deneysel sİyatİk sİnİr yaralanmasinda betametazon ve sİnİr … · deneysel siyatik sinir...

TC ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DENEYSEL SİYATİK SİNİR YARALANMASINDA

BETAMETAZON VE SİNİR BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN SİNİR

REJENERASYONUNA ULTRASTRÜKTÜREL ETKİLERİ

LEMAN SENCAR

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof. Dr. Sait POLAT

ADANA-2007

TC ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ-EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DENEYSEL SİYATİK SİNİR YARALANMASINDA

BETAMETAZON VE SİNİR BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN SİNİR

REJENERASYONUNA ULTRASTRÜKTÜREL ETKİLERİ

LEMAN SENCAR

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof. Dr. Sait POLAT

Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TF2005YL11 nolu proje olarak desteklenmiştir.

Tez No:….

ADANA-2007

iii

TEŞEKKÜR

Yüksek lisans eğitimim sırasında beni her konuda destekleyen, tez konumun

seçilmesi, yürütülmesi ve tamamlanmasında yardımlarını esirgemeyen, danışman

hocam Sayın Prof. Dr. Sait Polat’a sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, tez

çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen, Biyokimya Anabilim Dalı Öğretim

Üyelerinden Sayın Doç. Dr. Abdullah Tuli’ye, Diş Hekimliği Fakültesi Öğretim

Üyelerinden Sayın Yrd. Doç. Dr. Mehmet Kürkçü’ye, Biyofizik Anabilim Dalı

Öğr.Gör.Dr. Mustafa Güven ve Arş.Gör.İbrahim Kahraman’a ve Biyoistatistik

Anabilim Dalı Öğr.Gör.Dr. Yaşar Sertdemir’e sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı

sunarım. Eğitimim sırasında, bana her zaman destek olan ve yardımlarını esirgemeyen

Anabilim Dalımızın bütün Öğretim Üyelerine şükranlarımı sunarım. Ayrıca tezimin

hazırlanmasında emeği geçen Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı’nın bütün akademik

ve idari personeline de teşekkür ederim.

Yaşamım boyunca her zaman yanımda olan, beni yüreklendiren, her koşulda

destekleyen anneme ve babama, hayatımdaki en değerli varlık olan kardeşim İlhan’a

çok teşekkür ederim.

Arş.Gör.Leman SENCAR

iv

İÇİNDEKİLER

KABUL VE ONAY TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi SİMGELER VE KISALTMALAR viii ÖZET ix ABSTRACT xi 1.GİRİŞ 1 2.GENEL BİLGİLER 3 2.1. Periferik Sinir Histolojisi 3 2.2. Periferik Sinir Yaralanmaları 4 2.3. Sinir Yaralanmalarının Sınıflandırılması 5 2.4. Yaralanma Sonucu Sinirde Meydana Gelen Değişiklikler 6 2.4.1. Yaralanmayla Beraber Sinir Distalinde Meydana Gelen Değişiklikler 7 2.4.2. Sinir Proksimali ve Hücre Gövdesinde Meydana Gelen Değişiklikler 8 2.5. Schwann Hücreleri ve Rejenerasyondaki Rolleri 9 2.6. Nörotropik Faktörler 10 2.7. Periferik sinir yaralanmaları ve steroid maddeler 12 3.GEREÇ VE YÖNTEM 14 3.1. Deney hayvanlarının elde edilmesi ve gruplara ayrılması 14 3.2. Operasyon 14 3.3. Tedavinin uygulanması 14 3.4. Biyopsilerin alınması 15 3.5. Elektron Mikroskopi Yöntemleri 15 3.6. Biyokimyasal Analiz Yöntemi 16 3.6.1. Malondialdehit Analizi 17 3.6.2. Süperoksit dismutaz Analizi 17 3.7. Histomorfometrik Yöntemler 17 3.8. Footprint Analizi 17 3.9. İstatistik 18 4.BULGULAR 19 4.1. Histolojik ve elektron mikroskobik bulgular 19 4.1.1. Sağlam grup 19 4.1.2. Deney kontrol grubu 25 4.1.3. NGF grubu 34 4.1.4. Betametazon grubu 42 4.1.5. NGF+Betametazon grubu 48 4.2. Biyokimya Bulguları 55 4.3. Footprint Analizi Bulguları 57 4.4. Histomorfometrik Bulgular 58 5.TARTIŞMA 61

v

6.SONUÇLAR 69 7.KAYNAKLAR 71 8.ÖZGEÇMİŞ 74

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

ŞEKİL 1: Sağlam gruptan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.

ŞEKİL 2: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.



ŞEKİL 5: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.

ŞEKİL 6: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.




ŞEKİL10:Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.

ŞEKİL11:Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.

ŞEKİL 12: NGF grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.

ŞEKİL 13: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.





ŞEKİL 18: Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü.

ŞEKİL 19: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü.



ŞEKİL 22: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. ŞEKİL 23: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 24: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 25: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 26: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. ŞEKİL 27: Tüm gruplardan elde edilen malondialdehit seviyeleri.

ŞEKİL 28: Tüm gruplardan elde edilen süperoksit dismutaz aktiviteleri.

vii

ŞEKİL 29: Tüm gruplara ait footprint analiz sonuçları.

ŞEKİL 30: Tüm grupların ortalama miyelinli sinir lifi sayıları.

ŞEKİL 31: Tüm grupların ortalama akson çapları.

ŞEKİL 32: Tüm grupların ortalama miyelin kılıf kalınlıkları.

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

BDNF Beyin kökenli sinir büyüme faktörü CNTF Silyar kökenli sinir büyüme faktörü GDNF Glia kökenli sinir büyüme faktörü kDA Kilodalton LIF Lösemi inhibitör faktör MBP Miyelin temel proteini MDA Malondialdehit Ngr Nöroregülin NGF Sinir büyüme faktörü NT-3 Nörotropin-3 NT-4 Nörotropin-4 NT-5 Nörotropin-5 P0 Protein sıfır PMP Periferal miyelin proteini SOD Süperoksit dismutaz TGF Transforming growth factor TSF 1-5. parmak açıklık oranı μm Mikrometre μg Mikrogram U/g prot Unit/gram protein

ix

ÖZET

Deneysel Siyatik Sinir Yaralanmasında Betametazon ve Sinir

Büyüme Faktörünün Sinir Rejenerasyonuna Ultrastrüktürel Etkileri

Periferik sinir yaralanması dünyada ciddi sağlık sorunlarından birisidir. Yaralanma sonucunda özellikle sinir distalinde önemli yapısal değişiklikler meydana gelmektedir. Periferik sinir rejenerasyonunda çeşitli faktörlerin etkileri geniş olarak araştırılmıştır. Rejenerasyonda, schwann hücrelerinin primer rolleri yanında, eksojen olarak uygulanan nörotropinler, nörokinler ve bazı büyüme faktörlerinin de yararlı etkileri açıklanmıştır. Sinir dejenerasyonunda, sinir büyüme faktörü (NGF) gibi pek çok nörotropik faktörün sentezlenerek retrograd iletimle perikaryona ulaştırıldığı ve nöronda iyileştirici etkiyi başlattıkları kabul edilmektedir. Sunulan çalışmada, deneysel siyatik sinir yaralanmasında, NGF ve betametazon uygulamasının etkilerinin, footprint analizi, ışık ve elektron mikroskopi, histomorfometri ve biyokimyasal yöntemlerle araştırılması amaçlandı.

Elli adet erkek Wistar sıçan random olarak, sağlam grup, deney kontrol grubu, NGF tedavisi uygulanan grup, betametazon tedavisi uygulanan grup, NGF+betametazon uygulanan grup olmak üzere beş gruba ayrıldı. Sağlam grup dışındaki hayvanların sağ siyatik sinirlerinde ezilme tipi yaralanma yapıldı Betametazon, operasyondan hemen sonra, betametazon grubu ve NGF+betametazon tedavisi uygulanan gruptaki hayvanlara subkütan yolla perioperatif bölgeye, 8 saat aralıkla 1 gün süreyle verildi. NGF ve NGF+betametazon tedavisi uygulanan gruba operasyondan hemen sonra NGF-β subkütan yolla perioperatif bölgeye 14 gün boyunca enjekte edildi. Operasyonu takiben 7, 14, 21, 28, ve 35. günlerde footprint analizleri yapıldı. Operasyondan 6 hafta sonra, tüm gruplardan elde edilen sinir doku parçalarında, malondialdehit (MDA) seviyesi ve superoksit dismutaz (SOD) aktivitesi ölçüldü, ışık, elektron mikroskobik ve histomorfometrik değerlendirmeler yapıldı. Sağlam grupta sinir liflerinin normal yapıda oldukları gözlendi. Deney kontrol grubunda, sinir liflerinin çoğunda akson ve miyelin kılıfın dejenere olduğu, miyelin kılıf lamellerinin birbirlerinden ayrıldıkları, aksonun büzüştüğü ve bazı liflerde ise tamamen dejenere olduğu dikkati çekmekteydi. Dejenerasyonun belirgin olduğu alanlarda, dejenere sinir lifleri ve miyelin kılıf yapılarını fagosite etmiş pek çok makrofajın varlığı gözlendi. Bu değişikliklerin, NGF ve betametazon uygulanan gruplarda nisbeten azaldığı, NGF+betametazon kombine tedavi uygulanan grupta ise, sinir liflerinin çoğunda normal yapının korunduğu dikkati çekti. Deney kontrol grubunda MDA seviyesinin arttığı, SOD aktivitesinin belirgin olarak azaldığı bulundu. NGF+betametazon tedavisinin uygulandığı grupta, SOD aktivitesinde yükselme, MDA seviyesinde azalma ile birlikte, anlamlı motor fonksiyonel iyileşme belirlendi. Ayrıca, kombine tedavi uygulanan grupta,

x

miyelinli sinir liflerinin sayısında, akson çapında ve miyelin kılıf kalınlığında belirgin artış kaydedildi.

Sıçanlarda ezilme tipi siyatik sinir yaralanması sonrası NGF, betametazon ve NGF+betametazon tedavisinin uygulandığı bu çalışmada, NGF ve betametozon tedavi gruplarında sinir rejenerasyonunun meydana geldiği, NGF+betametazon kombine tedavisinin uygulandığı grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD aktivitesinin arttığı, ayrıca sinir rejenerasyonu, miyelin kılıf oluşumu ve anlamlı motor fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştiği bulundu. Betametazonun antienflamatuvar ve antiödematöz etkisiyle yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine grupta gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle, NGF+betametazon kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının tedavisinde dikkate alınabileceği sonucuna varıldı.

Anahtar Kelimeler: Betametazon, Footprint analizi, Histomorfometri, Sinir büyüme faktörü, Siyatik sinir yaralanması, Ultrastrüktür.

xi

ABSTRACT

Ultrastructural Effects of Betamethasone and Nerve Growth Factor on

Nerve Regeneration After Experimental Nerve Injury

Peripheral nerve injuries are important health problem in the world. Injury

of a peripheral nerve leads to degeneration of distal nerve stump. Several neurotrophic agents have been evaluated for their efficacy in nerve injury. Furthermore, beneficial effects of neurotrophins, neurokines and some growth factors on the peripheral nerve injury were reported. After nerve degeneration, many of neurotrophic factors such as nerve growth factor (NGF), are synthesised in tissues and delivered to the neuronal soma via retrograde transport where they exert a trophic effect. In this study, the effects of NGF and betamethasone on the rat sciatic nerve crush injury were examined by footprint analysis, light and electron microscopic, histomorphometric and biochemical methods.

Fifty male Wistar rats were divided into five groups as intact, control, received NGF treatment, betamethasone treatment and NGF+betamethasone treatment. Nerve crush injury was performed on right sciatic nerve of the animals except the intact group. Immediately after injury, betamethasone was subcutenaously injected perioperative zone to the betamethasone and NGF+betametasone treatment groups three times during the first day. NGF-β was subcutenaously injected perioperative zone to the NGF and NGF+betamethasone groups for 14 days. Footprint analysis was made on 7, 14, 21, 28 and 35 days following the operation. After 6 weeks, sciatic nerve tissue samples were obtained and the levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. In addition, light and electron microscopic and histomorphometric evaluations were carried out. The structures of nerve fiber were seen normal in intact group. Most of the nerve fibers were revealed degeneration of the axon and myelin sheaths, separation of myelin lamellae and disintegration of axonal structures in control group. Additionally, numerous macrophages were encountered among the nerve fibers. Although some of these findings were also seen in NGF and betamethasone treatment groups, many of the nerve fibers were exhibited normal structures. Moreover, increase of MDA levels and decrease of SOD activities were found in control group. It was interesting that decrease of MDA levels and increase of SOD activities and significant motor functional recovery were observed in NGF+betamethasone received group. Furthermore, the number of the myelinated nerve fibers, axon diameter and myelin thickness were significantly greater in combined treatment group.

Although the nerve regeneration were seen in NGF and betamethasone groups, the decrease in lipid peroxidation and increase in SOD activities and significant nerve regeneration, myelin sheath formation and motor functional recovery were observed in NGF+betamethasone treatment group. Combination of

xii

nerve regenerative effect of NGF and anti-inflammatory and/or anti-edematous effects of betamethasone could be attributed to that improvement. In conclusion, combined therapy of NGF and betamethasone can improve functional recovery such a combination may be an effective approach for treatment of peripheral nerve injury.

Key words: Betamethasone, Footprint analysis, Histomorphometry, Peripheral nerve injury, Nerve growth factor (NGF), Ultrastructure.

1

1. GİRİŞ

Periferik sinir yaralanmaları, sinirde gerilme, ezilme ve kesilme nedeniyle

meydana gelmektedir.Yaralanmayla beraber sinirin distal ve proksimalinde önemli

histolojik değişiklikler ortaya çıkmaktadır.Yaralanma sonrası, ilk 6 saat içerisinde,

nöronun perikaryonunda çekirdek perifere doğru göç eder ve Nissl cisimciklerinin

yapıları bozularak, bütün nöroplazmaya dağılır. Yaralı bölgenin distalinde, akson ve

miyelin kılıfın fiziksel fragmantasyonu, nörotübül ve nörofilamanların düzensizleşmesi

ve sonuçta aksonal yapının tamamen bozulması ile karakterize olan Wallerian

dejenerasyonu meydana gelmektedir1-5.

Yaralanmadan sonra ilk 48-96 saat içinde akson devamlılığı kaybolur ve buna

bağlı olarak impuls iletimi bozulur. Aksonal dejenerasyonda Schwann hücrelerinin

rolleri bilinmektedir. Schwann hücreleri ve makrofajlar, dejenere miyelin kılıf ve akson

yıkıntılarını fagosite ederek, yaralanma bölgesini bir haftadan bir aya kadar değişebilen

bir süre içerisinde temizler2,6,7,8. Dejenerasyonun geç dönemlerinde, Schwann hücreleri

büyüyen akson filizlerine rehberlik eden Büngner bandlarını oluşturur. Bunların yanı

sıra, sinir yaralanmalarında, yaralı bölgeye komşu proksimal akson segmentinde de

önemli yapısal değişikliklerin oluştuğu rapor edilmiştir2,3,9,10.

Günümüzde, mikrocerrahi uygulamalarının yaygınlaşması, histolojik ve

immünohistokimyasal yöntemlerin gelişmesi, periferik sinir yaralanmalarında, sinir

onarımının başarısını büyük oranda arttırmıştır4. Periferik sinir yaralanmalarının

tedavisinde bugüne kadar, anastomoz, sinir graftları, nonnöral doku graftları, kombine

graftlar6, sinir konduitleri ve sentetik tüpler gibi pek çok yöntem uygulanmış ve bunların

sinir iyileşmesine olan muhtemel etkileri geniş olarak rapor edilmiştir11-13. Sinir

rejenerasyonunun arttırılmasında, başlıca nörotropik faktörler6,14,15,16, steroidler17,18,

hormonlar, çeşitli kimyasal maddeler ve düşük frekanslı manyetik alan uygulamalarının

etkinliği yapılan çalışmalarda rapor edilmiştir19.

Nörotropik faktörler; nörotropinler, nörokinler ve TGF-β üyelerini kapsayan,

nöronların yaşamını devam ettirmesi için ihtiyaç duydukları bir polipeptid ailesidir20. Bu

faktörler arasında en iyi tanımlanan ve nörotropin ailesinin bir üyesi olan NGF’nin,

nöronların yaşamını ve gelişmelerini desteklemesinin yanında, sinir yaralanmalarında

2

Schwann hücrelerinin proliferasyonunu arttırdığı ve aksonal rejenerasyonu hızlandırdığı

kaydedilmiştir4,12,16,20,21. Diğer taraftan, sinir yaralanmalarında, iskemi ve travmanın

etkisiyle oluşan ödem ve enflamatuvar reaksiyonların zararlı etkilerinin azaltılması ve

rejenerasyonun sağlanması amacıyla steroid tedavisinin yararlı olduğu bildirilmiştir17.

