและการจดจ าแนกไดดยงขน เชน rpI gene, tuf gene และ SecY gene เปนตน โดยไพรเมอรทผลตนนมทงไพรเมอรทจ าเพาะเจาะจง (specific primer) และไพรเมอรชนดทไมจ าเพะเจาะจง (universal primer) ใชเพมปรมาณดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมา ขนาดของดเอนเอทเพมไดแตกตางกนตงแต 0.5-1.4 กโลเบส ขนอยกบไพรเมอรทใชเรมตนสงเคราะห (Ahrens และ Seemuller, 1992; Gibb และคณะ, 1998; White และคณะ, 1998) การตรวจเชอไฟโตพลาสมาโดยใชเทคนค Dot blot hybridization เทคนคไฮบรไดเซชน (Hybridization) สามารถตรวจเชอไฟโตพลาสมาไดแมมปรมาณนอย ตองมการผลตดเอนเอตวตรวจ(DNA probe) ทเตรยมไดจากโครโมโซมของเชอ ซง DNA probe ชนดนจะมความจ าเพาะเจาะจงตอเชอทน ามาท าตวตรวจ (probe) ดวยไพรเมอรทไมจ าเพาะเจาะจงน ามาท าตวตรวจกจะสามารถใชตรวจสอบโรคทเกดจากเชอไฟโตพลาสมา โดยอาศยหลกการจบกนของกรดนวคลอกของเชอไฟโตพลาสมา ซงหลกการของการตรวจหาดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาในพช ท าไดโดยการน าชนสวนของดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาทจะใชเปนตวตรวจ ซงอยในรปเสนตรงสายคมาแยกออกเปนเสนเดยวแลวสรางดเอนเอสายใหมทตดฉลากดวยอนพนธของกรดนวคลอกทเชอมตอกบสารไดกอกซเจนน (dUTP spacer-sterosis hapten digoxigenin; DIG-dUTP) เมอจดใหดเอนเอตวตรวจทตดฉลากจบคกบดเอนเอในตวอยางแลว ท าการตรวจตดตามดเอนเอทตดฉลากดวยวธ ELISA ทใช anibody conjugate (antidigoxigenin alkaline phosphatase conjugate) โยใหเอนไซมท าปฏกรยากบสารประกอบ คอ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate (X-phosphate) และ nitroblue tetrazolium salt (NBT) แลวใหสมวงน าเงน (Mathews, 1992) เทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) เทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) เปนเทคนคทสามารถน ามาใชประโยชนในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอไฟโตพลาสมา โดยดความแตกตางของขนาดดเอนเอทไดจากการยอยชนสวน 16S rDNA ดวยเอนไซมตดจ าเพาะ (restriction enzyme) อาศยหลกการขอมลทางพนธกรรมของสงมชวตอยในรปของดเอนเอ สามารถจ าลองตวเองไดอยางถกตองแมนย า เพอถายทอดสเซลลรนลกใหคงลกษณะทเหมอนเดม แตบางครงอาจมการเปลยนแปลงเบสภายในดเอนเอ เนองจากสงแวดลอมหรอขอผดพลาดของเซลลเอง การเปลยนแปลงสามารถสงผลใหเกดการหายไป (deletion) การจดเรยงตวใหม (rearrangement) หรอมการเปลยนต าแหนงของดเอนเอบางสวนภายในโครโมโซม (transposition) ผลทไดจากการเปลยนแปลงนท าใหเกดความหลากหลายของสงมชวตแตละชนด ซงสามารถตรวจพบไดโดยการหาล าดบเบสของดเอนเอ (sequencing) แลวน ามาเปรยบเทยบกน แตเปนวธทท าไดยากและใชเวลามาก วธทงายกวาคอการน าดเอนเอทตองการหาความแตกตางนนมายอยดวยเอนไซมตดจ าเพาะบางชนด แลวเปรยบเทยบชนสวนดเอนเอทถกตดโดยเอนไซมนน (สรนทร, 2539; Toth และคณะ, 1994) เทคนค การโคลนยน (gene cloning, DNA cloning หรอ molecular cloning) การโคลนยน หรอ เทคโนโลยการสรางดเอนเอสายผสม (recombinant DNA technology) หมายถง การเคลอนยายชนสวนดเอนเอทสนใจของสงมชวตชนดหนงเขาไปยงสารพนธกรรมทสามารถจ าลองตวเองได (self-replicating genetic element) เชน พลาสมดของแบคทเรย แลวชนสวนของดเอนเอนนกสามารถแพรกระจาย (propagate) ไปกบเซลลเจาบานได (host cell) ได การสรางดเอนเอสายผสมท าไดโดยการตดหรอแยกยนทตองการศกษาน ามาเชอมตอกบดเอนเอพาหะหรอเวคเตอร (vector) แลวถายโอนดเอนเอทไดสเซลลเจาบานใหมการเพมจ านวนชดของดเอนเอจนมปรมาณมากพอตามความตองการในการน าไปใชงาน

