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7/24/2019 Cultivos de los virus.doc

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Cultivos de los virus

Slo se desarrollan en el interior de clulas vivas. Para su aislamiento se han utilizado:

- Animales de experimentacin: La inoculacin de virus en los animales de experimentacin puede producir unaenfermedad con lesiones caractersicas, que se puede transmitir en serie, es el mtodo m!s anti"uo para aislar conservar el virus. Los animales se utilizan en investi"aciones experimentales so#re virus onc"enos, so#re lapato"enia e inmunidad de las virosis para la o#tencin de antisueros.

- Huevos embrionados: Los virus se pueden inocular en la cavidad alantoidea. $l desarrollo del virus se manifiestapor la muerte del em#rin o la produccin de hema"lutininas. $n la actualidad ha quedado limitado al cultivo de lospoxvirus so#re todo del virus de la "ripe tanto para su aislamiento como para la produccin de vacunas.

- Cultivos tisulares:%onstituen el mtodo de eleccin para el desarrollo de la maora de virus se utilizan loscultivos de r"anos para el aislamiento de virus de difcil desarrollo o en casos especiales.

- Cultivos celulares:Los cultivos de clulas aisladas en medios artificiales son mu inesta#les, de manera que loscultivos primarios al ca#o de pocos pases o cultivos secundarios, r!pidamente mueren. $n ocasiones puedenseleccionarse clulas, que conservan su morfolo"a, car!cter diploide se mantienen su capacidad de crecimiento, loque permite o#tener una cepa de clulas diploides, que al ca#o de un n&mero limitado de pases puede morir o dar

lu"ar a al"unas clulas mu alteradas en cuanto a morfolo"a dotacin "entica, que presentan la propiedad decrecer m!s r!pidamente de manera continua re"ular, son las lneas celulares. $stos tres tipos de cultivos celularesson los m!s utilizados en virolo"a:


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' %ultivos celulares primarios: %onsisten en el cultivo de clulas aisladas procedentes de te(idos normales. Lasclulas son de dos tipos, poli"onales de tipo epitelial o alar"adas de tipo fi#ro#l!stico su capacidad de multiplicacines mu limitada. Los cultivos de clulas de ri)n de mono de diversas clulas em#rionarias son los m!s empleados.$s el mtodo m!s costoso, pero las clulas presentan un amplio espectro de sensi#ilidad.

' %ultivos secundarios: %lulas epiteliales de cultivos celulares primarios su#cultivadas tratadas con tripsina la dispersin de una monocapa primaria.

' %epas de clulas diploides: %ultivo seriado in vitro clulas diploides normales. Su sensi#ilidad a los virus esmaor que la de las clulas adaptadas. Presentan la venta(a de no llevar virus latentes, ni estar infectadas por

micoplasmas.

' Lneas celulares heteroploides: %lulas al cultivo indefinido o *inmortalizadas* in vitro, de manera que sepueden pasar de tu#o a tu#o de cultivo, sin tener que recurrir al te(ido u r"ano del que proceden. Las clulasadaptadas han experimentado una mutacin en virtud de la cual presentan caracteres seme(antes, cualquiera quesea su procedencia. Son de aspecto epitelial su sensi#ilidad a los virus est! mu limitada. La maora de ellas sederivan de carcinomas epiteliales humanos o de clulas transformadas de otro modo.

- Cultivos de rganos:Son cortes de r"anos em#rionados, que en un medio adecuado pueden mantener suestructura funciones durante un corto periodo de tiempo.

La deteccin del desarrollo del virus puede reconocerse por las si"uientes manifestaciones:

- Por su accin citoptica,los virus pueden producir diversas alteraciones de las clulas del cultivo monocelularque muchas veces son caractersticas. $n la capa monocelular se o#serva que las clulas alteradas se redondean


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se retraen. La o#servacin de estas lesiones puede efectuarse a en fresco o en preparaciones te)idas en tu#os deLei"hton.

-Por la aparicin de componentes del virus en el medio de cultivo , en especial de hema"lutininas o deant"enos fi(adores del complemento.