Bununla beraber literatürde periferik sinir yaralanmalarında, bir nörotropik faktör

olan NGF ve steroid yapısında bir madde olan betametazonun kombine etkilerinin

araştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada, sıçanlarda oluşturulan deneysel

ezilme tipi siyatik sinir yaralanması modelinde, NGF ve betametazonun ayrı ayrı ve

kombine etkilerinin, ışık, elektron mikroskopik ve biyokimyasal yöntemlerle

araştırılması amaçlandı. Ayrıca motor fonksiyonel iyileşmenin değerlendirilmesi

amacıyla hayvanlarda footprint analizleri22-24 de yapıldı.

3

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Periferik Sinir Histolojisi

Merkezi sinir sistemi ve periferal organlar arasındaki motor ve duyu uyarımını

sağlayan periferik sinirler, dıştan epinöryum olarak bilinen kalın fibröz bir bağ dokusu

ile sarılmışlardır. Epinöryumun altında sinir fasiküllerini çevreleyen ve perinöryum

olarak adlandırılan fibröz bağ dokusu yer almaktadır. Her bir sinir lifi (akson),

endonöryum adında, fibroblast ve kollajen liflerden oluşan daha ince bir bağ dokusu ile

örtülmüştür. Endonöryumda fibroblastların dışında, az sayıda mast hücreleri ve diğer

bağ dokusu hücrelerine de rastlanır. Endonöryumun altında Schwann hücreleri

tarafından oluşturulan nörilemma kılıfı yer alır. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann

hücre sitoplazması içerisine gömülü olarak yer alan akson etrafında, konsantrik lamellar

tarzında düzenlenen miyelin kılıf bulunmaktadır. Akson ile Schwann hücresi arasında

periaksonal boşluk adı verilen ve 20 nm kadar genişlikte bir boşluk yer almaktadır.

Aksolemma ile sarılı olan aksonda, az sayıda mitokondriyon, SER tübülleri ile çok

miktarda nörotübül ve nörofilamanlar bulunmaktadır25,26. Schwann hücreleri periferik

sinir sisteminin destekleyici hücreleridir4,25-27. Bu hücreler nöral krestten gelişirler.

Schwann hücrelerinin temel fonksiyonu hem miyelinli hem de miyelinsiz sinir liflerini

desteklemektir. Miyelin kılıf, aksonu endonöryumun ekstrasellüler kompartmanından

ayırmakta ve sinir impulslarının hızlı bir şekilde iletilmesini sağlamaktadır. Akson

tepeciği ile hedef hücrelerle sinapsların kurulduğu akson terminalleri miyelin kılıfa

sahip değildir. Schwann hücreleri miyelinsiz sinir liflerini de sarmaktadır. Bu hücreler

ayrıca, periferik sinir sistemindeki yıkıntıları temizler ve yaralanma veya kesilme

sonrası aksonların yeniden büyümesine rehberlik ederler2,4,7,10,14,27. Miyelin kılıfın

yapısında, protein sıfır (P0), periferal miyelin proteini (PMP) ve miyelin temel protein

(MBP) olarak adlandırılan membran proteinleri bulunmaktadır3,18,25,26. P0, miyelin kılıf

lamellerinin sıkıca bir araya gelmesinden sorumlu esas yapısal miyelin proteinidir. P0

proteini, miyelinizasyon sırasında plazma membranında eksprese olan 30 kDA

ağırlığında bir hücre yapışma molekülüdür. Bu transmembran glikoprotein, karşılıklı iki

membran tabakası arasında güçlü bir adhezyon sağlar ve periferik sinir miyelininin

4

anahtar yapısal komponentidir. Yapısal ve genetik çalışmalar P0 proteinini kodlayan

genlerdeki mutasyonların demiyelinizan hastalıklara yol açabileceğini işaret etmektedir.

Miyelinizasyonda, miyelin kılıfın kalınlığı Schwann hücreleri tarafından değil,

akson çapı tarafından belirlenmektedir. Dolayısıyla, miyelin oluşumu, akson ve

Schwann hücresi arasındaki fonksiyonel ilişki sonucunda gerçekleşmektedir. Miyelin

kılıf kalınlığının düzenlenmesi, nöroregulin (Ngr1) adı verilen bir büyüme faktörüne

bağlıdır. Ngr1, aksonun nörolemması üzerinden salınan bir transmembran proteini olup,

Schwann hücrelerinin uygun kalınlıkta miyelin kılıf oluşturmasında sinyal molekülü

olabileceği düşünülmektedir25. Miyelin kılıf akson boyunca birbiri ardına dizilen birçok

Schwann hücresi tarafından yapıldığı için segmental bir görünümdedir. Komşu

Schwann hücrelerinin karşılaştığı bölgeler, miyelin kılıftan yoksundur. Bu alanlara

Ranvier düğümü (nodu) adı verilir. İki Ranvier nodu arasındaki miyelin kılıfla kaplı

bölgeye de internodal segment denilmektedir. Periferik sinir sisteminde Schwann

hücreleri miyelinsiz sinir liflerini de çevreler. Schwann hücreleri aksonun uzun ekseni

boyunca paralel olarak uzanır ve aksonlar hücre sitoplazmasına gömülü halde bulunur.

Miyelinsiz sinir liflerinde, her bir Schwann hücresi, bir ya da daha fazla aksonu aynı

anda sarmaktadır25,26.

2.2. Periferik Sinir Yaralanmaları

Sinir yaralanmalarının en yaygın görülen tipi gerilme tipi yaralanmalardır2.

Periferik sinirler, endonöryumlarından dolayı elastiktir, fakat sinire uygulanan çekme,

sinirin gerilme kapasitesinin üzerine çıkarsa, yaralanma meydana gelebilir ve

devamlılık tamamen kaybolabilir. Bununla beraber, çoğu yaralanmalarda devamlılığın

genellikle korunduğu rapor edilmiştir. Gerilme tipi yaralanmalar genellikle, periferik

sinir izolasyonunda veya ekstremite kırıklarında, sinirle kemiğin yakın olduğu

noktalarda görülür. Ciddi yaralanmaların % 30’unu oluşturan ve sinirde kesilme ile

karakterize yırtılma tipi yaralanmalar, diğer yaygın tip yaralanmalardır. Bu tip

yaralanmalarda tam bir kesi olabilmesine rağmen, sıklıkla bazı sinir elemanlarının

devamlılığı korunabilir1,2. Yırtılma tipi yaralanmalar, kolay bir şekilde

oluşturulabildiğinden, araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Yaygın

olarak görülen diğer yaralanma türü, ezilme tipi yaralanmalardır. Bu yaralanmada

5

sinirsel elemanların ayrılması veya kopması söz konusu değildir. Ezilme tipi

yaralanmalarda, motor ve duyu fonksiyonlarının total kaybı meydana gelebilmektedir.

Ezilme tipi yaralanmalarda, mekanik ezilme ve iskemi olmak üzere iki mekanizmanın,

primer etken olabileceği kabul edilmektedir. Bununla birlikte sinir hasarının

oluşumunda, hangi mekanizmanın daha önemli olduğu tam olarak açıklığa

kavuşmamıştır. Yapılan çalışmalar, kısa süreli ezilme tipi yaralanmalarda, iskeminin

fizyolojik iletim bloğuna neden olduğunu göstermiştir. Kısa süreli iskeminin, sinir

iletim bloğunu nasıl oluşturduğu açık değildir. Bununla birlikte, büyük çaplı miyelinli

liflerin, küçük çaplılara oranla daha fazla iskemik etkiye uğradığı gösterilmiştir. Kısa

süreli iskemide, histolojik değişiklikler genellikle geri dönüşümlüdür. Şiddetli iskemik

hasara uğramış sinirde, genellikle fonksiyonun kaybolabileceği ve tam bir iyileşmenin

oluşmayabileceği kabul edilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ezilme tipi

yaralanmalarda mekanik deformasyonun etkilerinin daha ön planda olduğunu görüşü ön

plana çıkmıştır1,2,9.

2.3. Sinir Yaralanmalarının Sınıflandırılması

Periferik sinir onarım yolunun başarısı ve süresi, sinir yaralanmasının derecesine

bağlıdır2,3. Sinir yaralanmasından sonra meydana gelen mikroskobik değişikliklerin

korelasyonuna izin veren ve klinikte kullanışlı olan yaralanma türleri geliştirilmiştir.

Seddon ile Sunderland tarafından geliştirilen sınıflandırma günümüzde yaygın olarak

kabul edilmektedir1-3,28. Seddon yaralanmaları şiddetine göre; nöropraksi, aksonotimes

ve nörotimes olmak üzere 3 sınıfa ayrılmaktadır. Sinir devamlılığının kaybolmadığı

ancak geçici bir fonksiyonel kaybın olduğu nöropraksi, bu yaralanmaların en hafif

tipidir. Nöropraksi’de, miyelin yapısında bazı değişiklikler meydana gelmesine rağmen,

oluşan geçici fonksiyon kayıplarının yaralanma bölgesindeki lokal bir iyon-aracılı iletim

bloğundan dolayı oluştuğu düşünülmektedir. Akson ve miyelin kılıfın tamamen

kesilmesiyle aksonotimes oluşmaktadır. Aksonotimeste, epinöryum ve perinöryum

genellikle korunmuştur. Yaralanmanın distal bölgesinde, akson ve miyelin

dejenerasyonu sonucu tam bir denervasyon meydana gelmektedir. Nörotimes, sinirin

bağlantılarının kesildiği ve tam bir fonksiyonel kaybın olduğu yaralanma tipidir. Bu tip

yaralanmada aksonda yeniden büyümeyi yönlendirecek yapılar kaybolur ve skar oluşur.

Cerrahi girişim yapılmadan genellikle iyileşme meydana gelmemektedir28.

6

Sunderland sinir yaralanmalarını 5 grupta değerlendirmiştir; 1.derece yaralanma,

Seddon’un nöropraksi tipi yaralanmasına, 2.derece yaralanma ise aksonotimes’e

eşdeğer olarak kabul edilmiştir. 3.derece yaralanmalar aksonda kesilme ile meydana

gelen, Seddon’un nöropraksi ve axonotimes tipleri arasında bir yaralanma tipine

eşdeğerdir. Bu tip yaralanmalarda endonöryum da kısmen hasar görmektedir.

Endonöryumdaki hasarın derecesine bağlı olarak iyileşme oluşabilir. Sunderland,

Seddon’un nörotimes tipi yaralanmasını, 4. ve 5.derece yaralanmalar olarak

sınıflandırmıştır. 4.derece yaralanmada, epinöryum haricinde sinirin bütün kısımları

bozulmakta, 5.derece yaralanmada ise sinir tamamen kesintiye uğramaktadır. Her iki

yaralanmada da iyileşme ancak cerrahi girişim ile sağlanabilmektedir1,2,5,28.

2.4. Yaralanma Sonucu Sinirde Meydana Gelen Değişiklikler

Sinir rejenerasyonunun başarısı, yaralanmanın başlangıçtaki şiddetine ve

meydana gelen dejeneratif değişikliklere bağlıdır. Yalnızca iletim bloğunun olduğu

birinci derece yaralanmalarda, patolojik değişiklikler ya hiç yoktur ya da çok hafiftir.

İkinci derece yaralanmalarda, yaralanma bölgesinde veya bu bölgenin proksimalinde

hafif histolojik değişiklikler oluşmaktadır. Yaralanma bölgesinin distalinde ise

Wallerian dejenerasyonu meydana gelmektedir2,3,5,7,10,29-32. Wallerian dejenerasyonunda

primer histolojik değişiklik, akson ve miyelin kılıfta oluşan yapısal bozukluklardır.

Dejenerasyon sonucu gözlenen başlıca yapısal değişikler, nöronda nörotübül ve

nörofilamanların düzensiz hale gelmesi, akson ve miyelin kılıfın birbirlerinden

ayrılmaları, aksonda varikoz şişkinliklerin oluşmasıdır. Miyelin kılıf dejenerasyonu

özellikle 36-48 saat içinde belirgin hale gelir. Yaralanmadan sonra 48-96 saatte

genellikle akson devamlılığı kaybolur ve impuls iletimi bozulur. Wallerian

dejenerasyonunda Schwann hücrelerinin anahtar rol oynadıkları kabul edilmektedir4,7,27.

Bu hücreler yaralanmadan sonra 24 saat içinde aktif hale geçer, çekirdek ve sitoplazmik

büyüme gösteren hücreler, hızla bölünerek, dejenerasyon ve tamir yoluna yardım

edecek bir çok molekülü eksprese ederler. Schwann hücreleri dejenerasyon sonrası,

akson ve miyelin artıklarını ortadan kaldırır. Periferik kandan göç eden makrofajlar ile

Schwann hücreleri, fagositoz yaparak, yaralanma bölgesini 1 haftadan bir kaç aya

ulaşan bir sürede temizler2,4,6. Bu süreçte, endonöryumda bulunan mast hücrelerinin de

7

önemli rollere sahip oldukları bilinmektedir. Bu hücreler yaralanmadan sonra ilk 2 hafta

içinde çoğalırlar, makrofaj göçünü kolaylaştıran ve kapiller permeabiliteyi arttıran

histamin ve serotonin salgılarlar7.

Başlangıç evresinde, travmaya cevap olarak endonöral tüp şişer, ilk iki haftadan

sonra çapı oldukça azalır. 5-8 haftada dejenere olan sinir artıkları genellikle ortadan

kaldırılmıştır. 3.derece yaralanmalarda travma-aracılı lokal bir reaksiyon meydana gelir.

İntrafasiküler yaralanmalarda sinir lifi distal kısımları elastik endonöryumlarından

dolayı retraksiyona uğrar. Lokal vasküler travma, etkin enflamatuvar cevapla

sonuçlanan hemoraji ve ödeme yol açar. Fibroblastlar prolifere olur ve oluşan fibröz bağ

dokusu, yaralı segmentte şişkinliğe neden olur. İntrafasiküler skar dokusu sinir

gövdesinde de gelişir ve genellikle perinöral skar dokusu ile kaynaşır2.

2.4.1. Yaralanmayla Beraber Sinir Distalinde Meydana Gelen Değişiklikler

Yaralı bölgenin distali karakteristik Wallerian dejenerasyonu ile karakterizedir.

İntrafasiküler yaralanmaların akson rejenerasyonunu bozması ve bundan dolayı

endonöral tüpün uzun süre denerve kalması önemli bir fark olarak ortaya çıkmaktadır.

Yaralanmadan sonra 3-4 ay içerisinde, endonöral tüp küçülmeye başlar. Schwann

hücresi bazal laminasının dış yüzeyindeki kollajene ilaveten, endonöral kılıfta da

kalınlaşma gözlenir. Endonöral tüp genellikle rejenere bir akson ile birleşir, akson ile

bağlantı kurulamadığında, artan fibrozis ile birlikte ortadan kalkar. Wallerian

dejenerasyonunun geç dönemlerinde Schwann hücre yığınları ile karakterize kollabe

endonöral tüpler mikroskopta da ayırt edilmektedir. Schwann hücre sütunlarından

oluşan aksonun rehber yolları, Büngner bandları2,9,10 olarak adlandırılır. Dolayısıyla bu

bandlar, sinir yaralanmasından sonra, akson büyümesi için Schwann hücrelerinin

nöronları destekleyici etkilerinin önemli bir göstergesidir. 4. ve 5.derece yaralanmalarda

endonöral tüpler tamamen bozulur, Schwann hücreleri ve aksonlar tanımlanamaz hale

gelirler. Bu tip yaralanmalarda epinöryumda önemli yapısal değişiklikler oluşur. 24 saat

içerisinde dejenere olmuş sinir uçlarında reaktif epinöral fibroblastlar ortaya çıkar.

Bütün bunlar, Schwann hücreleri, perinöral ve endonöral fibroblastların proliferasyonu

ile birliktedir. Etkin hücresel çoğalma bir hafta içinde en yüksek düzeye ulaşır ve uzun

süre devam eder. Hafif yaralanmalarda olduğu gibi, kapiller permeabilite artmaktadır,

8

bu artış, mast hücre proliferasyonu, ödem ve takip eden makrofaj infiltrasyonu sonucu

oluşmaktadır. Hücresel cevapların büyüklüğü, sinir ve onu saran dokulardaki travmanın

şiddetiyle paralel bir korelasyon göstermektedir. 4. ve 5. derece yaralanmalarda sinirin

son kısımları, şişkinleşmiş ve dejenerasyona uğramış Schwann hücreleri, fibroblastlar,

makrofajlar ve kollajen lif demetleri ile karaterizedir. Rejenere aksonlar, proksimal

segmentin şişkin kısmına ulaşır ve burada çok ciddi engellerle karşılaşır. Çoğu akson

skar dokusunda halka dizilimi oluşturur veya proksimal segment boyunca geri döner.

