UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de metodologia para separação
de aminas quaternárias utilizando eletroforese
não aquosa em microssistemas
Roger Cardoso Moreira
Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como exigência parcial, para obtenção do título de Mestre em Química
Orientador: Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro
Goiânia/GO
2015
Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG.
Moreira, Roger Cardoso Desenvolvimento de metodologia para separação de aminasquaternárias utilizando eletroforese não aquosa em microssistemas[manuscrito] / Roger Cardoso Moreira. - 2015. xvii, 131 f.
Orientador: Prof. Dr. Wendell Karlos Tomazelli Coltro.Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto deQuímica (IQ) , Catalão, Programa de Pós-Graduação em Química, Goiânia,2015. Bibliografia. Inclui siglas, lista de figuras, lista de tabelas.
1. eletroforese. 2. aminas quaternárias. 3. solventes orgânicos. 4.corrosão. I. Coltro, Wendell Karlos Tomazelli, orient. II. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de metodologia para separação
de aminas quaternárias utilizando eletroforese
não aquosa em microssistemas
Roger Cardoso Moreira
Goiânia/GO
2015
"O segredo do sucesso é a constância de propósito”
Benjamin Disraeli
“O universo não foi feito à medida do ser humano,
mas tampouco lhe é adverso: é-lhe indiferente.”
Carl Sagan
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho
Á minha mãe Geralda Maria Moreira e
Em memória de meu pai Adílson Cardoso Moreira
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Nesta página queria deixar registrados meus sinceros agradecimentos por
todas aquelas pessoas que participaram não somente da realização deste
trabalho, mas também aquelas pessoas que de alguma forma contribuíram
para minha formação pessoal e profissional.
À minha mãe Geralda Maria Moreira, essa guerreira que apesar de ter
perdido o marido quando os quatro filhos ainda eram crianças, conseguiu
exercer o papel de mãe e pai ao mesmo tempo. Hoje posso falar por mim e por
meus irmãos, nossa mãe tirou de letra, foi difícil eu sei, mas ela conseguiu
passar tudo de bom e fez o possível para que todos nós tivéssemos
oportunidades, eu que o diga, pois estou quase completando mais uma etapa
importante da minha formação.
Aos meus queridos irmãos, Jaqueline, Joelma e Róbson que juntamente
com minha mãe me deram todo suporte, seja financeiro ou emocional, para
conseguir passar esses seis longos anos vivendo sozinho em Goiânia. Com
certeza sem a ajuda deles nada do que eu conquistei até agora seria possível,
então serei eternamente grato á eles.
Aos meus amigos da graduação, os quais ainda mantenho contato até
hoje. Então, muito obrigado Alekssander, Kallita, Daniely, Pedro, Lucas, Thays,
Humberto, Brunno Conrado, Wanderson, Vinícius e Eric podem ter certeza que
todos vocês têm uma imensa contribuição em mais este “checkpoint”.
Ao meu orientador/amigo Wendell, não apenas pelos ensinamentos
acadêmicos passados durantes esses dois anos, mas principalmente por
acreditar no meu potencial e sempre me manter motivado para alcançar os
melhores resultados. Costumo dizer que o Wendell tem um dom que não se vê
muito hoje em dia, o dom de acreditar no potencial das pessoas. Já perdi a
conta das vezes que fui até a sua sala com a intenção de chutar o balde e de
desistir de algo que não está dando certo, mas sempre volto motivado para
AGRADECIMENTOS
resolver o problema e muitas vezes com outras ideias, hehe. Quem conhece o
Wendell sabe do que estou falando, então Professor, muito obrigado mesmo!
Aos amigos do Grupo de Métodos Eletroforéticos, os quais contribuíram
direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Dois anos de
laboratório parece pouco tempo, mas construí laços incríveis nesse período, os
quais irão durar por muito tempo. Camilla, Karoliny, Ellen, Marillya, Simone,
Marilia, Ariane, Laís, Luiza, Kariolanda, Nathália, Joice, Lorrana, Paula,
Fabrício, Eulício (Lolita), Lucas Duarte, Wanderson, Gerson, Anderson
(Gaúcho), Thiago Miguel (Presunto), Cyro, Sandro, Brunno, Paulo de Tarso,
Rodrigo, João Bruno, Lucas Rodrigues, Federico e Abdul muito obrigado por
fazerem parte desta caminhada.
Á Camilla, que mesmo em fase final de mestrado, teve paciência e me
introduziu no mundo da eletroforese, além de me passar toda sua experiência
com o equipamento comercial.
Aos grandes amigos Fabrício, Lolita e Presunto, os quais foram
fundamentais na etapa mais crítica deste trabalho, que foi a adaptação da
plataforma microfluídica.
Á Simone e a Marilia, alunas de IC, as quais ficaram sob minha “tutoria”.
Meninas podem ter certeza, aprendi muito trabalhando com vocês e muito
obrigado pela grande ajuda na realização deste trabalho.
Ao meu grande amigo Lolita, pois além de ajudar muito dentro do
laboratório, foi um cara que sempre me motivou a praticar esportes e viver uma
vida menos sedentária, além de estar sempre disponível para o que eu
precisasse.
E por último, agradeço à Petrobras pelo financiamento do projeto e
consequentemente pela bolsa concedida.
SUMÁRIO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
Sumário
Lista de Figuras ................................................................................................... i
Lista de Tabelas ................................................................................................. xi
Lista de Abreviaturas ......................................................................................... xii
Lista de Símbolos .............................................................................................. xv
Resumo ............................................................................................................ xvi
Abstract ........................................................................................................... xvii
1. Introdução .................................................................................................... 1
1.1 Aminas Quaternárias ............................................................................. 1
1.2 Miniaturização ....................................................................................... 5
1.3 Eletroforese .............................................................................................. 9
1.4 Detectores para MSE .............................................................................. 20
1.5 Eletroforese não Aquosa ......................................................................... 25
2 Objetivos .................................................................................................... 29
2.1 Objetivos Gerais ...................................................................................... 29
2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 29
3 Procedimento Experimental ....................................................................... 31
3.1 Reagentes ............................................................................................... 31
3.2 Preparo das Soluções ............................................................................. 33
SUMÁRIO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
3.3 Instrumentação ....................................................................................... 34
3.4 Otimização dos parâmetros operacionais do C4D ................................... 35
3.5. Controle Eletrocinético ........................................................................... 36
3.5.1 Modo floating .................................................................................... 36
3.5.2 Modo gated ....................................................................................... 37
3.6 Avaliação da repetibilidade da Injeção: gated versus floating ................. 38
3.7 Efeito do modo de injeção na resposta analítica ..................................... 39
3.8 Separação das Aminas Quaternárias em meio aquoso .......................... 39
3.9 Separação das Aminas Quaternárias em meio não aquoso ................... 39
3.9.1 Otimização dos potenciais de separação e injeção .......................... 39
3.9.2 Otimização da composição do eletrólito de corrida .......................... 40
3.9.3 Análises das aminas quaternárias em águas residuais .................... 41
4 Resultados e Discussão ............................................................................ 43
4.1 Otimização dos parâmetros operacionais do C4D ............................... 43
4.2 Avaliação da repetibilidade da Injeção: gated vs floating ........................ 45
4.3 Efeito da Injeção no desempenho do detector: gated vs floating ............ 49
4.4 Separação de cátions utilizando o modo de injeção gated ..................... 51
4.5 Aminas Quaternárias .............................................................................. 53
4.5.1 Eletroforese em meio aquoso ........................................................... 53
4.6 Eletroforese em meio não aquoso .......................................................... 61
SUMÁRIO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
4.6.1 Otimização do Eletrólito de Corrida .................................................. 81
4.6.2 Adaptação da plataforma original ..................................................... 88
4.6.3 Amostras Reais................................................................................. 94
4.6.4 Curva analítica com adição de padrão .............................................. 99
4.6.5 Influência do numero de carbonos na resposta analítica ................ 102
5 Conclusões e Perspectivas ...................................................................... 110
6 Referências Bibliográficas ....................................................................... 113
LISTA DE FIGURAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
i
Lista de Figuras
Figura 1. Levantamento de publicações nos 20 últimos utilizando as palavras
chaves (A) uTAS e (B) LOC. .............................................................................. 9
Figura 2. Representação da instrumentação utilizada para um sistema de EC.
......................................................................................................................... 10
Figura 3. Ilustração da geração do fluxo elestrosmótico na parede de um
capilar ou microcanal. ...................................................................................... 12
Figura 4. Esquema representando a inversão do fluxo eletrosmótico pela
adição de uma AQ. ........................................................................................... 14
Figura 5. Configuração típica de um microchip utilizado em eletroforese. ...... 15
Figura 6. Microdispositivos eletroforéticos fabricados em diversos substratos.
......................................................................................................................... 16
Figura 7. Ilustração da formação da zona de amostra no modo de injeção (A)
gated e (B) floating. A zona de amostra está destacada de vermelho. ............ 20
Figura 8. Ilustração dos eletrodos acoplados em um (B) capilar e em um (B)
microcanal. ....................................................................................................... 22
Figura 9. Sistema de eletroforese eDAQ: em (A) as fontes de alta tensão; em
(B) o sistema de detecção C4D; em (C) a plataforma microfluídica para
acoplamento do microchip com o sistema de detecção e as fontes de alta
tensão; em (D) o microchip de vidro. ............................................................... 35
LISTA DE FIGURAS
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ii
Figura 10. Apresentação do processo de introdução da amostra usando-se o
método floating em MSE contendo canais dispostos na configuração de (A)
duplo-T. Os números 1, 2, 3 e 4 indicam, respectivamente, os reservatórios da
amostra, do tampão, descarte da amostra. ...................................................... 36
Figura 11. Processo de introdução da amostra pelo modo gated em MSE
contendo canais dispostos na configuração de (A) duplo-T ilustrando as etapas
(B) amostragem, (C) controle eletrocinético da amostra, (D) introdução de uma
zona de amostra bem definida e (E) separação eletroforética dentro do canal
de separação. Em (A), os números 1, 2, 3 e 4 indicam, respectivamente, os
reservatórios de descarte da amostra, da amostra, do tampão e descarte do
tampão. ............................................................................................................ 37
Figura 12. Esquema genérico mostrando o funcionamento do C4D. ............... 43
Figura 13.Varredura da resposta versus a frequência em cada amplitude para
o eletrólito (A), para o branco (B) e a resultante da subtração (C). .................. 45
Figura 14. Série de eletroferogramas com injeções sequenciais mostrando a
repetitividade analítica utilizando o modo de injeção floating. Potenciais
aplicados nos reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V
respectivamente. Tempo de preenchimento do canal de injeção: 10 s. Solução
contendo K+ (100 µmol/L); Tampão: Mistura equimolar de MES/His (20 mmol/L
cada) pH 6,1; Frequência: 900 kHz; Amplitude: 20 Vpp. ................................... 46
Figura 15. Série de eletroferogramas com injeções sequenciais mostrando a
repetibilidade analítica utilizando o modo de injeção gated. Potenciais aplicados
LISTA DE FIGURAS
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iii
nos reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V respectivamente.
Tempo de injeção: 1s. Outras condições: ver Figura 14. ................................. 46
Figura 16. Representação gráfica do tempo de migração do íon K+ e do
marcador neutro versus o número de injeção para os modos (A) floating e (B)
gated. ............................................................................................................... 47
Figura 17. Eletroferograma mostrando a detecção de K+ (10 µmol/L).
Potenciais aplicados nos reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V
respectivamente. (A) Modo floating com tempo de preenchimento do canal de
injeção igual a 10 s. (B) Modo gated e com tempo de injeção igual a 5s. Outras
condições: ver Figura 14. ................................................................................. 49
Figura 18. (A) Eletroferogramas mostrando a detecção de K+ (1 µmol/L) sob
diferentes tempos de injeção no modo gated. Variação da área (A) e
intensidade (B) do pico referente ao k+. Outras condições: ver Figura 14. ...... 51
Figura 19. (A) Séries de eletroferogramas mostrando a separação de uma
amostra equimolar dos íons K+, Na+ e Li+ na concentração de 50 µmol/L.(B)
Magnificação de uma única injeção, evidenciando a qualidade da separação
obtida. Comprimento efetivo: 7,0 cm. Potenciais aplicados nos reservatórios da
amostra e tampão: 1800 e 2500 V respectivamente. Outras condições: ver
Figura 14. ......................................................................................................... 52
Figura 20. Simulação mostrando o eletroferograma da separação de seis
cátions das aminas quaternárias. Picos: (1) Tetrametilamônio; (2)
Trimetilfenilamônio; (3) Tetraetilamônio; (4) Hexiltrimetilamônio; (5)
LISTA DE FIGURAS
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iv
Heptiltrimetilamônio e (6) tetradeciltrimetila. Potencial de Separação e Injeção:
1000 V e 800 V respectivamente. Comprimento efetivo: 4,0 cm. ..................... 54
Figura 21. Eletroferogramas para uma solução aquosa contendo CTAB na
concentração de 100 µmol/L. Eletrólito: sistema tampão MES/His 20 mmol/L
cada, com a adição de TTAB na concentração (A) de 100 µmol/L (B) de 200
µmol/L e (C) 500 µmol/L. Outras condições: ver Figura 14. ............................. 56
Figura 22. Eletroferograma mostrando a separação de CTAB e TTAB na
concentração 100 µmol/L. Outras condições: ver Figura 14. ........................... 57
Figura 23. Eletroferograma para cada amina quaternária na concentração de
100 µmol/L e para uma mistura equimolar da cinco na concentração de 100
µmol/L. Outras condições: ver Figura 14. ......................................................... 58
Figura 24. Micrografia óptica mostrando a (A) intersecção e o (B) canal de
injeção obstruídos devido a precipitação das aminas quaternárias. ................ 59
Figura 25. Separação de cinco aminas quaternárias utilizando chip de PMMA.
Os picos 1, 2, 3, 4 e 5 são referentes aos cátions das aminas quaternárias
CTAB, TTAB, DTAC, ETAB e TOMB. Tampão: MES/His 20 mmol/L, pH 6,1;
Potencial de separação e injeção: 1200 V e 1000 V respectivamente;
Frequência: 570 kHz; Amplitude: 2,4 Vpp. Comprimento efetivo: 4 cm. ............ 60
Figura 26. (A) Eletroferogramas mostrando a injeção das aminas quaternárias
separadamente na concentração de 1 mmol/L cada, além de uma mistura
equimolar (1 mmol/L) contendo os cinco analitos. (B) Representação dos
eletroferogramas para a mistura variando os potenciais de injeção e separação.
LISTA DE FIGURAS
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v
Eletrólito: ácido benzoico/benzoato de sódio 10 mmol/L em MeOH/ACN 90:10
(v/v). Outras condições: ver Figura 14. ............................................................ 62
Figura 27. (A) Eletroferogramas para os íons de quaternário de amônio
injetados separadamente (1 mmol/L) e para uma mistura equimolar dos cinco
(1 mmol/L). (B) Aumento da região da separação. Eletrólito: ácido
benzoico/benzoato de sódio 10 mmol/L em MeOH/ACN 90:10 (v/v).
Comprimento efetivo: 7,3 cm. Potenciais aplicados nos reservatórios da
amostra e do tampão: 1800 e 2300 V respectivamente. Outras condições: ver
Figura 14. ......................................................................................................... 63
Figura 28. Eletroferogramas obtido com um sistema misto de eletroforese, para
amostras contendo as cincos AQs em duas concentrações. Comprimento
efetivo: 13 cm. Eletrólito: ácido benzoico/benzoato de sódio 10 mmol/L em
MeOH/ACN 90:10 (v/v). Outras condições: ver Figura 25. ............................... 64
Figura 29. Eletroferogramas para solução contendo os cinco tensoativos
utilizando os microchips com comprimento efetivo (A) 3,3 cm e (B) 7,0 cm.
Eletrólito: acetato de amônio 10 mmol/L em metanol/acetonitrila 90:10 (v/v).
Outras condições: ver Figura 14. ..................................................................... 65
Figura 30. Eletroferogramas para as curvas de calibração de quatro AQs. (A)
TOMB, (B) CTAB (C) TTAB e (D) DTAC. Eletrólito: acetato de amônio 10
mmol/L em MeOH/ACN 90:10 (v/v). Outras condições: ver Figura 14. ............ 67
Figura 31. Curvas de calibração construídas a partir do valor da área do pico.
(A) TOMB, (B) CTAB (C) TTAB e (D) DTAC. ................................................... 68
LISTA DE FIGURAS
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vi
Figura 32. Eletroferograma mostrando a separação de cinco aminas
quaternárias (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) TTAB e (5) TODAB com
concentração igual à 1 mmol/L cada. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L em MeOH
90:10 (v/v). Outras condições: ver Figura 14.................................................... 69
Figura 33. Eletroferograma mostrando a separação de oito aminas
quaternárias (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) DTAC, (5) TTAB, (6) CTAB,
(7) TODAB, (8) TOAB com concentração igual à 1 mmol/L cada. (A) 2,2 e 2,5
kV (B) 2,7,0 e 3,0 kV aplicados nos reservatórios da amoastra e do tampão
respectivamente. Outras condições: ver Figura 14. ......................................... 70
Figura 34. (A) Eletroferogramas mostrando a otimização dos potenciais de
separação e injeção. Analitos: (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) TTAB, (5)
TODAB e (6) TOAB. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L em MeOH 90:10 (v/v).
Tempo de injeção: 1 s. Comprimento efetivo = 7 cm. Condições de detecção:
700 kHz, 70 Vpp. Potenciais de Injeção e Separação: ver Tabela 2. (B)
Eletroferograma obtido com a aplicação de 3,0 e 2,7 kV para a separação e
injeção respectivamente. .................................................................................. 71
Figura 35. Representação gráfica da variação do (A) tempo de migração e da
(B) intensidade em função dos potenciais aplicados. ....................................... 73
Figura 36. Variação das resoluções em função do potencial de separação. ... 74
Figura 37. Eletroferograma para diferentes concentrações das seis aminas
quaternárias. (B) Eletroferogramas para amostras sintéticas preparadas
utilizando os padrões. Analitos: ver Figura 34. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L
em MeOH 90:10 (v/v). pH: 8,58 . Tempo de injeção: 1 s. Comprimento efetivo =
LISTA DE FIGURAS
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vii
7 cm. Potenciais aplicados nos reservatórios da amostra e do tampão: 2700 e
3000 V respectivamente. Condições de detecção: 700 kHz, 70 Vpp. ............... 75
Figura 38. Curvas de calibração para as aminas quaternárias construídas
através dos valores de área dos picos. (A) TEAOH, (B) HTAB, (C) TBAP, (D)
TTAB, (E) TODAB e (F) TOAB. ........................................................................ 76
Figura 39. Sequência contendo 9 injeções consecutivas mostrando a
separação de seis aminas quaternárias com a adição de 50 µL nos
reservatórios. Analitos: ver Figura 34. Outras condições: ver Figura 37. ......... 78
Figura 40. Variação da (A) área e da (B) intensidade no decorrer das injeções
consecutivas quando foi adicionado 50 µL de solução nos reservatórios. ....... 79
Figura 41. Sequência contendo 9 injeções consecutivas mostrando a
separação de seis aminas quaternárias com a adição de 100 µL de solução nos
reservatórios. Analitos: ver Figura 34. Outras condições: ver Figura 37. ......... 80
Figura 42. Variação da (A) área e da (B) intensidade no decorrer das injeções
consecutivas quando se adicionou 100 µL de solução nos reservatórios. ....... 81
Figura 43. Eletroferogramas mostrando injeções da mistura com seis aminas
quaternárias preparadas em diferentes solventes. Analitos: ver Figura 34.
