DNA HİBRİDİZASYONU

HAZIRLAYANLAR:

Beyhan KORKMAZ (040559019)

Prof. Dr. Figen ERKOÇ

GAZİ EĞİTİM FAKÜLTESİ

DNA hibritleşmesi; birbirine komplementer iki tek zincir nükleik asit sekansının çift zincirli tek bir yapı haline gelmesi işlemidir.

Sentetik olarak çoğaltılmış ve DNA probları olarak hazırlanmış spesifik DNA parçalarının, sekansıaraştırılacak olan hedef DNA molekülü ile birleştirilmesi işlemine "hibridizasyon" denir.

Nükleotidlerin, normal şartlar altında komplementer bağlanma özellikleri vardır. DNA'da Guanin ile Sitozin ve Adenin ile Timinbirbirine komplementerdir. Bu yüzden birbirine tamamen komplementer iki tek zincir nükleikasit dizisi kolaylıkla birbirine tanır; eşleşir ve yeniden çift zincir oluşturur. Buna "yapışma" adı verilir.

İki zincirden birinde bulunan tek nükleotid farklılığı bile yapışmayı zorlaştırır. Bu işlemin tersine "denatürasyon" ya da "erime" adı verilir. Çift zincirli bir DNA molekülü sıcaklık veya pHile denatüre edilebilir. Bu durumda çift zincir açılıp tek zincir haline gelir. DNA'nın hibritleşme ve denatüre olma özelliğinden birçok moleküler teknikte yararlanılmaktadır.

Hibridizasyon, genellikle, iki tür arasındaki genetik uzaklığın bulunmasında kullanılır. Bu tekniği ilk geliştiren Charles Sibley ve Jon Alqhuist, DNA-DNA hibridizasyonunu, kuşlar ve primatlararasındaki filogenetik akrabalıkları sınıflandırmada kullanmışlardır. DNA sekans analizi ve hibridizasyon deneyleri günümüzde mikrobiyolojide bakterilerin tanımlanmasında kullanılmaktadır.

Metodun Kısa Özeti

Örnek DNA’nın eritilip, tekrar kendini eşlemesi ve bu şekilde çoğaltılmasına dayanan bir tekniktir.İki türün DNA'sı izole edilir.Parçalar küçük baz çiftlerine kesilir.Parçalar izole edilir. İzole edilen parçalar karşılaştırılır.

İnfeksiyonların erken, kesin ve güvenilir teşhislerinde son 5-10 yıl içinde pratiğe konan biyoteknolojik yöntemler oldukça yararlı olmuşve konvansiyonel tekniklerin boşluklarınıdoldurmaya ve gidermeye başlamıştır. Bu metotlar başlıca 2 grup altında toplanabilirler. Bunlardan ilki etkenlerin genetik materyallerinin saptanması (hibridizasyonyöntemleri) dir.

Hibridizasyon MetodlarıHibridizasyon metodları, genellikle, incelenen materyalde (doku, organ, hücre kültürü, ekstrakt, sekresyon sıvısı vs.) bulunan hastalık edici etkenlerin veya bu dokulara ait hücre DNA’larındaki spesifik genlerin işaretli problarla ortaya konulmasını amaçlar. Son yıllarda hibridizasyon tekniklerinde bazı gelişmeler yapıldığından testler daha kolay, hızlı, etkin ve güvenilir hale getirilmiştir. Bunlar arasında en fazla kullanılanlardan bazılarının dayandığı prensipler aşağıda kısaca verilmektedir.

1. Southern Blot Hibridizasyonu

Bu tekniğin basamakları, sırasıyla:

1) Genomik DNA’nın izolasyonu: Patolojik materyalden izole edilen mikroorganizma (bakteri, virus, parazit vs.), saf kültür halinde üretilir ve DNA’ları ekstrakte edilir.

Eğer, bakteri DNA’sı kullanılacak ise, önce mikroorganizmanın hücre duvarı ve dış membranları lizozimve diğer enzimler kullanılarak patlatılır (lizis). Ayrıca, ekstraksiyon çözeltisine SDS (sodyum dodesil sülfat), proteinaz K ve RNase’lar da katılarak, DNA dışındaki bütün komponentler uzaklaştırılır. DNA’nın endojen nükleazlardankorunması için, enzim aktivatörü olan Mg iyonlarınıbağlayarak bir çok enzimin inhibe edebilen, EDTA eklenir.

Eukaryotlarda, ekstraksiyon tamponuna fenol veya kloroform da ilave edilerek DNA’nın suda çözünen proteinlerden ayrılması sağlanır. Polisakkaridleri uzaklaştırmak için de sezyum klorür dansite gradiyenti santrifüjlemesi yapılır. Plasmid, faj ve virüslere ait genetik materyalin (DNA) elde edilmesinde ve izolasyonunda özel, modifiye metodlar kullanılmaktadır.

