DNR replikacija (3)

DNR replikacija – tai DNR sintez ÷.

DNR replikacija visuose organizmuose neatsiejama nuo l ąstel ÷s dalijimosi. Replikacijos pabaiga - signalas l ąstelei dalintis.

Genų produktai, kontroliuojantys l ąstel ÷s cikl ą, inicijuoja DNR replikacij ą.

DNR REPLIKACIJOS YPATUMAI

Prokariotuose

1. Replikacijos inicijacija vyksta S faz ÷s pradžioje. 2. Prasideda ori taške. 3. Bakterijos turi tik vien ą chromosom ą, t.y. vien ą, didel ę žiedin ę DNR

molekul ę, tod÷l jų ląstel ÷je yra tik vienas ori taškas.4. Chromosomos ori sritis yra r ūšiai specifiška. Vienos r ūšies ori seka

nefunkcionuoja kitos r ūšies l ąstel ÷se. 5. Replikacijos vienetas vadinamas replikonu. 6. Bakterijose replikonas - chromosoma, arba plazmid ÷, arba bakteriofagas.

Replikonas yra DNR fragmentas, kuriame replikacijos cik las vyksta vien ąkart ą kiekviename l ąstel ÷s dalijimosi cikle.

7. Plazmid ÷s ir fagai - išimtys, jie gali replikuotis ir kelet ą kartų per vien ąląstel ÷s cikl ą. Kiekvienas chromosominis replikonas turi ori taip pat i r tersrit į, tai yra replikacijos pradžios srit į ir replikacijos pabaigos srit į.

DNR REPLIKACIJOS YPATUMAI

Eukariotuose

1. Eukariotin ÷ ląstel ÷ turi bent kelet ą chromosom ų. 2. Kiekviena eukariotin ÷ chromosoma turi daug ori tašk ų. Pav. miel ÷s S.

cerevisiae turi 16 chromosom ų. S faz÷je miel ÷se randama apie 700 ori, kurie išd ÷styti maždaug kas 40 kb.

3. Ori jokio produkto nekoduoja, replikacijai b ūtina pati DNR seka.

Replikacija reguliuojama tik inicijacijos taške.

Replikacija, prasid ÷jusi ori srityje, suformuoja vadinam ą replikacijos šakut ę, DNR grandin ÷s prasiskiria, išvyniojamos ir sintetinamos komplementa riosgrandin ÷s.

Replikacija gali b ūti vienkrypt ÷ arba dvikrypt ÷.

Vienkrypt ÷je replikacijoje susiformuoja tik viena replikacijos šaku t÷. Tokia replikacija vyksta kai kuriuose faguose bei plazmid ÷se.

Sud÷tingesn ÷se sistemose (bakterij ų chromosomos arba eukariotini ųchromosom ų) replikacija vyksta dviem kryptimis, t.y. susiformuoja dvireplikacijos šakut ÷s ir replikacija vyksta į priešingas puses nuo ori.

Organizmas Replikon ų Vidutinis repl. Šakut ÷s jud ÷jimoskai čius dydis greitis

Bakterijos 1 4600kb 50000bp/min Miel÷s 700 40kb 3600 bp/min Drozofila 3500 40kb 2600 bp/min Pel÷ 25000 150 kb 2200 bp/min

DNR REPLIKACIJOS YPATUMAI

PROKARIOTŲ DNR REPLIKACIJA

DNR Pol I (polA)Fermento dydis 103 kDa, 928 ar, 400 molekuli ų/ląstel ÷je.

Aktyvumai: polimerazinis 5’ - 3’ egzonukleazinis 5’ - 3’ (graužia nuo galo); svarbus nick -transliacijaiegzonukleazinis 3’ - 5’ (klaid ų taisymas) RNaz÷s H aktyvumasAtvirkštin ÷s transkriptaz ÷s aktyvumas

Šis fermentas n ÷ra pagrindinis replikacijos fermentas, nors joaktyvumas l ąstel ÷je gana didelis. DNR PolI dalyvauja reparacijoje: SOS s ąlygomis klaidas daran čiojereparacijoje, taip pat poreplikacin ÷je reparacijoje.