Bazı rejenere aksonlar distal kısma ulaşır. Sinir rejenerasyonu, orijinal yaralanmanın

şiddeti, skar oluşumunun büyüklüğü ve aksonun yaralı bölgeye ulaşmasından önce

geçen süre gibi, pek çok faktöre bağlı olarak değişiklik göstermektedir1,2,5,28.

2.4.2. Sinir Proksimali ve Hücre Gövdesinde Meydana Gelen Değişiklikler

Yaralanmaya bağlı olarak, nöron perikaryonunda ve sinir lifi proksimalinde

meydana gelen değişiklikler, yaralanmanın şiddetine ve yaralı bölgenin perikaryona

yakınlığına bağlıdır. Yaralı bölgenin yakınındaki proksimal segment boyunca, Schwann

hücrelerinde yapısal değişiklikler ile akson ve miyelin kılıf çapında azalma meydana

gelir. Şiddetli travmalarda olduğu gibi, sinir hücresi perikaryonu tam olarak dejenere

olduğunda, proksimal segmentin tamamı Wallerian dejenerasyonu bulgularını

göstermektedir1,2,4,9,28. Yaralanmayı takiben proksimal segmentte, akson çaplarının

azalmasıyla beraber sinir iletim hızı da düşmektedir. Rejenerasyon sürecinde, akson

çapları artmakla beraber, yaralanmadan önceki normal boyutlarını kazanamamaktadır.

Rejenerasyon sırasında, hücre perikaryonu ve akson arasındaki fonksiyonel ilişki son

derece önemlidir. Fonksiyonel periferal bağlantılar yeniden kurulmadan, hücre

perikaryonunda tam bir iyileşme meydana gelmez. Akson çapındaki artış, hücre

perikaryonundaki iyileşme ile doğru orantılıdır. Yaralanmayla beraber nöronun

çekirdeği 6 saat içinde perifere göç eder, Nissl cisimcikleri bozulur ve nöroplazmaya

dağılır3,9,25,29. Bunun dışında, nöronun sinaptik bağlantıları da genellikle bozulur. Bu

nedenle, şiddetli sinir yaralanmalarından sonra, hücre yaşamını daha fazla sürdüremez.

Aksonotimesi takiben, dorsal kök gangliyonunda apopitozla hücre ölüm insidansının,

%20-50’ye kadar arttığı rapor edilmiştir2. Yaralanma nedeniyle nöronal hücre

ölümünün mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla beraber, yaralı alanın

9

mikroçevresinin hücre ölümünde önemli olduğuna inanılmaktadır9. Yaralanmadan

sonra, periferik sinir mikroçevresinde, Schwann hücrelerinin4,9,10,27 destekleyici rolleri

yanında, salınan pek çok tropik molekülün, hücre yaşamını etkilediğini bildiren

çalışmalar yayınlanmıştır6,11-16,34-36.

2.5. Schwann Hücreleri ve Rejenerasyondaki Rolleri

Schwann hücreleri, periferik sinir sisteminde aksonları saran ve akson etrafında

miyelin kılıfı yapan destek hücreleridir4,25,27. Schwann hücreleri ve aksonlar arasındaki

bu yakın ilişki, bu hücrelerin aksonlar üzerinde özel etkilere sahip olmasının bir

göstergesidir. Nöron-Schwann hücresi ilişkisinin bozulması, nöronlarda ve Schwann

hücrelerinde önemli değişikliklere neden olur. Wallerian dejenerasyonu2,3,5,7,10,29-32 adını

alan bu hücresel değişiklikler, proksimal ve distal sinir segmenti sonunda meydana

gelir. Sinir distalinde morfolojik değişiklikler yaralanmadan sonra ilk 3 günde meydana

gelir. Fragmanlar küçülmeye ve oval bir görünüm almaya başlar. 2. günden itibaren, 4

ve 7.günler arasında en fazla olmak üzere, makrofajlar buraya ulaşır ve 15-30 gün sonra

aksonal yıkıntıları hemen tamamen temizler. 3.günde Schwann hücreleri önceden akson

ve miyelin kılıfla dolmuş olan alanı doldurmak için hızla mitozla bölünür3. Rejeneratif

Schwann hücreleri aksonal kökten rejenere olan filizleri kabul etmek için distal

segmentte Büngner bandını2,4,9,10 yapar. Histolojik değişikliklerin yanında, yaralanma

sonrası sinir distalinde bir takım moleküler değişiklikler de meydana gelir. Yetişkin

sıçan siyatik sinirinde normalde çok düşük konsantrasyonda bulunan NGF mRNA,

deneysel sinir yaralanmalarından sonra Schwann hücrelerinde hızla artar2,4,6. NGF

mRNA’nın bu artışı aktive makrofajların göçüne bağlıdır. Ayrıca, Schwann

hücrelerinde BDNF mRNA’nın da yüksek olduğu rapor edilmiştir. BDNF mRNA

üçüncü günden sonra artmaya başlar, 3-4. haftada en yüksek derecesine ulaşır. NT-3’ün

merkezi sinir sistemindeki ekspresyonu belirgin olmakla birlikte, yetişkin sıçanlarda,

NT-3 varlığı, sağlam siyatik sinirde de keşfedilmiştir4. Sinir yaralanmasından 6-12 saat

sonra distal segmentte NT-3 konsantrasyonu oldukça azalır ve yaralanmadan 2 hafta

sonra kontrol değerlerine ulaşır. Siyatik sinir distal segmentinde, aksotomiden 6-12 saat

sonra NT-4/5 mRNA miktarı azalmakta, daha sonra artarak, kontrolün yaklaşık 8 katı

seviyesine kadar yükselmektedir. Düşük affiniteli NGF reseptörü (p75NGFR) sağlam

10

siyatik sinirde bulunmamakla birlikte, yaralanmayı takiben özellikle distal segmentte

ekspresse olmaktadır. Yaralı sinirin proksimal ve distal kısımlarında, trk mRNA

ekspresyonu belirgin olmamakla birlikte, sinir yaralanmasından 1 hafta sonra Schwann

hücrelerindeki trk B ve trk C mRNA, özellikle lezyon bölgesinin proksimalinde belirgin

hale gelmektedir. CNTF, periferik sinir sisteminde Schwann hücrelerinden ve merkezi

sinir sisteminde de astrositlerden eksprese olur. Aksotomiden sonra, CNTF mRNA

ekspresyonu, distal kısımda belirgin olarak azalır ve aksonal rejenerasyondan sonra

ekspresyonu genellikle artar. Sıçanlarda siyatik sinir yaralanması sonrası Schwann

hücrelerinde, yaralanma bölgesinin hem proksimal hem de distal kısmında, GDNF

mRNA’nın ekspresyonu belirgin olarak artmaktadır4,16,20.

2.6. Nörotropik Faktörler

Nörotropik faktörler, nöronların yaşamını devam ettirmesi için ihtiyaç duyduğu

bir polipeptid ailesidir20,21. Embriyonik yaşam boyunca nöronların gelişim ve

olgunlaşmalarına katkıda bulundukları ve sinir yaralanmalarından sonra da

rejenerasyonu ilerlettikleri rapor edilmiştir. Nörotropik faktörler 3 ana gruba ayrılır.

Birinci grup, NGF, BDNF, NT-3 ve NT-4/5’i içeren nörotropinlerdir. Bunlar trk

ailesinin (trk A,B,C) tirozin kinaz reseptörlerine etki eden küçük temel polipeptidlerdir.

İkinci grup, CNTF ve LIF’i içeren nörokinlerdir. Üçüncü grup ise, TGF-β1, TGF-β2,

TGF-β3 ve GDNF’yi içeren TGF-β ailesidir20.

NGF, ilk ve en iyi tanımlanan sinir kökenli büyüme faktörüdür. 26 kDA

ağırlığında homodimerik polipeptiddir ve orijinal nörotropik faktör olarak

tanımlanmıştır. NGF üretildiğinde, spesifik reseptörlerine bağlanarak sinir terminalleri

tarafından alınır ve sinir hücre gövdesine retrograd aksonal transport yoluyla iletilir.

NGF’nin embriyonik dorsal gangliyon nöronlarının, sempatik ve duyu nöronlarının

gelişim ve yaşamını desteklediği rapor edilmiştir6,20,34-36. Diğer taraftan, bazı

araştırmalarda, NGF’nin motor nöronların gelişimleri üzerinde çok az etkiye sahip

olduğu da kaydedilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, NGF’nin motor sinir

rejenerasyonuna etkili olabilmesi için ortamda fibronektin gibi, kombine etki

göstereceği diğer maddelerin de bulunması gerektiği ileri sürülmüştür4. Tropik

faktörlerin ilgili reseptörüne bağlanması, reseptör otofosforilasyonuna yol açar. Bu da

11

reseptörlerin hedef proteinlerdeki fosforile tirozin uçlarına bağlanmasını sağlar. Sonuçta

hücre büyümesini ve farklanmasını uyaran proteinler aktive olur.

Sağlam siyatik sinir Schwann hücrelerinde, CNTF yüksek konsantrasyonda

bulunur14,20. CNTF’nin duyu ve sempatetik nöronlarda sinir büyümesini ilerlettiği ve in

vitro koşullarda, motor nöronların yaşamını desteklediği ve motor nöronların

apopitozunu engellediği rapor edilmiştir. Sıçanlarda yapılan çalışmalarda da, CNTF’nin

aksotomi sonrası motor nöron ölümünü azalttığı rapor edilmiştir. Aksotomiden sonra

CNTF mRNA düzeylerinin belirgin olarak azaldığı, aksonların rejenere olmasından

sonra tekrar yükseldiği belirlenmiştir. CNTF’nin aksotomiden sonra siyatik sinirde

motor fonksiyonel iyileşmeyi arttırdığı bulunmuştur. Periferik sinir rejenerasyonundan

sonra BDNF ve CNTF’nin kombine kullanımının, BDNF’nin tek başına kullanımına

kıyasla, fonksiyonel iyileşme hızını arttırdığı gösterilmiştir. Nörotropin ailesinin diğer

bir üyesi olan GDNF’nin başlangıçta yalnızca dopaminerjik nöronlar üzerine etkili

olduğu düşünülmüş, fakat son yıllardaki raporlar, GDNF’nin diğer birçok nöronal

populasyon için etkili bir nörotrofik faktör olduğunu göstermiştir. Embriyonik sıçan

spinal kord motor nöronlarından elde edilen GDNF’nin aksotomi sonrası motor ve duyu

nöronlarında hücre ölümünü azalttığı, ayrıca Schwann hücrelerinde güçlü bir tropik

etkiye sahip olduğu bulunmuştur. GDNF’nin, nöronlar ve Schwann hücreleri arası

etkileşimde önemli bir role sahip olduğu belirlenmiştir20,33.

Nörotropik faktörler içerisinde etkisi iyi bilinen ve üzerinde pek çok çalışma

yapılan NGF’nin in vitro ve in vivo olarak, sempatetik ve duyu nöronlarında

rejenerasyonu arttırdığı tespit edilmiştir6,11,12,34. Klinikte NGF, Alzheimer hastalığında

ve nörotropik keratitiste, kolinerjik dejenerasyonun engellenmesi, terminal nöronal

filizlenmeyi uyarmak, korneal sensiviteyi düzenlemek ve epitelyal iyileşmeyi sağlamak

amacıyla kullanılmaktadır. Motor nöronların düşük affiniteli NGF reseptörleri ile ilişkili

olmasına rağmen, son zamanlardaki deneysel çalışmalar NGF’nin motor nöron

rejenerasyonu üzerine de olumlu etkilerinin olduğu kaydedilmiştir. Sinir

yaralanmasında silikon tüp boyunca NGF kullanımının fasial sinirde rejenerasyonu

sağladığı, sıçan siyatik sinir modelinde de, motor sinir iletim hızını arttırdığını rapor

edilmiştir. Ayrıca, sıçanlarda siyatik sinir ezilme modelinde yapılan çalışmada, eksojen

NGF verilmesinin siyatik sinirde, elektrofizyolojik ve histolojik bulguların iyileşmesini

arttırdığını gösterilmiştir. Bunların yanında, sıçan siyatik sinir kesisinde ven graftı

12

uygulanan çalışmada, NGF’nin, hem duyu hem de motor sinir rejenerasyonunu önemli

derecede arttırdığı kaydedilmiştir. Bunların dışında, sıçanlarda siyatik sinir kesisinde,

ters çevrilmiş ven graftı uygulanan çalışmada, NGF verilen gruplarda, miyelinli sinir

liflerinin sayıları, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığının kontrol gruplarına göre

anlamlı olarak artış gösterdiği rapor edilmiştir12. Bununla birlikte, bugüne kadar yapılan

çalışmalarda NGF ve diğer nörotropik maddelerin periferal sinir rejenerasyonundaki

etki mekanizmaları henüz tam olarak aydınlatılamamıştır12-14.

2.7. Periferik sinir yaralanmaları ve steroid maddeler

Periferik sinir sisteminin steroid reseptörlerine sahip olduğu ve dolayısıyla bu

dokuların nöroaktif steroidler için hedef oldukları bilinmektedir. Nöroaktif steroidler,

periferik sinir sistemi miyelinli sinir liflerinde, miyelin kılıf yapısında bulunan P0 ve

PMP22 proteinlerinin ekspresyonlarını stimüle etmektedirler. Yapılan son çalışmalarda,

nöroaktif steroidlerin Schwann hücrelerinin proliferasyonunu ve hücresel gelişimlerini

düzenledikleri açığa çıkarılmıştır. Nöroaktif steroidlerin, miyelin proteinlerinin sentezini

kontrol etmeleri yanında, miyelin kılıf ve akson gelişimi üzerine de etkili oldukları rapor

edilmiştir. Pregnenolonu, progesterona çeviren P450scc (sitokrom) ve 3β-hidroksi steroid

dehidrogenaz (3β-HSD)’ın Schwann hücrelerinden salındığı gösterilmiştir18. Periferik

sinirler ve Schwann hücreleri, nöroaktif steroidleri eksprese etmektedirler ve bu maddeler

için aynı zamanda hedef hücre ve yapılardır. Bunun dışında, sıçan siyatik sinirinde

özellikle Schwann hücrelerinin, progesteron, östrojen, glukokortikoid ve

mineralokortikoid reseptörleri gibi klasik steroid reseptörlerini eksprese ettikleri de

bilinmektedir. Ayrıca, sıçan siyatik sinirinden androjen reseptörlerinin eksprese olduğuna

dair bulgular da kaydedilmiştir.

Periferik sinir yaralanmalarında, oluşan iskemi ve travmanın etkisiyle kan akımı

bozularak kesintiye uğramakta ve travma etkisi ile kanama ve yaygın ödem meydana

gelmektedir.Yaralanma sonucunda, primer olarak ortaya çıkan değişikliklerin yanında,

lipid peroksidasyon ürünleri ve superoksit anyonlar gibi, pek çok zararlı etkenin varlığına

bağlı sekonder hücresel değişikliklerin de ortaya çıkmasıyla, ciddi hücresel hasarların

meydana geldiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Sinir liflerinin yapısında bulunan

miyelin kılıfın lipid içeriğinin yüksek olduğu dikkate alındığında, travma ve dolaylı

13

olarak oluşacak iskemi sonrasında miyelin yapısının bozulacağı, membran yapılarının

etkileneceği ve lipid peroksidasyonun ortaya çıkacağı açıktır. Betametazon, bir

glukokortikoid olup, 9α-fluoro-16β-metilprednizolon yapısındadır. Betametazonun

antienflamatuvar ve antiödematöz etkileri yaygın olarak kabul edilmektedir17.

Bugüne kadar yapılan çalışmalarda, periferik sinir yaralanmalarında, nörotropik

bir madde olan NGF ve steroid yapısında olan betametazonun birlikte uygulandığı bir

çalışmaya literatürde rastlanmamıştır. Bu çalışmada sıçanlarda deneysel sinir ezilme

modelinde, NGF ve betametazonun ayrı ayrı ve kombine uygulanmasının, siyatik sinir

üzerine olan etkilerinin, ışık ve elektron mikroskopik, histomorfometrik, footprint analizi

ve biyokimyasal çalışmalarla araştırılması amaçlandı.

14

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Deney hayvanlarının elde edilmesi ve gruplara ayrılması

Sıçan siyatik sinirinde ezilme tipi yaralama sonrasında, sinir büyüme faktörü

(NGF-β, nerve growth factor-β) (Sigma, Katolog No: N-2513) ve steroid bir madde olan

Betametazon’un (Sigma, Katolog No: B-9675) ayrı ayrı ve kombine tedavilerinin,

periferik sinir rejenerasyonuna etkilerinin incelenmesi amacıyla Çukurova Üniversitesi

Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezi’nden, 250-300 gr ağırlığında

50 adet yetişkin erkek Wistar cinsi sıçan temin edildi. Denekler; hiçbir cerrahi işlem

yapılmayan sağlam grup, ezilme tipi sinir yaralanması oluşturulan ve serum fizyolojik

enjekte edilen deney kontrol grubu, sinir yaralanması + yalnızca betametazon tedavisi

uygulanan grup, sinir yaralanması + yalnızca NGF tedavisi uygulanan grup ve sinir

yaralanması + betametazon ve NGF tedavisinin birlikte uygulandığı grup(kombine

tedavi grubu) olmak üzere 5 eşit gruba ayrıldı.