Outras condições: ver Figura 37. ..................................................................... 82
Figura 44. Eletroferogramas mostrando a separação de nove AQS com
eletrólitos contendodiferentes porcentagens de acetonitrila. (A) 0 %, (B) 10%,
(C) 25%, (D) 50% e (E) 75%. (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TOMB, (4) DTAC; (5)
LISTA DE FIGURAS
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viii
TTAB, (6) CTAB, (7) TODAB, (8) TOAB, (9) TDAC 500 µmol/L cada. Outras
condições: ver Figura 37. ................................................................................. 83
Figura 45. Eletroferograma mostrando a separação de nove aminas
quaternárias em oito diferentes eletrólitos. Analitos: ver Figura 44. Outras
condições: ver Figura 37. ................................................................................. 85
Figura 46. Comparação da intensidade dos picos (em módulo) nos diferentes
eletrólitos. ......................................................................................................... 86
Figura 47. Comparação das resoluções (A) e das eficiências de separação (B)
nos diferentes eletrólitos avaliados. ................................................................. 87
Figura 48. Eletroferograma mostrando a separação das aminas em diferentes
concentrações. Analitos: ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37. ...... 88
Figura 49. Eletroferograma mostrando a separação das aminas em diferentes
concentrações após a aumento do tempo de condicionamento com NaOH.
Analitos: ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37. ................................ 89
Figura 50. Eletroferograma mostrando a separação de dez aminas
quaternárias utilizando a plataforma original danificada. (1) TMAB, (2) TEAOH,
(3) HTAB, (4) TOMB, (5) DTAC; (6) TTAB, (7) CTAB, (8) TODAB, (9) TOAB,
(10) TDAC 500 µmol/L cada. Outras condições: ver Figura 37. ....................... 90
Figura 51. Plataforma original danificada devida o contato do solvente orgânico
com a cola utilizada para fixação do cabo na plataforma. ................................ 91
Figura 52. Imagem da peça fabricada em poliacetal e da peça original com os
cabos concentrados na lateral. ......................................................................... 92
LISTA DE FIGURAS
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ix
Figura 53. Eletroferograma mostrando a separação de dez aminas
quaternárias utilizando a peça nova fabricada em poliacetal. Analitos: ver
Figura 50. Outras condições: ver Figura 37. .................................................... 92
Figura 54. (A) Esquema mostrando a plataforma construída em poliacetal
trabalhando aberta. (B) Sistema fechado utilizando uma tampa fabricada em
ABS por uma impressora 3D. Foi realizado ajuste na linha de base. ............... 93
Figura 55. Amostras de águas residuais coletadas em dutos petrolíferos
fornecidas pela Petrobras ................................................................................ 94
Figura 56. (A) Canal obstruído devido a alta salinidade da amostra. (B) Canal
após a primeira limpeza com solução piranha. (C) Canal completamente
desobstruído após segunda limpeza com solução piranha. ............................. 95
Figura 57. Eletroferograma para a amostra real diluída 10 vezes em Metanol.
......................................................................................................................... 96
Figura 58. Precipitação das amostras reais quando foram adicionados os
padrões das aminas quaternárias. ................................................................... 97
Figura 59. Reação da amostra pré-tratada com nitrato de prata com as aminas
quaternárias separadamente............................................................................ 98
Figura 60. (A) Curva analítica com adição de padrão das nove aminas
quaternárias. (B) Ampliação dos eletroferogramas para as concentrações de 50
e 100 µmol/L. ................................................................................................. 100
Figura 61. Curvas analíticas para as AQS. (A) TEAOH, (B) HTAB, (C) TOMB,
(D) DTAC, (E) TTAB, (F) CTAB, (G) TODAB, (H) TOAB e (I) TDAB. ............. 101
LISTA DE FIGURAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
x
Figura 62. Eletroferograma mostrando as injeções para: (A) Amostra real, (B)
amostra real dopada (100 µmol/L), (C) amostra dopada (100 µmol/L) + 250
µmol/L de cada AQs, (D) amostra dopada (100 µmol/L) + 500 µmol/L de cada
AQs, (E) amostra dopada (100 µmol/L) + 750 µmol/L de cada AQs. Analitos:
ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37. ............................................ 102
Figura 63. Dependência da condutividade da solução das aminas quaternárias
pela quantidade de carbonos do grupamento R2. Aminas Quaternárias da (A)
classe 1 e da (B) classe 2. ............................................................................. 104
Figura 64. Dependência da condutividade da solução das aminas quaternárias
pela quantidade total de carbonos. ................................................................ 105
Figura 65. Eletroferograma mostrando a separação das aminas quaternárias
da (A) classe 1 e (B) classe 2. (1) TMAB, (2) TEAOH, (3) TBAP, (4) TPAB, (5)
TOAB, (6) TDAB, (7) HTAB, (8) TOMB, (9) BTAP, (10) DTAC, (11) TTAB, (12)
CTAB e (13) TODAB. Outras condições: ver Figura 37. ............................... 106
LISTA DE TABELAS
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xi
Lista de Tabelas
Tabela 1. Relação dos reagentes utilizados no trabalho, juntamente com as
respectivas abreviaturas e pureza. ................................................................... 31
Tabela 2. Potenciais de injeção e separação utilizados na otimização. ........... 72
Tabela 3. Correlação entre os valores das concentrações adicionadas e
encontradas em uma amostra sintética. ........................................................... 77
Tabela 4. Medidas de Condutividade e pH dos diferentes eletrólitos utilizados
no estudo comparativo. .................................................................................... 84
Tabela 5. Valores de condutividade das soluções das aminas quaternárias na
concentração de 10 mmol/L. .......................................................................... 103
LISTA DE ABREVIATURAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xii
Lista de Abreviaturas
µPADs Microfluidic paper-based devices
µTAS Microssistemas para análises totais
ACN Acetonitrila
ActNH4 Acetato de Amônio
AQs Aminas Quaternárias
BTAB Brometo de benziltrimetilamônio
C4D Detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente
CAB Cloreto de Alquilbenzildimetilamônio
CQAs Compostos de quaternários de amônio
CTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
DCHA Ácido desoxicólico
DHBA Ácido 2,6 – dihidroxibenzóico
DMF N,N-dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DTAC Cloreto de dodeciltrimetilamônio
EC Eletroforese capilar
ETAB Brometo de deciltrimetilamônio
FEO Fluxo eletrosmótico
His Histidina
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
HTAB Brometo de hexiltrimetilamônio
LD Limite de detecção
LIF Fluorescência induzida a laser
LOC Lab on a chip
LISTA DE ABREVIATURAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xiii
MEKC Cromatografia eletrocinética micelar
MeOH Metanol
MSE Microssistemas eletroforéticos
NaCAPSO Ácido N-ciclohexil-2-hidroxil-3-aminopropanosulfônico sódico
NACE Eletroforese capilar não aquosa
NaCH Colato de sódio hidratado
NaDCHA Ácido desoxicólico sódico
NaDHBA Ácido 2,6 – dihidroxibenzóico sódico
NAME Eletroforese não aquosa em microchips
NaMES Ácido 2-(n-morfolino)etanosulfônico sódico
NaMOPS Ácido 3-(n-morflino)propanosulfônico hemi-sódico
PC Poli(carbonato)
PDMS Poli(dimetil siloxano)
PET Poli(etileno tereftalato)
PMMA Poli(metil metacrilato)
PT Poliéster toner
PU Poli(uretana)
s-ActNH4 Solução de Acetato de Amônio
TBAP Perclorato de tetrabutilamônio
TDAB Brometo de tetradodecilamônio
TEAOH Hidróxido de tetraetilamônio 40% em H2O
Tetryl Trinitrofenilmetilntroamina
TFB Tetrafenilborato
TMAB Brometo de de tetrametilamônio
TOAB Brometo de tetraoctilamônio
TODAB Brometo de trimetiloctadecilamônio
TOMB Brometo de trimetiloctilamônio
LISTA DE ABREVIATURAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xiv
TPAB Brometo de tetrapropilamônio
TTAB Brometo de tetradeciltrimetilamônio
LISTA DE SÍMBOLOS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xv
Lista de Símbolos
𝛾 Admitância
𝐸 Campo elétrico
𝐶𝑝 Capacitância da parede
𝐶1 Capacitância entre a parede e o eletrodo de excitação
𝐶2 Capacitância entre a parede e o eletrodo receptor
𝑘 Condutividade da solução
ℓ Comprimento efetivo
𝐿 Comprimento total
𝐾 Constante da cela
𝜀 Constante dielétrica da solução
𝑒0 Eletrodo de excitação
𝑒1 Eletrodo de recepção
𝑓 Frequência
𝜇𝑎𝑝 Mobilidade aparente
𝜇𝑒𝑜𝑓 Mobilidade do fluxo eletrosmótico
𝜇𝑒 Mobilidade eletroforética
𝑉 Potencial de separação
ζ Potencial zeta
𝑡𝑚 Tempo de migração
𝑣𝑎𝑝 Velocidade aparente
𝑣𝑒𝑜𝑓 Velocidade do fluxo eletrosmótico
𝑣𝑒 Velocidade eletroforética
η Viscosidade da solução
RESUMO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xvi
Resumo
O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma metodologia analítica
para separação de aminas quaternárias utilizando eletroforese não aquosa em
microchips (NAME, do inglês non-aqueous microchip electrophoresis) com
detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente (C4D, do
inglês capacitively coupled contactless conductivity detection). Inicialmente foi
realizado um estudo para avaliação de dois modos de introdução da amostra
nos microchips, denominados de gated e floating. O modo gated apresentou
repetitividade ligeiramente melhor que o modo floating, além de proporcionar
melhores respostas do detector C4D. No desenvolvimento da metodologia
utilizando NAME-C4D, foi realizado um estudo para encontrar a composição
ideal do eletrólito para as separações eletroforéticas. O eletrólito constituído de
deoxicolato de sódio (NaDCHA), na concentração de 10 mmol/L, dissolvido em
uma mistura de MeOH/ACN na proporção 90:10 (v/v), apresentou separações
com alta eficiência e resolução superior a 1. A partir de então, foi realizada a
otimização dos potenciais de injeção, separação e dos parâmetros de detecção
(frequência e amplitude). Durante o desenvolvimento da metodologia, foram
avaliados eletrólitos preparados em outros dois solventes, DMSO e DMF.
Porém, a mistura de MeOH/ACN como solvente forneceu os melhores
resultados, desta maneira também foi avaliada a adição de diferentes
proporções de MeOH/ACN. Os melhores resultados foram obtidos com o
eletrólito contendo 10% de ACN e 90% de MeOH. Na sequência, foram
avaliadas diferentes composições do eletrólito, com a adição de outros
compostos em substituição ao NaDCHA. Todos os eletrólitos avaliados
apresentaram ótimas separações, porém o eletrólito com NaDCHA apresentou
resultados ligeiramente superiores. Com a otimização da metodologia
desenvolvida, obteve-se separações eletroforéticas de nove aminas
quaternárias em microssistema contendo comprimento efetivo de 7,0 cm, com
um tempo de análise inferior a 120 s. As separações apresentaram resolução
superior a 1 e valores de eficiência entre 77,000 e 185,000 pratos/m, uma vez
que com a utilização de solventes orgânicos, foi possível a aplicação de
campos elétricos elevados. A metodologia desenvolvida foi avaliada através da
determinação das aminas quaternárias, pelo método de adição de padrão, em
uma matriz com elevada salinidade. Foram obtidos coeficientes de correlação
lineares acima de 0,990 para oito aminas quaternárias. Durante o
desenvolvimento do trabalho, foi observada uma clara dependência das
respostas analítica em função da quantidade de carbono da molécula.
ABSTRACT
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
xvii
Abstract
This study describes the development of an analytical methodology for the
separation of quaternary amines using nonaqueous electrophoresis microchips
coupled with capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D).
Initially, preliminary experiments were performed to evaluate two electrokinetic
modes for sample introduction on chip, known as gated and floating
approaches. Gated injection showed repeatability slightly better than floating
mode. In addition, it also provided better analytical responses on the C4D
system. During the development of analytical methodology for NAME-C4D, the
electrolyte composition was optimized to ensure satisfactory separations on
electrophoresis microchips. The electrolyte composed of sodium deoxycholate
(NaDCHA) at concentration of 10 mmol/L dissolved in a mixture of MeOH/ACN
at the ratio 90:10 (v/v) exhibited separations with high efficiency and resolution
above 1. Then, it was realized the optimization of potential injection, separation
and detection parameters (frequency and amplitude). Running electrolyte was
prepared in both DMSO and DMF, however, the use of a mixture containing
MeOH/ACN provided best analytical performance. The best results were
obtained with electrolyte containing 10% ACN and 90% MeOH. In addition,
different electrolyte compositions were also evaluated, but the electrolyte
containing NaDCHA offered results slightly better when compared to others.
The optimization of running buffer allowed the separation of nine quaternary
amines in electrophoresis channels with effective length of 7.0 cm with analysis
time lower than 120 s. The peak resolution was higher than 1 and the calculated
separation efficiencies ranged from 77.000 to 185.000 pratos/m. This excellent
performance was achieved using NAME conditions under high electric fields.
The developed methodology was used for the analysis of quaternary amines in
samples containing high salinity levels through the standard addition method.
Linear correlation coefficients were obtained up to 0,990 for eight quaternary
amines. Lastly, the use of NAME-C4D allowed to observe a strong dependence
of the detector response according to the carbon number of quaternary amine
molecules.
Introdução
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
1
1. Introdução
1.1 Aminas Quaternárias
Os surfactantes ou tensoativos são compostos químicos que possuem a
característica de alterar as propriedades da superfície de um líquido. Essas
substâncias podem ser classificadas pela natureza da sua carga iônica, ou
seja, catiônicos são aqueles carregados positivamente, aniônicos que possuem
carga negativa, neutros não apresentam carga e os anfóteros, são aqueles que
podem ter cargas positivas e negativas (LLENADO, R. A. et al., 1983).
As aminas quaternárias (AQs), ou quaternários de amônio (CQAs), fazem
parte dos tensoativos catiônicos. As AQs possuem um nitrogênio quaternário
com estrutura N(R)4+, onde R indica as cadeias carbônicas ligadas ao
nitrogênio, as quais podem apresentar estruturas idênticas ou diferentes. Desta
maneira, essas substâncias apresentam comportamento hidrofílico, em
decorrência do grupamento polar, e hidrofóbico devido à presença das cadeias
carbônicas, que podem ter diferentes tamanhos (CAO, H. W. et al., 2014).
As AQs são largamente utilizadas em diversos setores da indústria. Além
das indústrias de alimento e medicamentos, essas substâncias estão presentes
em amaciantes, condicionadores de cabelo, agentes emulsificantes,
desodorizadores, fungicidas e em uma infinidade de produtos de limpeza
(KREUZINGER, N. et al., 2007; MARTINEZ-CARBALLO, E., GONZALEZ-
BARREIRO, C., et al., 2007; MARTINEZ-CARBALLO, E., SITKA, A., et al.,
2007; TEZEL, U. et al., 2009; REN, R. et al., 2011; CAO, H. W. et al., 2014).
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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2
Em 2003 Pak e colaboradores, estudaram a substituição de agentes
anticolinérgicos (inibidores da acetilcolina) pelo cloreto de tróspio (amina
quaternária) para tratamento de incontinência urinária. Os autores reportaram
ótimos resultados, uma vez que a substância testada se mostrou eficaz e ainda
não foram observadas disfunções cognitivas, devido a essa substância não
atravessar a barreira nematoencefálica (PAK, R. W. et al., 2003).
Recentemente, Tran et al. publicaram um estudo no qual eles avaliaram a ação
do composto cloreto de poli-dialildimetilamônio (poli-DADMAC) em pomadas a
base de poliuretana para tratamentos de feridas. A pomada dopada com poli-
DADMAC se mostrou muito eficaz na inibição do crescimento dos três
principais patogénicos que se desenvolvem nas feridas, são eles:
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter
baumannii (TRAN, P. L. et al., 2015).
Esses compostos apresentam baixa toxicidade para a saúde humana,
porém um estudo realizado por Bernstein, em 1994, relacionou pela primeira
vez problemas respiratórios com o composto cloreto de
alquilbenzildimetilamônio (BAC), muito encontrado em produtos de limpeza
(BERNSTEIN, J. A. et al., 1994). Em 1998, M. Hitosuki reportou um caso de
envenenamento, onde cinco pessoas ingeriram acidentalmente um
medicamento conhecido como Hoesmin®, a qual consiste de uma solução
aquosa de BAC 10%, usada comumente como desinfetante da pele e da
mucosa. Quatro das pessoas sofreram apenas queimaduras da língua e dores
fortes na garganta, porém uma mulher veio a óbito três horas depois da
ingestão. A problemática da toxicidade dos CQAs presentes em amostras de
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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3
água foi muito bem descrita por Ferrer e colaboradores (FERRER, I. et al.,
2001).
As AQs apresentam características que dificultam a sua detecção, como
por exemplo, a ausência de grupos cromóforos, a formação de micelas devido
as longas cadeias alquílicas e a instabilidade térmica. Contudo, nos últimos
anos vários trabalhos têm sido publicados, mostrando a utilização de diversas
técnicas para análise de tais compostos (LIU, H. Y. et al., 2004). Bregoff e
colaboradores publicaram, em 1953, trabalho no qual foi utilizado a
cromatografia em papel para identificar algumas aminas quaternárias e
compostos relacionados (BREGOFF, H. M. et al., 1953).
Em 1958 Sass et al., reportaram uma metodologia para diferenciar e até
mesmo estimar aminas terciárias e aminas quaternárias. Os autores
exploraram a reação entre as AQs com o cloranil e acotiníco anidro (SASS, S.
et al., 1958).
Sakai reportou em 1977 a análise das AQs utilizando a técnica de
extração-titulação. A metodologia consistiu em titular as AQS utilizando
tetrafenilborato (TFB) de sódio como titulante e o sal
tetrabromofenolftaleínaetilester de potássio como indicador. Os cátions das
AQs ligados ao indicador formam um composto que torna a solução azul, pois
esse indicador é insolúvel em água, mas provoca uma coloração amarela na
solução quando está em 1,2-dicloroetano. Sendo assim o ponto final da reação
ocorre quando a solução muda de azul para amarelo (SAKAI, T. et al., 1977).
As AQs são bastante exploradas para revestimentos de superfície, devido
as suas características anfifílicas - grupos hidrofílicos e hidrofóbicos (PADHY,
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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4
S. K. et al., 2015). Isquith et. al, em 1972 reportaram um estudo mostrando a
atividade antimicrobiana em superfícies revestidas com AQs (ISQUITH, A. J. et
al., 1972). Explorando essas características das AQs, Pernak e colaboradores,
em 2003, sintetizaram cinco novos compostos, além de testarem sua atividade
antimicrobiana. A utilização de compostos à base de AQs com atividade
antimicrobiana foi muto bem abordada no trabalho de revisão de Buffet-
Bataillon et. al, (BUFFET-BATAILLON, S. et al., 2012).
A indústria petrolífera possui grande interesse na utilização das AQs para
revestimento contra corrosão em dutos petrolíferos. Os problemas com
corrosão representam custos elevadíssimos para a indústria deste setor, além
de gerar problemas relacionados aos recursos hídricos e poluição ambiental. A
corrosão afeta praticamente todos os níveis do campo de petróleo, desde o
fundo do poço até a superfície, onde estão as instalações de processamento
(OSMAN, M. M. et al., 2003; OKAFOR, P. C. et al., 2009; NESIC, S. et al.,
2010; FINSGAR, M. et al., 2014).
Desta maneira é importante o desenvolvimento de uma metodologia para
determinação das AQs, pois assim será possível a avaliação da eficiência de
revestimento de uma infinidade de compostos desta classe. A técnica de
cromatografia de íons é muito utilizada para análise das AQs, apesar de
apresentar elevados tempos de análise. Em 1975 Small et al., reportaram a
separação de duas aminas quaternárias utilizando uma coluna preenchida com
copolímeros de estireno divinilbenzeno (SMALL, H. et al., 1975). A
característica anfifílica destes compostos provoca a sua adsorção na parede da
coluna, o que afeta diretamente na eficiência de separação e na
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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5
reprodutibilidade das análises. Para contornar esse problema, colunas
modificadas têm sido bastante exploradas. Wahlund et al. reportaram, em
1978, a utilização de um método de fase reversa para separação de algumas
AQs e outros compostos com características anfifílica (WAHLUND, K. G. et al.,
1978).
Recentemente, a técnica de eletroforese em meio não aquoso vem sendo
bastante explorada para a separação destes compostos em capilares, porém a
separação destes compostos em microchips é pouco estudada (GEISER, L. et
al., 2009; KENNDLER, E., 2009).