- Por hemadsorcin o fijacin de los glbulos rojosSe presenta con los virus hema"lutinantes.

- Por inmunofluorescencia, por la presencia del virus o sus ant"enos en las clulas mediante el empleo de unsuero inmune marcado con sustancia fluorescentes

- Por interferencia: el primer virus #loquea el desarrollo del se"undo virus e interfieren con l.

+todo para la demostracin de placas de destruccin celular de esta manera, cada virin se multiplica produce unpeque)o foco o clon de clulas infectadas, que a los pocos das se o#serva a simple vista como un !rea o placa dedestruccin celular.

!edios

Soluciones concentradas o en forma de polvo o un medio esencial mnimo +$+ que puede someterse al autoclave.e#e compro#arse la esterilidad el p/ de todos los medios antes de ser utilizados.

Las soluciones salinas equili#radas de /an0s $arle sirven de #ase para la maora de los medios son diluentes"enerales excelentes en el la#oratorio de #iolo"a. ifieren en la capacidad amorti"uadora. La solucin de /an0s es&til en los medios de crecimiento donde los cultivos ocasionan cantidades #a(as de !cidos. %uando es necesaria unamaor capacidad de amorti"uacin puede ser &til el amorti"uador de tris o tricina.

$l ro(o fenol, indicador del p/ atxico es de oclor p&rpura a un p/ de 1,2 amarillo a un p/ de 3,1 o por de#a(o.

"eactivos

Se prefiere la solucin salina equili#rada SS$ de /an0s, que contiene penicilina 4 acuosa en una concentracin de5666 78ml, "entamicina a 6,9 m"8ml anfotericina a una concentracin 56 micro"8ml. %uando est! con"elada es

esta#le durante varios meses.

$l #icar#onato sdico al 1,1;, se prepara en a"ua. ? solucin 4@A

Preparacin de muestras

- #rotis:Se a"itan vi"orosamente en =ml del medio de transporte, se exprimen en un lado del tu#o se eliminan. Lasolucin se puede de(ar a temperatura am#iente durante B6 minutos o #ien filtrarla a travs de un filtro de una (erin"ade 6,29. $n los tu#os de cultivo hstico se colocan porciones de 6,9 ml. Los tu#os inoculados se colocan en un tam#ora"itador durante 5 hora para permitir la adsorcin del virus volviendo a a)adir un medio de mantenimiento.

- Heces:=" de heces con 5= ml de la SSe de /an0s con ati#iticos en un tu#o de centrifu"adora se mantiene atemperatura am#iente durante B6 minutos se centrifu"a la solucin a B966 rpm durante 59 minutos se inoculan 6,=ml de so#renadante.

- $rina:Se a)aden 6,9 ml de SS$ de /an0s con anti#iticos a = ml de la muestra se inoculan 6,= ml en los tu#osde cultivo hstico lo m!s pronto posi#le. $s aconse(a#le proceder a cam#iar el medio a las 53 a =2 horas despus dela inoculacin.

- %&'uido cefalorra'u&deo:6,= ml de L%C directamente en los tu#os de cultivo hstico sin otro tratamiento previo se manipula en la forma descrita.

-(ejido: Se trituran de 5 a = " en un almirez para te(idos, de pDrex, se prepara una suspensin con SS$ de /an0s

con anti#iticos.

C)%(*+$ +*").


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+uchos virus pueden desarrollarse en cultivos celulares o en huevos frtiles en condiciones estrictamentecontroladas. Si"ue recurrindose al crecimiento de los virus en animales para el aislamiento primario de al"unos deellos, para los estudios de la pato"enia de las enfermedades virales de la onco"nesis viral. $n los la#oratorios dedia"nstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para esta#lecer los aspectos etiol"icos de lasenfermedades. $n los la#oratorios de investi"acin se cultivan virus como #ase de los an!lisis detallados de laexpresin la replicacin virales.