E. coli DNR polimeraz ÷s

DNR Pol II (polB)

Fermentas turi 5’-3’ polimerazin į aktyvum ąnukleazin į 3’-5’

Optimalus šio fermento pradmuo - DNR dupleksas su skyle. Fermentas dalyvauja reparacijoje. SOS indukcija, t.y. dideli DNR pažeidimai didina šio fe rmentoaktyvum ą ląstel ÷je apie 7 kartus. Bet ir reparacijoje jis n ÷ra esminis, nes mutantai nepasižymi augimo arreplikacijos defektais.

E. coli DNR polimeraz ÷s

DNR Pol III (polC)Tai didelis fermentas, susidedantis iš daug komponent ų (alfa, epsilon, teta,

tau, gama, delta, kapa, psi, beta);Pasižymi polimeraziniu aktyvumu.

Savyb ÷s:

1. Alfa subvienetas (dnaE) pasižymi polimeraziniu 5‘ -3‘ aktyvumu. Ta čiau vieno baltymo aktyvumas labai menkas;

2. Epsilon - egzonukleaz ÷, jos funkcija - klaid ų taisymas;

3. Teta - sujungia alfa su epsilon. Šie trys baltymai sudaro fermento šerd į. Šerd į sudaran čio komplekso polimerazinis aktyvumas yra didesnis n egu vieno alfa baltymo 2 kartus, o egzonukleazinis akty vumas didesnis net 200 kartų.

4. Gama ir tau baltymai randami ekvimoliarin ÷se koncentracijose. Gama yra ssDNR ATPaz ÷, dalyvauja sudarant kompleks ą tarp holofermento ir matricos, tau didina fermento procesyvum ą, sujungia šerd į su gama-kompleksu.

E. coli DNR polimeraz ÷s

5. Tau didina DNA Pol III procesyvum ą 6 kartus, sujungia gama - kompleks ą su šerdimi. Tai prailgina fermento darb ą.

6. Gama kompleksas. Didina procesyvum ą, turi 2 gama, delta, delta’, kapa, ir psi baltymus. Gama kompleksas atlieka periodiško be ta užd ÷jimo funkcij ą atsiliekan čios grandin ÷s sintez ÷je.

7. Beta yra sudarytas iš 2 molekuli ų, kurios suformuoja žied ą, apgaubiant į DNR ir tokiu b ūdu prirakinant į šerd į prie matricos. Beta baltymas labai padidina fermento procesyvum ą.

E. coli DNR polimeraz ÷s

Bakterij ų DNR replikacijos greitis yra ~50000nt/min, o eukar iotų ~2000nt/min.

DNR replikacijos tipai:

Planin÷ – viso genomo DNR sintez ÷, vykstanti prieš l ąstelei dalinantis.

Neplanin÷ – atskir ų DNR segment ų sintez ÷, nesusijusi su l ąstel ÷s dalijimusi (tr ūkių užtaisymas).

DNR REPLIKACIJOS TIPAI

DNR sintez ÷ prasideda nuo ori taško, kuris apsuptas dideliu ki ekiu AT (lengviau atskiriamos grandin ÷s); Prie ori prisiriša DnaA baltymas ir inicijuoja replikacij ą

DNR helikaz ÷s (DnaB) išvynioja dvigub ą DNR spiral ę;

Viengrandes DNR stabilizuoja SSB baltymai;

DNR II topoizomeraz ÷ pašalina DNR kilpas;

DNR I topoizomeraz ÷ (giraz÷) keičia superspiralizacijos pob ūdį iš + į -.