1.2 Miniaturização
A miniaturização de dispositivos eletrônicos, iniciada na década de 1940,
se tornou essencial nos dias de hoje, trazendo diversos benefícios para a
sociedade como, por exemplo, aumento da velocidade de processamento e
armazenamento de dados, desenvolvimento de sistemas portáteis e ainda a
possibilidade de integrar múltiplos processamentos em paralelo (EHRFELD,
W., 2003; COLTRO, W. K. T. et al., 2007). Sendo assim, os sistemas
miniaturizados estão presentes em diversos aparelhos comuns no dia a dia,
como rádio, televisão, telefone, discos rígidos, microcomputadores, etc. A
miniaturização estendeu-se para outros campos criando várias áreas de estudo
como a micromecânica, a microóptica, a microacústica, a microfluídica dentre
outras. Essas áreas costumam ser englobadas pelo termo microtecnologia ou
tecnologia de microssistemas (WOOLLEY, A. T. et al., 1998).
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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6
Os sistemas miniaturizados também provocaram uma verdadeira
revolução na Química Analítica Instrumental, pois os microssistemas além de
aumentarem o desempenho analítico apresentaram várias outras vantagens
como a redução do volume de reagentes (volumes utilizados da ordem de µL),
baixo custo de fabricação, análise em tempo reduzido e a integração de várias
etapas de análise em um único chip (MANZ, A., GRABER, N., et al., 1990;
WOOLLEY, A. T. et al., 1998; AUROUX, P. A. et al., 2002). Por outro lado, os
processos químicos são afetados pela redução do tamanho. Na escala macro a
mistura de soluções é geralmente realizada por convecção. Por outro lado, nas
microestruturas isso não é possível devido o número de Reynolds ser baixo, o
que impede a geração de turbulência espontânea nos microcanais. Sendo
assim, a mistura de soluções nesses dispositivos são obtidas essencialmente
pela difusão, pois o tempo que uma espécie necessita para percorrer uma
dimensão ℓ diminui proporcionalmente ao quadrado do seu valor (1/ ℓ2) (MANZ,
A. et al., 2001).
Em 1979 foi construído o primeiro sistema miniaturizado de análises
químicas. Nesse trabalho pioneiro, Terry e colaboradores desenvolveram um
micro cromatográfo gasoso que consistia em uma válvula para injeção de
amostras e uma coluna capilar com comprimento de 1,5 m para separação
(TERRY, S. C. et al., 1979). Esses componentes foram integrados em uma
placa circular de silício com 5 cm de diâmetro. Um detector de condutividade
térmica foi integrado ao conjunto descrito anteriormente. Com este dispositivo
foi possível realizar rápidas separações resultando em um aumento na
frequência analítica. Ainda assim, tal dispositivo não teve um grande impacto
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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7
na comunidade científica daquela época, pois os grupos de pesquisas não
tinham um total conhecimento dos métodos de separação em micro escala, o
que provocou nos anos seguintes, um direcionamento das pesquisas para o
desenvolvimento de bombas e válvulas em escala micro e sensores químicos
(TERRY, S. C. et al., 1979; REYES, D. R. et al., 2002).
Em 1990, os microdispositivos analíticos ficaram em evidência quando
Manz e colaboradores desenvolveram um sistema miniaturizado de
cromatografia em fase líquida com dimensões de 5 x 5 mm fabricado em
substrato de silício. O dispositivo foi constituído de uma coluna tubular aberta
(6 µm x 2 µm x 15 cm) contendo um detector condutométrico e conexões para
válvulas externas para aplicação de pressão (MANZ, A., MIYAHARA, Y., et al.,
1990). No mesmo ano, Manz e colaboradores introduziram o conceito de
microssistemas para análises totais, ou µTAS (do inglês micro total analysis
systems) permitindo a integração de várias etapas analíticas como introdução
das amostras, pré-tratamento da amostra, reações químicas, separação
química e detecção em um único dispositivo (MANZ, A., GRABER, N., et al.,
1990; WOOLLEY, A. T. et al., 1998).
A partir de então, houve um crescente esforço para o desenvolvimento de
micro bombas e micro válvulas para acoplamento nos µTAS. O que se viu nos
anos seguintes foi um intenso aumento de publicação abordando os µTAS. Até
meados dos anos 1990, a grande maioria dos microdispositivos era construída
utilizando placas de silício e vidro. Desta maneira, com o emprego de vários
substratos alternativos para construção dos microdispositivos, abriu-se um
leque de aplicações, como por exemplo, a separação e análise de DNA,
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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8
separação de aminoácidos, realização de bioensaios, imobilização enzimática,
além da possibilidade manipulação de células em microcanais pela aplicação
de campos elétricos (AUROUX, P. A. et al., 2002; REYES, D. R. et al., 2002;
VILKNER, T. et al., 2004; DITTRICH, P. S. et al., 2006; WEST, J. et al., 2008;
ARORA, A. et al., 2010; KOVARIK, M. L. et al., 2013; CULBERTSON, C. T. et
al., 2014; SAJEESH, P. et al., 2014).
Ao longo do desenvolvimento das técnicas analíticas em micro escala, a
utilização da eletromigração em capilares de diâmetros internos reduzidos e em
microchips, foram bastante exploradas e a eletroforese capilar (EC) ganhou
destaque devido a sua simplicidade instrumental aliada ao uso de campo
elétrico para o transporte do fluído, eliminando assim a necessidade de
bombas e micro válvulas (LACHER, N. A. et al., 2001; COLTRO, W. K. T. et al.,
2007).
A popularização das pesquisas relacionada à miniaturização proporcionou
um grande crescimento do número de publicações nos últimos anos, como
pode ser observado na Figura 1. Na Figura 1 é possível observar uma falsa
saturação no número de publicações a partir de 2009. Essa tendência pode ser
justificada pelo surgimento de novas tecnologias em microssistemas, que não
foram incluídas na busca com as palavras chaves µTAS e LOC (do inglês, Lab
on a chip), como por exemplo, microdispositivos analíticos à base de
papel(PADs, do inglês Microfluidic paper-based analytical devices) e droplet
microfluidics, por exemplo.
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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9
Figura 1. Levantamento de publicações nos 20 últimos utilizando as palavras chaves
(A) uTAS e (B) LOC.
1.3 Eletroforese
Na década de 30 o químico e bioquímico Arne Tiselius desenvolveu uma
metodologia para separação das proteínas do soro sanguíneo, dando início à
eletroforese. O trabalho pioneiro de Tiselius com eletroforese lhe rendeu o
Prêmio Nobel no ano de 1948, além de impulsionar vários estudos
relacionados à separação de ânions, cátions, aminoácidos, drogas, vitaminas,
carboidratos, proteínas, peptídeos, entre outros analitos (SOGA, T. et al.,
2000).
A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração de
espécies iônicas ou ionizáveis sob a aplicação de um campo elétrico
(TAVARES, M. F., 1996; TAVARES, M. F., 1997). Compostos neutros também
podem ser separados com a utilização de uma modalidade eletroforética de
análise conhecida como cromatografia eletrocinética micelar (MEKC, do inglês
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
2006
2008
2010
2012
2014
2016
0
200
400
600
800
1000
Nú
mero
de p
ub
licaçõ
es
TAS
LOC
1990
1992
1994
1996
1998
2000
0
10
20
30
40
50
60
70
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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10
micellar electrokinetic chromatography) que foi proposta por Terabe e
colaboradores (TERABE, S. et al., 1984; TERABE, S. et al., 1985).
Com o passar dos anos, foram desenvolvidos capilares com diâmetro
interno reduzido, proporcionando assim uma dissipação eficiente do calor
gerado pelo efeito Joule. A partir daí, campos elétricos mais elevados puderam
ser aplicados, resultando em separações de elevada eficiência e resolução
(TAVARES, M. F., 1996; TAVARES, M. F., 1997).
A eletroforese capilar (EC) possui instrumentação simples e é composta
basicamente por uma fonte de alta tensão, um capilar para separação, um
detector e recipientes para armazenamento dos reagentes (TAVARES, M. F.,
1996). A Figura 2 representa um esquema genérico da instrumentação
necessária para EC.
Figura 2. Representação da instrumentação utilizada para um sistema de EC.
Na EC, as separações são realizadas em tubos capilares com diâmetro
interno de 20 a 100 µm e comprimento de 50 a 100 cm. O diâmetro interno
Fonte de alta tensão
Detector
Amostra
Tampão
+ Sistema de Aquisição de
Dados
Capilar
-
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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11
reduzido do capilar possibilita uma eficiente dissipação do calor gerado pela
passagem de corrente (efeito Joule) e oferece uma alta resistência elétrica,
permitindo assim a aplicação de campo elétrico elevado. Isso resulta em
separações com alta eficiência e resolução. A EC ainda apresenta vantagens
como baixo consumo de reagentes e portabilidade (BAKER, D. R., 1995;
TAVARES, M. F., 1996; TAVARES, M. F., 1997).
A velocidade das espécies dentro do capilar depende do campo elétrico
(E) aplicado e algumas propriedades da solução tampão, como por exemplo, a
viscosidade, pH e força iônica. Características das espécies a serem
separadas também são importantes, tendo a razão carga/raio do íon solvatado
como um dos principais fatores, pois de acordo com essa relação, cada
espécie adquire uma mobilidade, chamada de mobilidade eletroforética (𝜇𝑒𝑙𝑓).
A Equação 1 mostra que a velocidade de migração eletroforética (𝑣𝑒𝑙𝑓) é
proporcional ao campo elétrico (𝐸) aplicado e que a mobilidade eletroforética
(𝜇𝑒𝑙𝑓) é a constante de proporcionalidade (TAVARES, M. F., 1996; TAVARES,
M. F., 1997; SILVA, J. A. F. d., 2001; SILVA, J. A. F. d. et al., 2007).
𝑣𝑒𝑓 = 𝜇𝑒𝑓 × 𝐸 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1)
O campo elétrico aplicado também afeta as espécies carregadas do
eletrólito, que irão se movimentar gerando a eletrosmose. Tal fenômeno ocorre
pela presença de grupos silanóis na parede do capilar ou dos microcanais. Os
grupos silanóis apresentam propriedades ácidas (pKa ~ 3,0) e são facilmente
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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12
desprotonados em soluções com pH básico, havendo a formação da dupla
camada elétrica, composta pelas camadas fixa e difusa (BAKER, D. R., 1995;
TAVARES, M. F., 1996; TAVARES, M. F., 1997). A camada fixa é formada
pelas cargas positivas da solução ligadas eletrostaticamente à parede negativa
do capilar ou do microcanal. A camada difusa é a região onde não há uma
ligação tão efetiva das cargas positivas com a parede carregada
negativamente, estabelecendo-se assim um plano de cisalhamento e,
consequentemente a eletrosmose. O fenômeno de eletrosmose é conhecido
como FEO (do inglês electroosmotic flow), o qual apresenta perfil planar de
velocidade, contribuindo assim para a obtenção de picos mais estreitos e
separações com elevada eficiência e resolução (BAKER, D. R., 1995;
TAVARES, M. F., 1996; TAVARES, M. F., 1997). A Figura 3 ilustra a geração
do FEO no capilar ou microcanal.
Figura 3. Ilustração da geração do fluxo elestrosmótico na parede de um capilar ou
microcanal.
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13
A velocidade do fluxo elestrósmotico (𝑣𝑒𝑜), é proporcional ao campo
elétrico aplicado (E) de acordo com a Equação 2.
𝑣𝑒𝑜 = 𝜇𝑒𝑜 × 𝐸 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 2)
Onde 𝜇𝐹𝐸𝑂 é a mobilidade eletrosmótica e é dependente da constante dielétrica
(ε) do tampão, do potencial zeta (ζ), estabelecido no plano de cisalhamento da
camada difusa, e da viscosidade do tampão (η), de acordo com a Equação 3.
𝜇𝑒𝑜 = 𝜀ζ
4𝜋η (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 3)
A presença do FEO provoca um aumento na velocidade aparente (𝑣𝑎𝑝)
dos íons, de acordo com a Equação 4.
𝑣𝑎𝑝 = 𝑣𝑒𝑓 + 𝑣𝑒𝑜 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 4)
Onde:
𝑣𝑎𝑝 = velocidade eletroforética da espécie;
𝑣𝑒𝑜 = velocidade do fluxo eletrosmótico;
𝑣𝑒𝑓 = velocidade eletroforética da espécie;
A análise de ânions é realizada contra o FEO, uma vez que com a
polaridade invertida as cargas positivas do tampão e, consequentemente o
FEO irão migrar em sentido oposto ao detector. Desta maneira, o tempo de
análise dos ânions é diretamente afetado. Entretanto pode-se inverter a direção
do FEO para reduzir o tempo de análises dos ânions. A inversão do FEO é
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14
realizada mediante a adição de um surfactante, que pode ser uma AQ, no
tampão. Aparte polar com carga positiva interage com os grupos silanóis
negativamente carregados da parede do microcanal deixando exposta a parte
apolar. A parte apolar de outra molécula deste sal interage com a parte apolar
da molécula ligada à parede ficando exposta a parte polar carregada
positivamente. Nesta condição ocorrerá uma interação de cargas negativas do
tampão com as cargas positivas da amina quaternária formando a camada fixa.
A camada móvel de cargas negativas é formada, e com a aplicação do campo
elétrico o plano de cisalhamento é formado, e nessa condição o FEO migrará
em direção ao detector, ou seja, no mesmo sentido dos ânions (BAKER, D. R.,
1995). A Figura 4 ilustra a inversão do FEO no capilar ou microcanal.
Figura 4. Esquema representando a inversão do fluxo eletrosmótico pela adição de
uma AQ.
Os avanços alcançados na EC serviram de base para os microssistemas
eletroforéticos (MSE), tendo em vista que vários conceitos são aplicados. A
principal diferença é referente ao local de separação, enquanto em EC as
separações ocorrem em capilares, em MSE as separações ocorrem em
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15
microcanais fabricados em uma ampla variedade de substratos. A Figura 5
apresenta um microchip típico de eletroforese.
Figura 5. Configuração típica de um microchip utilizado em eletroforese.
Dentre os substratos utilizados na fabricação dos MSE, o vidro é bastante
utilizado, pois apresenta vantagens como transparência óptica, baixa
reatividade química e similaridade com os capilares de sílica. Porém, a
fabricação MSE em vidro é uma técnica que requer instrumentação sofisticada,
o que agrega alto custos na fabricação dos dispositivos. (EFFENHAUSER, C.
S. et al., 1993; SEILER, K. et al., 1993; DOLNÍK, V. et al., 2000; MCCREEDY,
T., 2000). Desta maneira, a confecção de MSE utilizando substratos
alternativos vem sendo bastante explorada nos últimos anos, como o
poli(carbonato) (PC) (LIU, Y. et al., 2001; WABUYELE, M. B. et al., 2001;
SHADPOUR, H. et al., 2007), poli(uretana) (PU) (PICCIN, E. et al., 2007),
poli(eltileno tereftalato) (PET) (ROSSIER, J. S. et al., 1999), poli(metil
Can
al d
e S
epar
ação
Canal de Injeção
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16
metacrilato) (PMMA) (LEE, G.-B. et al., 2001; PUMERA, Martin et al., 2002;
TANYANYIWA, J. et al., 2003), poli(dimetil siloxano) (PDMS) (DUFFY, D. C. et
al., 1998; MCDONALD, J. C. et al., 2000; VICKERS, J. A. et al., 2006) e
poliéster toner (PT) (DO LAGO, C. L. et al., 2003; GABRIEL, E. F. M. et al.,
2012; DA SILVA, E. R. et al., 2013). Na Figura 6 podem-se observar microchips
construídos em diversos substratos.
Figura 6. Microdispositivos eletroforéticos fabricados em diversos substratos.
O avanço nas técnicas de fabricação dos microdispositivos permitiu que
empresas especializadas se estabelecessem no mercado, como a Micronit
Microfluidics (www.micronit.com), a Microfluidics ChipShop (www.microfluidic-
chipshop.com), a Micralyne (www.micralyne.com) e a MicruX
(www.micruxfluidic.com). Atualmente é possível adquirir chips fabricados em
PMMA Vidro
ABS e PLA
Papel
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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17
PMMA com valores em torno de EUR 30,00, enquanto chips e vidro podem ser
comprados por cerca de USD 1000,00 o kit com quatro microchips de 4,5 cm
ou dois microchips de 9,0 cm.
A qualidade das separações resulta, principalmente, do processo de
injeção, o que é dificultado devido ao pequeno volume de amostra injetado, da
ordem de 200-700 pL (BAKER, D. R., 1995; TAVARES, M. F., 1996;
TAVARES, M. F., 1997; SILVA, J. A. F. d., 2001; COLTRO, W. K. T. et al.,
2007). A introdução de amostra pode ser realizada por duas técnicas
diferentes, a injeção hidrodinâmica, onde o fluido é bombeado pela aplicação
de pressão, e a injeção eletrocinética que utiliza um campo elétrico para
bombear o fluido através do capilar ou do microssistema. A injeção
hidrodinâmica apresenta como vantagem a ausência de discriminação da
amostra (BACKOFEN, U. et al., 2002; SOLIGNAC, D. et al., 2003; SAITO, R.
M. et al., 2012). A injeção eletrocinética apresenta fluxo planar, o que é uma
vantagem em comparação ao fluxo parabólico característico da injeção
hidrodinâmica. Outra vantagem dos métodos eletrocinéticos está no uso de
campo elétrico para bombear o fluído, dispensando assim o uso de bombas e
válvulas. Deste modo a introdução de amostra nos microssistema é realizada
principalmente por métodos eletrocinéticos (FU, L. M. et al., 2002; KARLINSEY,
J. M., 2012).
Dentre os métodos de injeção eletrocinética, existem três modalidades
diferentes, floating (unpinched) (HARRISON, D. J., FAN, Z. H., et al., 1993;
HARRISON, D. J., FLURI, K., et al., 1993; FAN, Z. H. et al., 1994), pinched
(EFFENHAUSER, C. S. et al., 1994; JACOBSON, S. C., HERGENRODER, R.,
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18
KOUTNY, L. B. e RAMSEY, J. M., 1994; JACOBSON, S. C., HERGENRODER,
R., KOUTNY, L. B., WARMACK, R. J., et al., 1994) e gated (JACOBSON, S. C.,
KOUTNY, L. B., et al., 1994; JACOBSON, S. C. et al., 1995; ERMAKOV, S. V.
et al., 2000; ZHANG, G. et al., 2007). O modo floating foi apresentado por
Jacobson e colaboradores em 1994 (JACOBSON, S. C., HERGENRODER, R.,
KOUTNY, L. B., WARMACK, R. J., et al., 1994), e dentre todas as estratégias
eletrocinéticas, é o método mais simples para introdução da amostra em MSE,
pois requer apenas uma fonte de alta tensão e o controle dos potenciais em
apenas dois reservatórios. Na etapa de preenchimento é estabelecido um
campo elétrico entre os reservatórios da amostra e de descarte da amostra,
desta maneira ocorrerá o preenchimento do canal de injeção. Em seguida, na
etapa de injeção, o campo elétrico é estabelecido entre os reservatórios do
tampão e de descarte do tampão, ocorrendo assim a injeção de uma zona de
amostra definida pela intersecção dos canais. Na etapa de separação, as
espécies presentes na zona de amostra irão se separar de acordo com as suas
respectivas mobilidades.
Para reduzir o alargamento da zona de amostra provocado pela difusão,
Jacobson e colaboradores (JACOBSON, S. C., HERGENRODER, R.,
KOUTNY, L. B., WARMACK, R. J., et al., 1994) apresentaram o modo de
injeção pinched, o qual consiste em aplicar potencial em três reservatórios, no
sentido de definir a zona de amostra introduzida no canal de separação
(JACOBSON, S. C., HERGENRODER, R., KOUTNY, L. B., WARMACK, R. J.,
et al., 1994; ERMAKOV, S. V. et al., 2000; FU, L. M. et al., 2002; PUMERA, M.,
2007; KARLINSEY, J. M., 2012).
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19
O modo de injeção gated consiste em três etapas. É necessária a
utilização de mais de uma fonte de alta tensão ou fontes multicanais, pois é
aplicada uma diferença de potencial em dois reservatórios simultaneamente.