La disponi#ilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin el cultivo de virus recin aislados lacaracterizacin de los que a se conocan. /a tres tipos #!sicos de cultivo celular. Los cultivos primarios se efect&an

mediante dispersin de clulas por lo "eneral con tripsina de te(idos huspedes recin extirpados. $n "eneral nopueden crecer m!s all! de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos secundarios. Las lneas celulares diploidesson cultivos secundarios que han experimentado un cam#io que permite su cultivo limitado hasta 96 pasos, peroque retienen su patrn cromosmico normal. Las lneas celulares continuas son cultivos capaces de crecimiento m!sprolon"ado, quiz! indefinido, que se han o#tenido de lneas celulares diploides o de te(idos mali"nos.Envaria#lemente tienen n&meros alterados e irre"ulares de cromosomas. $l tipo de cultivo celular que se emplee paracultivar virus depende de la sensi#ilidad de las clulas a tal virus particular.

Edentificacin de clulas infectadas por virus: $s posi#le vi"ilar la multiplicacin de un virus de diversas maneras:

l. esarrollo de efectos citop!ticos, es decir, cam#ios morfol"icos en las clulas. Los tipos de efectos citop!ticosinducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares, formacin de inclusiones, formacin de clulas "i"antes vacuolizacin citopl!smica. La maor parte de los virus producen al"&n efecto citop!tico manifiesto en las clulasinfectadas que es, en "eneral, caracterstico del "rupo del virus.

=. ?paricin de una protena codificada por el virus, como la hema"lutinina del virus de la influenza. Se puedenemplear antisueros especficos para identificar la sntesis de protenas virales en las clulas infectadas.

B. ?dsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin, a causa de la presencia dehema"lutinina codificada por el virus parainfluenza, influenza en las mem#ranas celulares. $sta reaccin se vuelvepositiva antes que sean visi#les los cam#ios citop!ticos , en al"unos casos, ocurre en ausencia de stos.

2. Enterferencia por un virus no citopat"eno por e(emplo, el de la ru#ola con la replicacin e induccin de efectoscitop!ticos por un se"undo virus de car"a por e(emplo, echovirus que se a)ade como indicador.

9. >ransformacin morfol"ica por un virus onc"eno por e(emplo, virus del sarcoma de Cous, que sueleacompa)arse de prdida de la inhi#icin de contacto acumulacin de clulas en focos definidos.

urante la multiplicacin de los virus en el interior de las clulas, pueden producirse estructuras especficas de virus,denominadas cuerpos de inclusin. $stas estructuras lle"an a ser mucho m!s "randes que las partculas individualesdel virus, a menudo muestran afinidad para los colorantes !cidos por e(emplo, la eosina. Pueden situarse en eln&cleo herpesvirus, en el citoplasma poxvirus o en am#os virus del sarampin. $n muchas infecciones virales,los cuerpos de inclusin son el sitio de desarrollo del virin la f!#rica del virus. $n al"unas infecciones poxvirus,reovirus, el cuerpo de inclusin consiste en masas de partculas virales en el proceso de replicacin. ?un en otroscasos m!s, como en el cuerpo de inclusin intranuclear del herpes, el virus se multiplica en una etapa m!s tempranade la infeccin el cuerpo de inclusin parece ser un producto residual de la multiplicacin viral. Las variaciones en elaspecto del material de inclusin, dependen de la composicin del fi(ador tisular empleado.

La presencia de cuerpos de inclusin puede ser de considera#le utilidad en el dia"nstico. Las inclusionesintracitopl!smicas de las clulas nerviosas, denominadas cuerpos de Ae"ri, son pato"nomnicas de la ra#ia.


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A*.%A!*/($ 0 C)%(*+$ A1/(. +*"A%.