DNR replikacija negali prasid ÷ti nuo nukleotido. Visoms DNR polimeraz ÷ms reikalingas trumpas pradmuo. Pradmens sintez ę galiatlikti arba RNR polimeraz ÷ arba specialus replikacijos fermentas -pradmens polimeraz ÷ – praimaz ÷ (DnaG). Pradmuo, kaip taisykl ÷, yraRNR, 5-10 nt.

DNR REPLIKACIJOS EIGA

RNR pradmen į pašalina RNaz ÷ H, palikdama vien ą ribonukleotid ą. Pastar ąjį pašalina DNR Pol I.

DNR grandini ų išsiskyrimo vietoje susidaro replikacin ÷ šakut ÷. DNR sintez ÷ vyksta 5’ → 3’ kryptimi.

Pirmoji sintetinama grandin ÷ – pirmaujantiAntroji v ÷luojanti

Praimaz ÷ sintetina pradmenis ant v ÷luojan čios grandin ÷s; Replisomos komplekse esanti DNR pol III periodiškai sintetina Okazakio

fragmentus

DNR polimeraz ÷ I užstato tr ūkius

DNR ligaz÷ sujungia fragmentus

Replikacij ą sustabdo ter elementas, prie kurio jungiasi Tus ba ltymas, neleidžiantis helikazei jud ÷ti ir išvynioti DNR.

DNR REPLIKACIJOS EIGA

Replikacijos reguliacija vyksta iniciacijos stadijoje .

Ją įtakoja:

1. Ori aplinkin ÷s sekos

2. Dna A baltymo veikla ir jo kiekis (DnaA baltymas - p agrindinisreplikacijos iniciatorius, absoliu čiai būtinas replikacijai prasid ÷ti. Joatpažinimo sekos randamos ir plazmidži ų ori, taip pat kai kuri ų genų, susijusi ų su replikacija, promotoriuose).

3. Ori sekos metilinimas (pusiau metilinta DNR, kuri atsiranda tuojau po replikacijos, negali v ÷l prad ÷ti naujos replikacijos iniciacijos, kol nebus pilnai užmetilintos abi grandin ÷s).

4. OriC srityje prasideda dviej ų genų transkripcija į priešingas puses. Manoma, kad transkripcija gali b ūti svarbi DNR strukt ūros pakeitimui. Transkripcija stimuliuoja replikacijos iniciacij ą.

REPLIKACIJOS REGULIACIJA

Svarbi plazmidži ų savyb ÷ – autonomiška replikacijareplikacijos bei kopij ų skai čiaus autokontrol ÷

Replikacijos mechanizmai:

1. Teta tipo (dominuoja Gram (-) bakterijose)2. Grandin ÷s išst ūmimo (sutinkama plataus šeiminink ų spektro

plazmid ÷se) 3. Riedančio rato (dominuoja Gram (+) bakterijose)

Linijini ų plazmidži ų replikacija:

Galuose formuojamas segtukas;Prie 5’ galo prijungiamas baltymas, kuris pateikia pi rmą nukleotid ą,

tarnaujant į pradmeniu.

BAKTERIJ Ų PLAZMIDŽIŲ REPLIKACIJA

Panaši į chromosomin ÷s DNR replikacij ą

1. DNR grandin ÷s perskiriamos ori srityje2. Sintetinamas RNR pradmuo3. Inicijuojama DNR sintez ÷ – reikalingas Rep baltymas, kuris

atpaž įsta DNR pasikartojimus (iteronus)

Iteronai – Rep baltym ų surišimo taikiniai – replikacijos iniciacijai ir kopij ų skai čiaus kontrolei

4. Sintez÷ vyksta koordinuotai abiejose grandin ÷se (viena grandin ÷ sintetinama pilnai, kita – fragmentais); sintez ę vykdo DNR pol III

5. Replikacijos pabaigos taškas – terminatorius ter , kur į atpaž įsta Tus baltymas

pSC101, P1, R1 plazmidži ų replikacijai reikalingas Rep baltymas;ColE1, pMB1 replikacija vyksta be Rep, sintez ę pradeda DNR pol I, iš

kurios perima estafet ę DNR pol III

TETA TIPO REPLIKACIJA

TETA TIPO REPLIKACIJA

Reikalingi trys plazmid ÷s koduojami baltymai, kurie suformuoja iniciacijos kompleks ą:

RepA (helikaz ÷) – juda 5’-3’ kryptimi ir išlydo DNR,RepB (praimaz ÷) – atpaž įsta segtuk ų strukt ūras ir inicijuoja replikacij ą,RepC - inicijuoja replikacij ą, susirišdamas su iteronais.