3.2. Operasyon

Sıçanlara 8 mg/100 gr ketamin ve 1 mg/100 gr xylazin karışımının

intraperitoneal verilmesiyle anestezi yapıldı. Anesteziyi takiben sağ dış uyluk traş

edildi, femoral ve gluteal kaslar arasından longitüdinal insizyonla siyatik sinir açığa

çıkarıldı. Siyatik sinirde, Aesculab66 hemostatik fine forceps kullanılarak, 2 diş

sıklığında 30 sn süreyle ezilme oluşturuldu. Daha sonra kas ve deri sırasıyla 4-0 vicryl

ve 4-0 nylon iplikle dikilerek kapatıldı36.

3.3. Tedavinin Uygulanması

Betametazon, operasyondan hemen sonra 2mg/kg/gün dozunda; sinir

yaralanması + betametazon grubu ve sinir yaralanması sonrası NGF+Betametazon’un

kombine tedavisi uygulanan hayvanlara, perioperatif bölgeye subkütan yolla, 1 gün

süreyle ve 8 saat aralıklarla 3 defa uygulandı17. NGF+Betametazon tedavisi uygulanan

gruba (kombine grup) ve NGF grubuna operasyondan hemen sonra 0.3 ml fosfat

15

tamponu içerisinde 1µg NGF-β subkütan yolla perioperatif bölgeye 14 gün boyunca

uygulandı12. Deney kontrol grubuna da aynı dozda ve aynı yolla serum fizyolojik

verildi. Operasyondan sonra 7, 14, 21, 28 ve 35. günlerde fonksiyonel iyileşmeyi

değerlendirmek amacıyla Footprint analizi yapıldı. Analizde, sırasıyla sıçanların arka

bacak 1-5. parmak açıklık oranları ( Toe spread factor, TSF değeri) ölçüldü22.

3.4. Biyopsi Alınması

Postoperatif 6.hafta sonunda siyatik sinir biyopsilerinin alınması amacıyla,

sıçanlara 8 mg/100 gr ketamin ve 1 mg/100 gr xylazin karışımı intraperitoneal olarak

verilerek anestezi yapıldı. Yaralanma oluşturulan sağ siyatik sinir açığa çıkarıldı ve kor

bölgesini içerecek şekilde alınan sinir doku parçaları, ışık, elektron mikroskopik ve

biyokimyasal yöntemlerle hazırlandı.

3.5. Elektron Mikroskopi Yöntemleri

Elektron mikroskobik değerlendirme için alınan sinir doku parçaları Millonig

fosfat tamponu ile hazırlanmış % 5 lik gluteraldehit solüsyonunda 1 saat bekletildikten

sonra üzerinde birkaç damla gluteraldehit olan dişçi mumuyla kaplı petri üzerinde jilet

yardımıyla 1 mm³ lük parçalara ayrıldı. Doku parçaları tekrar gluteraldehit solüsyonuna

alınarak 3 saat kadar tespit edildi. Böylece dokular toplam 4 saat tespit edilmiş oldu.

Daha sonra dokular Millonig fosfat tamponunda 10 dk çalkalandı. Dokular ikinci kez

Millonig fosfat tamponuna alındıktan sonra aynı tampon içerisinde bir gece bekletildi.

Ertesi gün dokular Millonig fosfat tamponu ile hazırlanmış %1 lik osmium tetraoksit

solüsyonu ile ikinci defa tespit edildi ve yine fosfat tamponu ile iki kez 10’ar dk

yıkandı. Dokular daha sonra aşağıdaki sıraya göre dehidrate edildi :

• % 50 Etil alkolde + 4º C’de 15 dakika






16

Buraya kadar olan işlemler buzdolabında + 4º C’de gerçekleştirildi. Daha sonra

aşağıdaki işlemler oda ısısında gerçekleştirildi :

• %100 Etil alkolde 15 dakika

• Propilen oksitte 15 dakika

• Propilen oksitte 15 dakika

Dehidrate edilen doku parçaları daha sonra aşağıdaki solüsyonlar içerisinde immerse

edildi :

Propilen oksit + gömme materyali 30 dakika

Propilen oksit + gömme materyali 30 dakika

Bu işlemlerden sonra doku parçaları içerisinde yeni hazırlanmış gömme materyali

(rezin) bulunan tüplere alındı ve bir gece süreyle rotatorda karıştırıldı.

Gömme Materyali :

• Araldit CY 212 20 ml

• Sertleştirici HY 964 20 ml

• Hızlandırıcı DY 064 0.6 ml

• Plastikleştirici – Dibütil Fitalat 1 ml

Ertesi gün doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali kullanılarak 00

polietilen kapsüllere gömüldü ve 60º C etüvde 48 saat süreyle polimerize edildi. Daha

sonra elde edilen bloklar etüvden çıkarılarak soğumaya bırakıldı. Bloklardan Reichert

Ultracut S ultramikrotomu ile 500 Aº kalınlığında kesitler alındı. Kesitler 200-300

gözenekli bakır gridlere toplandı ve % 70’lik etil alkolde doymuş uranil asetat ve

Reynolds’un kurşun sitrat solüsyonları ile boyandı. Boyanan kesitler Zeiss E.M. 10 B

elektron mikroskobu ile incelendi. Mikrograflar Dupont filmleri ile çekildi. Resimler

fohar ve fortezo kağıtlarına basıldı.

3.6. Biyokimyasal Analiz Yöntemi

Deneklerden elde edilen siyatik sinir doku parçaları serum fizyolojik içeren şişelere

konuldu ve buz içerisinde muhafaza edildi. Daha sonra serum fizyolojik içerisinden

çıkarılan dokular fosfat tamponu ile homojenize edilerek (homojenizat) santrifüj tüpü

17

içerisine konuldu ve buz içerisinde saklandı. Sonra fosfat tamponu ile 1/10 oranında

seyreltilen homojenizatlarda malondialdehit (MDA) ve süperoksit dismutaz (SOD)

ölçümleri yapıldı.

3.6.1. Malondialdehit (MDA) Analizi:

Homojenizatın pH:3,4’de aerobik koşullarda, tiobarbitürik asit ile 95°C’de

inkübasyonu sonucu oluşan pembe renkli kompleksin optik dansitesinin ölçümüyle

malondialdehit miktarı saptandı ve hesaplamaları yapıldı37.

3.6.2. Süperoksit Dismutaz (SOD) Analizi:

Homojenizatlarda, ksantin ve ksantin oksidaz kullanılarak oluşturulan süperoksit

radikallerinin p-iyodonitrotetrazoliyum viyolet (INT) ile meydana getirdiği kırmızı

renkli formazan boyasının optik dansitesinin okunması esasına dayanan randox kit

yöntemi kullanılarak süperoksit dismutaz tayini yapıldı. Daha sonra ölçülen değerlerin

hesaplamaları yapıldı38.

3.7. Histomorfometrik Yöntemler

Siyatik sinir doku bloklarından, ince kesitlerin hazırlanmasından önce, 1µm

kalınlığında yarı ince kesitler alındı. Kesitler toluidin mavisi ile boyandı ve Olympus

BX50 (Tokyo-Japanya) ışık mikroskobunda incelendi. Mikroskoba bağlı Bioquant

Omega II software analiz programı kullanılarak, ortalama miyelinli sinir liflerinin

sayıları, akson çapları ve miyelin kılıf kalınlıkları ölçüldü.

3.8. Footprint Analizi

Footprint analizi siyatik sinir yaralanmasından sonra fonksiyonel iyileşmeyi

ölçmek amacıyla, non-invaziv, duyu ve motor iyileşmenin kombinasyonunu gösteren

bir metoddur ve siyatik sinir rejenerasyonun değerlendirilmesinde yaygın olarak

18

kullanılmaktadır22-24. Bu çalışmada, Bervar tarafından tanımlanan22 video destekli

footprint analiz tekniğini kullanıldı.

Bütün gruplarda, footprint analizi 7, 14, 21, 28 ve 35. günlerde yapıldı. Video

footprint sistemi, 50x100 cm ebatlarında cam bir tablanın altına yerleştirilen bir video

kamera kaydedici ve bunların hemen yanına 100 W’lık elektrik lambasından

oluşturuldu. Ayrıca, standart bir televizyon monitörü de bu sisteme dahil edildi.

Sıçanlar, cam tabla üzerindeki 10x20x20 cm ebatlarındaki pleksiglas kutulara

yerleştirildi ve 5 dk. süreyle adaptasyona bırakıldı. Deneklerin, uygun ortamda 3 dk.

süreyle video kayıtları yapıldı ve dijital fotoğraf makinası ile de ayak fotoğrafları elde

edildi. Video kayıtlarının incelenmesinden sonra alınan veriler bilgisayara aktarıldı ve

Excel-Visual Basic tabanlı bir analiz programı değerlendirildi. Her bir sıçan için, en az

5 fotografta, 1-5. parmaklar arası açıklık oranı (TSF, toe spread factor) hesaplanarak,

ortalama TSF değerleri elde edildi.

3.9. İstatistik

Gruplar arası karşılaştırma tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) ile

istatistiksel olarak değerlendirildi. Karşılaştırma Bonferroni ve Tamhane testine göre

yapıldı. 0,05’ten küçük p değerleri anlamlı olarak kabul edildi (p<0,05). Değerler

aritmetik ortalama (X) ± standart sapma şeklinde ifade edildi.

19

4. BULGULAR

4.1. Histolojik ve Elektron Mikroskobik Bulgular

4.1.1. Sağlam Grup

Sağlam gruba ait hayvanların siyatik sinirinin yarı ince kesitlerinin toluidin

mavisi ile boyanmasından elde edilen kesitlerin ışık mikroskobik incelenmesinde,

sinirin dıştan kalın fibröz bir bağ dokudan oluşan epinöryum ile çevrili olduğu izlendi.

Epinöryumda fibröz bağ dokusu dışında, kan damarlarının varlığı da gözlendi.

Epinöryumun altında sinir fasiküllerinin daha ince bir bağ dokusu olan perinöryumla

çevrili olduğu görüldü. Perinöryumdan kaynaklanan daha ince bağ dokusu bölmelerinin

tek tek sinir liflerini çevrelediği gözlendi. Endonöryum olarak adlandırılan bu ince bağ

dokusunun altında Schwann hücrelerinden oluşan nörilemma kılıfının varlığı izlendi.

Aksonları saran Schwann hücreleri, oval ya da yuvarlak çekirdekleri ile ayırt edildi.

Aksonlar, Schwann hücrelerinin sitoplazmasına gömülmüş halde, soluk renkli olarak

izlendi. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann hücreleri tarafından yapılan ve aksonun

etrafında yerleşmiş olan bir miyelin kılıfın varlığı görüldü. Miyelinli sinir liflerinin

aralarında, miyelinsiz sinir lifleri, bağ dokusu hücreleri ve kan damarları da ayırt

edilmekteydi (Şekil 1). Bu grubun elektron mikroskobik incelenmesinde, sinir

fasiküllerinin miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinden oluştuğu dikkati çekti (Şekil 2,3).

Sinir liflerinin Schwann hücreleri tarafından çevrelendikleri ve Schwann hücresi

sitoplazması içerisinde bulundukları izlendi. Schwann hücrelerinin, heterokromatinden

zengin oval ya da yuvarlak bir çekirdeğe sahip oldukları, heterokromatinin genellikle

nüklear kılıf yakınında yoğunlaştığı dikkati çekti. Çekirdek, miyelinsiz sinir liflerini

saran hücrelerde, genellikle hücrenin ortasında yer alırken (Şekil 4), miyelinli sinir

liflerini saran Schwann hücrelerinde ise genellikle sitoplazmanın fazla bulunduğu bir

alanda yerleşmişti (Şekil 2,3). Schwann hücreleri dıştan bir bazal lamina ile sarılı idi,

bazal laminanın altında hücrenin plazmalemması yer almaktaydı. Hücrenin

sitoplazmasında endoplazmik retikulum sisternaları, golgi apparatus, mitokondriyonlar,

lizozomlar ve dağınık olarak ribozomlar yer almaktaydı. Schwann hücrelerinin,

miyelinli ve miyelinsiz bütün aksonları sardıkları izlendi. Miyelinli sinir liflerinde,

20

Schwann hücrelerinin aksonu sararak, akson etrafında konsantrik lamellar tarzda

miyelin kılıfı oluşturdukları görüldü. Miyelinli sinir liflerinde, Schwann hücrelerinin tek

bir aksonu sardığı ve aksolemma ile hücre zarı arasında periaksonal boşluğun

bulunduğu gözlendi. Akson içerisinde mitokondriyonlar, agranüler endoplazmik

retikulum sisternaları, çok miktarda nörotübül ve nörofilamanların varlığı izlendi (Şekil

2,3). Miyelinsiz sinir liflerinde, bir Schwann hücresinin, genellikle birden fazla aksonu

aynı anda sardığı dikkati çekti. Miyelin kılıfa sahip olmayan aksonlar, Schwann hücresi

sitoplazması içerisine gömülü olarak bulunmaktaydı (Şekil 3,4). Sinir lifleri, Schwann

kılıfının üzerinde fibröz bağ dokudan oluşan ve endonöryum adı verilen bağ dokusu

kılıfı ile sarılıydı. Sinir liflerinin aralarında, ince uzun sitoplazmik uzantıları ve

heterokromatik çekirdekleriyle karakterize edilen fibroblastların varlığı izlendi (Şekil

4). Ayrıca, az sayıda mast hücresi, kapiller damarlar ve başlıca kollajen liflerden oluşan

fibröz bağ dokusu da yer almaktaydı (Şekil 2,3,4).

21

ŞEKİL 1: Sağlam gruptan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin (a) belirgin bir miyelin kılıfa sahip olduğu (oklar) ve bu liflerin normal yapıda oldukları görülmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma) izlenmektedir.

22

ŞEKİL 2: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin akson (a), miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla birlikte normal oldukları, akson (a) içerisinde; mitokondriyonlar (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) görülmektedir. Sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarıldığı, Schwann hücrelerinin çekirdeği (Ç) ve sitoplazmik organellerinin normal yapıda olduğu görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresinin birden fazla aksonu sardığı, sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) varlığı görülmektedir.X8100.

23

ŞEKİL 3: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda olduğu görülmektedir. Akson içerisinde mitokondriyonlar (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) normal olarak izlenmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresinin birden fazla aksonu sardığı, sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) varlığı izlenmektedir. Çekirdek (Ç).X12400.

24

ŞEKİL 4: Sağlam gruptan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarıldığı görülmektedir. Sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda olduğu ve miyelinsiz sinir liflerinin (ma) Schwann hücre sitoplazmasına gömülü olarak bulundukları görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında fibroblast (Fb) ve kollajen liflerin (Kol) bulunduğu dikkati çekmektedir. Çekirdek (Ç).X10100.