การศกษาเพอจดจ าแนก Lee และคณะ (1993) รายงานวาสามารถใชเทคนค Polymerase chain reaction (PCR) เพมปรมาณยน 16S rDNA บางสวนของเชอไฟโตพลาสมาได 40 ชนด โดยใช universal prime (R16F2 / R16R2) และเปรยบเทยบความแตกตางของยน 16 S rDNA ขนาด 1.2 กโลเบส ดวยเทคนค Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ซงจดกลมของเชอทง 40 ชนดไดเปน 9 กลม และ 14 กลมยอย Marcone และคณะ (1997b) ศกษาหญาแพรกขาวในอตาลและลกษณะส าคญทเกยวของกบเชอไฟโตพลาสมา โดยใชเทคนคทางดาน PCR เพมปรมาณชนสวนดเอนเอของเชอไฟโตพลาสมาดวยไพรเมอรทจ าเพาะเจาะจง พบวาในหญาทแสดงอาการใบขาวทน ามาทดสอบทงหมดใหผลบวก สวนหญาปกตไมพบแถบดเอนเอจากการท า PCR สภาพร และคณะ (2540) ศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอไฟโตพลาสมาทพบในโรคพช 8 ชนด คอ โรคใบขาวของออย หญาแพรก และหญา Brachiaria โรคเหลองเตยของขาว โรคแตกพมฝอยของงา ปอเทอง และผกเสยนผ และดรคดอกเขยวของแพงพวย โดยเทคนค PCR ในการเพมปรมาณดเอนเอ ใชไพรเมอร (R16F2 / R16R2) ทจ าเพาะเจาะจงส าหรบเพมปรมาณยน 16S rDNA บางสวนของเชอไฟโตพลาสมาและใชดเอนเอทสกดจากใบพชเปนโรคเปนตนแบบ พบวาสามารถเพมปรมาณดแอนเอทไดจากตวอยางโรคแตกพมฝอยของงา น ามาตดฉลากดวยสารไดกอกซเจนน เพอใชเปนดเอนเอตวตรวจส าหรบวนจฉยโรค ดวยเทคนค dot blot และ Southern blot hybridization พบวาดเอนเอตวตรวจสามารถท าปฏกรยากบดเอนเอทสกดจากใบพชทเปนโรคทกชนดและกบดเอนเอขนาด 1.2 กโลเบส ทเพมปรมาณจากตวอยางทกโรค และพบวาสามารถจดกลมได 4 กลม คอ กลมโรคใบขาวของออย หญาแพรก และหญา Brachiaria, กลมโรคแตกพมฝอยของงา ปอเทอง และผกเสยนผ, กลมโรคเหลองเตยของขาวและกลมดอกเขยวของแพงพวย Lee และคณะ (1998) ศกษาการจดกลมของเชอไฟโตพลาสมาโดยการเปรยบเทยบล าดบ นวคลโอไทดของยน 16S rDNA และแบงเปน 14 กลม ไดแก 16SrI-16SXIV และ 41 กลมยอย Marcone และคณะ (1999) ศกษาและรายงานขนาดโครโมโซมของเชอไฟโตพลาสมาเพอจดกลมความสมพนธทางววฒนาการเปนกลมใหญและกลมยอย สามารถแยกออกไดเปน 12 กลม