? diferencia de la maora de #acterias con la excepcin de las %hlamdias Cic0ettsias hon"os, los virus sonparsitos intracelulares obligados incapaces de crecer en medios de cultivo simples por enriquecidos que ellosseanF esto es de#ido a que los virus requieren para su multiplicacin de la inte"ridad de la maquinaria #iosinttica dela clula. Enicialmente se utiliz como mtodo de aislamiento replicacin viral los animales de la#oratorio ratn,hamster o cone(o los em#riones de pollo. $l aislamiento de los virus requiere del uso de lneas celulares que entrminos "enerales se conoce como cultivode c2lulas. Gue hasta el inicio de la dcada de los 96 que H.G. $nders cola#oradores pudieron desarrollar sta tcnica con ell su#secuente desarrollo de la caracterizacin de partculasvirales la produccin de vacunas a partir de la atenuacin o inactivacin de "randes cantidades de virus que "raciasa este descu#rimiento lo"raron o#tenerse.Si en el campo de la #acteriolo"a tenemos diferentes medios de cultivo, en el campo de la virolo"a este hecho esmucho mas determinante, no todos los virus crecen en un mismo tipo de clula, porque como a ha#amos se)aladopreviamente es necesario para que el virus entre al interior de la clula que esta sea permisiva esta posi#ilidad est!

marcada por el tipo de protenas que se expresan en la superficie de mem#rana celular. $n otros trminos esnecesario que las clulas a ser infectadas posean una unidad receptora celular que reconozca las protenas de uninde la partcula viral. Para que una lnea celular pueda mantenerse via#leF es decir viva, sana permisiva se requierende medios qumicos que poseen los nutrientes necesarios para la multiplicacin celular sales, "lucosa, vitaminas,coenzimas, vitaminas, factores de crecimiento, amino!cidos, etc. $stos medios esenciales tam#in requieren quesean isotnicos, con un p/ cercano a I.2. e#ido a la produccin de meta#olitos txicos fruto del meta#olismo


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celular de#e realizarse cam#ios peridicos del medio de cultivo celular para "arantizar de esta manera la presenciade los requerimientos necesarios para el meta#olismo de la clula. Por su contenido el medio de cultivo celular estam#in un caldo mu apto para el crecimiento de microor"anismos presentes en la muestra clnica o facilmenteo#tenidos durante la manipulacin de la lnea celular, razn por la cual en muchos la#oratorios se le adicionananti#iticos antimicticos en concentraciones inhi#itorias del crecimiento micro#iano, pero que carecen de txicidadpara las clulas.

Los medios de cultivo carecen de al"unos factores de crecimiento celular que impiden una r!pida proliferacin de lasclulas cultivadas, por sta razn se requiere de la adicin de al"unos de estos factores presentes en el suero fetal

#ovino, para la maora de estos factores su naturaleza no es conocida.

$xisten distintos tipos de lneas celulares como veremos a continuacin:

Cultivo celular primario: en el cual las clulas se o#tienen a partir de los te(idos frescos de animales de la#oratorio.Las clulas se dis"re"an en clulas individuales "racias a la accin de varias enzimas hidrolticas como la tripsina ola pronasa. $ste tipo de clulas tiene como venta(a ell poder soportar una amplia "ama de tipos virales comodesventa(a el no soportar m!s que un limitado n&mero de divisiones celulares.

Cultivo de c2lulas diploides: las clulas diploides poseen un "enoma presente en dos (ue"os homlo"os. $stasclulas tienen una maor capacidad de divisin celular mantienen el n&mero ori"inal de cromosomas. Son &tiles anivel de dia"nstico de produccin de vacunas.

Cultivo de c2lulas continuas: estas son clulas que se han inmortalizado o que son inmortales por ser ori"inariasde clulas tumorales o por mutacin realizada so#re clulas diploides. ?l"unas derivan de te(idos humanos pero la"ran maora son ori"inadas en otras especies de animales o aun de insectos. Las lneas celulares mantienen in vitrouna morfolo"a que les es caracterstica, #a(o la influencia de la infeccin viral adquieren una serie de cam#ios citlisis, redondeamiento, formacin de clulas multinucleadas o de ac&mulos celulares o sincitios que conformanlo que se conoce como efecto citoptico que constituen un valioso elemento de dia"nstico viral. Si #ien esteefecto es caracterstico del tipo viral puede tam#in corresponder a varios a"entes virales no es caracterstico devariantes de estas familias virales. Por otro lado no siempre la partcula viral va a ocasionar efecto citop!tico lapresencia del virus se determina en forma indirecta por medio de hema"lutinacin o hemadsorcin,inmunofluorescencia o mediante el fenmeno de interferencia viral usando partculas virales con efecto citop!ticoconocido so#re la lnea celular utilizada.