Em uma primeira etapa uma alça de amostragem é formada com o
estabelecimento de um campo elétrico entre os reservatórios da amostra e de
descarte da amostra e outro campo elétrico entre os reservatórios do tampão e
de descarte do tampão. Em segundo momento, na etapa de formação da zona
de amostra, o campo elétrico aplicado entre os reservatórios do tampão e do
descarte do tampão é interrompido, então temos o controle eletrocinético da
amostra na intersecção dos canais. A etapa de injeção ocorre quando o campo
elétrico entre os reservatórios do tampão e de descarte do tampão é
reestabelecido. Por fim, na etapa de separação, os analitos presentes na zona
de amostra injetada são separados de acordo com suas respectivas
mobilidades.
O método de injeção gated apresenta como vantagem a possibilidade de
controlar as zonas de amostras introduzidas no canal de separação, variando-
se o tempo de injeção (JACOBSON, S. C., HERGENRODER, R., KOUTNY, L.
B., WARMACK, R. J., et al., 1994; FU, L. M. et al., 2002; BIAS, M. et al., 2008;
KARLINSEY, J. M., 2012). Slentz e colaboradores avaliaram a influência do
modo de injeção gated na resposta do detector por fluorescência induzida a
laser (LIF, do inglês laser induced fluorescence) e os autores observaram um
aumento do sinal pela variação do tempo de injeção (SLENTZ, B. E. et al.,
2002). Umas das desvantagens da injeção eletrocinética, já citada
anteriormente, é a discriminação da amostra. Utilizando simulações
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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20
computacionais, Blas e colaboradores investigaram a influência de parâmetros
operacionais na discriminação da amostra (BLAS, M. et al., 2007).
A Figura 7 apresenta uma ilustração resumida da formação da zona de
amostra para o modo floating (Figura 7A) e gated (Figura 7B). Uma ilustração
mais detalhada, de ambos os modos, pode ser visualizada nas Figuras 10 e 11
para os modos gated e floating respectivamente.
Figura 7. Ilustração da formação da zona de amostra no modo de injeção (A) gated e
(B) floating. A zona de amostra está destacada de vermelho.
1.4 Detectores para MSE
A fluorescência induzida a laser (LIF, do inglês laser induced
fluorescence) e a espectrometria de massa (MS, do inglês mass spectrometry)
são métodos bastante utilizados em MSE, uma vez que proporcionam
excelentes níveis de detectabilidade. Esses detectores são amplamente
utilizados em aplicações biológicas bionalíticas, principalmente em análises
genéticas e proteômicas (MUNRO, N. J. et al., 2000; JIN, L. J. et al., 2001;
MCCLAIN, M. A. et al., 2003). Porém o alto custo e a complexidade da
instrumentação se tornam uma desvantagem para os métodos de detecção
citados anteriormente. Deste modo, a detecção eletroquímica vem ganhando
+
-
+
+ -
-
+
- -
(A) (B)
-
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21
bastante destaque para uso em MSE, pois requer instrumentação
economicamente mais acessível e apresenta elevado potencial para integração
nos microssistemas analíticos (VANDAVEER, W. R. et al., 2002; WANG, J.,
2002; WANG, J., 2005). O trabalho de Woolley e colaboradores, publicado em
1998, foi o primeiro a reportar o uso da detecção amperométrica (DA) acoplada
a microdispositivos. Nesse trabalho, foi utilizado um microdispositivo de vidro
com detecção na saída do canal para a análise de neurotransmissores
(WOOLLEY, A. T. et al., 1998). A detecção eletroquímica em microdispositvo
pode ser realizada por três modos diferentes: amperometria (VANDAVEER, W.
R. et al., 2002), condutometria e potenciometria (TANYANYIWA, J. et al.,
2002).
Dentre as técnicas de detecção citadas anteriormente, a DA é a mais
utilizada em microssistemas eletroforéticos, uma vez que é a técnica com os
melhores níveis de detectabilidade. O funcionamento da DA está baseado na
aplicação de um potencial em um eletrodo de trabalho, enquanto a corrente é
monitorada em função do tempo. Um dos fatores mais importante da DA é o
posicionamento dos eletrodos, deste modo nos últimos anos foram publicados
vários trabalhos explorando diversas configurações de posicionamento de
eletrodos (CHEN, D. C. et al., 2001; MARTIN, R. S. et al., 2002; LAI, C. C. J. et
al., 2004).
A condutometria é um método de detecção quase universal, largamente
utilizada em microssistemas eletroforéticos. Essa técnica funciona basicamente
pela diferença de condutividade das zonas dos analitos (TANYANYIWA, J. et
al., 2002). A condutometria pode ser realizada de dois modos, com contato
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22
(HABER, C. et al., 1998; KATZMAYR, M. U. et al., 1999) e sem contato (DA
SILVA, J. A. F. et al., 1998).
Na detecção condutométrica sem contato (C4D do inglês Capacitively
coupled contactless conductivity detection) o posicionamento dos eletrodos é
externo ao microcanal, ou seja, não entra em contato com a solução. Esse
posicionamento externo é possível devido à utilização de altas frequências de
operação, proporcionando assim uma maior durabilidade dos eletrodos, uma
vez que não há a contaminação dos mesmos, além disso, não há problemas
relacionados com a formação de bolhas, eletrólise e interferência do campo
elétrico aplicado no processo eletroforético(PUMERA, M. et al., 2002;
COLTRO, W. K. T. et al., 2007; COLTRO, W. K. T. et al., 2012; KUBÁŇ, P. et
al., 2013). Na Figura 8 temos a ilustração dos acoplamentos dos eletrodos em
capilares (Figura 8A) e em microcanais (Figura 8B).
Figura 8. Ilustração dos eletrodos acoplados em um (B) capilar e em um (B)
microcanal.
e0 e1
e0
e1
(A)
(B)
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23
A principal desvantagem do C4D são os baixos níveis de detectabilidade
alcançados. Trabalhos recentes utilizando C4D em sistemas convencionais de
EC reportam limites de detecção (LD) abaixo de 1 µmol/L, com a utilização de
eletrodos circulares (KUBAN, P. et al., 2008). No entanto, nos MSE a
integração de eletrodos se dá basicamente pelo uso de eletrodos planares, o
que reduz o acoplamento capacitivo e, consequentemente, afeta os valores de
LD. Guijt e colaboradores apresentaram, em 2001, o primeiro trabalho
utilizando C4D em MSE. Neste trabalho, os autores reportaram a detecção de
K+ na concentração de 200 µmol/L (GUIJT, R. M. et al., 2001). Pumera e
colaboradores em 2002 usaram MSE-C4D e reportaram valores de LD de 2,8
µmol/L para o íon K+ (PUMERA, M. et al., 2002). Lee e colaboradores
propuseram a fabricação de eletrodos semicirculares como estratégia para
melhorar o limite e detecção do sistema C4D em MSE. De acordo com os
resultados publicados, os autores encontraram LD de aproximadamente 1
µmol/L (LEE, C. Y. et al., 2006). Em 2010 Mahabadi e colaboradores
apresentaram uma nova configuração de eletrodos para MSE, eles usaram
eletrodos planares duplos e alcançaram LD de 0,56 µmol/L para o íon K+.
Outra vantagem importante da C4D é a fácil integração dos eletrodos com
os microcanais, permitindo assim a utilização de vários materiais para
construção de eletrodos integrados em diferentes geometrias. É comum a
utilização de eletrodos fabricados pela deposição de finas camadas de metais,
como por exemplo, ouro (Au) (JANG, Y. C. et al., 2011), platina (Pt)
(LICHTENBERG, J. et al., 2002) e alumínio (Al) (PUMERA, M. et al., 2002).
Fitas de metal e deposição térmica de toner também são bastante utilizadas
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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24
para construção de eletrodos de forma simples e rápida (WANG, J. et al., 2002;
DO LAGO, C. L. et al., 2004). Guijt et al. e Coltro et al., propuseram de forma
independente, em 2011, a utilização de placas de circuito impresso para a
fabricação de eletrodos para a detecção de cátions inorgânicos (COLTRO, W.
K. T. et al., 2011; GUIJT, R. M. et al., 2011). Recentemente, Chagas et al.,
reportaram a utilização de lápis para desenhar eletrodos em papel, abrindo a
possibilidade para explorar várias geometrias de eletrodo de forma rápida e
barata (CHAGAS, C. L. S. et al., 2015). Metodologias para construção de
eletrodos utilizando ligas metálicas (GAUDRY, A. J. et al., 2013; THREDGOLD,
L. D. et al., 2013) e soluções iônicas (BLASZCZYK, K. et al., 2013; DUARTE,
G. F. et al., 2015), em canais perpendiculares ao canal de separação, foram
proposta recentemente.
A popularização da eletroforese e todos os avanços alcançados na
integração de eletrodos e microcanais, proporcionaram o surgimento de
equipamentos comerciais de eletroforese em microchips. O primeiro sistema
com detecção C4D foi lançado pela eDAQ (Denistone, Austrália). Até o
momento existem quatro equipamentos deste no Brasil, dos quais dois estão
presentes no nosso grupo, os outros estão no Centro de Pesquisas Leopoldo
Américo Miguez de Mello (Cenpes) e na USP de São Carlos. Desta maneira, o
primeiro trabalho utilizando esse equipamento foi publicado recentemente pelo
nosso grupo. Neste trabalho, os autores reportaram o monitoramento de íons
inorgânicos em amostras ambientais, além do monitoramento do ciclo do
nitrogênio em ambientes com peixes (FREITAS, C. B. et al., 2016).
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25
1.5 Eletroforese não Aquosa
A diferença da eletroforese não aquosa para a convencional é
basicamente a utilização de solventes orgânicos no preparo do eletrólito de
corrida. Os vários tipos de solventes orgânicos proporcionam uma infinidade de
composições do eletrólito de corrida, seja na forma pura ou mistura de dois ou
mais solventes (ASSUNCAO, N. A. et al., 2005; GEISER, L. et al., 2009;
KENNDLER, E., 2009).
A utilização de solventes orgânicos apresenta uma série de vantagens,
como por exemplo, alta resolução na separação dos compostos, larga
versatilidade, relativa ausência de interferentes e ainda a possibilidade de se
analisar compostos com baixa ou nenhuma solubilidade em água (VARENNE,
A. et al., 2008; GEISER, L. et al., 2009).
O uso de solventes orgânicos como eletrólito foi mostrado pela primeira
vez em 1984 por Jorgenson e co-autores. Neste trabalho, os autores
reportaram a utilização da NACE (do inglês, nonaqueous capillary
electrophoresis) para a separação de algumas bases orgânicas utilizando um
eletrólito composto por perclorato de tetraetilamônio (0,05 M) e ácido clorídrico
(0,01 M) em acetonitrila (WALBROEHL, Y. et al., 1984). A partir deste trabalho
pioneiro, o uso da eletroforese não aquosa em capilares foi bastante explorado
(MUZIKAR, J. et al., 2001; CANTU, M. D. et al., 2004; BUGLIONE, L. et al.,
2013a; BUGLIONE, L. et al., 2013b), por outro lado o uso de microchips não
vem sendo tão explorada, principalmente utilizando C4D.
Lu et al, em 2002 utilizaram um sistema de eletroforese não aquosa em
microchips (NAME do inglês nonaqueous microchips electrophoresis) com um
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26
fotomultiplicador como detector. Neste trabalho foram determinados de três
composto usados em explosivos ( trinitrotolueno – TNT, trinitrobenzeno - TNB e
trinitrofenilmetilntroamina - tetryl) utilizando um microchip com comprimento
efetivo de 8 cm e como eletrólito uma mistura de MeOH/ACN na proporção
87,5:12,5 (v/v) com a adição de NaOH 2,5 mmol/L (LU, Q. et al., 2002).
O primeiro trabalho utilizando um sistema NAME acoplado com C4D, foi
publicado em 2003 por Wang et al. Neste trabalho os autores reportaram a
separação de quatro AQs (brometo de tetrametilamônio, cloreto de
tetrapropilamônio, perclorato de tetrabutilamônio) e uma amina terciária (N,N-
dimetildodecilamina), utilizando um microchip de comprimento efetivo de 8 cm.
Como eletrólito, os autores utilizaram uma mistura de DHBA e NaDHBA na
concentração de 5 mmol/L cada, dissolvidos em uma mistura de ACN/MeOH
90:10 (v/v).
Varjo e colaboradores utilizaram um sistema NAME com detecção por
epifluorescência, a qual, a fluorescência é incidida na amostra
perpendicularmente ao eixo de excitação. Nesse trabalho, os autores
reportaram a separação de aminas derivatizadas com isoticianato de
fluoresceína (FITC do inglês fluorescein isothiocyanate) (VARJO, S. J. et al.,
2004).
Em 2013 Hu et al, utilizaram um sistema NAME com detecção por
quimioluminescência para separar dois tipos de rodaminas (Rodamina 123 e
Rodamina 6G) (HU, H. M., YIN, X. F., et al., 2013). Em 2013, os mesmo
autores utilizaram um sistema de NAME com detecção LIF, para determinação
de catecolaminas em amostras de urina (HU, H. M., LI, Z. H., et al., 2013).
INTRODUÇÃO – Determinação de Aminas Quaternárias
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27
Recentemente, Cable e colaboradores identificaram aminas primárias de
solo de Titan (lua de Saturno) utilizando um sistema NAME-LIF (CABLE, M. L.,
HORST, S. M., et al., 2014). No mesmo ano, Cable e colaboradores reportaram
a separação de ácidos graxos utilizando o mesmo sistema NAME-LIF (CABLE,
M. L., STOCKTON, A. M., et al., 2014).
28
Objetivos
OBJETIVOS
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29
2 Objetivos
2.1 Objetivos Gerais
O objetivo geral desse trabalho visa o desenvolvimento de uma
metodologia analítica para separação de aminas quaternárias utilizando
eletroforese não aquosa em microchips com C4D.
2.2 Objetivos específicos
Otimizar as condições operacionais do C4D;
Avaliar a reprodutibilidade na introdução da amostra nos MSE;
Avaliar o efeito do modo de injeção nos níveis de detectabilidade do C4D;
Otimizar o controle eletrocinético na eletroforese em meio não aquoso;
Avaliar a composição do eletrólito para as separações eletroforéticas;
Analisar as aminas quaternárias em águas residuais de dutos petrolíferos;
30
Parte Experimental
PARTE EXPERIMENTAL
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31
3 Procedimento Experimental
3.1 Reagentes
Os regentes utilizados foram adquiridos junto a Sigma-Aldrich (St.
Louis/MO, USA) os quais estão listados na tabela 1 com suas respectivas
abreviaturas e purezas.
Tabela 1. Relação dos reagentes utilizados no trabalho, juntamente com as
respectivas abreviaturas e pureza.
Reagentes Abreviatura Pureza (%)
Acetato de amônio ActNH4 97,0
Acetonitrila ACN 99,8
Ácido 2-(n-morfolino)etanosulfônico sódico NaMES 99,0
Ácido 2,6 – dihidroxibenzóico DHBA 98,0
Ácido 2-N-morfolino etanossulfônico MES 99,0
Ácido 3-(n-morflino)propanosulfônico hemi-sódico
NaMOPS 99,0
Ácido benzóico HBA 99,5
Ácido desoxicólico DCHA 98,0
Ácido desoxicólico sódico NaDCHA 97,0
Ácido N-ciclohexil-2-hidroxil-3-aminopropanosulfônico sódico
NaCAPSO 98,0
Benzoato de sódio NaBA 99,5
PARTE EXPERIMENTAL
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32
Continuação da Tabela 1
Brometo de benziltrimetilamônio BTAB 99,0
Brometo de tetrametilamônio TMAB 98,0
Brometo de deciltrimetilamônio ETAB 98,0
Brometo de hexadeciltrimetilamônio CTAB 98,0
Brometo de hexiltrimetilamônio HTAB 98,0
Brometo de tetradeciltrimetilamônio TTAB 98,0
Brometo de tetradodecilamônio TDAB 99,0
Brometo de tetraoctilamônio TOAB 98,0
Brometo de tetrapropilamônio TPAB 98,0
Brometo de trimetiloctadecilamônio TODAB 98,0
Brometo de trimetiloctilamônio TOMB 98,0
Cloreto de dodeciltrimetilamônio DTAC 98,0
Cloreto de lítio 99,0
Cloreto de potássio 99,5
Cloreto de sódio 99,8
Colato de sódio hidratado NaCH 99,0
Dimetilsulfóxido DMSO 99,9
Hidróxido de sódio 99,8
Hidróxido de tetraetilamônio 40% in H2O TEAOH
PARTE EXPERIMENTAL
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33
Continuação da Tabela 1
Lactato de sódio NaLa 98,0
L-histina His 99,0
Metanol MeOH 99,8
N,N-dimetilformamida DMF 99,8
Perclorato de tetrabutilamônio TBAP 99,0
Solução de acetato de amônio 7,5 M s-ActNH4
3.2 Preparo das Soluções
As soluções estoques para a eletroforese em meio aquoso foram
preparadas semanalmente empregando água deionizada com resistividade
igual a 18,2 MΩ.cm (Millipore, Kansas City, MO, EUA) na concentração de 100
mmol/L para MES e His, e 10 mmol/L para os cátions K+, Na+ e Li+, sendo
filtradas em seguida com membrana de 0,22 µm (Millipore, Kansas City, MO,
EUA). As soluções estoques das aminas quaternárias para a eletroforese não
aquosa foram preparadas semanalmente em metanol grau HPLC na
concentração de 10 mmol/L. Os eletrólitos de corrida foram preparados
diretamente nas concentrações utilizadas no processo eletroforético.
PARTE EXPERIMENTAL
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34
3.3 Instrumentação
Os experimentos foram realizados utilizando o sistema de eletroforese em
microchips acoplado com C4D (eDAQ, Australia - http://www.edaq.com). Este
sistema é composto por duas fontes de alta tensão modelo Sequencer ER230
(Figura 9A) e um detector modelo C4D System ER225 (Figura 9B). Os
microchips modelos ET145 e ET190 contendo canal de separação com
comprimentos de 45 e 90 mm respectivamente. Os microcanais possuem
dimensões de 100 × 10 µm (largura × altura) com geometria em duplo-T. Estes
microchips já possuem eletrodos integrados, os quais possuem dimensões 200
µm × 500 µm × 200 nm (largura × comprimento × espessura) e são separados
por uma distância de 250 µm. Estes microchips são facilmente acoplados ao
sistema de detecção e às fontes de alta tensão através de uma plataforma
microfluídica modelo ET225 (Figura 9C) também comercializada pela eDAQ). A
aquisição de dados e controle do detector foram realizados através do software
PowerChrom, e para o controle dos potenciais bem como o controle do tempo
de injeção foi utilizado o software Sequencer, ambos disponibilizados pela
eDAQ.
PARTE EXPERIMENTAL
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35
Figura 9. Sistema de eletroforese eDAQ: em (A) as fontes de alta tensão; em (B) o
sistema de detecção C4D; em (C) a plataforma microfluídica para acoplamento do
microchip com o sistema de detecção e as fontes de alta tensão; em (D) o microchip
de vidro.
3.4 Otimização dos parâmetros operacionais do C4D
A otimização do detector é necessária para cada eletrólito utilizado, para
obtermos as melhores condições operacionais que permitam a melhor relação
sinal/ruído. O sistema tampão MES/His (20 mmol/L) foi utilizado como eletrólito de
corrida, por apresentar baixa condutividade e favorecer a detecção de espécies
inorgânicas, que apresentam alta condutividade.
A otimização foi realizada automaticamente utilizando o software de
aquisição de dados (PowerChrom). Esse estudo foi realizado com os canais do
chip preenchidos com eletrólito. Então a resposta do detector foi monitorada em
frequências e amplitudes que variaram de 100-1400 kHz e 2-20 Vpp
respectivamente. Em seguida realizou-se a mesma varredura, com os canais do
chip preenchidos com o eletrólito diluído em 20%, sendo considerado o branco. As
(A) (B)
(C) (D)
PARTE EXPERIMENTAL
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36
respostas das varreduras foram subtraídas para obter as condições em que o sinal
foi mais intenso. O mesmo procedimento descrito anteriormente foi utilizado para
otimização dos parâmetros de detecção na eletroforese em meio não aquoso. A
única diferença foi que na varredura a frequência foi variada de 10-100 Vpp, uma
vez que o modo de ganho do detector foi utilizado (Headstage gain on).