2) Özgül restriksiyon endonükleazlarıyla (RE) sindirme: Hedef DNA saf olarak elde edildikten sonra, çok az miktarda (0.5 - 5 µg, bu miktar kullanılan hedef DNA’nın türüne göre değişebilir) alınarak ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine, sindirimde kullanılacak RE enziminden, tam bir sindirim sağlayabilecek miktarda ilâve edilir ve bir süre (genellikle, 37°C’de 4-6 saat kadar)inkübasyona bırakılır. Örnek RE enzimler: EcoRl, Hind III, BamHI.

3) Parçaların (fragman) elektroforezi:Parçalanan DNA, çözelti halinde agarose jele (PAGE'de olabilir) uygulanarak uygun bir süre, bazen bir gece 40-50 volt altında elektroforezetabi tutulur. Bu separasyon sırasında fragmentler büyükten küçüğe doğru bir sıralama ile bantlar oluşturur. Büyükler başlangıç yerinde, küçük segmentler de karşı uçta lokalize olur.

Bu safhada jel üzerinde oluşan bantlar etidyumbromür ile boyanarak UV-ışını altında görüntülenebilir ve bantlar, standard bantla karşılaştırılarak değerlendirilir.

4) Bantların membran üzerine transferi (Southern transfer): Agarose jel (veya PAGE) üzerinde bulunan bantların naylon veya nitroselüloz membran üzerine transferleri yapılır.

5) Denatürasyon ve fiksasyon: Naylon üzerine transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0.5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift zincirli DNA, bazlar arası bağlar koparak tek zincir haline gelir). Bu aşamadan sonra naylon membran, 80°C’ye kadar ısıtılarak, tek zincirlerin membran üzerine sabitlenmesi (fiksasyon) sağlanır.

6) Hibridizasyon: Naylon membran önce, pre-hibridizasyon çözeltisi içinde 60-65°C’de 2-4 saat kadar tutulur; sonra yıkanır. Bu aşamadan sonra, membran üzerine işaretli DNA prob(veya RNA prob) ilâve edilir.

Problar 32P (veya biyotinle) işaretli olabilir. Membran üzerine konulan tek zincirli ve işâretli prob, kendine komplementer olan tek zincirli hedef DNA segmenti ile non-kovalent bağlarla karşılıklı olarak birleşir ve çift zincirli DNA x DNA dubleksi (eğer RNA prob kullanılırsa DNA x RNA dubleksi) oluşur. Hibridizasyongerçekleşir.

Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra, membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek zincir hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek zincir problar uzaklaştırılır ve böylece membranüzerinde sadece çift zincirli sekanslar kalır.

7) Otoradyografi: Naylon membran üzerine, X-ışınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR-2) kapatılarak -70°C’de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin filmi etkilemesi sağlanır. Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde, işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen bulunur ve teşhis konulur.

Eğer probları işâretlemede biotin kullanılmışise, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri gösterir.

2. Northern Blot Hibridizasyon

Bu teknik genelde, Southern blotting yöntemine benzer. Ancak, DNA yerine mRNA, viral RNA veya total RNA kullanılır. Buna göre, RNA’nın agarose jel üzerinde ayrılması, filtreye transferi, spesifik probla(RNA veya DNA) hibridizasyonu ve otoradyografisi, Northern Blot Hibridizasyonu olarak adlandırılır. Bu teknik, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNAseviyesini belirlemede ve viral RNA’lar arasındaki farkın tespitinde kullanılır.

Southern blottinge benzeyen bu teknikte RNA’ların restriksiyon enzimleri ile kesimi işlemi yoktur. Bu aşama atlanıldığı için zamandan ve maliyetten önemli tasarruf sağlanmaktadır.

Northern blot hibridizasyonunun başlıca safhalarıözetle: 1) RNA’nın izolasyonu (total hücresel RNA, mRNA, viral RNA, vs.).2) RNA’nın elektroforezde ayrılması. 3) RNA’ların naylon membrana transferi (Northerntransfer).4) İşâretli DNA veya RNA problarıyla hibridizasyon. 5) Otoradiografı ile görüntüleme ve değerlendirme.

3. Dot Blot Hibridizasyonu

Bu yöntemde, genomik DNA segmentlerihibridizasyondan önce elektroforetik bir ayrılmaya tabi tutulmaz.Patolojik materyalden izole edilen nükleik asit ekstrakte edilir ve konsantre edilir. Bu aşamadan sonra örnekler iki veya 5 defa sulandırılır. Her örneğe ait dilüsyonlardannaylon veya nitroselüloz membran üzerine birer damla damlatılır.