25

4.1.2. Deney Kontrol Grubu

Deney kontrol grubundan elde edilen siyatik sinirinin yarı ince kesitlerinin ışık

mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan fibröz bir bağ dokudan oluşan epinöryum ile

çevrili olduğu izlendi. Epinöryumda fibröz bağ dokusu dışında, kan damarlarının varlığı

da gözlendi. Epinöryumun altında, içerisinde miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin

bulunduğu sinir fasiküllerinin varlığı ayırt edildi. Miyelinli sinir liflerinin rejenerasyonu

belirgin olmakla birlikte, sinir liflerinin bazılarında akson ve miyelin kılıfın dejenere

olduğu, miyelin kılıf lamellerinin birbirlerinden ayrıldıkları, aksonun büzüştüğü ve bazı

liflerde ise tamamen dejenere olduğu dikkati çekti. Dejenerasyonun belirgin olduğu

alanlarda, dejenere sinir lifleri ve miyelin kılıf yapılarını fagosite etmiş ve sindirmiş pek

çok makrofajın varlığı da ayırt edildi. Bunların yanında, miyelinli sinir liflerinin önemli

bir kısmının normal yapılarını korudukları görülmekle birlikte, akson çapları ve miyelin

kılıf kalınlıklarında sağlam gruba göre önemli bir azalmanın meydana geldiği dikkati

çekti. Miyelinli sinir liflerinin aralarında, miyelinsiz lifler, makrofajlar, mast hücreleri

ve fibroblastlar ile fibröz bağ dokusunun varlığı gözlendi (Şekil 5). Deney kontrol

grubunun elektron mikroskobisinde, bazı alanlarda miyelinli ve miyelinsiz sinir lifleri

ve Schwann hücrelerinin normal yapılarını korudukları izlenmekle birlikte (Şekil 6,7),

çoğu alanlarda özellikle miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfta önemli yapısal

değişikliklerin meydana geldiği dikkati çekti (Şekil 8,9). Miyelin kılıfın normal

konsantrik lamellar yapısının yer yer bozulduğu ve akson içerisine doğru invajine

olduğu, bazı miyelinli sinir liflerinde ise miyelin kılıfın sinir lifi dışına doğru çıkıntı

oluşturduğu görüldü (Şekil 9). Miyelin kılıf dejenerasyonunun belirgin olduğu sinir

liflerinde, aksonlarda da belirgin yapısal değişiklikler izlendi. Aksonun genellikle

büzüştüğü, akson ile miyelin kılıf arasında çeşitli büyüklüklerde vakuollerin meydana

geldiği, bazı sinir liflerinde ise aksonun tamamen dejenere olduğu ve akson içerisindeki

organellerin tanınmaz bir şekil aldığı ayırt edildi (Şekil 8,9). Dejenerasyonun belirgin

olduğu alanlarda Schwann hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmik özellikleri ile oldukça

aktif bir görünümde oldukları izlendi. Schwann hücrelerinde çekirdekteki kromatin

dağılımı ve sitoplazmik organellerin yapılarının nisbeten normal olduğu (Şekil 6,7),

bazı sinir liflerinde ise Schwann hücrelerinde çekirdekte heterokromatin artışı ve

sitoplazmada endoplazmik retikülüm genişlemesine bağlı olarak vakuolizasyonun

meydana geldiği dikkati çekti (Şekil 8). Miyelinsiz sinir liflerinin genellikle normal

26

yapılarını korudukları izlendi. Sinir liflerinin aralarında dejenere miyelin kılıf yapılarını

fagosite etmiş halde izlenen çok sayıda makrofajın varlığı kaydedildi. Makrofajların

sitoplazmalarında çok sayıda fagozom bulunmaktaydı. Bazı alanlarda, makrofajların

ileri derecede dejenere oldukları, çekirdeklerinin hiperkromatik görünüm kazandığı ve

piknotik değişiklikler gösterdiği izlendi (Şekil 6,7,10). Dejenerasyonun belirgin olduğu

alanlarda, fibroblast sitoplazmalarında bol miktarda ribozom yanında, çeşitli

büyüklüklerde lipid damlacıklarının birikimi de ilgi çekici bulundu (Şekil 7). Ayrıca

ortamda, oval ya da yuvarlak nispeten ökromatik bir çekirdeğe sahip, sitoplazmalarında

elektron dens birçok salgı granülünün bulunduğu mast hücreleri de yer almaktaydı.

Özellikle dejenere alanlarda, mast hücrelerinin Schwann hücreleri ve sinir liflerine

komşu yerleşimi ilgi çekici bulundu (Şekil 11). Bunun dışında, sinir liflerinin aralarında

aktif fibroblastların yanında, farklı yönlerde düzenlenmiş, kollajen liflerden zengin

fibröz bağ dokusunun artışı da izlendi (Şekil 7,8,10,11).

27

ŞEKİL 5: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Sinirin dıştan epinöryum (Ep) adı verilen fibröz bağ dokusuyla sarılı olduğu görülmektedir. Miyelinli sinir liflerinin çoğu alanlarda normal yapıda oldukları görülmekle birlikte (oklar) liflerin önemli bir kısmında akson ve miyelin kılıf yapılarının dejenere olduğu izlenmektedir (ok başları). Sinir liflerinin aralarında makrofaj (M) ve mast hücresi (Mh) dikkati çekmektedir.

28

ŞEKİL 6: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin Schwann hücreleri (Sh) tarafından sarılı oldukları, akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarının normal olduğu izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) ve sitoplazması lipid damlacıkları (L) ve muhtemelen miyelin kılıf kalıntıları (x) içeren makrofajların (M) varlığı dikkati çekmektedir. Çekirdek (Ç).X10100.

29

ŞEKİL 7: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde Schwann hücrelerinin (Sh) normal yapıda oldukları görülmektedir. Miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal olduğu, aksonların (a) bazılarında akson ile miyelin kılıf arasında boşlukların (b) oluştuğu dikkati çekmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) Schwann hücrelerinin (Sh) birden fazla aksonu çevrelediği izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofaj (M), sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) içeren fibroblast (Fb) görülmektedir. Çekirdek (Ç), kollajen lifler (Kol).X12100.

30

ŞEKİL 8: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) ileri derecede dejenere olduğu dikkati çekmektedir (oklar). Schwann hücrelerinde (Sh) çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada vakuolizasyon (V) oluştuğu izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen liflerin (Kol) sıkıca bir araya geldikleri görülmektedir. X16100.

31

ŞEKİL 9: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin önemli bir kısmında miyelin kılıfın (Mk) akson (a) içerisine doğru invajine olduğu (ok başları) ve miyelin kılıf lamellerinin yer yer birbirinden ayrıldığı dikkati çekmektedir (oklar). Schwann hücresi (Sh), Fibroblast (Fb), kollajen lifler (Kol).X10100.

32

ŞEKİL 10: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin aralarında çekirdekleri (Ç) hiperkromatik hale dönüşmüş ve sitoplazmasında fagozom (f), lipid damlacıkları (L) ve vakuoller içeren (v) makrofajlar (M) görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında yoğun şekilde bir araya gelmiş kollajen lifler (Kol) izlenmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Schwann hücresi (Sh).X8100.

33

ŞEKİL 11: Deney kontrol grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir lifleri akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla normal olarak izlenmekle birlikte sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında karekteristik granülleriyle (gr) mast hücresinin (Mh) varlığı dikkati çekmektedir. Sinir liflerinin aralarında sıkıca bir araya gelmiş kollajen lifler (Kol) izlenmektedir. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Schwann hücresi (Sh), çekirdek (Ç).X12400.

34

4.1.3. NGF-β ile tedavi edilen grup

Siyatik sinir ezilmesi sonrası NGF-β verilen gruba ait sinirinin yarı ince

kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin, miyelinli ve miyelinsiz sinir

liflerinden meydana geldiği gözlendi. Miyelinli sinir liflerinin çoğu alanlarda rejenere

oldukları ve akson ve miyelin kılıf yapıları ile birlikte normal görünümde oldukları

kaydedildi. Bununla beraber bazı miyelinli sinir liflerinde, akson etrafında yer alan

miyelin kılıfın normal yapısının bozulduğu, miyelin kılıf ve aksonun dejenere oldukları

gözlendi. Bu alanlara komşu fagositik hücrelerin, akson ve miyelin yıkıntılarını fagosite

ettikleri dikkati çekti. Makrofajlar, hiperkromatik bir çekirdek ve vakuoler görünümlü

sitoplazmaları ile ayırt edildi. Ayrıca mast hücreleri ve fibroblastların varlığı da izlendi.

Miyelinli sinir liflerinin yapılarının çoğu alanlarda genellikle normal olarak

değerlendirilmekle beraber, sağlam gruba göre, akson çapı ve miyelin kılıf

kalınlıklarında belirgin bir azalmanın olduğu ayırt edildi (Şekil 12). Siyatik sinir

ezilmesi sonrası NGF-β tedavisi uygulanan gruptan alınan sinir biyopsilerinin elektron

mikroskobik incelemelerinde, bazı alanlarda miyelinli sinir liflerinde hafif miyelin kılıf

bozuklukları, bazı aksonlarda yapısal değişiklikler, Schwann hücrelerinde sitoplazmik

vakuolizasyon izlenmekle birlikte (Şekil 13,14,15), çoğu alanlarda miyelinli, miyelinsiz

sinir liflerinin ve Schwann hücrelerinin genellikle normal yapılarını korudukları

gözlendi (Şekil 16,17). Dejenerasyonun belirgin olduğu alanlarda Schwann hücrelerinin

çekirdeklerinde heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm

genişlemesine bağlı vakuolizasyon dikkati çekti (Şekil 14,15). Bazı alanlarda Schwann

hücrelerinin fagositik hücre özelliklerini kazanarak fagositoz yaptığı, hücrenin

çekirdeğinin heterokromatin artışına bağlı olarak piknotik hale geldiği,

sitoplazmalarında sekonder lizozomlar ve vakuollerin varlığı ayırt edilmekteydi (Şekil

13). Miyelinsiz aksonlar da Schwann hücresi ile sarılıydı. Miyelinsiz sinir liflerinde bir

Schwann hücresinin birden fazla aksonu aynı zamanda sarmış olduğu görüldü (Şekil

14,17). Miyelinli sinir liflerinde akson etrafında yer alan miyelin kılıfın bazı alanlarda

miyelin lamellerinde hafif ayrışma dışında (Şekil 13), genellikle normal yapıda

oldukları izlendi (Şekil 14,17). Miyelinli sinir liflerinde aksonların bazılarında yapısal

değişiklikler görülse de(Şekil 14), çoğu alanlarda aksonların normal yapıda oldukları,

aksoplazmada mitokondriyonların, nörotübül ve nörofilamanların yer aldığı görüldü

(Şekil 15,17). Dejenere miyelinli sinir liflerinin bulunduğu alanlara yakın yerleşimli

35

makrofajların varlığına bu grupta da rastlandı. Makrofajlarda çekirdekte heterokromatin

artışı, sitoplazmada lizozomal yapılar ve çeşitli büyüklüklerde vakuoller bulundu (Şekil

14). Sinir liflerinin aralarında fibroblastlar ile kollajen liflerden oluşan fibröz bağ

dokusu yer almaktaydı (Şekil 13-17).

36

ŞEKİL 12: NGF grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinin çoğunlukla normal oldukları izlenmekle birlikte (oklar), bazı sinir liflerinde akson ve miyelin kılıfın dejenerasyona uğradığı dikkati çekmektedir (ok başı). Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M) ve mast hücreleri (Mh) görülmektedir. Epinöryum (Ep).

37

ŞEKİL 13: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde hafif miyelin değişiklikleri izlenmektedir (oklar). Aksonlar (a) normal olmakla birlikte bazı sinir liflerinde akson ile miyelin kılıf arasında boşluklar (b) oluştuğu dikkati çekmektedir. Miyelinli sinir liflerinin aralarında normal yapıda miyelinsiz sinir lifleri (ma), çekirdeği (Ç) piknotik hale dönüşmüş ve sitoplazmasında fagozomlar (f) içeren Schwann hücresinin (Sh) varlığı görülmektedir. Miyelin kılıf (Mk), kollajen lifler (Kol).X16100.

38

ŞEKİL 14: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Schwann hücrelerin (Sh) sitoplazmasında hafif vakuolizasyon (v) izlenmekle birlikte, miyelinli sinir lifleri, akson (a) ve miyelin kılıf (Mk) yapılarıyla normal olarak görülmektedir. Bazı sinir liflerinde akson yapısının bozulduğu dikkati çekmektedir (oklar). Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresi birden fazla aksonu sarmış olarak izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında hiperkromatik çekirdeğe sahip sitoplazmalarında geniş vakuoller (v) ve fagozomlar (f) içeren makrofaj (M) görülmektedir. Kollajen lifler (Kol), fibroblast (Fb).X16100.

39

ŞEKİL 15: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskobik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında hafif miyelin kılıf hasarı (oklar) görülmekle beraber, sinir liflerinin çoğunda akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücresi (Sh) sitoplazmasında hafif vakuolizasyon (v) görülmekte, sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Miyelinsiz sinir lifleri (ma), Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X10100.

40

ŞEKİL 16: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapılarını korudukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) bulunan bir fibroblast (Fb) ve kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X8100.

41

ŞEKİL 17: NGF grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında hafif miyelin kılıf hasarı (oklar) izlenmekle beraber, sinir liflerinin çoğunda akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları görülmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik özellikleriyle normal yapıda oldukları, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (ok başları). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X10100.

42

4.1.4. Betametazon Grubu

Siyatik sinir ezilmesi sonrası betametazon verilen gruba ait sinirinin yarı ince

kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan fibröz bir bağ dokudan

oluşan epinöryum ile çevrili olduğu gözlendi. Siyatik sinirin, miyelinli ve miyelinsiz

sinir liflerinden meydana geldiği, miyelinli sinir liflerinin akson etrafında bir miyelin

kılıf içerdikleri ayırt edildi. Bu grupta da, miyelinli sinir liflerinin rejenerasyonunun

oldukça belirgin olduğu dikkati çekici bulundu. Bununla birlikte, bazı alanlarda

miyelinli sinir liflerinde akson ve miyelin kılıfın dejenere oldukları görüldü. Dejenere

alanlarda, hiperkromatik oval veya yuvarlak çekirdeğe sahip, sitoplazmasında fagozom

ve lipid damlacıkları ile karakterize makrofajların varlığı da ilgi çekiciydi. Ayrıca mast

hücreleri ve fibroblastlar da izlendi. Miyelinli sinir lifleri, akson ve miyelin kılıf yapıları

ile birlikte normal olarak değerlendirilmekle beraber, akson çapı ve miyelin kılıf

kalınlıklarında sağlam gruba göre belirgin bir azalma, bu grupta da izlendi (Şekil 18).

Betametazonla tedavi edilen gruptan alınan sinir biyopsisi örneklerinin elektron

mikroskobik incelenmesinde, bazı alanlarda Schwann hücrelerinde çekirdekte

heterokromatin yoğunlaşması, sitoplazmada endoplazmik retikulumda genişleme,

miyelinli sinir liflerinde kısmi miyelin kılıf hasarları, interstisyumda makrofajlar

izlenmekle birlikte (Şekil19), çoğu alanlarda Schwann hücreleri ve sinir liflerinin

normal yapılarını korudukları dikkati çekti (Şekil 20,21). Dejenerasyonun belirgin

olduğu alanlarda miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıfın aşırı şekilde kalınlaştığı ve

akson içerisine doğru invajinasyon oluşturduğu, aksonun ileri derecede büzüştüğü ve

akson içerisindeki organellerin yapılarının dejenarasyona uğradığı görüldü (Şekil 19).

Bununla beraber özellikle küçük çaplı sinir liflerinde histolojik yapının nispeten

korunduğu gözlendi. Miyelinli sinir liflerinde, aksonun bir Schwann hücresi ile sarılı

olduğu, Schwann hücresinin dıştan bir bazal lamina ile çevrelendiği görüldü. Miyelinli

sinir liflerinde, çoğu alanlarda, miyelin lamellerinin normal yapılarını korudukları

izlendi. Akson içerisinde, genellikle normal yapıda izlenen agranüler endoplazmik

retikülüm sisternaları, mitokondriyonlar, nörotübüller ve nörofilamanlar bulunmaktaydı.

Miyelinsiz sinir lifleri genellikle tüm alanlarda normal yapıdaydı. Miyelinsiz sinir

liflerinde bir Schwann hücresinin pek çok aksonu birlikte sardığı ve sinir liflerinin

aralarında farklı yönlerde seyreden kollajen liflerin bulunduğu görüldü (Şekil 20,21).

Ayrıca interstisyumda çekirdeklerinde heterokromatin artışı, sitoplazmasında bol

43

miktarda sekonder lizozomların yer aldığı makrofajların varlığına da sıklıkla rastlandı.

Makrofajların sitoplazmalarında muhtemelen fagosite edilen miyelin kılıf artıklarının

sindirilmesinden kaynaklanan lipid benzeri yapılar bulundu (Şekil 19).

44

ŞEKİL 18: Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskopik görünümü. Siyatik sinirin miyelinli sinir liflerini (oklar) içerdiği izlenmektedir. Miyelinli sinir liflerinin bazılarında akson ve miyelin kılıfı içeren dejeneratif değişikliklerin (ok başları) varlığı görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M) gözlenmektedir.

45

ŞEKİL 19: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında miyelin kılıfta (Mk) hafiften orta dereceye kadar değişen miyelin kılıf hasarı (oklar) izlenmektedir. Schwann hücrelerinde çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm sisternalarında (er) genişlemeler görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinde (ma) bir Schwann hücresi birden fazla aksonu aynı anda sarmaktadır. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında, içerikleri kısmen veya tamamen ortadan kaldırılmış fagozomlar ile lizozom içeren makrofaj (M) gözlenmektedir. Ortamda ayrıca kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X10100.

46

ŞEKİL 20: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapılarını korudukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.

47

ŞEKİL 21: Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik öezellikleriyle normal olduğu, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.