3.5. Controle Eletrocinético
Foram estudados os modos de injeção eletrocinética gated e floating, os dois
mais comuns que podem ser aplicados aos MSE. Neste estudo, avaliou-se a
repetitividade de ambos os processos usando-se uma solução de K+.
3.5.1 Modo floating
A Figura 10 apresenta um esquema simplificado para ilustrar a introdução
da amostra nessa modalidade explorando-se a geometria dos canais no
formato de duplo-T. Conforme definido na Figura 10A, o canal delimitado pelos
reservatórios 1 e 3 representa o canal de injeção, enquanto o canal delimitado
pelos pontos 2 e 4 representa o canal de separação.
Figura 10. Apresentação do processo de introdução da amostra usando-se o método
floating em MSE contendo canais dispostos na configuração de (A) duplo-T. Os
números 1, 2, 3 e 4 indicam, respectivamente, os reservatórios da amostra, do
tampão, descarte da amostra.
1
4
3
2
800 V
0 V
1000 V
0 V 0 V
1000 V(A) (B) (C) (D)
PARTE EXPERIMENTAL
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37
Inicialmente, uma diferença de potencial igual a 800 V foi aplicada ao
canal de injeção por um tempo de 5 s, permitindo assim o preenchimento de
todo o canal com amostra (Figura 10B). Em seguida, o potencial aplicado ao
canal de injeção foi desligado e uma diferença de potencial igual a 1000 V foi
aplicada ao canal de separação. Conforme pode se observar na Figura 10C,
nessa etapa a zona de amostra definida na intersecção dos canais foi
introduzida no canal de separação. Nessa etapa, as espécies de separam de
acordo com suas mobilidades e são detectadas pelo detector condutométrico
posicionado próximo ao reservatório 4 (Figura 10D).
3.5.2 Modo gated
A Figura 11 apresenta um esquema simplificado para ilustrar a
introdução da amostra nessa modalidade. Conforme definido na Figura 11A, a
alça delimitada pelos reservatórios 1 e 2 representa o canal de amostragem,
enquanto que a alça delimitada pelos pontos 3 e 4 representa o canal de
separação.
Figura 11. Processo de introdução da amostra pelo modo gated em MSE contendo
canais dispostos na configuração de (A) duplo-T ilustrando as etapas (B) amostragem,
(C) controle eletrocinético da amostra, (D) introdução de uma zona de amostra bem
definida e (E) separação eletroforética dentro do canal de separação. Em (A), os
números 1, 2, 3 e 4 indicam, respectivamente, os reservatórios de descarte da
amostra, da amostra, do tampão e descarte do tampão.
800 V
1
4
3
2 800 V 800 V 800 V
1000 V 0V 1000 V 1000 V
0 V 0 V 0 V 0 V
0 V 0 V 0 V 0 V
(A) (B) (C) (D) (E)
PARTE EXPERIMENTAL
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38
Incialmente é aplicado uma diferença de potencial de 800 V entre os
reservatórios da amostra e de descarte da amostra, ocorrendo o
preenchimento do canal de amostragem. Também foi estabelecida uma
diferença de potencial de 1000 V entre os reservatórios do tampão e de
descarte do tampão (Figura 11B). O potencial do reservatório do tampão é
desligado por um intervalo de tempo, ocorrendo a injeção da amostra entre a
intersecção dos canais (Figura 11C). Religando o potencial no reservatório do
tampão, uma zona de amostra bem definida (Figura 11D) é introduzida no
canal de separação e as espécies se separam de acordo com suas respectivas
mobilidades (Figura 11E).
3.6 Avaliação da repetibilidade da Injeção: gated versus floating
Foi realizada uma série de injeções consecutivas de uma solução
contendo K+ 100 µmol/L para avaliar a repetibilidade dos tempos de migração e
ainda a variação na velocidade eletrosmótica em ambos os modos de injeção.
No modo gated também foi realizada a separação dos íons K+, Na+ e Li+ a
fim de avaliar parâmetros como eficiência de separação e resolução, além de
encontrar os LDs. Para esse ensaio preparou-se uma solução equimolar das
espécies na concentração de 50 µmol/L para ambos os modos de injeção.
PARTE EXPERIMENTAL
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39
3.7 Efeito do modo de injeção na resposta analítica
Avaliou-se o efeito do volume injetado sobre o nível de detectabilidade
para ambos os modos. Utilizou-se uma solução do íon potássio (K+) e as
análises foram realizadas variando-se o tempo de injeção para várias
concentrações, no sentido de investigar a influência do tempo de injeção sobre
o nível de detectabilidade do sistema C4D.
3.8 Separação das Aminas Quaternárias em meio aquoso
Realizou-se uma simulação experimental do processo de separação dos
tensoativos pelo software livre PeakMaster 5.3 Complex, desenvolvido e
disponibilizado no website http://web.natur.cuni.cz/~gas/ pelo grupo de
pesquisa do Prof. Bohuslav Gaš. Porém o software permite apenas realizar
simulação em meio aquoso. Após a simulação foram realizados testes
empregando o tampão utilizado nas análises dos íons inorgânicos, constituído
de uma mistura equimolar de MES e His (20 mmol/L).
3.9 Separação das Aminas Quaternárias em meio não aquoso
3.9.1 Otimização dos potenciais de separação e injeção
Uma das vantagens da utilização de eletrólitos a base de solventes
orgânicos, é a possibilidade da aplicação de elevados potenciais no processo
eletrofético, sem que isso cause problemas de aquecimento devido ao efeito
Joule. Desta maneira, foi realizada a otimização dos potenciais de injeção e
PARTE EXPERIMENTAL
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40
separação, uma vez que o campo elétrico influencia diretamente na mobilidade
dos analitos e consequentemente no formato dos picos e no tempo de análise.
3.9.2 Otimização da composição do eletrólito de corrida
Inicialmente foi utilizado uma mistura de MeOH/ACN na proporção 90:10
(v/v) como solvente, pois existem alguns trabalhos na literatura a qual foi
explorado esse eletrólito para separações em capilares e microchips (LU, Q. et
al., 2002; WANG, J. et al., 2003; BUGLIONE, L. et al., 2013a).
A utilização de solventes orgânicos permite a escolha de composições
variadas do eletrólito. Várias composições de eletrólitos foram testadas a fim de
encontrar a melhor condição experimental para promover separações com alta
eficiência e boa resolução. Para fins comparativos, foi realizado um estudo
para avaliar a substituição da mistura de MeOH/ACN por DMSO e DMF no
preparo do eletrólito de corrida.
Buglione et al. reportaram um trabalho avaliando a eficiência de alguns
sais adicionados no eletrólito para separações de aminas quaternárias
utilizando eletroforese em capilares. Desta maneira, realizou-se um estudo
comparativo desses compostos quando adicionados no eletrólito de corrida.
Nesse estudo foram utilizados os seguintes compostos: s-ActNH4, NaDCHA,
NaCH, DCHA, NaMES, NaMOPS, NaCAPSO, na concentração igual a 10
mmol/L cada, e também a mistura contendo os compostos DCHA-TEAOH nas
concentrações de 10 mmol/L e 5 mmol/L, respectivamente.
PARTE EXPERIMENTAL
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
41
Foram realizadas medidas de condutividades utilizando um
condutivímetro CG853 da SCHOTT (Hoffenhein, Alemanha) e medidas de pH
utilizando um pHmetro PG1800 da GEHAKA (São Paulo, Brasil) com um
eletrodo polimérico SA02 da Sensoglass (São Paulo,Brasil).
Por fim, foi estudada a variação na porcentagem de ACN na mistura de
MeOH/ACN utilizada como solvente.
3.9.3 Análises das aminas quaternárias em águas residuais
Foram recebidas da Petrobras três amostras de água de saídas de dutos
petrolíferos, sendo essa água a matriz de interesse para determinação das
aminas quaternárias. A curva analítica com adição padrão foi construída com a
faixa de concentração de 50 µmol/L até 1 mmol/L. Cada solução foi preparada
com os respectivos valores de concentrações das aminas quaternárias e em
cada uma foi adicionada 10% da amostra tratada previamente.
42
Resultados e Discussão
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
43
4 Resultados e Discussão
4.1 Otimização dos parâmetros operacionais do C4D
O princípio de funcionamento do C4D consiste basicamente na geração de um
sinal de alta frequência a partir de um gerador de funções, o qual é aplicado por
um eletrodo de excitação (e0), assim há o estabelecimento de um campo
elétrico entre os eletrodos de excitação e recepção do sinal (e0 e e1,
respectivamente) (Figura 12) (DA SILVA, J. A. F. et al., 1998; BRITO-NETO, J.
G. A. et al., 2005a; BRITO-NETO, J. G. A. et al., 2005b; COLTRO, W. K. T. et
al., 2012). A corrente gerada é proporcional à condutividade do meio e é
registrada pelo eletrodo receptor (e1) que é então encaminhada a um circuito
onde ela é convertida em um sinal digital (DA SILVA, J. A. F. et al., 1998;
BRITO-NETO, J. G. A. et al., 2005a; BRITO-NETO, J. G. A. et al., 2005b;
COLTRO, W. K. T. et al., 2012). Os parâmetros operacionais com maior
influência na resposta do sistema C4D são a geometria dos eletrodos e a
frequência da onda senoidal aplicada aos eletrodos, conforme demonstrado na
Equação 5.
Figura 12. Esquema genérico mostrando o funcionamento do C4D.
V
t
i(t)
e0
e1
+-
RESULTADOS E DISCUSSÃO
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44
|𝑌| =1
√(𝐾𝑘 )
2
+ 1
4𝜋2𝑓2𝐶𝑃2
(𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 5)
onde (𝐾) é a constante da cela, (𝑘) é a condutividade, (𝑓) é a frequência e (𝐶𝑃)
é a capacitância da parede do canal, que é calculada pela relação abaixo
𝐶𝑝 =𝐶1 × 𝐶2
𝐶1 + 𝐶2 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 6)
onde 𝐶1 e 𝐶2 são as capacitâncias entre os eletrodos 1 e 2 com a parede
(BRITO-NETO, J. G. A. et al., 2005a; BRITO-NETO, J. G. A. et al., 2005b).
Levando-se em consideração que a geometria dos eletrodos é
constante, a constante da cela (𝐾) não sofrerá alterações. Logo, a frequência
afeta diretamente a resposta do detector e a otimização da amplitude é
importante, pois ela promove uma variação diretamente proporcional na
resposta analítica, sendo assim quanto maior a corrente gerada pela onda
aplicada aos eletrodos, maior será a resposta do sistema de detecção.
Desse modo, a otimização foi realizada na presença do eletrólito (Figura
13A) e do branco - eletrólito diluído 5% - (Figura 13B). Então a resposta do
branco foi subtraída da resposta do eletrólito (Figura 13C). A melhor resposta
foi obtida na frequência de 900 kHz e amplitude de 20 Vpp.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
45
Figura 13.Varredura da resposta versus a frequência em cada amplitude para o
eletrólito (A), para o branco (B) e a resultante da subtração (C).
4.2 Avaliação da repetibilidade da Injeção: gated vs floating
A repetibilidade do processo de injeção da amostra foi investigada em
função do uso dos modos eletrocinéticos gated e floating. Cinco séries
contendo nove injeções cada foram realizadas usando-se uma solução de K+
preparada na concentração igual a 100 µmol/L. Os resultados estão
apresentados nas Figuras 14 e 15.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0(A)
100%
80%
90%
70%
60%
50%
40%
30%20%
10%
Re
sp
os
ta (
mV
)
Frequência (kHz)0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-1400
-1200
-1000
-800
-600
-400
-200
0(B)
100%
80%
90%
70%
60%
50%
40%
30%20%
10%
Frequência (kHz)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
10
20
30
40
50
60
70(C)
100%
80%90%
70%
60%
50%40%
30%
20%
10%
Re
sp
os
ta (
mV
)
Frequência (kHz)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
46
Figura 14. Série de eletroferogramas com injeções sequenciais mostrando a
repetitividade analítica utilizando o modo de injeção floating. Potenciais aplicados nos
reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V respectivamente. Tempo de
preenchimento do canal de injeção: 10 s. Solução contendo K+ (100 µmol/L); Tampão:
Mistura equimolar de MES/His (20 mmol/L cada) pH 6,1; Frequência: 900 kHz;
Amplitude: 20 Vpp.
Figura 15. Série de eletroferogramas com injeções sequenciais mostrando a
repetibilidade analítica utilizando o modo de injeção gated. Potenciais aplicados nos
reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V respectivamente. Tempo de
injeção: 1s. Outras condições: ver Figura 14.
0 100 200 300 400 500 600 700
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo (s)
20 mV
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Sin
al
C4D
(m
V)
Tempo (s)
20 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
47
Devido à variação de condutividade, os picos positivos e negativos
representam, respectivamente, o íon K+ e a água. A representação gráfica da
repetitividade para o tempo de migração do íon K+ e do marcador neutro versus
o número de injeções em ambos os modos de injeção estão apresentados na
Figura 16.
Figura 16. Representação gráfica do tempo de migração do íon K+ e do marcador
neutro versus o número de injeção para os modos (A) floating e (B) gated.
O tempo de migração do íon potássio para os modos gated e floating foi
26 ± 1s (n = 45) e 26 ± 2s (n = 45), respectivamente. Desse modo, a
repetibilidade para ambos os modos foi aceitável, levando-se em consideração
o tempo de migração. A magnitude do FEO foi calculada a partir da Equação 7
(BAKER, D. R., 1995).
𝜇𝑒𝑜 =ℓ × 𝐿
𝑡𝑚 × 𝑉 (𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 7)
0 10 20 30 40 50-60
-30
0
30
60
90
120
150
(A)
Potássio (K+)
Tem
po d
e M
igra
ção
(s)
Injeções Sucessivas
Marcador Neutro (H2O)
0 10 20 30 40 50-60
-30
0
30
60
90
120
150
(B)
Injeções Sucessivas
Marcador Neutro (H2O)
Potássio (K+)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
48
Onde:
ℓ = comprimento efetivo;
𝐿 = comprimento total;
𝑡𝑚 = tempo de migração;
𝑉 = potencial de separação;
A magnitude do FEO encontrado foi 2,4×10-4 ± 0,5×10-4 e 2,5×10-4 ±
0,5×10-4 cm2 s-1 V-1 para os modos floating e gated respectivamente.
Possivelmente, essa diferença encontrada pode estar relacionada com a maior
difusão observada para o modo de injeção floating. Avaliando a repetitividade
para a intensidade e área do pico, referente ao íon potássio, observou-se que
em ambos os modos de injeção os desvios foram maiores, quando comparado
aos desvios dos tempos de migração. No modo floating, os valores
encontrados foram 27 ± 6 mV.s e 23 ± 5 mV e no modo gated encontrou-se 62
± 25 mV.s e 33 ± 7 mV para a área e intensidade, respectivamente. Como
esperado, o modo gated apresentou picos com área e intensidade maiores
devido ao maior controle do volume de amostra injetado. Porém, o desvio
padrão para área no modo gated foi muito alto, o que não era esperado devido
ao modo gated permitir um controle maior do volume de amostra injetado.
Não considerando os valores para área versus as injeções consecutivas
no modo gated, o qual apresentou DPR na ordem de 40%, podemos dizer que
ambos os modos de injeção apresentaram boa repetitividade analítica. Vale
ressaltar que as injeções (45 no total) foram realizadas consecutivamente, ou
seja, sem troca ou reposição das soluções dos reservatórios entre as
sequências.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
49
4.3 Efeito da Injeção no desempenho do detector: gated vs floating
Uma das principais desvantagens associadas com o sistema C4D se
refere ao o nível de detectabilidade. Na literatura são encontrados, tipicamente,
limites de detecção da ordem de 1 a 10 µmol/L (PUMERA, M. et al., 2002; LEE,
C.-Y. et al., 2006). Sendo assim, foram realizados alguns experimentos de
modo a avaliar o efeito do modo de injeção na resposta analítica para melhorar
os níveis de detectabilidade. Os dados para uma solução de K+ na
concentração 10 µmol/L explorando ambos os modos de injeção estão
apresentados na Figura 17.
Figura 17. Eletroferograma mostrando a detecção de K+ (10 µmol/L). Potenciais
aplicados nos reservatórios da amostra e do tampão: 800 e 1000 V respectivamente.
(A) Modo floating com tempo de preenchimento do canal de injeção igual a 10 s. (B)
Modo gated e com tempo de injeção igual a 5s. Outras condições: ver Figura 14.
Como visto no eletroferograma da Figura 17A, quando se usou o modo
floating para analisar uma solução contendo K+ na concentração10 µmol/L foi
possível observar o pico positivo referente ao íon potássio, o qual apresentou
intensidade na ordem de 2 mV. Usando o modo gated para a mesma solução
0 10 20 30 40 50 60 70-400
-300
-200
-100
0
100
(A)
Sin
al
C4D
(m
V)
Tempo (s)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20-44
-43
-42
-41
-40
-39
-38
-37
-36
0 15 30 45 60 75 90-80
-60
-40
-20
0
20
40
(B)
Sin
al
C4D
(m
V)
Tempo (s)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
50
observou-se o pico referente ao íon potássio com intensidade na ordem de 20
mV, o que representa um aumento de sinal de 10 vezes quando comparado
com o modo de injeção floating. Esse aumento é explicado pelo maior volume
de amostra introduzido no canal de separação, ocorrendo assim o efeito de
pré-concentração. Uma vez introduzido no canal, a resposta analítica é
sensivelmente afetada pelo volume do analito que passa pelos eletrodos de
detecção.
Pelos resultados apresentados, observou-se que o volume de amostra
injetado é mais bem controlado utilizando o modo de injeção gated. Sendo
assim, utilizou-se este modo para realizar um estudo sobre o efeito do tempo
de injeção sobre a resposta do detector. Uma solução de K+ preparada na
concentração de 1 µmol/L foi introduzida nos microcanais variando-se o tempo
de 1 a 5 s. A análise de uma solução contendo o íon potássio na concentração
de 1 µmol/L variando o tempo de 1 a 5 s. Os eletroferogramas obtidos estão
representados na Figura 18.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
51
Figura 18. (A) Eletroferogramas mostrando a detecção de K+ (1 µmol/L) sob diferentes
tempos de injeção no modo gated. Variação da área (A) e intensidade (B) do pico
referente ao k+. Outras condições: ver Figura 14.
De acordo com os resultados mostrados na Figura 18 fica claro um
aumento linear da resposta analítica quando o tempo de injeção é aumentado.
A intensidade e a área do pico referente ao íon K+ aumentou em torno de
5 vezes quando comparamos a injeção com 1 s e 5 s, mostrando assim a
possibilidade de melhora nos níveis de detectabilidade apenas controlando o
volume de amostra injetado no canal de separação.
4.4 Separação de cátions utilizando o modo de injeção gated
Como visto nos resultados anteriores o modo de injeção gated
proporcionou um maior controle da introdução de amostra, o que acaba se
1 2 3 4 50
5
10
15
20
25
(B)
Áre
a (
mV
.s)
Tempo de Injeção (s)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
(A)
5s
4s
3s
2s
Sin
al
C4D
Tempo (s)
10 mVK+
1s
1 2 3 4 50
5
10
15
20
(C)
Inte
ns
ida
de
(m
V)
Tempo de Injeção (s)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
52
tornando uma vantagem para a detecção de espécies em baixas
concentrações. Sendo assim realizou-se a injeção de uma amostra contendo
cloreto de potássio, cloreto de sódio e cloreto de lítio na concentração de 50
µmol/L de cada. Os eletroferogramas estão apresentados na Figura 19.