A.PC($. )%("A.(")C()"A%. %A */#CC*3/ % +*"). A.$C*A$ C$/ ."A.

$l uso del microscopio electrnico para el an!lisis de te(idos en diferentes infecciones virales representa uninstrumento sensi#le que no requiere de reactivos especficos para la localizacin viral las alteraciones producidas anivel celular. Los estudios acerca de los aspectos ultraestructurales del coronavirus asociado al SC?S se hanrealizado principalmente en cultivos celulares, lo que es una herramienta importante para el an!lisis de los hallaz"osa nivel del te(ido humano. +ediante la tcnica de tincin ne"ativa, el virus asociado a SC?S se presenta como unapartcula redonda u oval con un di!metro de 36 a 5=6 nm. $st! cu#ierto por una estructura formada porprotu#erancias de 56 a =6 nm separadas por hendiduras. $sta estructura corresponde a la reportada para loscoronavirus Gi". 5? 2I. $studios realizados en clulas Jero $3 despus de ser infectadas por virus o#tenido depacientes con SC?S, muestran en los primeros B6 minutos, a los virus alineados en la superficie celular Gi". 5Fstos pasan al interior de la clula mediante fusin de sus envolturas con la mem#rana celular o por endocitosis.

Los nucleoc!psidos penetran al citoplasma en "randes vacuolas 21. Las clulas infectadas presentan el efectocitop!tico caracterizado por la presencia de muchas vesculas citoplasm!ticas vacas, disminucin del n&mero demitocondrias ruptura de las mem#ranas mitocondriales internas externas. $l retculo endopl!smico disminue seedematiza 2I. Las vesculas sacos transversales del aparato de 4ol"i proliferan contienen en su interiorpartculas virales en diferentes estados de maduracin. Parte de las vesculas citoplasm!ticas contienen partculasvirales Gi". 5% se localizan cerca de la mem#rana celular externa para li#erar virus por exocitosis 2K. Lasvesculas que contienen estos virus son llamadas vesculas relacionadas con la morfo"nesis viralM J+J, porquese sospecha que all se ensam#lan los virus Gi"s. 5% 2I. ?l"unas partculas virales pueden encontrarsepe"adas en la mem#rana celular formando arre"los cristalinos 2K. La cromatina nuclear se encuentra acumulada a"re"ada en la parte interna de la mem#rana nuclear, o#serv!ndose la presencia de "r!nulos en el n&cleo. ?l"unaspartculas virales se pueden encontrar en la matriz nuclear. $stas se presentan como nucleoc!psidos electrondensosrodeados de un halo claro Gi"uras 5G 4. La cisterna perinuclear se puede presentar edematizada con la presenciade sacos que contienen varias partculas virales Gi". 5/. $n #ase a estos datos morfo"nicos, se hipotetiza que las

partculas virales inmaduras apareceran en las J+J en donde se ensam#laran con el !cido nucleico, hacindosem!s "randes electrondensas. espus de lo cual los virus adquieren su envoltura "emando a travs de estasvesculas o del retculo endopl!smico Gi". =? con posterior salida de la clula. Si #ien se descri#e que loscoronavirus se duplican ensam#lan en el citoplasma 96, 95, la presencia del virus en el n&cleo en la cisternaperinuclear hace pensar que el virus asociado a SC?S puede representar un nuevo coronavirus que su sitio deensam#la(e morfo"nesis puede ha#er cam#iado 2I. Los estudios realizados en humanos afectados por SC?S
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han demostrado la presencia de virus relacionados con los coronavirus extra e intracelularmente en diferentes te(idos lavados #ronquiales Gi"ura = % K. Se han encontrado inclusiones virales en el citoplasma del epitelio alveolar macrfa"os alveolares en el endotelio de los vasos peque)os con un di!metro de 16-536 nm 9=-92.