Burada denatürasyona tabi tutularak membranüzerine fikse edilirler. Üzerlerine 32P işâretli spesifik tek zincir problar ilave edilir. Bu aşamadan sonraki işlemlere aynen Southernblotting de olduğu gibi devam edilir. Film üzerinde oluşan koyu lekeler hibridizasyonbölgelerini ve dolayısıyla de aranan DNA sekanslarını veya mikroorganizmaya ait spesifik bazları gösterir.

4. İn situ Hibridizasyon

Bu teste infekte doku kültürleri, biyopsi materyalleri, doku süspansiyonları, periferalkan ve benzeri numunelerden bir damla lam üzerine konur. Denatürasyondan sonra işâretli (32P, biotin-avidin, vs.) cDNA prob ilâve edilerek hibridizasyon sağlanır. Mikroorganizmaların DNA’larının bulunduğu yerler kolayca belirlenir.

Bu test doku kesitleri ile de yapılabilir. Örnek, infekte akciğer dokusu nötral formalinli tampon içinde fikse edilir, parafinlenir ve ince kesitler (5 µm’lik) alınır. Kesitler parafinleri giderildikten ve dehidrate edildikten sonra temiz bir lam üzerine alınır ve üzerine biotinle işaretli cDNAprob konur ve her ikisi birden denatürasyonatabi tutulur (90°C’de 5 dakika).

Karışım 37°C’de 18-24 saat tutularak hibridizasyon sağlanır. Sonra ortama avidin-biotin peroksidaz kompleksi katılır. Renk değişimi olan bölgeler aranan mikroorganizma DNA segmentlerininbulunduğu yerlerdir.

Genomik hibridizasyon. Referans DNA yeşil bir florokrom ile (şekilde açık mavi) boyanır. Teste tabi tutulan DNA şekilde koyu mavidir. Her iki DNA örneği karıştırılır ve insan DNA sekanslarıyla yasoldaki gibi metafaz kromozomları üzerinde veya sağdaki gibi cam mikroarray lamında hibritleştirilir. Test DNA’sında delesyonlar yeşil görülür (şekilde açık mavi verilmiştir) ve duplikasyonlar da kırmızıhibridizasyonlar olarak verilmiştir (şekilde koyu mavi).

Hedef DNA’nın DNA SAM probu ile hibridizasyonu. DNA SAM probunda tek ve çift zincirli kısımlar bulunmaktadır.

Nükleik asit hibridizasyonu. (A) Eğer DNA sarmalı iki zincire ayrılırsa, uygun iyonik şartlar ve sürede zincirler tekrar birleşir (anneal). (B) Benzer olarak, eğer DNA iki zincirine ayrıldıysa, RNA kodlanan ilgili genlere bağlanabilmelidir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PCR)

DNA’da yer alan, sekansı bilinen iki segment arasındaki belirli bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan reaksiyonlara verilen ortak bir isimdir. Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun şartlarda çoğaltılmasıesasına dayanır.

94°C-98°C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon37°C-65°C aralığında sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması‘hibridizasyonu’72°C’de gerçekleştirilen zincirin uzaması‘polimerizasyonu’ (çift zincirli DNA’ların sentezi) ve bu siklusların belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır.

Metodun temeliÇoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerini tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift zincirli DNA’ların sentezi) iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.

PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya imkân sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar teşhisinde çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir.

PCR KULLANIM ALANLARI1. Kalıtsal hastaliklarda taşıyıcının ve hastanın

teşhisi.2. Perinatal teşhisde.3. Klinik numunelerde patojen organizmaların

teşhisinde.4. Adlî tıp uygulamalrında.5. Kanser araştırmalarında.6. Probe'ların oluşturulmasında/klonlamada/gen

ekspresyonu araştırmalarında.

7. DNA sekans analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında.

8. Bilinmeyen sekansların tayininde.9. Geçmiş DNA'nin incelenmesi ve moleküler

filogeninin aydınlatılmasında.10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm

RFLP) analizinde.

11. İn vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasi ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmunun sağlanması.

12. DNA-protein etkileşmesinin araştırılmasında (footprinting) kullanilabilir.

PCR CİHAZI

KAYNAKLAR

http://www.medicine.ankara.edu.tr/internal_medical/pediatrics/mol-gen/index.php?PgId=70

http://ansiklopedi.turkcebilgi.com/hibritleşmehttp://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htmhttp://www.blackwellpublishing.com/korfgenetics/figure.asp?chap=06&fig=Fig6-25

• http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32• http://www.nanonet.go.jp/english/mailmag/2005/053b.html

• http://www.mikrobiyoloji.org/dokgoster.asp?dosya=110016200

• http://evolution.berkeley.edu/evosite/history/genetsims2.shtml

• http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32• http://www.nanonet.go.jp/english/mailmag/2005/053b.html

• http://www.mikrobiyoloji.org/dokgoster.asp?dosya=110016200

http://escience.ws/b572/L22/L22.htm