48

4.1.5. NGF-β + Betametazon Grubu

NGF ve Betametazon’un birlikte uygulandığı gruba ait siyatik sinirin yarı ince

kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde, sinirin dıştan epinöryum adı verilen kalın

fibröz bir bağ dokusu ile çevrili olduğu izlendi. Epinöryumun altında sinir fasiküllerinin

daha ince bir bağ dokusu olan perinöryumla çevrili olduğu görüldü. Perinöryumdan

kaynaklanan daha ince bağ dokusu bölmelerinin tek tek sinir liflerini çevrelediği

gözlenmekteydi. Endonöryum olarak adlandırılan bu ince bağ dokusu içerisinde

fibroblast ve nörilemmaya ait Schwann hücreleri görülmekteydi. Schwann hücreleri,

oval ya da yuvarlak çekirdekleri ile ayırt edildi. Aksonlar, Schwann hücrelerinin

sitoplazmasına gömülmüş halde, soluk renkli olarak izlendi. Miyelinli sinir liflerinde,

Schwann hücreleri tarafından yapılan ve aksonu çevreleyen miyelin kılıf belirgin olarak

izlendi. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında fagozomlar bulunan makrofajların

varlığı gözlendi. Kombine tedavi uygulanan bu grupta da sinir liflerinin rejenerasyonu

belirgin olarak görüldü. Bunun dışında, miyelinli sinir liflerinin aralarında, miyelinsiz

sinir lifleri, bağ dokusu hücreleri ve kan damarları da ayırt edildi (Şekil 22). Siyatik

sinir zedelenmesinden sonra betametazon ve NGF-β’nın kombine tedavilerinin

uygulandığı grubun elektron mikroskobisinde, her ne kadar bazı alanlarda Schwann

hücrelerinde heterokromatin artışı, bazı aksonlarda mitokondriyonlarda yapısal

bozukluklar, miyelinsiz aksonlarda harabiyet ve fagozom içeren makrofajlara rastlansa

da (Şekil 23,24), çoğu alanlarda sinir liflerinin akson ve miyelin kılıf yapıları ile birlikte

normale yakın görünümde oldukları görüldü (Şekil 25,26). Miyelinsiz sinir liflerinde

aksonların Schwann hücre sitoplazmasına gömülü olarak bulundukları ve genellikle

normal yapılarını korudukları izlendi.

Miyelinli sinir liflerinde Schwann hücrelerinin tek bir aksonu sardığı, akson

etrafında miyelin kılıf oluşturduğu görüldü. Schwann hücrelerinin oval veya yuvarlak

çekirdeğe sahip olduğu, sitoplazmasında mitokondriyonlar, endoplazmik retikülüm

sisternaları, lizozom ve ribozomlar içerdiği izlendi. Hücrelerin yapıları genellikle

normal olarak değerlendirildi (Şekil 24,26). Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında

fagosite edilen materyal içeren makrofajlara bu grupta da rastlandı. Makrofaj

sitoplazmalarında, lizozomlar, lipid damlacıkları ve fagozom artıkları bulundu (Şekil

49

23,24). Ayrıca ortamda çekirdek ve sitoplazmik özellikleriyle normal görünümde

izlenen fibroblastlar ve kollajen lifler de yer almaktaydı (Şekil 23, 26).

50

ŞEKİL 22: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin ışık mikroskopik görünümü. Sinirin dıştan epinöryum (Ep) adı verilen fibröz bağ dokusuyla sarılı olduğu ve miyelinli (oklar) ve miyelinsiz liflerden oluştuğu izlenmektedir. Miyelinli sinir liflerinin bazılarında (ok başları), akson ve miyelin kılıfı içeren dejeneratif değişikliklerin varlığı görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında makrofajlar (M), kan damarları ve bağ dokusunun varlığı da gözlenmektedir.

51

ŞEKİL 23: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) içerisinde mitokondriyonlarda (m) yapısal bozukluklar izlenmekle birlikte, miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapıda olduğu dikkati çekmektedir. Schwann hücrelerinde çekirdekte (Ç) heterokromatin artışı, sitoplazmada endoplazmik retikülüm sisternalarında (er) hafif genişlemeler görülmektedir. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında membranöz yapılar, lipid damlacıkları (L) içeren, bazı alanlarda ise fagozom (f) içeriğinin kısmi veya tamamen sindirildiği makrofajlar (M) izlenmektedir. Ortamda ayrıca fibroblast (Fb), kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Çekirdek (Ç), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X12400.

52

ŞEKİL 24: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinden bazılarında akson (a) içerisinde mitokondriyonlarda (m) yapısal bozukluklar izlenmektedir. Miyelin kılıfın (Mk) genellikle normal yapıda olduğu görülmektedir. Miyelinsiz sinir liflerinden (ma) bazılarında aksonal dejenerasyon (oklar) dikkati çekmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) bazılarında sitoplazmada vakuolizasyon (v) gözlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında, lipid damlacıkları (L) ve fagozom (f) içeren makrofajlar (M) izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir.X16100.

53

ŞEKİL 25: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında, sitoplazmasında lipid damlacıkları (L) ve fagozom (f) içeren makrofajlar (M) izlenmektedir. Sinir liflerinin aralarında kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X16100.

54

ŞEKİL 26: NGF+Betametazon grubundan elde edilen sinirin elektron mikroskopik görünümü. Miyelinli sinir liflerinde akson (a) ve miyelin kılıfın (Mk) normal yapıda oldukları izlenmektedir. Schwann hücrelerinin (Sh) çekirdek (Ç) ve sitoplazmik özellikleriyle normal yapıda oldukları, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerini (ma) sardıkları, miyelinsiz liflerde, bir hücrenin birden fazla aksonu aynı anda çevrelediği görülmektedir (oklar). Sinir liflerinin aralarında fibroblastlar (Fb), kollajen lifler (Kol) yer almaktadır. Mitokondriyon (m), nörotübül ve nörofilamanlar (x) gösterilmiştir. X6300.

55

4.2.Biyokimya Bulguları

Malondialdehit (MDA) miktarı, lipid peroksidasyonu seviyesinin

değerlendirilmesinde önemli bir ölçüttür. Bütün gruplardan elde edilen malondialdehit

(MDA) seviyeleri şekil 27’de gösterilmiştir. Malondialdehit seviyesinin gruplar

arasında karşılaştırılmasında; sağlam grupta MDA seviyesi 2,98±0,32 iken, deney

kontrol grubunda; 8,3±083, NGF verilen grupta; 6,97±0,93, Betametazon verilen

grupta; 7,45±0,77 ve NGF+Betametazon grubunda; 4,72±0,55 olduğu belirlendi. Deney

kontrol grubunda, diğer gruplar ile karşılaştırıldığında, MDA seviyesinin anlamlı olarak

arttığı bulundu (p<0.05). NGF ve Betametazon grupları arasında fark önemsizdi.

NGF+Betametazon grubunun, deney kontrol grubu, yalnızca NGF ve yalnızca

Betametazon uygulanan gruplar ile karşılaştırıldığında, MDA seviyesinin anlamlı

olarak azaldığı (p< 0.05) dikkati çekti.

Şekil 27: Tüm gruplardan elde edilen malondialdehit (MDA) seviyeleri

MD

A (n

mol

/mL)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

NGF+BetametazonBetametazonNGFDeneykontrol

Sağlam

56

Superoksit dismutaz enzim (SOD) seviyeleri şekil 28’de gösterilmiştir.

Superoksit dismutaz enzim seviyesinin gruplar arası karşılaştırılmasında; sağlam grupta

SOD seviyesi; 2823±193, deney kontrol grubunda; 1163±150, NGF verilen grupta;

1657±214, Betametazon verilen grupta; 1749±239 ve NGF+Betametazon grubunda ise

2143±117 olduğu bulundu. Deney kontrol grubuna ait SOD seviyesi diğer gruplar ile

karşılaştırıldığında, SOD seviyesinin anlamlı olarak azaldığı saptandı (p< 0.05). NGF ve

Betametazon grupları arasındaki fark önemsizdi. NGF+Betametazon grubunun, deney

kontrol grubu ve yalnızca NGF ve Betametazon uygulanan gruplar ile

karşılaştırıldığında, SOD seviyesinin anlamlı olarak artış gösterdiği ilgi çekiciydi

(p< 0.05).

Şekil 28: Tüm gruplardan elde edilen superoksit dismutaz aktiviteleri

SOD

(U/g

pro

tein

)

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

NGF+BetametazonBetametazon

NGFDeney Kontrol

Sağlam

57

4.3. Footprint Analiz Bulguları

Footprint analiz sonuçları şekil 29’da görülmektedir. Analiz sonuçlarına göre, 7.

ve 14. günlerde gruplar arasında anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluşmadığı

görülmektedir. 21. günde, fonksiyonel iyileşmenin oluşmaya başladığı, 28 ve 35.

günlerde iyileşmenin belirgin olarak arttığı dikkati çekmektedir. 21.günde deney

kontrol, NGF ve Betametazon grupları arasında, anlamlı bir fark meydana gelmemekle

birlikte, NGF + Betametazon grubunda anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluştuğu, bu

iyileşmenin 28. ve 35. günlerde daha belirgin olduğu izlenmektedir. 35.günde; deney

kontrol ve Betametazon gruplarında fonksiyonel iyileşme yüzdeleri birbirine yakın

olmakla birlikte, NGF grubunda, deney kontrol ve Betametazon gruplarına göre anlamlı

bir iyileşme oluştu. NGF + Betametazon grubunda diğer gruplara göre anlamlı bir

fonksiyonel iyileşmenin oluşması ilgi çekiciydi. Bununla beraber, normal TS oranı 100

kabul edildiğinde, 35 günlük süre içinde grupların hiçbirinde tam bir fonksiyonel

iyileşmenin meydana gelmediği gözlendi.

0102030405060708090

100

7 14 21 28 35Günler

1-5

Parm

ak a

ralığ

ı (%

kon

trol)

Deney kontrolNGF

BetametazonKombine

Şekil 29: Tüm gruplardan elde edilen footprint analiz sonuçları

58

4.4. Histomorfometrik Bulgular

Gruplar arasında miyelinli sinir liflerinin sayıları Şekil 30’da verilmiştir.

Ortalama miyelinli sinir lifi sayıları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama

miyelinli sinir lifi sayısı; 7671±211, deney kontrol grubunda; 4360±349, NGF

grubunda; 5245±375, Betametazon grubunda; 5025±442 ve NGF+Betametazon

grubunda; 6079±513 olarak bulundu. NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında,

NGF grubunda miyelinli sinir lifi sayısı yüksek olmakla birlikte iki grup arasındaki fark

anlamlı değildi (p> 0.05). Buna karşın, NGF+Betametazon grubunda miyelinli sinir lifi

sayısının, deney kontrol grubu ile tek başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara

göre anlamlı olarak artış gösterdiği belirlendi (p< 0.05).

Şekil 30:Tüm gruplarda ortalama miyelinli sinir lifi sayıları

NGF+BetametazonBetametazon NGFDeneykontrol

Sağlam

M

iyel

inli

sini

r lifi

say

ısı (μm

)

10000

8000

6000

4000

2000

59

Gruplardan elde edilen akson çapları Şekil 31’de verilmiştir. Ortalama akson

çapları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama akson çapı; 9.3 ± 1.5, deney kontrol

grubunda; 5.5 ± 2.3, NGF grubunda; 5.8 ±1.8, Betametazon grubunda; 5.8 ± 2.3 ve

NGF + Betametazon grubunda; 6.8 ± 2.4 olarak bulundu. Sağlam grupla deney kontrol

grubu karşılaştırıldığında, deney kontrol grubunda akson çapının anlamlı olarak azaldığı

dikkati çekti (p< 0.05). NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında, Betametazon

grubunda akson çapı bir miktar yüksek olmakla birlikte iki grup arasındaki fark anlamlı

değildi (p> 0.05). Ayrıca, NGF + Betametazon grubunda akson çapının, deney kontrol

grubu ile tek başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara göre yüksek olmakla

birlikte, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p> 0.05).

Şekil 31: Tüm gruplarda ortalama akson çapları

NGF+BetametazonBetametazonNGFDeney

kontrolSağlam

Aks

on ç

apı (μm

)

12.00

10.00

8.00

6.00

4.00

2.00

60

Gruplardan elde edilen miyelin kılıf kalınlıkları Şekil 32’de verilmiştir.

Ortalama miyelin kılıf kalınlıkları dikkate alındığında; sağlam grupta ortalama miyelin

kılıf kalınlığı; 1.67 ± 0.54, deney kontrol grubunda; 0.69 ± 0.28, NGF grubunda; 0.83 ±

0.25, Betametazon grubunda; 0.72 ± 0.31 ve NGF + Betametazon grubunda ise 1.04 ±

0.29 olarak bulundu. Sağlam grupla deney kontrol grubu karşılaştırıldığında, miyelin

kılıf kalınlığının deney kontrol grubunda anlamlı olarak azaldığı dikkati çekti (p< 0.05).

NGF ve Betametazon grupları karşılaştırıldığında, NGF grubunda miyelin kılıf kalınlığı

daha yüksek olmakla birlikte, iki grup arasındaki fark anlamlı değildi (p> 0.05). Ayrıca,

NGF + Betametazon grubunda miyelin kılıf kalınlığının, deney kontrol grubu ile tek

başına NGF ve Betametazon uygulanan gruplara göre yüksek olmakla birlikte, farkın

istatistiksel olarak anlamlı olmadığı dikkati çekti (p> 0.05).

Şekil 32: Tüm gruplarda ortalama miyelin kılıf kalınlıkları

NGF+BetametazonBetametazonNGFDeney

kontrolSağlam

Miy

elin

kılı

f kal

inlığ

ı (μm

)

2.50

2.00

1.50

1.00

0.50

0.00

61

5. TARTIŞMA

Deneysel sıçan siyatik sinir ezilmesi modelinde, sinir büyüme faktörü (NGF) ve

betametazon tedavisinin etkinliğinin araştırıldığı bu çalışmada, yaralanma sonrası

NGF+betametazon kombine tedavi uygulamasının siyatik sinirde, sinir liflerinin

rejenerasyonu, akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığında artışa neden olduğu, lipid

peroksidasyonunu azalttığı, SOD aktivitesini anlamlı olarak yükselttiği ve motor

fonksiyonlarda iyileşmeyi sağladığı bulundu.

Sıçan siyatik sinir modeli, sinir yaralanması sonrası fonksiyonel değişikliklerin

incelenmesi, farklı cerrahi yöntemler ve medikal tedavilerin etkinliğinin

araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır39. Bunun yanında, periferik sinir

araştırmalarında sıçan siyatik sinir ezilme yöntemi de sıklıkla kullanılan bir metoddur.

Sinir ezilmesinde farklı tekniklerin kullanılması ve değerlendirme yöntemlerinin

farklılık göstermesi, karşılaştırmalarda önemli güçlükleri ortaya çıkarmaktadır40. Sinir

rejenerasyonunun ölçülmesi, periferik sinir araştırmalarında önemli problemlerden

birisidir34,36. Günümüzde periferik sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesinde,

histolojik, morfometrik, elektrofizyolojik yöntemler ve footprint analizlerinin birlikte

korele edilmesinin önemi vurgulanmıştır12. Sunulan çalışmada, sinir ezilmesi sonrası

uygulanan tedavi yöntemlerinin etkinliği, histolojik, ultrastrüktürel ve histomorfometrik

yöntemler yanında, footprint analizi ve biyokimyasal analizler ile birlikte

değerlendirilmiştir. Sinir yaralanmaları sonucunda oluşan travma ve iskeminin primer

etkileri yanında ortaya çıkan ödem ve enflamatuvar reaksiyonların da hücre ve dokular

üzerinde ciddi yapısal değişikliklere neden olabileceği yaygın olarak kabul

edilmektedir3,6,7. Dolayısıyla, sinir rejenerasyonunun değerlendirilmesi ve olası

nedenlerinin araştırılmasında, lipid peroksidasyonu41 superoksit anyonların artışı, ödem

ve enflamatuvar reaksiyonların meydana gelmesi7,17 primer doku hasarı yanında

sekonder doku hasarlarına neden olmaktadır.