Gi". 5. ? >incin ne"ativa del virus asociado con el SC?S. Jiriones en la parte externa de una clula, la flechase)ala a una partcula viral tpica con su envoltura. % Jiriones en vesculas relacionadas con la morfo"nesis viralJ+J, ntese la presencia de partculas virales adoptando un patrn seme(ante a un ptalo flecha. J+Js conmem#ranas claras flecha. $ Jescula citoplasm!tica mostrando en su interior viriones. Atese la presencia de unapartcula viral con su envoltura flecha. G Partculas virales dentro de vesculas citoplasm!ticas flecha en eln&cleo flecha en cruz. 4 Partculas virales en el n&cleo flecha. / Presencia de partculas virales en la cisternaperinuclear flecha. arras: 566 nm =K.
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0535-51332005000100009&script=sci_arttext#fig2%23fig2http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0535-51332005000100009&script=sci_arttext#fig2%23fig2


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Gi". =. ? Partculas virales "emando dentro del reticuloendoplasmico flecha dentro de la cisterna en clulas Jero$3. La ca#eza de flecha muestra las protu#erancias de la envoltura viral. clulas con efecto citop!tico partculasvirales o#tenidas del lado #ronquial de una paciente con SC?S. La flecha "ruesa se)ala un ac&mulo de viriones, elcual se encuentran amplificados en %. arra: 566 nm. K.

Los leucocitos de san"re perifrica pueden tam#in ser afectados por el virus. Se ha demostrado la presencia departculas virales asociadas a coronavirus, especialmente en linfocitos > de san"re perifrica en donde los virus sereplican 2I, 99. Si #ien se ha reportado afectacin hep!tica durante el SC?S evidencia de la presencia delant"eno viral a travs de C>-P%C, no se han encontrado partculas virales, mitocondrias "i"antes o aumento deln&mero de micro o macro vesculas en el te(ido hep!tico =I. >am#in se ha reportado la presencia de partculasvirales en las clulas del intestino "rueso del"ado en pacientes con SC?S 5I. La presencia de apoptosis lainfiltracin de monocitos es un fenmeno "eneral en el SC?S. $l virus induce apoptosis en celulas > del pulmn,

#azo ndulos linf!ticos, disminuendo los mecanismos de defensa inmunitarios 2I.

TCNICAS PARA AISLAR LOS VIRUS. Los virus al infectar, se distri#uen por diferentes partes del or"anismo. ?partir de al"uno8s de su8s componente8s, es que se intenta aislarlo para lue"o identificarlo. Los materiales en "eneralson: san"re de sta, lo que se denomina suero, orina, materia fecal, lquido cefalorraqudeo lquido que se o#tienepor puncin entre las vrte#ras de la columna verte#ral, lesiones en la piel o "ar"anta, etctera.


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? partir del material seleccionado es que se intenta el aislamiento usando la tcnica que "eneralmente est! indicada.$llas son: cultivo celularen el la#oratorio se puede o#tener clulas que forman una capa, simulando un te(ido. ?lponer en contacto con las clulas el material a investi"ar, si ste contiene un virus, se pondr! de manifiesto unaalteracin de las clulas, producida por el virus, que como a se se)al, son par!sitos o#li"ados de las clulas porello se produce la alteracin. $n el lquido que #a)a las clulas medio de cultivo se encontrar!n los virus.


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#igura 9.Ema"en a +$tincinne"ativa departculas

virales decoronavirusaislado encultivo declulas de unpaciente conS?CS.

Fotografa 5.Cultivo celular CH.-96;< infectado conP. salmonis: Las clulas del cultivo presentanvacuolas citoplasm!ticas en cuo interior se o#serva la presencia de microor"anismos cocoidescorrespondientes a P. salmonis. 5666N.