Iš šeimininko reikalingi SSB baltymai, DNR pol III ir RNR polimeraz ÷ (vykdo RepA, B, C transkripcij ą).

Replikacija gali vykti nuo abiej ų grandini ų nepriklausomai, RepA išstumia vien ą grandin ę ir sudaro D kilp ą.

GRANDINIŲ IŠSTŪMIMO REPLIKACIJA

GRANDINIŲ IŠSTŪMIMO REPLIKACIJA

Rep baltymas susiriša su ori sritimi ir įkerpa vien ą grandin ę superspiralizuotoje DNR;

Laisvas –OH tarnauja pradmeniu

Helikaz ÷ perskiria DNR grandines

DNR pol III vykdo sintez ę ratu, kol pasiekiamas tr ūkio taškas irsusintetinama pilna nauja DNR grandin ÷, o senoji išstumiama

Toliau seka sk ÷limo ir ligavimo reakcijos – DNR grandin ÷s išskiriamos

RIEDANČIO RATO TIPO REPLIKACIJA

RIEDANČIO RATO TIPO REPLIKACIJA

EUKARIOTŲ DNR REPLIKACIJA

Aptinkamos 4 branduolines DNR polimeraz ÷s - alfa (I), beta (IV), delta (III), epsilon (II) ir viena mitochondrin ÷ - gama.

Alfa ir delta tikrai dalyvauja chromosomos replikacijoje.

Epsilon ir delta - būtini miel÷ms fermentai, tuo tarpu fagui SV40 replikuotis in vitro užtenka alfa ir delta.

Beta - mažiausias fermentas, dalyvauja reparacijoje.

Gama - mitochondrijose, replikuoja mitDNR grandin÷s išstūmimo būdu.

Eukariotų DNR polimeraz÷s, skirtingai nuo prokariotų, neturi klaidų taisymo mechanizmo, bet yra kitos, tikslumą užtikrinančios sistemos. Bendra visų polimerazių savyb÷ - jos negali prad÷ti sintez÷s nuo nukleotido, reikia pradmens, dažniausiai RNR, po to sintetinama DNR.

EUKARIOTŲ DNR POLIMERAZöS

Alfa polimeraz ÷ (I) - būtinas fermentas, mutacijos letalios.

Fermentas susideda iš 4 subvienetų: Didžiausiais 180kDa (POL1)- turi DNR polimeraz÷s aktyvumą, kiti baltymai -

86 (POL10), 58(PRI1), 48(PRI2) kDa - pagalbinai. Du mažiausi baltymai pasižymi pradmens polimeraz÷s - praimaz÷s aktyvumu, tod÷l visas fermentas vadinamas praimaze.

Fermento tikslumas didelis, procesyvumas - vidutinis, tai rodo, kad jis sintetina nelabai didelius fragmentas.

Procesyvumas - 2-2000 nt, tai yra nukleotidų skaičius, įjungtas vienu fermento prisirišimu prie DNR.

Delta (III) polimeraz ÷ Sudaryta iš 2 subvienetų: 125 kDa (polimeraz÷) (POL3, CDC2), 48 kDa

(aktyvumai: DNR polimeraz÷ ir 3‘-5‘ ekzonukleaz÷). Fermento funkcijai būtini pagalbiniai baltymai.