เชน เชอไฟโตพลาสมาทมขนาดจโนม 600-1,130 กโลเบส จดอยในกลม aster yellows phytoplasma ขนาดจโนมทอยในชวง 860-1,350 กโลเบส จดอยในกลม stolbur phytoplasma หากขนาดจโนมอยในชวง 670-1,075 กโลเบส สามารถพสจนไดวาจดอยในกลม X-disease เปนตน SecY gene SecY gene พบในสงมชวตจ าพวกแบคทเรยท าหนาทสราง SecY protein ทเปน Secretion protein จดอยใน Sec translocate system อยในบรเวณชนของ lipid bilayer ของ membrane ของเชอไฟโตพลาสมา เพอท าการควบคมการสงออกของสารจ าพวกโปรตนทจ าเปนตอการเจรญเตบโตของเซลลออกส cytoplasm ผานทางชอง protein-conducting (Margaret และคณะ, 2005) โดย Sec transloate system ประกอบไปดวย SecA, SecB และ SecY complex ซง SecY complexประกอบดวย 3 subunits ไดแก -subunit (รปราง helices), β-subunit (รปราง simple helix) และ γ-subunit (รปราง L-shaped) มขนาดของชองภายใน SecY complex เพอใหโปรตนถกสงออก เทากบ 16 Ao (Pu Tian และคณะ, 2006)

กลไกการท างาน เมอม precursor protein ทจะสงออกไปยงภายนอกผาน membrane จะถกจบดวย SecB ทท าหนาทเปนสาร chaperon ใชในการสงออกโดยเฉพาะ จากนน SecA จะเขามาจบกบ precursor protein และ SecB เพอรวมตวกลายเปน ternary complex แลวถกสงออกผานทางชองทเกดจาก SecY complex (Margaret และคณะ, 2005)

ความแตกตางระหวาง 16S rDNA และ SecY gene วธการจดจ าแนกเชอไฟโตพลาสมาทนยมใช คอ วธการ RFLP โดยใช 16S rDNA ในการจดจ าแนก แตเนองจาก 16S rDNA มคาความคลายคลงกน (homologies) เทากบ 98.5% - 99.5% ทคอนขางสง ท าใหจดจ าแนกไดไมละเอยด โดยเฉพาะในกลมเชอทเปนสาเหตใหกบพชหลายชนด เชน Aster yellows เปนตน จงท าการคนควาหา gene ชนดใหม ทสามารถแยกไดละเอยดยงกวา คอ SecY gene มคาความคลายคลงกนเทากบ 94.7% - 98.8% ซงนอยกวา 16S rDNA ท าใหสามารถจดจ าแนกแบงกลมเชอโรคไดอยางละเอยด (Lee และคณะ, 2005)

Lee และคณะ (2005) ศกษาการจดกลมของเชอไฟโตพลาสมาในกลมของ Aster yellows โดยใชยน SecY ท าการเปรยบเทยบ พบวาสามารถแบงกลมยอยของ Aster yellows ได 10 กลมจาก 20 ตวอยางไดละเอยดและหลากหลายมากกวาใชยน 16S rDNA Arnaud และคณะ (2007) ศกษาการจดกลมของ flavescence dorée (FD)ของเชอไฟโตพลาสมาในองนในประเทศฝรงเศสและสเปน โดยใชเทคนค RFLP และใช SecY หาความสมพนธและความหลากหลาย พบวาสามารถแบงออกเปน 3 กลมทมความสมพนธกน ในกลมแรก (FD1) มความหลากหลายคอนขางนอย และพบเปน 17% ขององนทเปนโรคทางตะวนตกเฉยงใตในประเทศฝรงเศส กลมท 2 ไมมความหลากหลายและพบในองนทเปนโรค 83% ทงในฝรงเศสและอตาล ในกลมท 3 พบความหลากหลายมากทสดในองนของประเทศอตาล และเมอน ามาท า phylogenetic tree ระหวาง flavescence dorée (FD), German Palatinate grapevine yellows phytoplasmas (PGY) และ alder phytoplasmas (AldY) สามารถสรปไดวา FD, PGY และ AldY จดอยในกลมเดยวกนซงมถนก าเนดอยในยโรป