Çalışmamızda lipid peroksidasyonunun önemli bir göstergesi olan

malondialdehit (MDA) seviyesinin, deney kontrol grubunda anlamlı olarak arttığı,

NGF+Betametazon kombine tedavi grubunda anlamlı olarak azaldığı dikkati

çekmektedir (Şekil 27). MDA seviyesinin tek başına NGF ve betametazon tedavisi

uygulanan gruplarda azaldığı görülmekle birlikte, gruplar arasındaki fark istatistiksel

62

olarak anlamsız olarak değerlendirildi. Periferik sinir ezilmesi sırasında travma ve kısa

süreli iskeminin etkisi ile miyelin kılıf yapısında bozulma, miyelin lamellerinin

birbirlerinden ayrılması, akson zarı ve organellerde yapısal değişikliklerin meydana

geldiği bilinmektedir. Sinir dokusunda, miyelin kılıf lamellerinin lipid içeriğinden

zengin olması ve yaralanma sonrası ortamda superoksit anyonlar gibi oksidatif ajanların

ortaya çıkması, dokuda lipid peroksidasyonuna neden olacağı ve buna bağlı olarak da

sinir liflerinin yapılarının bozulacağı açıktır. Gerçekten de sinir yaralanmasını takiben

makrofajların bölgeye göç ettikleri ve şiddetli yaralanmalarda, enflamatuvar

reaksiyonların meydana geldiği, buna bağlı olarak da hücresel yapıların bozulmasına

neden oldukları bilinmektedir3,6,7. Çalışmamızda yalnızca serum fizyolojik verilen

deney kontrol grubuna ait sinir kesitlerinin ışık mikroskobik incelenmesinde sinirlerin

miyelin kılıf yapılarının çoğu alanlarda dejenere oldukları, ortamda makrofajların artış

gösterdiği ve makrofaj sitoplazmalarında miyelin kılıf artıklarının fagosite edildikleri

izlenmektedir (Şekil 5). Elektron mikroskopik incelemelerde de miyelin kılıf yapısında

bozukluklar, akson yapısında değişiklikler, makrofaj infiltrasyonu, aktif fibroblastlar ve

kollajen lifleri içeren yoğun fibröz bağ dokusunun varlığı dikkati çekmektedir (Şekil

7,8,9,10). Ayrıca ortamda çok sayıda karakteristik sitoplazmik granüllere sahip mast

hücrelerinin de bulunması, sinir yaralanması sonucunda ortamda enflamatuvar

reaksiyonların meydana geldiğini göstermektedir. Bu reaksiyonlara bağlı olarak

membran yapılarının bozulabileceği ve lipid peroksidasyonunun artacağı söylenebilir.

Nitekim sinir yaralanması sonrası, ortamda endonöral makrofajlar ve Schwann

hücrelerinin miyelin kılıf artıkları ve aksonal kalıntıları fagosite etmeye başladıkları,

daha sonra da periferik kan kökenli makrofajların bölgeye göç ederek reaksiyonlara

katıldıkları ve dejenerasyona uğrayan yapıları ortadan kaldırdıkları rapor edilmiştir3.

Sinir yaralanması sonrası makrofajların ortama göç etmeleri ve fagositoz yapmaları

normal fonksiyonel bir süreç olarak kabul edilmektedir3,6,7. Bununla birlikte aşırı

enflamatuvar reaksiyonların oluşumu, yoğun fibröz bağ dokusunun meydana gelmesi,

sinir rejenerasyonuna zarar vermekte ve çoğunlukla da skar dokusunun gelişimine

neden olmaktadır. Atkinson et al42 skar dokusunun travma ve cerrahi yaralanmalar

sırasında oldukça sık rastlanan bir problem olduğunu, bu oluşumun rejenerasyon

sırasında akson filizleri için mekanik bir bariyer olabileceğini rapor etmişlerdir.

Yaralanma sonrası, enflamatuvar reaksiyonların azaltılmasına paralel olarak, skar

63

dokusunun da azaltılması sinir iyileşmesinde önemli hedeflerden birisini

oluşturmaktadır. Bu amaçla, yaralanma sonrası glukokortikoidler43 ve nonsteroid

antienflamatuvar ilaçların44 kullanımının yararlı olabileceği bildirilmiştir. Sunulan

çalışmada ezilme tipi yaralanma uygulanan siyatik sinirde glukokortikoid türevi olan

betametazon, perioperatif olarak 24 saat süreyle verildi. Gerçekten de bu grupta ışık ve

elektron mikroskobik bulguların deney kontrol grubuna göre daha iyi durumda olması,

lipid peroksidasyonunun nisbeten azalması ilgi çekici bulundu (Şekil 18,19,20). Sinir

yaralanmasından hemen sonra uygulanan steroid tedavisi muhtemelen enflamasyonu

azaltmakta ve buna bağlı olarak meydana gelen sekonder doku hasarlarının oluşumunu

engellemektedir. Nitekim Becker et al45 lokal glukokortikoid uygulamasının periferik

sinir yaralanmasında fibroblast sayısını ve dolayısıyla da skar dokusu oluşumunu

azalttığını rapor etmişlerdir. Araştırmacılar, glukokortikoidlerin bu yolla nöroma

oluşumunu engellediklerini, ayrıca Schwann hücrelerini aktive ederek miyelin kılıf

yapımını uyardıklarını ve aksonal filizlenmeyi de arttırarak rejenerasyonu

desteklediklerini kaydetmişlerdir. Sunulan çalışmada deney kontrol grubunda

yaralanmayı takiben ortamda çok sayıda aktif fibroblastın ve yoğun kollajen liflerin

bulunduğu (Şekil 10,11), betametazon verilen gruplarda fibröz bağ dokusu oluşumunun

nisbeten normale yakın olduğu izlenmektedir (Şekil 21).

Yaralanma sonrası ortamda meydana gelen enflamatuvar reaksiyonlara bağlı

olarak, çok miktarda superoksit anyonlarının ortaya çıktığı ve bu anyonların özellikle

mitokondriyonlar başta olmak üzere, hücresel yapılar üzerinde dejeneratif etkilere neden

oldukları rapor edilmiştir46. Superoksit dismutaz, doğal antioksidan savunma sisteminde

yer alan ve superoksit anyonların ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan enzimlerden

birisidir. Çalışmamızda siyatik sinir yaralanması sonrası SOD aktivitesinin, deney

kontrol grubunda belirgin olarak azaldığı, betametazon grubunda artış gösterdiği,

NGF+betametazon tedavi grubunda SOD aktivitesinin anlamlı olarak arttığı dikkati

çekmektedir (Şekil 28). Sinir yaralanması sonucunda ortamda meydana gelen

enflamatuvar reaksiyonlara bağlı olarak superoksit anyonların artış göstermesi, buna

bağlı olarak membranların zarar görmesi sonucu SOD aktivitesinin azalması, serbest

oksijen radikallerinin oksidatif hasarlarını arttıracaktır. Nitekim betametazon ve

NGF+Betametazon gruplarında, SOD aktivitesinin deney kontrol grubuna göre artış

göstermesi, betametazonun antienflamatuvar etkisinin bir sonucu olarak

64

değerlendirilebilir. Betametazon ve NGF+Betametazon gruplarında, MDA seviyesinin

de azalması ve sinir liflerinin yapılarının nisbeten korunmuş olması (Şekil 27) bu

görüşümüzü destekler niteliktedir.

Periferik sinir yaralanmasında sinir lifleri ve Schwann hücrelerinin primer hedef

oldukları bilinmektedir3. Yaralanma sonrası distal segmentte, akson ve miyelin kılıfın

dejenerasyonuna bağlı olarak akson fonksiyonu bozulmaktadır. Akson fonksiyonunun

yeniden kazanılması, proksimal uçtan yeni gelişen akson filizlerinin oluşması ve

effektör hücrelere bağlanması ile sağlanmaktadır. Sunulan çalışmada sinir yaralanması

sonrası uygulanan NGF ve betametazon tedavisinin motor fonksiyonel iyileşme üzerine

etkisini değerlendirmek üzere, yaralanma sonrası, 7, 14, 28 ve 35.günlerde footprint

analizi yapıldı. Motor fonksiyonel iyileşmenin önemli bir göstergesi olan footprint

analiz22 sonuçları değerlendirildiğinde, yaralanma sonrası 7. ve 14. günlerde gruplar

arasında anlamlı bir fonksiyonel iyileşmenin oluşmadığı görülmektedir. 21. günde,

fonksiyonel iyileşmenin oluşmaya başladığı, 28 ve 35. günlerde ise iyileşmenin belirgin

olduğu dikkati çekmektedir (Şekil 29). Yaralanma sonrası 21.günde, deney kontrol,

NGF ve betametazon grupları arasında, motor fonksiyonel iyileşmede anlamlı bir fark

meydana gelmemekle birlikte, NGF + Betametazon grubunda anlamlı bir iyileşmenin

oluştuğu, bu iyileşmenin 28. ve 35. günlerde daha belirgin olduğu dikkati çekmektedir.

Bunun yanında, 35.günde deney kontrol ve betametazon gruplarında fonksiyonel

iyileşme yüzdeleri birbirine yakın olmakla birlikte, NGF grubunda, deney kontrol ve

betametazon gruplarına göre anlamlı bir iyileşmenin oluştuğu görüldü. NGF +

Betametazon grubunda diğer gruplara göre belirgin bir fonksiyonel iyileşme meydana

gelmesine rağmen, 35 günlük süre içinde grupların hiçbirinde tam bir motor fonksiyonel

iyileşmenin oluşmadığı gözlenmektedir (Şekil 29).

Sinir yaralanması sonrasında, birinci haftada dejenere olan akson ve miyelin

kılıfların ortadan kaldırıldığı, Schwann hücrelerinin prolifere oldukları ve makrofajların

bölgeye göç ettikleri bilinmektedir2,3. Yaralanma sonrası ilk 2-3 hafta içerisinde

nörotropik faktörlerin ekspresyonları, yaralanmanın etkisiyle son derece

azalmaktadır4,20. Bu nedenle, çalışmamızda sinir rejenerasyonun uyarılması amacıyla

perioperatif bölgeye 2 hafta süreyle NGF enjeksiyonu yapıldı. NGF, ilk keşfedilen

nöronal büyüme faktörü olup, sinir yaralanmalarında üzerinde en çok çalışma yapılan

nörotropik faktörlerden birisidir20. NGF, klinikte, Alzheimer hastalığında ve nörotropik

65

keratitiste, kolinerjik dejenerasyonda, terminal nöronal filizlenmeyi uyarmada, korneal

sensiviteyi düzenleme ve epitelyal iyileşmeyi sağlamak amacıyla kullanılmaktadır.

NGF’nin in vitro ve in vivo olarak, sempatetik ve duyu nöronlarında rejenerasyonu

arttırdığı yaygın olarak kabul edilmektedir. Deneysel çalışmalarda motor nöronların,

düşük affiniteli NGF reseptörleri ile ilişkili olduğunu, bu nedenle de, motor nöron

rejenerasyonu üzerine etkisinin oldukça az olduğu ileri sürülmüştür. Bununla birlikte,

son yıllarda yapılan deneysel çalışmalarda, NGF’nin motor nöron rejenerasyonu üzerine

de olumlu etkilerinin olduğu kabul edilmiştir. Bununla birlikte, NGF’nin sinir

rejenerasyonunda olumlu etkilerinin olduğu pek çok araştırmacı tarafından kabul edilse

de, NGF’nin rejenerasyondaki bu etkilerinin nasıl gerçekleştirdiği hala tam olarak

açıklanamamıştır12.

Çalışmamızda, NGF verilen grupta lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD

düzeyinin yükseldiği (Şekil 28), miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin yapılarının

nisbeten normale yakın oldukları, sinir rejenerasyonunun da, deney kontrol grubuna

göre daha iyi olduğu belirlendi (Şekil 12,15,16) Bunun yanında, NGF verilen grupta,

miyelinli sinir lifi sayıları, akson çapları ve miyelin kılıf kalınlıkları dikkate alındığında,

deney kontrol grubuna göre anlamlı bir artışın meydana geldiği dikkati çekmektedir

(Şekil 30,31,32). Gravannis ve arkadaşları12, sıçan siyatik sinirinde kesilme tipi

yaralanma sonrası, iç-dış ven graftı uyguladıkları deneysel çalışmalarında, NGF verilen

gruplarda, sinir rejenerasyonun ve motor fonksiyonel iyileşmenin daha fazla

gerçekleştiğini, akson çapı, miyelin kılıf kalınlığı ve miyelinli sinir lifleri sayılarının

kontrol gruplarına göre artış gösterdiğini rapor etmişlerdir.

Sinir yaralanmasını takiben, başlıca yaralı bölgenin distalinde, aksonlardan ve

Schwann hücrelerinden NGF’nin salgılandığı, üretilen NGF’nin sinir terminallerinden

alınarak, retrograd aksonal iletimle nöron perikaryonuna iletildiği ve böylece akson

rejenerasyonunun uyarıldığı yaygın olarak kabul edilmektedir14,20. Periferik sinir

rejenerasyonunda aksonun dışında, Schwann hücrelerinin de önemli rollere sahip

olduğu düşünülmektedir. Nitekim aksonal yaralanma sonucunda, Schwann hücrelerinde

NGF reseptörlerinin artış gösterdiği yapılan çalışmalarda rapor edilmiştir2. Yaralanma

sonucu, Schwann hücrelerinin hücre yapışma moleküllerini sentezledikleri, bu yolla

aksonal oryantasyon ve rejenerasyonu kolaylaştırdıkları kaydedilmiştir12. NGF

konsantrasyonunun yaralanmadan sonra oldukça azaldığı yaygın olarak kabul

66

edilmektedir12,20. Çalışmamızda bunu kompanse etmek amacıyla sıçanlara 2 hafta

süreyle perioperatif olarak eksojen NGF verildi. NGF uygulanan gruplarda sinir lifleri

ve hücresel yapının nispeten korunmuş olması (Şekil 16,17), fonksiyonel iyileşmenin

deney kontrol grubuna göre daha fazla olması (Şekil 29), muhtemelen NGF’nin uyarıcı

etkisiyle yaralı bölgede Schwann hücrelerinin prolifere oldukları ve aksonal

rejenerasyonu sağladıkları ileri sürülebilir.

Schwann hücrelerinin rejenerasyon sırasında, akson filizlerinin effektör hücre ve

dokulara ulaşmasında rehberlik ettikleri bilinmektedir4. Bununla birlikte, rejenere

aksonların doğru hücre bandlarına ulaşmalarının mekanizması hala tam olarak

bilinmemektedir14,20. Schwann hücrelerinin bazal laminasının rehber yol oluşumunda

önemli bir role sahip olduğu, muhtemelen NGF’nin uyarıcı etkisiyle hücre

proliferasyonunun oluştuğu, bu yolla da fonksiyonel iyileşme üzerine etkili olduğu

düşünülmektedir.

Sıçan siyatik sinirinde ezilme tipi yaralanmadan sonra NGF ve betametazon

kombinasyonunun etkilerinin incelendiği bu çalışma, literatür bilgilerine göre ilk defa

yapılmaktadır. Steroidlerin, antienflamatuvar ve antiödematöz etkileriyle, NGF’nin

akson rejenerasyonu üzerine uyarıcı etkilerinin birlikte değerlendirildiği,

NGF+Betametazon kombine tedavi grubunda, siyatik sinirin ışık mikroskobik (Şekil

22), ultrastrüktürel (Şekil 23,24,25) ve histomorfometrik bulgularının (Şekil 30,31,32),

bu maddelerin tek başına uygulandığı gruplar ve deney kontrol grubu ile

karşılaştırılmasında, kombine tedavinin, sinir iyileşmesinde anlamlı olarak etkili olduğu

bulundu. Ayrıca, kombine grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı (Şekil 27), SOD

enzim seviyesinin yükseldiği (Şekil 28), motor fonksiyonel iyileşmenin de anlamlı

olarak artış gösterdiği (Şekil 29) dikkati çekti.

Betametazonun, antienflamatuvar ve antiödematöz etkileri ile yaralı bölgede

sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid

peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu

arttırdığını, böylece her iki maddenin sinerjik etkisiyle, kombine grupta gözlenen

verilerin oluştuğu söylenebilir. Gerçektende Li et al. sıçanlarda spinal kord yaralanması

sonrası nörotropik bir madde olan BDNF ve steroid madde metilprednisolone

kombinasyonunun etkilerini inceledikleri çalışmalarında, kombine tedavinin spinal

korda, periferik kan kökenli enflamatuvar hücrelerin infiltrasyonunun azalttığını,

67

aksonal miyelinizasyonu arttırdığını ve fonksiyonel iyileşmeyi hızlandırdığını rapor

etmişlerdir.

Periferik sinir yaralanması sonrası gelişen sinir rejenerasyonunun objektif

değerlendirmelerinden birisi de, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin sayısal

dağılımları, oryantasyonları, akson çapları, ve miyelin kılıf kalınlıklarının

ölçülmesidir12,34,36. Çalışmamızda, ezilme tipi sinir yaralanmasını takiben 6 hafta sonra

elde edilen sinir kesitlerinde, miyelinli sinir lifi sayısı, akson çapları ve miyelin kılıf

kalınlıkları değerlendirildi (Şekil 30,31,32). Sağlam ve deney kontrol gruplarının tedavi

grupları ile karşılaştırılması yapıldığında, tedavi gruplarında, miyelinli sinir lifi sayısı,

akson çapı ve miyelin kılıf kalınlığının, deney kontrol grubuna göre artış gösterdiği

belirlendi. Bununla beraber, akson çapları deney kontrol grubuna göre bir miktar artış

göstermekle birlikte, farkın istatistiksel açıdan önemli olmadığı görüldü. Buna karşın,

NGF+Betametozon kombine tedavi grubunda miyelinli sinir lifi sayıları, akson çapları

ve miyelin kılıf kalınlıklarının anlamlı olarak arttığı bulundu (Şekil 30,31,32). Kombine

tedavinin etkisiyle, sinir rejenerasyonu için uygun ortamın yaratıldığını, nöronların ve

Schwann hücrelerinin uyarılması sonucu aksonların rejenere olduklarını, akson

sayılarının ve çaplarının arttığını ve rejenere aksonlar etrafında miyelin yapımının

uyarıldığını söylemek yanlış olmayacaktır.