Figura 19. (A) Séries de eletroferogramas mostrando a separação de uma amostra
equimolar dos íons K+, Na+ e Li+ na concentração de 50 µmol/L.(B) Magnificação de
uma única injeção, evidenciando a qualidade da separação obtida. Comprimento
efetivo: 7,0 cm. Potenciais aplicados nos reservatórios da amostra e tampão: 1800 e
2500 V respectivamente. Outras condições: ver Figura 14.
A separação foi realizada usando um microchip com comprimento total de
9 cm. Os valores de resolução para os picos K+ e Na+ e Na+ e Li+ foram 1,5 ±
0,2 e 1,4 ± 0,1 respectivamente. As eficiências de separação foram 6.600 ±
2.000, 12.600 ± 3.000 e 30.500 ± 1.000 pratos/m para os íons K+, Na+ e Li+,
respectivamente. Estimaram-se os limites de detecção pela relação sinal/ruído
(S/R = 3) e os valores encontrados foram 3, 5 e 7 µmol/L para os íons K+, Na+ e
Li+, respectivamente. Levando-se em consideração que o aumento do tempo
de injeção de 1 para 5 s promoveu uma melhora em aproximadamente 5 vezes
0 50 100 150 200 250 300 350 400
(A)
Sin
al C
4D
Tempo (s)
190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
(B)Li
+Na+
Sin
al C
4D
Tempo (s)
5 mVK
+
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
53
na resposta do C4D, acredita-se que os LD’s calculados nesse protótipo podem
ser reduzidos na mesma proporção. Além disso, o efeito de pré concentração
dentro do canal (com comprimento efetivo) pode, certamente, contribuir para a
obtenção de valores na faixa de nmol/L. No entanto, essa afirmação ainda
precisa de uma investigação mais aprofundada, o que poderá contribuir para
uma melhora significativa nos níveis de detectabilidade desse detector.
4.5 Aminas Quaternárias
O modo de injeção gated foi utilizado para determinação das AQs, pois
esse apresentou melhores resultados quando comparado com o modo de
injeção floating.
4.5.1 Eletroforese em meio aquoso
4.5.1.1 Simulação no PeakMaster®
Devido à limitação das estruturas contidas na biblioteca do software
PeakMaster, procurou-se utilizar compostos com estruturas similares aos
analitos alvos. A simulação foi importante pois serviu como ferramenta para se
ter um ponto de partida para as próximas etapas. A Figura 20 mostra um
eletroferograma simulado para uma mistura equimolar (100 µmol/L) contendo
seis tensoativos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
54
Figura 20. Simulação mostrando o eletroferograma da separação de seis cátions das
aminas quaternárias. Picos: (1) Tetrametilamônio; (2) Trimetilfenilamônio; (3)
Tetraetilamônio; (4) Hexiltrimetilamônio; (5) Heptiltrimetilamônio e (6)
tetradeciltrimetila. Potencial de Separação e Injeção: 1000 V e 800 V respectivamente.
Comprimento efetivo: 4,0 cm.
Assim como nas simulações, para os testes iniciais e otimizações das
condições, utilizamos um tampão bastante comum para a detecção e
separação de cátions inorgânicos, constituído por uma mistura equimolar de
MES e His na concentração de 20 mmol/L. Inclusive na primeira parte deste
trabalho foi realizada a otimização dos parâmetros de detecção (frequência e
amplitude) para esse tampão (ver Figura 13). Sendo assim, a primeira etapa
das análises dos tensoativos consistiu na otimização dos potenciais de injeção
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
5432
1
6
Sin
al d
o d
ete
cto
r (U
. A
.)
tempo (min)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
55
e separação, e como amostra foi utilizada uma solução contendo CTAB na
concentração de 100 µmol/L.
As melhores respostas analíticas foram observadas quando foi aplicado
1,2 kV e 1,4 kV para injeção e separação respectivamente para injeção e
separação.
As AQs possuem caráter orgânico, e como o tampão consistiu de uma
solução preparada em água havia o receio dos compostos precipitarem nos
microcanais, devido à baixa solubilidade em água. A princípio, este efeito não
foi observado, porém ficou claro a formação de cauda nos picos, causados pela
adsorção na parede dos microcanais. Diante desse panorama resolveu-se
continuar os testes com esse tampão.
Testes iniciais foram realizados com o CTAB, que é uma amina
quaternária bastante usada em eletroforese como inversor do FEO. Uma
solução na concentração de 100 µmol/L foi analisada e foi observado picos
com cauda. Analisou-se a mesma solução contendo CTAB na concentração de
100 µmol/L e ao tampão foi adicionado TTAB em diferentes concentrações. A
ideia era descobrir se a adição das aminas quaternárias ao tampão, na ordem
de concentrações analisadas, mudaria o aspecto dos eletroferogramas obtidos
anteriormente. Os resultados estão apresentados na Figura 21 para três
concentrações de TTAB no tampão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
56
Figura 21. Eletroferogramas para uma solução aquosa contendo CTAB na
concentração de 100 µmol/L. Eletrólito: sistema tampão MES/His 20 mmol/L cada,
com a adição de TTAB na concentração (A) de 100 µmol/L (B) de 200 µmol/L e (C)
500 µmol/L. Outras condições: ver Figura 14.
Foi possível observar que os tensoativos, quando presentes no eletrólito,
alteram significativamente a magnitude do FEO. É possível ver a diferença do
pico, referente ao cátion do CTAB, nas diferentes concentrações de TTAB
adicionadas. Quando a concentração de TTAB foi de 100 µmol/L (Figura 21A)
observou um pico referente ao cátion do CTAB, mais estreito. Já quando a
concentração de TTAB no tampão foi de 200 µmol/L (Figura 21B) é possível
notar uma alteração no perfil dos picos referentes ao cátion do CTAB e vale
ressaltar também a diminuição de intensidade dos mesmos. E finalmente
quando a concentração de TTAB foi de 500 µmol/L (Figura 21C) observou um
aumento na cauda dos picos referente ao cátion do CTAB, também foi
observada a inversão dos picos, ou seja, nessa condição o tampão passou a
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
(A)
(B)
(C)
Sin
al C
4D
(mV
)
Tempo (s)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
57
apresentar condutividade maior do que a condutividade da amostra contendo o
analito o que provocou o efeito de eletrodispersão.
O próximo passo consistiu na tentativa de separação dos dois analitos,
CTAB e TTAB, utilizando o mesmo tampão dos testes anteriores. Uma mistura
contendo os dois analitos na concentração de 100 µmol/L cada foi utilizada. Os
resultados podem ser visualizados na Figura 22.
Figura 22. Eletroferograma mostrando a separação de CTAB e TTAB na concentração
100 µmol/L. Outras condições: ver Figura 14.
Como pode ser visto na Figura 22, foi alcançada uma boa separação
entre os cátions do CTAB e do TTAB. Diante desses resultados foi avaliado
ordem de migração de cinco aminas quaternárias, fazendo injeções de
soluções contendo cada uma separadamente. Logo após foi realizado a injeção
0 50 100 150 200-3
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo de Migração (s)
90 95 100 105 110
0
2
4
6
CTAB
TTAB
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
58
de uma mistura contendo as cinco aminas quaternárias. Os eletroferogramas
estão representados na Figura 23.
Figura 23. Eletroferograma para cada amina quaternária na concentração de 100
µmol/L e para uma mistura equimolar da cinco na concentração de 100 µmol/L. Outras
condições: ver Figura 14.
Como visto na Figura 23, foram obtidos bons resultados para cada amina
separadamente, porém não foi possível identificar a ordem de migração, devido
às semelhanças o tempo de migração. Quando foi injetada a mistura contendo
as cinco aminas quaternárias, não se observou a presença de picos, sendo
detectado apenas uma pequena variação no sinal elétrico com perfil similar a
uma zona de amostra alargada. O microchip foi retirado da plataforma
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Mistura
TTAB
TOMB
ETAB
DTAB
CTAB
S
ina
l C
4D
(m
V)
Tempo (s)
3 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
59
microfluídica e, a partir de micrografias ópticas dos microcanais, foi possível
observar que aos canais estavam obstruídos. Na Figura 24 é possível observar
os canais e a intersecção obstruídos.
Figura 24. Micrografia óptica mostrando a (A) intersecção e o (B) canal de injeção
obstruídos devido a precipitação das aminas quaternárias.
Várias tentativas de limpeza dos microcanais foram realizadas, porém
não foi possível recuperar o microchip. Esse fato tornou inviável a continuação
dos experimentos utilizando meio aquoso nos microchips de vidro.
4.5.1.2 Separação de tensoativos utilizando chips fabricados em outros
substratos
Utilizou-se um equipamento OpenSource para detecção e separação dos
tensoativos em um microchip fabricado de PMMA (FRANCISCO, K. J. M. et al.,
2009; DUARTE, G. F. et al., 2015). Este substrato foi utilizado por não
apresentar tanta interação com os analitos, como no vidro. Foi analisada uma
mistura equimolar na concentração de 500 µmol/L, dos seguintes compostos:
(A) (B)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
60
CTAB, TTAB, DTAC, ETAB e TOMB. Os eletroferogramas obtidos estão
representados na Figura 25.
Figura 25. Separação de cinco aminas quaternárias utilizando chip de PMMA. Os
picos 1, 2, 3, 4 e 5 são referentes aos cátions das aminas quaternárias CTAB, TTAB,
DTAC, ETAB e TOMB. Tampão: MES/His 20 mmol/L, pH 6,1; Potencial de separação
e injeção: 1200 V e 1000 V respectivamente; Frequência: 570 kHz; Amplitude: 2,4 Vpp.
Comprimento efetivo: 4 cm.
Na análise feita no chip de PMMA foi possível observar cinco picos
referente às cinco AQs. No entanto, a separação entre os compostos 1 e 2,
assim como o 3 e 4 não apresentaram boa resolução.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
3713000
3714000
3715000
3716000
3717000
3718000
4
5
2
3
Sin
al C
4D
(U
.A.)
Tempo (s)
1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
61
4.6 Eletroforese em meio não aquoso
No presente estudo, o eletrólito escolhido foi uma mistura de MeOH/ACN
na proporção 90:10 (v/v). Não foram observados picos para os compostos
utilizando esse eletrólito, isso devido à falta de cargas suficientes para
promover o transporte eletrocinético das espécies. Portanto, foi necessário
adicionar algum sal que fosse solúvel nesta mistura de solventes orgânicos,
para assim termos cargas suficientes para geração do FEO.
O primeiro eletrólito testado foi uma mistura de ácido benzoico e benzoato
de sódio na concentração de 10 mmol/L cada, os quais foram dissolvidos na
mistura MeOH/ACN 90:10 (v/v). Como a eletroforese não aquosa até então era
novidade para nosso grupo, utilizamos as mesmas condições de detecção
anteriores. A ideia era descobrir qual eletrólito daria a melhor resposta e após
isso realizar a otimização de todos os parâmetros.
A primeira etapa consistiu na injeção de cada analito separadamente, no
sentido de determinar a ordem de migração das espécies. Também foi injetada
uma mistura dos cinco compostos, e os eletroferogramas estão apresentados
na Figura 26.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
62
Figura 26. (A) Eletroferogramas mostrando a injeção das aminas quaternárias
separadamente na concentração de 1 mmol/L cada, além de uma mistura equimolar (1
mmol/L) contendo os cinco analitos. (B) Representação dos eletroferogramas para a
mistura variando os potenciais de injeção e separação. Eletrólito: ácido
benzoico/benzoato de sódio 10 mmol/L em MeOH/ACN 90:10 (v/v). Outras condições:
ver Figura 14.
Uma diferença que pode ser notada em relação a eletroforese aquosa é a
detectabilidade, sendo necessário um aumento de 10 vezes na concentração
para que fosse possível a obtenção de respostas similares com aquelas
alcançadas na eletroforese aquosa. O pico para o cátion do composto ETAB
não foi observado nem em concentrações superiores. A separação não
apresentou resolução suficiente para observar os quatro picos, mas vale
ressaltar que as análises foram realizadas utilizando o microchip com
comprimento efetivo de 3,3 cm. Esse problema foi contornado utilizando o
microchip com comprimento efetivo de 7,3 cm. Antes da troca do microchip,
realizaram-se análises variando os potenciais de injeção e de separação
(Figura 26B).
0 10 20 30 40 50 60 70
(B)
CTABTTAB
DTAC
TOMB
1V/1,5V
0,5V/0,5V
0,8V/1V
Sin
al C
4D
Tempo (s)
5 mV
0 20 40 60 80 100 120
(A)
Mistura (5 compostos)
TTAB
TOMB
ETAB
DTAC
CTAB
Sin
al C
4D
Tempo (s)
5 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
63
Foi possível observar uma melhor resolução quando foram utilizados
potenciais menores, sendo possível visualizar quatro picos. Mas apesar do
ganho de resolução, foi notada uma diminuição na intensidade dos sinais. As
análises com o microchip de comprimento efetivo igual a 7 cm foram realizadas
seguindo a mesma sequência anterior, com a injeção das AQ’s separadamente
e depois a injeção da mistura equimolar composta pelas cinco AQs. Os
eletroferogramas estão representados na Figura 27.
Figura 27. (A) Eletroferogramas para os íons de quaternário de amônio injetados
separadamente (1 mmol/L) e para uma mistura equimolar dos cinco (1 mmol/L). (B)
Aumento da região da separação. Eletrólito: ácido benzoico/benzoato de sódio 10
mmol/L em MeOH/ACN 90:10 (v/v). Comprimento efetivo: 7,3 cm. Potenciais aplicados
nos reservatórios da amostra e do tampão: 1800 e 2300 V respectivamente. Outras
condições: ver Figura 14.
Os picos foram observados como anteriormente, mas a linha de base não
ficou tão estável como nas análises utilizando o microchip de comprimento
efetivo menor. Na Figura 27B está apresentada uma magnificação da região
entre 40 e 100 s, na qual é possível observar uma significativa melhora na
0 20 40 60 80 100 120 14090
100
110
120(B)
S
ina
l C
4D
(m
V)
Tempo (s)
40 60 80 100
108
109
110
111
112
CTAB
TTAB
DTAC
ETAB
TOMB
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
(A)
Mistura (5 componentes)
TOMB
CTAB
DTAC
ETAB
TTAB
Sin
al C
4D
Tempo (s)
5 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
64
resolução, porém as intensidades foram menores quando comparadas com as
injeções individuais.
Para fins comparativos, foi utilizado um sistema eletroforético híbrido
“Homemade” para análise das misturas das cinco AQs. O sistema é composto
de capilares de sílica fundida interligados com reservatórios através de uma
interface microfabricada.1 A vantagem deste sistema é a possibilidade de
aumento do comprimento efetivo, o que em teoria aumentaria a resolução dos
picos. O comprimento efetivo utilizado foi de 13 cm e os eletroferogramas estão
apresentados na Figura 28 para duas concentrações diferentes.
Figura 28. Eletroferogramas obtido com um sistema misto de eletroforese, para
amostras contendo as cincos AQs em duas concentrações. Comprimento efetivo: 13
cm. Eletrólito: ácido benzoico/benzoato de sódio 10 mmol/L em MeOH/ACN 90:10
(v/v). Outras condições: ver Figura 25.
1 Sistema em desenvolvimento pelo mestrando Eulício Lobo de Oliveira Júnior
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
43
2
1 mmol/L
0,5 mmol/L
Sin
al C
4D
(V
)
Tempo (s)
1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
65
Intensidades menores foram obtidas, quando comparadas com as
análises no sistema de eletroforese comercial. Também não foi observado um
aumento da resolução, apesar do comprimento efetivo maior. Ou seja, mesmo
com um comprimento efetivo duas vez maior não foi observada uma boa
separação, deixando clara a necessidade do estudo de um eletrólito com
composição diferente.
Para o segundo tampão, contendo acetato de amônio 10 mmol/L, não
foram realizadas injeções individuais, pois já se conhecia a ordem de migração
dos analitos em questão. Sendo assim, misturas dos compostos foram
analisadas utilizando microchips com comprimento efetivo de 3,3 e 7,0 cm. Os
eletroferogramas estão representados na Figura 29.
Figura 29. Eletroferogramas para solução contendo os cinco tensoativos utilizando os
microchips com comprimento efetivo (A) 3,3 cm e (B) 7,0 cm. Eletrólito: acetato de
amônio 10 mmol/L em metanol/acetonitrila 90:10 (v/v). Outras condições: ver
Figura 14.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
(b)
432
1
2
3 4
Sig
na
l C
4D
Tempo (s)
1 mV
1(a)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
66
Observou-se que com o segundo tampão, as intensidades aumentaram e
que até com o microchip de comprimento efetivo igual 3,3 cm, ocorreu a
separação, mas com o microchip de comprimento efetivo igual a 7,0 cm a
resolução com maiores valores. Como visto nos resultados apresentados até
aqui, o segundo tampão (acetato de amônio 10 mmol/L) se mostrou mais
adequado. Sendo assim, foram realizadas injeções de soluções com
concentrações diferentes para construção de uma curva de calibração.
Para estabelecer a faixa de concentração da curva analítica, nos foi
fornecida uma estimativa da concentração dos analitos nas amostras alvo
desta metodologia. A concentração informada foi em torno de 5 ppm e a faixa
determinada para as curvas foi 0,5 a 2,5 mmol/L. Os resultados iniciais não
apresentaram nenhuma correlação linear. Possivelmente devido a utilização do
microchip com comprimento efetivo de 7,0 cm, o que resultou em alguns
eletroferogramas com muita instabilidade na linha e base.
Na tentativa de obter as curvas de calibração, foram injetadas soluções
de concentrações diferentes para os analitos separadamente. Os
eletroferogramas para as curvas de calibração estão representadas na
Figura 30.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
67
Figura 30. Eletroferogramas para as curvas de calibração de quatro AQs. (A) TOMB,
(B) CTAB (C) TTAB e (D) DTAC. Eletrólito: acetato de amônio 10 mmol/L em
MeOH/ACN 90:10 (v/v). Outras condições: ver Figura 14.
Não foram observados picos para nenhuma concentração do composto
ETAB. As curvas de calibração para as demais AQ’s estão representadas na
Figura 31, e foram construídas considerando os valores de área do pico.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
(A)
Sin
al C
4D
2 mV
0.5 mmol/L
1 mmol/L
1.5 mmol/L
2 mmol/L
2.5 mmol/L
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(C)
Sig
na
l C
4D
Tempo (s)
0,5 mmol/L
1 mmol/L
1,5 mmol/L
2 mmol/L
2,5 mmol/L
2 mV
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(B)
2 mV
1 mmol/L
0,5 mmol/L
1,5 mmol/L
2 mmol/L
2,5 mmol/L
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(D)
Tempo (s)
2 mV
0,5 mmol/L
1 mmol/L
1,5 mmol/L
2 mmol/L
2,5 mmol/L
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
68
Figura 31. Curvas de calibração construídas a partir do valor da área do pico. (A)
TOMB, (B) CTAB (C) TTAB e (D) DTAC.
Como pode ser observado na Figura 30, as curvas analíticas apresentarm
coeficientes de correlação lineares adequadas para as AQs TOB, CTAB e
DTAC, entretanto, a curva analítica para o TTAB apresentou coeficiente de
correlação linear abaixo de 0,97.
A utilização do segundo eletrólito apresentou resultados satisfatórios
quando se analisou as AQs separadamente. Porém, não foi possível construir
uma curva analítica para as quatros AQs na mesma análise, pois foram
encontradas coeficientes de correlação lineares abaixo de 0,8 quando
concentrações diferentes da mistura, contendo as quatro AQs, foram injetadas.
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
2
4
6
8
R2 = 0,978
y = 0,177 + 3,081*x
(B)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
y = 0,177 + 3,081*x
R2 = 0,985
(A)
Áre
a (
mV
.s)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0
1
2
3
4
5 (C)
Áre
a (
mV
.s)
Concentração (mmol/L)
y = -0,365 + 2,159*x
R2 = 0,967
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
(D)
Concentração (mmol/L)
y = 0,03 + 1,045*x
R2 = 0,995
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
69
Um terceiro eletrólito foi selecionado de acordo com o trabalho de
Buglione et al., publicado em 2013, onde os autores reportaram separações
com alta eficiência e resolução de oito AQs utilizando NACE-C4D. O eletrólito
constituído de NaDCHA 10 mM em metanol/acetonitrila 90:10 (v/v) foi então
avaliado. A utilização deste eletrólito coincidiu com a compra de outras AQs .
Desta maneira, primeiramente realizou-se uma separação de cinco AQs, o
eletroferograma está apresentado na Figura 32.
Figura 32. Eletroferograma mostrando a separação de cinco aminas quaternárias (1)
TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) TTAB e (5) TODAB com concentração igual à 1
mmol/L cada. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L em MeOH 90:10 (v/v). Outras condições:
ver Figura 14.