Epsilon (II) polimeraz ÷. Sudaryta iš penkių polipeptidų: 256 kDa (aktyvumai: DNR polimeraz÷ ir 3‘-5‘

ekzonukleaz÷, POL2), 80 kDa , 34 kDa ir 31kDa (nukleotidų surišimas), 29 kDa.

Ši polimeraz÷ dalyvauja reparacijoje.

Beta polimeraz ÷ (IV) Tai mažas baltymas (68 kDa). Dalyvauja reparacijoje ir rekombinacijoje. Didžiausias aktyvumas su substratu

turinčiu plyšį.

Gama DNR polimeraz ÷. Randama mitochondrijose, susideda iš dviejų subvienetų, katalitinis

subvienetas MIP1 (144 kDa).

Polimeraz ÷ alfa - pradmens polimeraz÷; T - antigenas - helikaz÷ (SV40 specifinis

baltymas); R-PA - replikacijos baltymas A, trimeras,

bakterijų Ssb baltymo analogas; R-PC - replikacijos baltymas C; PCNA- (proliferating cell nuclear

antigen) E. coli beta (dimero) baltymo – slystančios spynos- funkcinis analogas. PCNA – trimeras;

DNR polimeraz ÷ deltaMF1 - 5‘-3‘ egzonukleaz÷ DNR ligaz÷ RNaz÷ H

Eukariotų DNR replikacijos mechanizmas sud÷tingesnis. Geriausiai ištirta eil÷s eukariotinių virusų (kaip SV40) bei mielių replikacija.Tyrin÷jant SV40 replikacijos sistem ą, pasteb÷ta tam tikra analogija su E. coli, tačiau skiriasi organizacija, baltymų funkcijos:

REPLIKACINIS KOMPLEKSAS

ORC – (origin recognition complex) susiriša su ori)

Kiti baltymai, ateinantis į replikacijos pradžios vietą ir sąveikaujantys su ORC bei būtini pre-replikacinio komplekso formavimui yra Cdc6 ir Cdt1.

Mcm2-7 baltymai reikalingi replikacijos iniciacijai ir elongacijai (helikazinis aktyvumas).

Mcm10

Cdc45 yra esminis baltymas replikacijos iniciacijoje. Šis baltymas sąveikaujasu Mcm2 bei RP-A ir polimeraz÷mis alfa ir epsilon . Cdc45 reikalingas irreplikacijos elongacijos procese, matomai dalyvauja polimerazių atvedimuiOkazaki fragmentų sintez÷je.

ciklinai

EUKARIOTŲ REPLIKACIJOS REGULIACIJOJE DALYVAUJA

REPLIKACIJOS INICIACIJOS KOMPLEKSAI

Miel÷se rastos visos 5 tos pačios polimeraz÷s, kaip ir žinduolių ląstel÷se:

alfa, delta, epsilon, beta, gama.

Mielių replikacin÷s šakut÷s baltymai:RP-A, bakterijų Ssb baltymo

analogas; PCNA, stimuliuoja tiek delta, tiek

epsilon DNR polimerazes RF-C, turi ligaz÷ms būdingą motyvąFEN1 (flap endonuclease 1) – tai

nukleaz÷, pašalina pradmenį ir iniciatorinę DNR, jeigu naujai sintetinamas Okazaki fragmentas, pasiekęs anksčiau susintetinto Okazaki fragmento 5‘-galą, pakelia jo 5‘-galą ir „palenda“ po juo.

Helikaz ÷

MIELIŲ DNR REPLIKACIJA

EUKARIOTŲ REPLIKACIJA

REPLIKACIJOS INICIACIJOS PALYGINIMAS

REPLIKACIJOS PROCES Ų PALYGINIMAS

DNR replikacijos supratimas ir ypatumaiProkariotų DNR replikacija (DNR polimeraz÷s, sintez÷ ir jos

reguliacija)Bakterijų plazmidžių replikacijos tipai (riedančio rato, teta, grandinių

išstūmimo)Eukariotų DNR replikacija (polimeraz÷s, sintez÷ ir jos reguliacija)

KARTOJIMAS