A*.%A!*/($ +*"A%

*noculacin de Cultivos Celulares

*noculacin de Animales de %aboratorio

Aislamiento +iral

6 *noculacin de Cultivos Celulares

$ste mtodo de "ran sensi#ilidad para al"unos a"entes virales, consiste en poner en contacto el material sospechosocon cultivos celulares suscepti#les, para que el virus se multiplique pueda detectarse su presencia por efectocitop!tico $%P u otros mtodos inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, hemoadsorcin, etc.

5.5.Procesamientos de las muestras

a


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# /isopados: una vez suspendido el material reco"ido en medio de cultivo celular con anti#iticos566N se elimina el hisopo la suspensin se centrifu"a a B666 rpm durante =6 minutos a 2O%. $lso#renadante se constitue el inculo para cultivo celular.

c Lquidos transcelulares: cefalorraqudeo, sinovial, etc. de#en centrifu"arse a B666 rpm, durante =6minutos a 2O%, utiliz!ndose el so#renadante como inculo para cultivo celular.

d San"re: de#e emplearse entera aunque puede diluirse 5856, en medio de cultivo celular a fin dedisminuir su citotoxicidad. Si se sospecha de una asociacin viral con po#laciones celulares, es conveniente

separar la fraccin celular lue"o inocular el cultivo celular.

e Semen: se dilue la pastilla 8o pa(uela 5856 en medio de cultivo celular, esta solucin constitue elinoculo para los cultivos. La toxidad del material seminal determina que lue"o de un perodo de adsorcin de36 minutos de#e descartarse el inculo de#e lavarse la monocapa con medio de cultivo celular B veces.

f +aterial fecal: se macera resuspende la materia fecal en medio de mantenimiento 5856 p8v. Seclarifica por centreifu"acin a 9666 rpm, =6 minutos a 2O% el so#renadante se trata con una solucin detripsina 56 u"8ml. 5 hora a BIO%, inoculando lue"o el so#renadante en cultivo celular.

5.=.Enoculacin de los cultivos

Se emplean cultivos en monocapa, primarios o de lnea, suscepti#les al virus que se desea aislar ver cuadro5 con m!s de un I9; de la superficie cu#ierta en envases adecuados. Para este propsito se emplean tu#os deLei"hton o de ensao comunes con laminillas de vidrio en su interior placas de =2 ells L?>$@'. $stos cultivosde#en estar li#res de virus anticuerpos que interfieran con los virus que se desea investi"ar. Por e(emplo, esfrecuente que los cultivos primarios o de lnea puedan estar infectados con cepas no citopato"nicas de JJ o elsuero #ovino que se usa en el medio de crecimiento pueda tener anticuerpos 8o virus.

Seleccionados los cultivos, se procede a :

Enoculacion de la muestra 5Q pasa(e , utilizando no menos de B tu#os o ells por muestra de material,descartando el medio de crecimiento, se inoculan con 6,= ml de suspensin pro#lema por tu#o o 6,5 ml por cadaorificio de placa x =2. $n estas condiciones se incu#an a BIO% durante 29-36 minutos para facilitar la adsorcin del

virus. %umplimentado este perodo se de#e volcar el inculo realizar = lavados con medio de mantenimiento,particularmente en el caso de materiales mu txicos para la clulas como san"re, +G, semen, #azo, h"ado, etc.Lue"o se incorpora 5,1 - = ml de medio de mantenimiento celular por tu#o o 5ml por cada orificio de la placa seincu#a a BIO%. Se o#servan diariamente al microscopio durante I das para la deteccin de $%P. Si no se detectapresencia viral al microscopio, se de#e realizar un nuevo pasa(e en cultivo celular pasa(e cie"o.

Se"undo pasa(e: se con"ela la muestra a R=6Q% durante 5 8- 58= hora se descon"ela a BIQ% J,EC deser necesario se clarificar! por centrifu"acin. Se procede a inocular como en el primer pasa(e. Se considerane"ativo si cumplido el perodo de incu#acin de este se"undo pasa(e Idias no se detecta presencia viral , para elcaso de EC, o se hace otro pasa(e BQ pas. en el caso de JJ.