Como pode ser observado na Figura 32, o eletrólito composto de
NaDCHA em MEOH/ACN 90:10 (v/V) proporcionou uma separação com
excelente eficiência e resolução, além de uma linha de base bem estável com
maior estabilidade. Diante disto, foram adicionadas mais três aminas
0 50 100 150 200-10
-8
-6
-4
-2
0
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo (s)
1
2
34
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
70
quaternárias no processo de separação. Na Figura 33 temos a apresentação
dos eletroferogramas obtidos com a aplicação de diferentes potenciais de
separação e injeção.
Figura 33. Eletroferograma mostrando a separação de oito aminas quaternárias (1)
TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) DTAC, (5) TTAB, (6) CTAB, (7) TODAB, (8) TOAB
com concentração igual à 1 mmol/L cada. (A) 2,2 e 2,5 kV (B) 2,7,0 e 3,0 kV aplicados
nos reservatórios da amoastra e do tampão respectivamente. Outras condições: ver
Figura 14.
Como observado na Figura 33, desempenhos diferentes foram obtidos
quando potenciais diferentes foram utilizados. Desta maneira decidiu-se
otimizar os potenciais, no sentido de encontrar as condições que fornecem as
melhores separações em um menor intervalo de tempo. Antes da otimização
dos potenciais, foi realizada a otimização dos parâmetros de detecção para
esse eletrólito. O procedimento adotado foi semelhante ao descrito na secção
3.3. A única diferença foi a realização da varredura com a opção de headstage
gain no modo on, o que altera a janela de amplitude para 20-100 Vpp. A melhor
resposta do C4D foi obtida na frequência de 700 kHz e amplitude de 70 Vpp.
(B)
0 50 100 150 200 250
-15
-12
-9
-6
S
ina
l C
4D
(m
V)
Tempo (s)
1
2
345 6
8
7
(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
71
Para a otimização dos potenciais, foram escolhidas as seis aminas
quaternárias que apresentaram separações com a melhor resolução. Na
figura 34 temos a apresentação de uma série de eletroferogramas mostrando a
separação das seis AQs em diferentes potenciais de separação e injeção.
Figura 34. (A) Eletroferogramas mostrando a otimização dos potenciais de separação
e injeção. Analitos: (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TBAP, (4) TTAB, (5) TODAB e (6)
TOAB. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L em MeOH 90:10 (v/v). Tempo de injeção: 1 s.
Comprimento efetivo = 7 cm. Condições de detecção: 700 kHz, 70 Vpp. Potenciais de
40 50 60 70 80 90 100-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4(B)
TTAB
TODAB
TOAB
TBAP
HTAB
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo (s)
TEAOH
0 50 100 150 200 250
(A)
Sin
al C
4D
viii
vii
vi
v
iv
iii
i
ii
Tempo (s)
5 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
72
Injeção e Separação: ver Tabela 2. (B) Eletroferograma obtido com a aplicação de 3,0
e 2,7 kV para a separação e injeção respectivamente.
Os potenciais aplicados em cada injeção da otimização estão
apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Potenciais de injeção e separação utilizados na otimização.
Condição Potenciais aplicados (kV)
Injeção Separação
i 0,8 1,1
ii 0,9 1,2
iii 1,2 1,5
iv 1,5 1,8
v 1,8 2,1
vi 2,1 2,4
vii 2,4 2,7
viii 2,7 3,0
A representação gráfica da variação dos tempos de migração (Figura
35A) e da intensidade dos picos (Figura 35B) em função dos potenciais
aplicados está apresentada na Figura 35.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
73
Figura 35. Representação gráfica da variação do (A) tempo de migração e da (B)
intensidade em função dos potenciais aplicados.
Como previsto, o aumento do potencial provocou a redução do tempo de
migração de todos os analitos (Figura 35A), proporcionando assim a redução
no tempo de análise e o aumento da frequência anlítica. O aumento dos
potenciais também provovou o aumento na intensidade dos picos referente a
todas a AQs (Figura 35B). Desta maneira, a melhor resposta foi obtida
aplicando-se +2,7 e +3,0 kV nos reservatórios da amostra e do eletrólito,
respectivamente. Como visto, o aumento do potencial diminui o tempo de
migração das espécies, e essa redução implica na redução da resolução da
separação. Deste modo, um gráfico das resoluções em função do potencial de
separação foi construído e está apresentado na Figura 36.
0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,3
50
100
150
200
250
300
Tem
po
de M
igra
ção
(s)
Potencial de Separação (kV)
TEAOH
HTAB
TBAP
TTAB
TODAB
TOAB
0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,30
1
2
3
4
Inte
ns
ida
de
(m
V)
Potencial de Separação (kV)
(A) (B)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
74
Figura 36. Variação das resoluções em função do potencial de separação.
Como esperado, foi observado uma redução na resolução quando
potenciais maiores foram utilizados. Entretanto, mesmo aplicando o potencial
máximo (+3,0 kV), o qual forneceu os melhores resultados, os valores de
resolução ficaram acima de 1. Ou seja, a perda de resolução não se torna um
problema para se utilizar potenciais maiores.
Após a otimização dos potenciais, soluções com concentrações diferentes
das seis aminas quaternárias (em uma faixa de concentração de 0,1 a 1,5
mmol/L), foram analisadas para construção de uma curva analítica. Os
eletroferogramas podem ser visualizados na Figura 37A.
0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,30
1
2
3
4
5
Re
so
luç
ão
Potencial de Separação
TEAOH-HTAB
HTAB-TBAP
TBAP-TTAB
TTAB-TODAB
TODAB-TOAB
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
75
Figura 37. Eletroferograma para diferentes concentrações das seis aminas
quaternárias. (B) Eletroferogramas para amostras sintéticas preparadas utilizando os
padrões. Analitos: ver Figura 34. Eletrólito: NaDCHA 10 mmol/L em MeOH 90:10
(v/v). pH: 8,58 . Tempo de injeção: 1 s. Comprimento efetivo = 7 cm. Potenciais
aplicados nos reservatórios da amostra e do tampão: 2700 e 3000 V respectivamente.
Condições de detecção: 700 kHz, 70 Vpp.
As curvas de calibração para cada AQ estão apresentadas na Figura 38,
e foram construídas levando-se em consideração a área do pico. Foram
observadas linearidade para todas as AQs na faixa de concentração estudada,
com coeficientes de correlação lineares variando de 0,980 a 0,996. Entretanto,
0 50 100 150 200 250
(A)
Sin
al C
4D
Tempo (s)
2 mV
0,10 mol/L
0,25 mol/L
0,50 mol/L
0,75 mol/L
1,00 mol/L
1,25 mol/L
1,50 mol/L
1 2
3 4 5 6
0 50 100 150 200 250
(B)
Sin
al C
4D
Tempo (s)
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
1
3
61
35
61 2
3 45
6
2 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
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76
para a construção das curvas de cinco AQs foi necessária à exclusão do um
ponto, apenas para o composto TEAOH foi possível a construção da curva com
as seis concentrações utilizadas.
Figura 38. Curvas de calibração para as aminas quaternárias construídas através dos
valores de área dos picos. (A) TEAOH, (B) HTAB, (C) TBAP, (D) TTAB, (E) TODAB e
(F) TOAB.
Para avaliação das curvas construídas, foram analisadas três amostras
sintéticas contendo concentrações diferentes das aminas quaternárias (ver
composição de cada amostra na Tabela 1). O eletroferograma referente a
essas amostras estão representados na Figura 37B. As concentrações
encontradas a partir das curvas analíticas obtidas foram similares aos valores
adicionados. Porém, para alguns analitos, observou-se uma discrepância entre
as concentrações, de acordo com a Tabela 3.
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
1
2
3
4
5
6
R2 = 0,980
(A)
Áre
a (
mV
.s)
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
1
2
3
4
5
R2 = 0,989
(B)
Equation
Weight
Residual Sum
of Squares
Pearson's r
Adj. R-Square
Área
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
1
2
3
R2 = 0,994
(C)
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
1
2
3
4
R2 = 0,983
(D)
Áre
a (
mV
.s)
Concentração (mmol/L)
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
1
2
3
4
5
6
7
R2 = 0,988
(E)
Concentração (mmol/L)
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,750
4
8
12
16
R2 = 0,996
(F)
Concentração (mmol/L)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
77
Tabela 3. Correlação entre os valores das concentrações adicionadas e encontradas em uma amostra sintética.
Composto Valores Adicionados
(mmol/L)
Valores Encontrados
(mmol/L)
Amostra 1
Hidróxido Tetra etil amonio 1 2,2 ± 0,3
Perclorato de tetra butil amônio 0,5 0,8 ± 0,1
Brometo de tetra octil amônio 0,8 1,5 ± 0,1
Amostra 2
Hidróxido Tetra etil amonio 0,9 0,4 ± 0,1
Perclorato de tetra butil amônio 0,7 1,1 ± 0,1
Brometo de trimetil octadecil amônio 1,3 2,3 ± 0,2
Brometo de tetra octil amônio 1 1,2 ± 0,7
Amostra 3
Hidróxido Tetra etil amonio 0,7 0,9 ± 0,1
Brometo de hexil trimetil amônio 1,0 1,1 ± 0,1
Perclorato de tetra butil amônio 0,5 0,4 ± 0,1
Brometo de tetra decil trimetilamônio 0,8 1,1 ± 0,3
Brometo de trimetil octadecil amônio 1,3 1,7 ± 0,1
Brometo de tetra octil amônio 0,7 0,8 ± 0,1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
78
A discrepância entre as concentrações citada acima e os altos desvios
observados, foram atribuídos à evaporação do eletrólito, composto por
solventes orgânicos. O problema da evaporação pode ter sido acentuado pelo
pequeno volume de eletrólito adicionado em cada reservatório. Para fim de
confirmação foram realizadas nove injeções consecutivas de uma mistura
contendo as seis aminas quaternárias, adicionando 50 µL de solução nos
reservatórios. Os eletroferogramas resultantes estão representados na
Figura 39.
Figura 39. Sequência contendo 9 injeções consecutivas mostrando a separação de
seis aminas quaternárias com a adição de 50 µL nos reservatórios. Analitos: ver Figura
34. Outras condições: ver Figura 37.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
79
De acordo com o eletroferograma apresentado na Figura 39, foi possível
observar uma diminuição acentuada na intensidade dos picos de todos os
analitos. Os valores de RSD calculados ficaram entre 26 - 65% e 25 - 60% para
intensidade e área respectivamente. Esse efeito representa um grande
problema para a repetitividade das análises, além disso, a quantificação dos
analitos pode ser seriamente comprometida. A diminuição da resposta analítica
no decorrer das injeções, está representada graficamente na Figura 39, onde
os valores de área (Figura 40A) e intensidade (Figura 40B) dos picos foram
plotados em função das injeções consecutivas.
Figura 40. Variação da (A) área e da (B) intensidade no decorrer das injeções
consecutivas quando foi adicionado 50 µL de solução nos reservatórios.
Uma maneira avaliada para contornar o problema de repetitividade foi a
adição de 100 µL de solução nos reservatórios, e essa estratégia se mostrou
bastante eficaz como pode ser observado na Figura 41, a qual mostra a
mesma sequência de nove injeções consecutivas.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
2
4
6
8
10
12(A)
TEAOH
HTAB
TBAP
TTAB
TODAB
TOAB
Áre
a (
mV
.s)
Injeções Consecutivas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
1
2
3
4
5(B)
Inte
nsid
ad
e (
mV
)
Injeções Consecutivas
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
80
Figura 41. Sequência contendo 9 injeções consecutivas mostrando a separação de
seis aminas quaternárias com a adição de 100 µL de solução nos reservatórios.
Analitos: ver Figura 34. Outras condições: ver Figura 37.
A partir do eletroferograma apresentado na Figura 41, pode-se observar
um grande aumento na repetitividade das nove injeções consecutivas, porém
ainda foi notada uma pequena diminuição na área e na intensidade, como
mostra a representação gráfica da Figura 42. Os valores de RSD calculados
ficaram entre 6 - 12% e 4 - 13% para intensidade e área respectivamente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
81
Figura 42. Variação da (A) área e da (B) intensidade no decorrer das injeções
consecutivas quando se adicionou 100 µL de solução nos reservatórios.
Desta maneira, na continuidade do desenvolvimento do trabalho, todas as
análises foram realizadas com a adição de 100 µL de solução nos
reservatórios.
4.6.1 Otimização do Eletrólito de Corrida
As análises até o momento foram realizadas utilizando um eletrólito que
consistiu de NaDCHA dissolvido em uma mistura de MeOH/ACN 90:10 (v/v).
No sentido de estudar a influência do solvente, avaliou-se também a utilização
de DMF e DMSO no eletrólito. Para este estudo, foi preparada uma mistura
contendo seis aminas quaternárias, em metanol. Os eletroferogramas
resultantes estão representados na Figura 43.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
5
10
15
20
25
(A) TEAOH
HTAB
TBAP
TTAB
TODAB
TOAB
Áre
a (
mV
.s)
Injeções Consecutivas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
1
2
3
4
5
6
(B)
Inte
ns
ida
de
(m
V)
Injeções Consecutivas
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
82
Figura 43. Eletroferogramas mostrando injeções da mistura com seis aminas
quaternárias preparadas em diferentes solventes. Analitos: ver Figura 34. Outras
condições: ver Figura 37.
A partir dos resultados apresentados na Figura 43 é possível observar
que a utilização da mistura MeOH/ACN 90:10 (v/v) no eletrólito apresentou os
melhores resultados em termos de resolução, eficiência e intensidade do sinal.
Quando foi utilizado DMF, observou-se a presença de apenas quatro picos, e
sem resolução e eficiência adequada para uma completa separação. Já
quando foi utilizado o DMSO, foram observados apenas dois picos. Além disso,
quando foi utilizado DMSO e DMF como solventes, ocorreu o ressecamento
dos anéis de borrachas localizados na tampa da plataforma, os quais garantem
a vedação entre os reservatórios do microchip e a plataforma.
Também foram realizados testes variando a porcentagem de acetonitrila
na composição do eletrólito, proporção essa que até então estava fixado em
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225
54
6
3
1
DMSO
DMF
Sin
al
C4D
Tempo (s)
5 mV
MeOH/ACN
2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
83
10%. Uma mistura equimolar (500 µmol/L) contendo nove aminas quaternárias
foi injetada e eletrólitos com 0, 10, 25, 50 e 75% de acetonitrila foram
avaliados. A Figura 44 apresenta os eletroferogramas obtidos neste estudo.
Figura 44. Eletroferogramas mostrando a separação de nove AQS com eletrólitos
contendodiferentes porcentagens de acetonitrila. (A) 0 %, (B) 10%, (C) 25%, (D) 50%
e (E) 75%. (1) TEAOH, (2) HTAB, (3) TOMB, (4) DTAC; (5) TTAB, (6) CTAB, (7)
TODAB, (8) TOAB, (9) TDAC 500 µmol/L cada. Outras condições: ver Figura 37.
Analisando os eletroferogramas da Figura 44, é possível observar que o
eletrólito composto por 25 % de acetonitrila apresentou os sinais mais intensos
para todos os analitos. Porém, os picos referentes aos analitos 4, 5, 6 e 7 não
apresentaram separação na linha de base, o que pode afetar diretamente em
uma posterior quantificação desses analitos. O aumento da porcentagem de
acetonitrila contribuiu para a diminuição do tempo de análise, entretanto a partir
0 20 40 60 80 100 120 140
(E)
(D)
(C)
(B) 987654
32
Sin
al
C4D
Tempo (s)
5 mV
1
(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
84
de 50% foram observados apenas oito pico e não nove. A explicação para
essas diferenças está na viscosidade do eletrólito, que aumenta com adição de
uma maior quantidade de acetonitrila e consequentemente diminui a
mobilidade do fluxo eletrosmótico. Desta maneira o eletrólito constituído por
10% de acetonitrila foi escolhido para a continuidade do trabalho.
Além da avaliação dos diferentes solventes orgânicos, a adição de
diferentes sais no eletrólito foi avaliada, uma vez que a adição destes
compostos altera diversas propriedades do eletrólito como pH e viscosidade.
Nove composições diferentes foram avaliadas, e antes da realização do
processo eletrofético, mediu-se a condutividade e o pH de todos os eletrólitos.
As medidas de condutividade e pH para cada eletrólito estão listadas na
Tabela 4.
Tabela 4. Medidas de Condutividade e pH dos diferentes eletrólitos utilizados no estudo comparativo.
Constituintes do
Eletrólito
Concentração
(mmol/L) pH
Condutivida
de (µS/cm)
NaLa 10 7,32 793
NaMOPS 10 6,45 429
ActNH4 10 7,75 692
NaDCHA 10 8,58 613
NaCAPSO 10 10,21 735
DHBA/TEA 10/5 2,03 514
NaCH 10 8,46 593
NaMES 10 7,64 750
DCHA-TEA 10/5 7,03 415
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
85
Novamente uma mistura contendo nove aminas quaternárias foi utilizada
como amostra nesse estudo. Os eletroferogramas obtidos para as
composições do eletrólito avaliadas estão apresentados na Figura 45.
Figura 45. Eletroferograma mostrando a separação de nove aminas quaternárias em
oito diferentes eletrólitos. Analitos: ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37.
Analisando comparativamente o eletroferograma com as injeções
utilizando os diferentes eletrólitos, é possível observar que a maioria dos
compostos adicionados no eletrólito apresentou sinais referentes aos nove
analitos. Devido à similaridade dos resultados apresentados para eletrólitos
estudados, foi realizada uma comparação da intensidade dos sinais para cada
analito, e a representação gráfica pode ser visualizada na Figura 46.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
DCHA-TEA
NaCH
NaMOPS
NaMES
NaCAPSO
NaLa
ActNH4
987654
32
Sin
al
C4D
Tempo (s)
5 mV1
NaDCHA
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
86
Figura 46. Comparação da intensidade dos picos (em módulo) nos diferentes eletrólitos.
Na Figura 46 é possível observar que os eletrólitos contendo o sal NaCH
e NaDCHA apresentaram sinais com intensidades bem semelhantes, o que
pode ser justificado por esses compostos apresentarem estruturas
semelhantes.
A resolução e eficiência de separação também foram comparadas para
cada eletrólito, a representação gráfica está apresentada na Figura 47.
NaDCHA
ActNH4
NaLa
NaCAPSO
NaMES
NaMOPSNaCH
DCHA-TEA
0
2
4
6
8
10
12
Sin
al C
4D
(m
V)
TEAOH
TOMB
HTAB
DTAC
TTAB
CTAB
TODAB
TOAB
TDAB
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
87
Figura 47. Comparação das resoluções (A) e das eficiências de separação (B) nos
diferentes eletrólitos avaliados.
Os valores de resolução de uma forma geral foram satisfatórios para
todos os eletrólitos estudados. Os valores de eficiência foram mais
discrepantes, por exemplo, para o eletrólito contendo DCHA os valores de
eficiências foram bem abaixo quando comparados com os outros eletrólitos.
Entretanto, os valores de eficiências na ordem de 1 × 105 pratos/m são
excelentes para eletroforese em microchips.
Os resultados anteriores permitiram definir a utilização do eletrólito com
o NaDCHA para a continuidade do trabalho. Entretanto os resultados
NaD
CHA
Act
NH4
NaL
a
NaC
APSO
NaM
ES
NaM
OPS
NaC
H
DCHA-T
EA
0
1
2
3
4
5
Re
so
luç
ão
TEAOH-TOMB
TOMB-HTAB
HTAB-DTAC
DTAC-TTAB
TTAB-CTAB
CTAB-TODAB
TODAB-TOAB
TOAB-TDAB
(A)
NaD
CHA
Act
NH4
NaL
a
NaC
APSO
NaM
ES
NaM
OPS
NaC
H
DCHA-T
EA
0
1
2
3
4
5 (B)
N (
x10
5 p
rato
s/m
)
TEAOH
TOMB
HTAB
DTAC
TTAB
CTAB
TODAB
TOAB
TDAB
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
88
anteriores abriram inúmeras possibilidades, uma vez que a maioria dos
eletrólitos estudados proporcionaram excelentes resultados.
4.6.2 Adaptação da plataforma original
Após algumas análises foram observadas separações com pouca
repetitividade, e resultados bem discrepantes em relação à concentração
analisada. No sentido de investigar esses desvios, foi realizado um estudo
onde misturas das nove aminas quaternárias em concentrações diferentes
foram analisadas. Os resultados obtidos podem ser visualizados no
eletroferograma representado na Figura 48.