Sinir yaralanmalarını takiben, kesi oluşmadığında veya kesi anastomozundan

sonra normal şartlarda da sinir rejenerasyonun meydana geldiği yaygın olarak kabul

edilmektedir2,3. Bu durumda, motor fonksiyonel iyileşmenin daha az oranda

gerçekleştiği, iyileşme sürecinin geciktiği, yaralı alanda skar dokusunun geliştiği ve

sıklıkla nöroma oluşumuna rastlandığı rapor edilmiştir42. Yaralanmış sinirde yapısal

değişikliklerin ortadan kaldırılması, normal yapının yeniden kazandırılması ve sonuçta

da fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştirilmesi en önemli hedeftir. Bu amaçla, sinir

konduitleri6,12silikon kaplamalar17, çeşitli kimyasal maddeler44 ve nörotropik

maddeleri4,6,34,36,47,48 içeren medikal tedavilerin uygulanması ve geliştirilmesine yönelik

çalışmalar hala sürdürülmektedir.

Sonuç olarak, sıçanlarda ezilme tipi siyatik sinir yaralanması sonrası NGF,

betametazon ve NGF+betametazon kombine tedavisinin uygulandığı bu çalışmada,

NGF ve betametozon tedavilerinin ayrı ayrı uygulandığı gruplarda sinir

rejenerasyonunun meydana geldiği, NGF+betametazon kombine tedavisinin

68

uygulandığı grupta, lipid peroksidasyonunun azaldığı, SOD aktivitesinin arttığı, ayrıca

sinir rejenerasyonu, miyelin kılıf oluşumu ve anlamlı motor fonksiyonel iyileşmenin

gerçekleştiği bulundu. Betametazonun, antienflamatuvar ve antiödematöz etkisiyle,

yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve ödemi azalttığı, lipid

peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir rejenerasyonunu

arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine tedavi uygulanan grupta

gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle, NGF+betametazon

kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının medikal tedavisinde dikkate

alınabileceği sonucuna varıldı.

69

6. SONUÇLAR

Deneysel siyatik sinir yaralanmasında, sinir büyüme faktörü (NGF) ve

betametazon uygulamasının etkilerinin, footprint analizi, ışık, elektron mikroskopi,

histomorfometri ve biyokimyasal yöntemlerle araştırılmasının amaçlandığı bu çalışma

sonucunda;

1- Siyatik sinir ezilmesi sonrasında yalnızca serum fizyolojik verilen kontrol

grubunun ışık ve elektron mikroskobik incelenmesinde, miyelinli sinir liflerinde

akson ve miyelin kılıfta önemli yapısal değişikliklerin oluştuğu,

2- Deney kontrol grubunda, sağlam gruba göre MDA seviyesinin anlamlı olarak

yükseldiği, SOD aktivitesinin azaldığı,

3- Deney kontrol grubunda, miyelinli sinir lifi sayısı, akson çapı ve miyelin

kalınlığının sağlam gruba göre anlamlı olarak azaldığı,

4- Motor fonksiyonel iyileşmenin değerlendirildiği footprint analizi sonuçlarına

göre deney kontrol grubunda da kısmi iyileşmenin oluştuğu,

5- Yaralanma sonrası perioperatif olarak yalnızca NGF verilen grubun ışık ve

elektron mikroskobik değerlendirilmesinde, bazı alanlarda yapısal bozuklukların

varlığı izlenmekle birlikte, sinir liflerinin yapılarının deney kontrol grubuna göre

nisbeten normal olduğu,

6- Yalnızca NGF verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, MDA seviyesinde

hafif azalma ve SOD aktivitesinde hafif artışın meydana geldiği,

7- Yalnızca NGF verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, footprint analizinde,

35. günde bir miktar artış olmakla birlikte, farkın istatistiksel açıdan önemli

olmadığı,

8- Yaralanma sonrası perioperatif olarak yalnızca betametazon verilen grubun ışık

ve elektron mikroskobik incelenmesinde, sinir liflerinin bazılarında miyelin kılıf

hasarı, aksonal değişiklikler izlenmekle birlikte, görünümün daha çok yalnızca

NGF uygulanan gruba benzerlik gösterdiği,

9- Yalnızca betametazon verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, MDA

seviyesinde azalma ve SOD aktivitesinde hafif artışın meydana geldiği,

70

10- Yalnızca betametazon verilen grupta, deney kontrol grubuna göre, footprint

analizinde, her nekadar, 28. günde bir miktar artış olmakla birlikte, farkın

istatistiksel açıdan önemli olmadığı,

11- Yalnızca NGF ve betametazon verilen gruplarda, MDA seviyeleri, SOD

aktiviteleri ve footprint analiz sonuçlarının birbirleriyle karşılaştırılmasında,

farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı,

12- Yalnızca NGF ve betametazon verilen gruplarda, miyelinli sinir sayısı, akson

çapı ve miyelin kılıf kalınlığında bazı küçük farklılıklar görülse de,

histomorfometrik sonuçlar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı

olmadığı,

13- Yaralanma sonrası perioperatif olarak NGF+betametazon kombine tedavisi

uygulanan grubun ışık mikroskobik değerlendirilmesinde, sinir

rejenerasyonunun belirgin olduğu, miyelinli ve miyelinsiz sinir liflerinin

yapılarının çoğunlukla normal olduğu,

14- NGF+Betametazon kombine tedavisi uygulanan grupta footprint analizi

incelendiğinde, deney kontrol, NGF ve betametazon gruplarına göre anlamlı

olarak motor fonksiyonel iyileşmenin gerçekleştiği,

15- NGF+Betametazon kombine tedavisi uygulanan grupta, deney kontrol, NGF ve

betametazon gruplarına göre anlamlı olarak, MDA seviyesinde azalma ve SOD

aktivitesinde artışın meydana geldiği dikkati çekti.

Bütün bu sonuçlar dikkate alındığında, betametazonun antienflamatuvar ve

antiödematöz etkisiyle, yaralı bölgede sinir rejenerasyonuna engel olabilecek fibrozis ve

ödemi azalttığı, lipid peroksidasyonunu engellediği, NGF’nin de uyarıcı etkisiyle, sinir

rejenerasyonunu arttırdığı, böylece her iki maddenin birlikte etkisiyle, kombine tedavi

uygulanan grupta gözlenen iyileşmenin sağlandığı düşünüldü. Bu nedenle,

NGF+betametazon kombinasyonunun, periferik sinir yaralanmalarının tedavisinde

dikkate alınabileceği sonucuna varıldı.

71

7. KAYNAKLAR

1. Robinson LR. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle & Nerve, 2000; 23: 863-873. 2. Burnett MG, Zager EL. Pathophysiology of peripheral nerve injury: a brief review. Neurosurg Focus, 2004; 16 (5): 1-7. 3. Stoll G, Müller HW. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathology, 1999; 9: 313-325. 4. Frostick SP, Yın Q and Kemp GJ. Schwann cells, neurotrophic factors, and peripheral nerve regeneration. Microsurgery, 1998; 18: 397-405. 5. Quan D, Bird S. Nerve conduction studies and electromyography in the evaluation of peripheral nerve injuries. Orthopaedic Journal, 1999; 12: 45-51. 6. Pagnotta A, Tos P, Fornaro M, Gigante A, Geuna S, Battiston B. Neurotrophins and their receptors in early axonal regeneration along muscle-vein-combined grafts. Microsurgery, 2002; 22: 300-303. 7. Hirata Kazuho and Kawabuchi Masaru. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during wallerian degeneration. Microscopy Research and Technique, 2002; 57:541-547. 8. Jones LL, Oidega M, Bunge MB and Tuszynski MH. Neurotrophic factors, cellular bridges and gene therapy for spinal cord injury. J Physiology, 2001; 533.1: 83-89. 9. Zochodne DW. The microenvironment of injured and regenerating peripheral nerves. Muscle Nerve Supplement, 2000; 9:33-38. 10. Ansselin AD, Fink T, Davey DF. An alternative to nerve grafts in peripheral nerve repair: Nerve guides seeded with adult Schwann cells. Acta Chururgica Austriaca , 1998; 147: 19-24. 11. Midha R, Munro CA., Dalton PD, Tator CH and Shoiched MS. Growth factor enhancement of peripheral nerve regeneration through a novel synthetic hydrogel tube. J Neurosurg, 2003; 99:555-565. 12. Gravvanis AI, Tsoutsos DA, Tagaris GA, Papalois AE, Patralexis CG, Iconomou TG, Panayotou PN, and Ioannovich JD. Beneficial effect of nerve growth factor-7S on peripheral nerve regeneration through inside-out vein grafts: an experimental study. Microsurgery, 2004; 24:408-415. 13. Sheng CY, Liang HC, Chuan TC, Hsin CT, Chiang CW, Li HC, Hsu YC. Peripheral nerve regeneration using silicone rubber chambers filled with collagen, laminin and fibronectin. Biomaterials 2000; 21: 1541-1547. 14. Makwana M, Raivich G. Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. FEBS Journal, 2005; 272: 2628-2638 15. Evans GRD. Challenges to nerve regeneration. Seminars in Surgical Oncology, 2000; 19: 312-318. 16. Gordon T, Sulaiman O, Boyd GJ. Experimental strategies to promote functional recovery after peripheral nerve injuries. J Peripheral Nervous System, 2003; 8: 236-250. 17. Al-Bishri A, Dahlin L, Sunzel B and Rosenquist J. Systemic betamethasone accelerates functional recovery after a crush injury to rat sciatic nerve. J Oral Maxillofac Surg, 2005; 63(7): 973-977.

72

18. Melcangi RC, Cavarretta IT, Ballabio M, Leonelli E, Scheone A, Azcoitia I, Magnaghi V. Peripheral nerves: a target for the action of neuroactive steroids. Brain Research, 2005; 48(2): 328-338. 19. Mendonca AC, Barbieri HC, Mazzer N. Directly applied low intensity direct electric current enhances peripheral nerve regeneration in rats. J Neuroscience Methods, 2003; 129:183-190. 20. Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors. J Anat, 1999; 194: 1-14. 21. Funakoshi H, Risling M, Carlstedt T, Lendahl U, Tımmusk T, Metsis M, Yamamoto Y and Ibanez CF. Targeted expression of a multifunctional chimeric neurotrophin in the lesioned sciatic nerve accelerates regeneration of sensory and motor axons. Proc Natl Acad Sci, 1998; 95: 5269-5274. 22. Bervar M. Video analysis of standing-an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neuroscience Methods, 2000; 102:109-116. 23. De Medicanelli L, Freed WJ, Wyatt RJ. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology, 1982; 77: 634-643. 24. Varejao AS, Meek MF, Ferreira AJ, Cabrita AM. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat : walking track analysis. J Neuroscience Methods, 2001; 108: 1-9. 25. Ross MH, Pawlina W. Histology: A text and atlas. Baltimore, Philadelphia, 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2006. 26. Junqueira LC, Carneiro J. Basic Histology: Text and atlas. 10th ed, New York, LANGE Mc Graw- Hill, 2003. 27. Mirajullah M, Xinya S. Schwann cells: Leader of nervenkitt. J Ayub Med Coll Abbottabad, 2002; 14 (1): 30-33. 28. Fernandez E, Pallini R, Lauretti L, Scogna A. Neurosurgery of the peripheral nervous system: ınjuries, degeneration and regeneration of the peripheral nerves. Surg Neurol, 1997; 48: 446-447. 29. Stoll G, Jander S and Myers RR. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripheral Nervous System, 2002; 7: 13-27. 30. Patsalos PN, Bell ME, Wiggins RC. Pattern of myelin breakdown during sciatic nerve wallerian degeneration: reversal of the order of assembly. J Cell Biology , 1980; 187: 1-5. 31. Behnam-Rasouli M, Nikravesh MR, Mahdavi-Shahri N, and Tehranipour M. Post-Operative Time Effects after Sciatic Nerve Crush on the Number of Alpha Motoneurons, Using a Stereological Counting Method (Disector). Iran Biomed J, 2000; 4: 45-49. 32. Cunha MTR, Silva AL, Fenelon SB. Comparison of nerve graft integration after segmentar resection versus epineural burying in crushed rat sciatic nerves. Acta Cir Bras, 1997; 12 (4): 221-5 33. Boyd JG and Gordon T. Glial cell line-derived neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor sustain the axonal regeneration of chronically axotomized motoneurons in vivo. Experimental Neurology, 2003; 183: 610-619. 34. Santos X, Rodrigo J, Hontanilla B and Bilboa G. Evaluation of peripheral nerve regeneration by nevre growth factor locally administered with a novel system. J Neuroscience Methods, 1998; 85 (1): 119-127. 35. Xu X, Yee WC, Hwang PYK., Yu H, Wan ACA, Gao S, Boon KL, Mao HQ, Leong Kam WL and Wang S. Peripheral nerve regeneration with sustained release of poly (phosphoester)

73

microencapsulated nevre growth factor within nerve guide conduits. Biomaterials, 2003; 24 (13): 2405-2412. 36. Lee AC, Yu VM, Lowe YB, Brenner MJ, Hunter DA, Mackinnon SE, Elbert-Sakiyama SE. Controlled release of nerve growth factor enhances sciatic nerve regeneration. Experimental Neurology, 2003; 184 (1): 295-303. 37. Okhawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxidase in animal tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979; 95:351. 38. Durak I, Yurtaslanlı Z, Canpolat O, Akyol O. A methodological approach to superoxide dismutase (SOD) activity assay based on inhibition of nitroblue tetrazolium (NBT) reduction. Clin Chim Acta, 1993; 214: 103-104. 39. Varejao AS, Melo-Pinto P, Meek MF, Filipe VM, Blulas-Cruz J. Methods for experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Neurological Research, 2004; 26: 186-194. 40. Varejao AS, Cabrito AM, Meek MF, Blulas-Cruz J, Melo-Pinto P, Raimondo S, Geuna S, Giacobini- Roberchi MG. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma, 2004; 21: 1652-1670. 41. İldan F, Öner A, Polat S, İsbir T, Göcer İ, Kaya M, Karadayı A. Correlation of alterations on Na+-K+/Mg+2 ATP ase activity, lipid peroxidation and ultrastructural findings following experimental spinal cord injury with and without intravenous methylprednisolone treatment. Neurosurg Rev, 1995; 35-44. 42. Atkins S, Smith KG, Loescher AR, Boissonade FM, Ferguson MWJ, Robinson PP. The effect of antibodies to TGF-β1 and TGF-β2 at a site of sciatic nerve repair. J Peripheral Nervous System, 2006; 11:286-293. 43. Nasser RM, Chen LE, Seaber AV, Urbaniak JR. Protective effect of 21-aminosteroid pretreatment in peripheral nerve low-load crush injury in mature and immature rats. J Orthop Res, 1996; 14: 823-829. 44. Subbana PKT, Prosanna CG, Gunale BK, Tyapi MG. Acetyl salicylic acid augments functional recovery following sciatic nerve crush in mice. J Brachial Plexus Peripheral Nerve Injury, 2007; 2: 1-4. 45. Becker KW, Kienecker EW, Andrea I. Effect of locally applied corticoids on the morphology of peripheral nerves following neurotmesis and microsurgical suture. Neurochirurgia, 1987; 30: 161-167. 46. Lieven CJ, Hoegger MJ, Schliene CR, Lewin LA. Retinal ganglion cell axotomy induces an increase in intracellular superoxide anion. Invest Ophthalmol Vis, 2006; 47: 1477-1485. 47. Hirata A, Masaki T, Motoyoshi K and Kamakura K. Intrathecal administration of nerve growth factor delays GAP 43 expression and early phase regeneration of adult rat peripheral nerve. Brain Research, 2002; 944 (1-2): 146-156. 48. Li L, Xu Q, Wu Y, Hu W, Gu P, Fu Z. Combined therapy of methylprednisolone and brain derived neurotrophic factor promotes axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats. Chin Med J, 2003; 116 (3): 414-418.

74

ÖZGEÇMİŞ

Leman Sencar, 1981 yılında Mersin’de doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini

Mersin’de tamamlayan Leman Sencar, 1999 yılında İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa

Tıp Fakültesi Tıbbi Biyolojik Bilimler Bölümünü kazandı ve 2003 yılında da mezun

oldu. 2004 yılında, Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji-Embriyoloji Anabilim

Dalı’nda Yüksek Lisans eğitimine başlayan Leman Sencar, 2006 yılında Histoloji-

Embriyoloji Anabilim Dalına Araştırma Görevlisi olarak atandı. Arş.Gör.Leman

Sencar, halen aynı Anabilim Dalında görevini sürdürmektedir.

deneysel sİyatİk sİnİr yaralanmasinda betametazon ve sİnİr … · deneysel siyatik sinir...

Documents