?l finalizar el procesamiento de las muestras, se de#en realizar los controles en tu#o o placa aparte, positivo: seinocula el virus referencia conteniendo 566 E%> 96 el ne"ativo sin el a"re"ado viral. %onsiderar que si el control

positivo no presenta $%P en el tiempo estimado 8o las celulas del control ne"ativo se presentan anormales o consi"nos de toxicidad el aislamiento de#e ser repetido.

5.B. Edentificacin Jiral

Para confirmar la replicacin viral esta#lecer con certeza su identidad, para ello se puede recurrir a variastcnicas que, haciendo uso de reactivos de referencia, sirven para este fin: seroneutralizacin, fi(acin decomplemento, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, $LES? o hemoadsorcin descriptas en otros captulos.

9 *noculacin de Animales de %aboratorio

Se inocula animales de la#oratorios ratones, cone(os, co#aos, etc. suscepti#les a la infeccin por el a"ente

viral cua presencia se sospecha. $ste se multiplicar! en el hospedador experimental con la produccin de diferentesintomatolo"a, hasta en al"unos casos puede causarle la muerte.


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$s un mtodo sencillo, sensi#le r!pido aunque son pocos los virus animales de nuestro inters que poseenhuspedes de la#oratorio suscepti#les ver %uadro 5. Ao o#stante, constitue una importante tcnica en laidentificacin caracterizacin de a"entes dia"nstico diferencial.

=.5. +ateriales +todos

Procesamiento de la muestra.

Edem 5.5

=.5.5. Enoculacin de Catn Lactante

a Ja Entracere#ral: el punto de inoculacin es la interseccin de dos lneas una que va desde el o(o ala ore(a la otra perpendicular a esta lnea cort!ndole por el centro. Se utiliza a"u(a (erin"a de tu#erculinacon dosis menor a 6,6= ml.

# Ja Entramuscular: se realiza la inoculacin en la masa muscular del miem#ro posterior, aspirandopreviamente pra ase"urarse de no estar en vena. Se utiliza a"u(a (erin"a similar al anterior.

c Ja intraperitoneal: su(etando el animal por la piel de la nuca con el ndice pul"ar con el resto delos dedos por los miem#ros posteriores cola, se lo presenta de cito dorsal para inocularlo en un punto dellado derecho centro del a#domen. Se utiliza a"u(a (erin"a de tu#erculina.

=.5.=. Enoculacin de huevos em#rionados

Se seleccionan huevos de planteles li#re de infecciones virales, o#serv!ndolos en un ovoscopio o coniluminacin adecuada.

e acuerdo al a"ente viral que se sospecha, ser! la va de inoculacin por ende, la edad del em#rin vercuadro 5 a utilizar.

%uadro 5

?islamiento viral

%7L>EJ< $ >$HEpe B PE-B

CG->G +@7C.

ovine?denovirus?dJ

CG->G +@7C.

Goot and +ouseisease G+J

CG->G>irG

/@

+@

ECS=

7C

Catn lactante im., ic. o ip%o#ao adap

Jesicular $P.


13/16

Stomatitis JirusJSJ %$CJ

J$C$CE?L$S D +U>?


16/16

ese periodo se o#serv si viva, se cuid de que no se pe"ara el em#rinF al a#rirse el huevo, se o#serv elpro"reso del virus inoculado en el em#rin, o#serv!ndose la mem#rana de la c!mara de aireF en nuestro huevo no seo#serv nada anormal, se"uramente porque no fue suficiente tiempo para que el virus actuara, no creemos que haasido en el proceso inoculacin porque se hizo mu #ien, con las medidas pertinentes, aunque puede ser otraposi#ilidad. $n el huevo de otros, se o#serv la mem#rana opaca de color #lanco.

%

cultivos de los virus.doc

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