Figura 48. Eletroferograma mostrando a separação das aminas em diferentes
concentrações. Analitos: ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37.
Analisando os resultados apresentados na Figura 48, é visível uma
variação do tempo de migração das AQs, além de soluções com concentrações
diferentes apresentarem picos com intensidades semelhantes, como por
exemplos nas concentrações 0,5 mmol/L e 1 mmol/L. No sentido de investigar
se o fator responsável por esses desvios era o condicionamento pouco
0 20 40 60 80 100 120 140 160
3
4 5 6 78 9
1 2
1,00 mmol/L
0,75 mmol/L
0,25 mmol/L
Sin
al C
4D
Tempo de Migração (s)
3 mV
0,50 mmol/L
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
89
eficiente com hidróxido de sódio, dobrou-se o tempo de condicionamento com
NaOH 100 mmol/L antes das análises e repetiu-se as injeções das diferentes
concentrações da mistura das aminas. O eletroferograma obtido está
apresentado na Figura 49.
Figura 49. Eletroferograma mostrando a separação das aminas em diferentes
concentrações após a aumento do tempo de condicionamento com NaOH. Analitos:
ver Figura 44. Outras condições: ver Figura 37.
O aumento de intensidade dos picos obedeceu melhor o aumento de
concentração quando comparados coms os eletroferogramas da Figura 48.
Porém, os tempos de migração dos analitos continuaram a apresentar
variação, principalmente para as aminas de cadeias carbônicas maiores.
Com uma averiguação mais cuidadosa na plataforma microfluídica, foi
possível encontrar a causa desse problema. A conexão dos cabos com a
plataforma é feita por uma cola, a qual não resiste aos solventes orgânicos
utilizados nas análises das aminas quaternárias, então com o passar do tempo
a constante evaporação do eletrólito durante as análises danificou as conexões
0 25 50 75 100 125
3
4 5 6 78 9
1
1,00 mmol/L
0,75 mmol/L
0,50 mmol/L
0,25 mmol/L
Sin
al C
4D
Tempo de Migração (s)
5 mV0,10 mmol/L
2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
90
de um dos cabos com a plataforma. Com isso, estava ocorrendo o vazamento
do eletrólito no reservatório 4 durante as análises, causando assim os desvios
observados anteriormente. Ainda com a plataforma danificada, foi possível
obter um eletroferograma com a separação de dez aminas quaternárias, o qual
pode ser visualizado na Figura 50.
Figura 50. Eletroferograma mostrando a separação de dez aminas quaternárias
utilizando a plataforma original danificada. (1) TMAB, (2) TEAOH, (3) HTAB, (4)
TOMB, (5) DTAC; (6) TTAB, (7) CTAB, (8) TODAB, (9) TOAB, (10) TDAC 500 µmol/L
cada. Outras condições: ver Figura 37.
É visível a instabilidade da linha de base no eletroferograma anterior,
porém foi possível observar os picos referentes às dez aminas quaternárias. O
problema foi que nesse momento a plataforma foi danificada de tal forma que a
eletroforese não aquosa se tornou inviável neste sistema. A plataforma
avariada pode ser observada na Figura 51, o local onde ocorreu o vazamento
do solvente está destacado.
0 30 60 90 120 150-20
-15
-10
-5
0
5
10
Sin
al
C4D
(m
V)
Tempo de Migração (s)
1
23
4
5
7
8 10
6
9
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
91
Figura 51. Plataforma original danificada devida o contato do solvente orgânico com a
cola utilizada para fixação do cabo na plataforma.
Uma saída encontrada foi à substituição da parte danificada da plataforma
original, eliminando a conexão dos cabos pela lateral. Desta maneira, os
potenciais teriam que ser aplicados por cabos externos diretamente nos
reservatórios. A construção da plataforma foi possível, pois os cabos para
aplicação dos potenciais foram encontrados para compra. A peça foi fabricada
pela empresa MS Máquinas localizada em Goiânia/GO. O material utilizado foi
o poliacetal, que é um polímero termo resistente utilizado em bioanálises. A
nova peça pode ser visualizada na Figura 52 juntamente com a original
danificada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
92
Figura 52. Imagem da peça fabricada em poliacetal e da peça original com os cabos
concentrados na lateral.
Para teste da plataforma fabricada em poliacetal, foi realizada a injeção
de uma mistura contendo as dez aminas quaternária, e o eletroferograma
mostrando a separação está representado na Figura 53.
Figura 53. Eletroferograma mostrando a separação de dez aminas quaternárias
utilizando a peça nova fabricada em poliacetal. Analitos: ver Figura 50. Outras
condições: ver Figura 37.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
-60
-45
-30
-15
0
15
30
(B)10
98765
432
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo (s)
1
(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
93
Foi observada uma instabilidade na linha de base, provavelmente devido
ao sistema adaptado trabalhar aberto. Também foi percebida uma diminuição
na intensidade dos picos e uma visível queda na eficiência de separação.
Provavelmente estes problemas foram causados pelo fato do sistema adaptado
permanecer aberto. Desta maneira, para manter o sistema fechado, foi
construída, utilizando uma impressora 3D, uma tampa com as mesmas
medidas da original. A única diferença é que nessa nova tampa foram deixadas
aberturas para conexão dos cabos com os reservatórios. Na Figura 54 temos a
imagem final do sistema (A) e em (B) um eletroferograma mostrando a
separação de dez aminas quaternárias.
Figura 54. (A) Esquema mostrando a plataforma construída em poliacetal trabalhando
aberta. (B) Sistema fechado utilizando uma tampa fabricada em ABS por uma
impressora 3D. Foi realizado ajuste na linha de base.
A plataforma adaptada foi utilizada exaustivamente, inclusive para
análises de cátions inorgânicas em meio aquoso. Desta maneira a próxima
etapa do trabalho consistiu da análise das amostras reais enviadas pela
Petrobras.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-6
-4
-2
0
2
4
6
(B)
109
876
5
4
2
3
Sig
na
l C
4D
(m
V)
Tempo (s)
1(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
94
4.6.3 Amostras Reais
A amostra real consiste da água de saída de um duto petrolífero que não
passou pelo processo de revestimento com o anticorrosivo (aminas
quaternárias).
Figura 55. Amostras de águas residuais coletadas em dutos petrolíferos fornecidas pela Petrobras
Foi realizada a injeção da amostra para garantir que não haveria a
presença das aminas quaternárias. Porém, as amostras apresentam uma alta
salinidade, uma vez que essa água é retirada diretamente do mar. A alta
salinidade da amostra provocou a obstrução da intersecção do microchip, uma
vez que alta concentração de cloreto levou a precipitação do mesmo. Ou seja,
não foi possível realizar nenhuma injeção da amostra bruta, sem que ela
precipitasse no interior do microcanal. A micrografia óptica apresentada na
Figura 56A mostra o microcanal logo após a tentativa da primeira injeção.
Desta maneira foi necessária a utilização de solução extremamente oxidante
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
95
(solução piranha), composta por ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio na
proporção 4:1. Os canais do microchip foram preenchidos com esta solução e
levada a estufa a 85 ºC por 10 minutos. Após a limpeza com solução piranha,
ainda foi observado uma pequena precipitação no canal (Figura 56B). Desta
maneira, foi necessário repetir o processo de limpeza para remover toda a
obstrução do canal, na Figura 56C podemos ver o canal completamente limpo.
Figura 56. (A) Canal obstruído devido a alta salinidade da amostra. (B) Canal após a
primeira limpeza com solução piranha. (C) Canal completamente desobstruído após
segunda limpeza com solução piranha.
Na tentativa de reduzir a concentração de cloreto, a amostra foi diluída
10 vezes em metanol. Então a amostra foi injetada no microchip, desta vez foi
possível à obtenção de eletroferogramas onde foi possível visualizar o pico
referente ao marcador neutro e alguns sinais positivos com tempos que não
coincidiram com o tempo das aminas quaternárias analisadas anteriormente. O
eletroferograma obtido está representado na Figura 57.
(A) (B) (C)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
96
Figura 57. Eletroferograma para a amostra real diluída 10 vezes em Metanol.
Após algumas injeções consecutivas houve novamente a obstrução dos
canais do microchip, sendo necessário repetir todo o procedimento de limpeza
do microchip, descrito anteriormente. Desta maneira, na tentativa de reduzir o
teor de cloreto, sem diluir mais as amostras, foi realizada uma precipitação do
cloreto com nitrato de prata (AgNO3). Inicialmente uma alíquota de 5 mL da
amostra previamente filtrada, foi transferida para um tubo de ensaio e em
seguida 1 mL de solução 0,1 mol/L em AgNO3 foi adicionada. Houve uma
rápida e intensa precipitação, após a centrifugação e separação do precipitado,
foi adicionado mais 1 mL da solução de AgNO3. Esse processo foi repetido por
mais dez vezes, e a precipitação intensa ainda continuou.
Uma nova tentativa com uma solução 0,5 mol/L em AgNO3 foi utilizada
para precipitação do cloreto, então o mesmo processo descrito anteriormente
(adição de 1 mL da solução de AgNO3 em 5 mL da alíquota seguido de
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
-75
0
75
150
225
300
375
Sin
al C
4D
(m
V)
Tempo de Migração (s)
120 124 128 132 136 14050
55
60
65
70
75
80
85
90
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
97
centrifugação) foi repetido por cinco vezes, e a precipitação já não era tão
intensa. O sobrenadante (amostra após precipitação) foi filtrado e então diluído
10 vezes em metanol.
A amostra foi injetada logo após esse procedimento. Vinte injeções
consecutivas foram realizadas, não sendo observada a obstrução dos
microcanais, inclusive foram obtidos eletroferogramas similares ao da
Figura 57. Então a amostra estava pronta para ser dopada com os padrões das
aminas quaternárias. Mas foi então surgiu mais um problema, ao adicionar uma
mistura equimolar das nove aminas quaternárias na amostra pré-tratada,
observou-se a formação de um intenso precipitado, como mostrado na
Figura 58 para as três amostras diferentes.
Figura 58. Precipitação das amostras reais quando foram adicionados os padrões das
aminas quaternárias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
98
No teste anterior foi adicionada uma mistura equimolar das aminas
quaternárias, então com o intuito de investigar se algum analito específico
estava sendo precipitado, soluções contendo as AQs foram adicionadas a
amostra separadamente em tubos Eppendorfs®. Foi observada uma rápida e
intensa precipitação em todos, como pode ser observado na Figura 59.
Figura 59. Reação da amostra pré-tratada com nitrato de prata com as aminas
quaternárias separadamente.
Possivelmente ocorreu a precipitação dos contra íons das aminas
quaternárias (brometo e cloreto) com a prata presente na amostra após a
precipitação para remoção do cloreto.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
99
Diante dos problemas com a precipitação da amostra real, partimos para
uma estratégia de duas diluições consecutivas das amostras brutas. Alíquotas
de 1 mL das amostras brutas, filtradas duas vezes com membrana millipore
0,22 µm, foram adicionadas a um balão de 10 mL e o volume foi completado
com metanol. Da solução resultante foi retirada uma alíquota de 1 mL e
adicionado a outro balão de 10 mL e o volume foi completado com metanol.
Uma série de 10 injeções da amostra diluída duas vezes, foi realizada e
foram obtidos eletroferogramas semelhantes ao da Figura 52. O microchip foi
retirado da plataforma microfluídica para verificar se os canais não estavam
obstruídos, e uma pequena precipitação no canal de injeção foi visualizada. O
microchip foi lavado utilizando o eletrólito de corrida com aplicação de potencial
e a precipitação foi removida com facilidade. Desta maneira, tomou-se o
cuidado de limpar o microchip com o eletrólito de corrida após algumas
injeções de soluções contendo a amostra.
Com o problema da precipitação resolvido, pelo menos na maior parte, o
próximo passo consistiu na construção de uma curva analítica com adição de
padrão.
4.6.4 Curva analítica com adição de padrão
A amostra enviada pela Petrobras não contém os analitos de interesse
presentes, pois o objetivo do projeto é avaliar a possibilidade de determinar as
aminas quaternárias nesta matriz com concentrações na ordem de 5 mmol/L ou
menor. Os eletroferogramas obtidos estão representados na Figura 60.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
100
Figura 60. (A) Curva analítica com adição de padrão das nove aminas quaternárias.
(B) Ampliação dos eletroferogramas para as concentrações de 50 e 100 µmol/L.
Se compararmos os eletroferogramas desta curva analítica com a
representada na Figura 37, onde as soluções eram compostas por apenas
padrões, percebemos uma diminuição das respostas analíticas muito
provavelmente devido ao efeito matriz, umas vez que a matriz consiste de água
retirada do mar, a qual possui alta concentração de íons inorgânicos. Mas por
outro lado, correlações lineares satisfatórias foram obtidas para todos os
0 20 40 60 80 100
(A)
98765
3
4
2
1000 mol/L
750 mol/L
500 mol/L
250 mol/L
100 mol/L
50 mol/L
Sin
al C
4D
Tempo (s)
Amostra 5 mV
1
0 20 40 60 80 100
(B)
100 mol/L
50 mol/L
Sin
al C
4D
Tempo (s)
0,5 mV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
101
analitos, considerando a área. A curva para cada analito está representada na
Figura 61.
Figura 61. Curvas analíticas para as AQS. (A) TEAOH, (B) HTAB, (C) TOMB, (D)
DTAC, (E) TTAB, (F) CTAB, (G) TODAB, (H) TOAB e (I) TDAB.
Para construção das curvas analíticas, foi necessário retirar um ponto
para os compostos TEAOH, HTAB, TTAB, TODAB, TOAB e TDAB e dois
pontos para o composto TOMB. As curvas apresentaram coeficientes de
correlação lineares na casa de 0,99 para todos as AQs, menos para o TOMB,
que apresentou coeficiente na ordem de 0,98. O ensaio de recuperação foi
realizado em três níveis, 250, 500 e 750 µmol/L. Como na amostra real não há
presença dos analitos (Figura 61A), uma amostra foi dopada com as AQs para
uma concentração final de 100 µmol/L (Figura 61B). O eletroferograma obtido
para os três níveis de concentrações está apresentado na Figura 62.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0(F)
R2 = 0,991
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
R2 = 0,996
(D)
Áre
a (
mV
.s)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
1
2
3
4
R2 = 0,997
(B)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
3
6
9
12
15
R2 = 0,998
(I)
Concentração (mol/L)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
1
2
3
4
R2 = 0,997
(A)
Áre
a (
mV
.s)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
2
4
6
8
R2 = 0,996
(H)
Concentração (mol/L)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,7
1,4
2,1
2,8
3,5
R2 = 0,998
(G)
Áre
a (
mV
.s)
Concentração (mol/L)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
R2 = 0,980
(C)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00,0
0,5
1,0
1,5
2,0
R2 = 0,997
(E)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
102
Figura 62. Eletroferograma mostrando as injeções para: (A) Amostra real, (B) amostra
real dopada (100 µmol/L), (C) amostra dopada (100 µmol/L) + 250 µmol/L de cada
AQs, (D) amostra dopada (100 µmol/L) + 500 µmol/L de cada AQs, (E) amostra
dopada (100 µmol/L) + 750 µmol/L de cada AQs. Analitos: ver Figura 44. Outras
condições: ver Figura 37.
Os valores de recuperação para os três níveis ficaram entre 74 e 130 %.
Analisando-se os dados, observou-se uma tendência de diminuição do valor de
recuperação com o aumento do número de carbonos na molécula. Outro fator
que pode ter contribuído para os valores que ficaram distante da faixa 90-
110%, é o efeito de matriz, uma vez que a amostra dopada foi preparada
utilizando a amostra real envida pela Petrobras.
4.6.5 Influência do numero de carbonos na resposta analítica
Os resultados anteriores mostraram uma visível dependência da
intensidade pela quantidade de carbono dos analitos. Para investigar melhor
essa dependência, separaram-se os analitos em duas classes. A primeira
0 20 40 60 80 100 120
(E)
(D)
(C)
(B)
987654
32
Sin
al C
4D
Tempo (s)
5 mV
1
(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
103
classe consiste de quatro cadeias carbônicas idênticas ligadas ao nitrogênio
central. A segunda classe apresenta três metilas ligadas ao nitrogênio central,
e uma cadeia carbônica com quantidades de carbono diferente. Primeiramente
realizou-se medidas de condutividades da solução de cada amina quaternária
na concentração de 10 mmol/L. Os valores de condutividades estão
apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de condutividade das soluções das aminas quaternárias na
concentração de 10 mmol/L.
Aminas Quaternárias (10 mmol/L Condutividade (µS/cm)
TMAB 1321
TEAOH 797
HTAB 924
TOMB 1082
DTAC 795
TTAB 829
CTAB 803
TBAP 857
TPAB 982
TDAB 662
BTAB 1127
TOAB 711
ETAB 892
TODAB 784
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
104
Não foi possível fazer um estudo relacionando diretamente a
condutividade dos cátions das aminas quaternárias com a quantidade de
carbono, pois a condutividade da solução também é dependente da presença
do contra íon, que geralmente não é igual para todos os sais utilizados. Porém,
a maioria dos contra-íons é o brometo, desta maneira foi possível construir
gráficos (Figura 63) da condutividade versus a quantidade de carbono para
cada tipo de estrutura dos analitos que contém o mesmo contra-íon.
Figura 63. Dependência da condutividade da solução das aminas quaternárias pela
quantidade de carbonos do grupamento R2. Aminas Quaternárias da (A) classe 1 e da
(B) classe 2.
As soluções das duas classes das aminas quaternárias apresentaram
uma queda de condutividade com o aumento do número de carbonos da
molécula. Foi construído outro gráfico (Figura 64), desta vez da condutividade
das soluções das AQs versus a quantidade total de carbono da molécula.
6 8 10 12 14 16 18750
800
850
900
950
1000
1050
1100 (B)
C
on
du
tivid
ad
e (
S/c
m)
nº carbonos de R2
0 2 4 6 8 10 12600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
(A)
Co
nd
uti
vid
ad
e (
S/c
m)
nº carbonos de R2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
105
Figura 64. Dependência da condutividade da solução das aminas quaternárias pela
quantidade total de carbonos.
O mesmo decréscimo de condutividade com o aumento da quantidade de
carbonos foi observado. Mas foi observado que a queda de condutividade é
mais pronunciada para quantidade de carbonos menores. Isso pode ser
explicado pelo raio de hidratação das espécies, que é maior com o aumento do
número de carbono da molécula.
Foram realizadas injeções individuais das aminas quaternárias
disponíveis no laboratório. Desta maneira foi possível encontrar o número
máximo de AQs que poderiam ser separadas em uma mesma análises.
Também se analisou a mistura contendo as aminas quaternárias pertencentes
à mesma classe. O eletroferograma representando a injeção da mistura de
cada classe pode se visto na Figura 65.
0 10 20 30 40 50 60600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
Co
nd
uti
vid
ad
e (
S/c
m)
nº total de carbonos
Model
Equation
Reduced Chi-Sqr
Adj. R-Square
B
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
106
Figura 65. Eletroferograma mostrando a separação das aminas quaternárias da (A)
classe 1 e (B) classe 2. (1) TMAB, (2) TEAOH, (3) TBAP, (4) TPAB, (5) TOAB, (6)
TDAB, (7) HTAB, (8) TOMB, (9) BTAP, (10) DTAC, (11) TTAB, (12) CTAB e (13)
TODAB. Outras condições: ver Figura 37.
No preparo da mistura das aminas da classe dois, ocorreu um equívoco,
sendo adicionado o analito TOAB que pertence a classe 1. Assim, o pico
referente a esse analito apareceu nas duas injeções.
A partir dos resultados anteriores, foi possível escolher dez aminas
quaternárias para uma separação simultânea. Desta maneira, injetou-se a
mistura na concentração de 500 µmol/L de cada amina. O eletroferograma
resultante está representado na Figura 66.
0 20 40 60 80 100 120
(B)
5
13
1211
10
98
7
65
4
3
2
Sin
al C
4D
Tempo de Migração (s)
3 mV1
(A)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
107
Figura 66. (A) Eletroferograma mostrando cinco injeções consecutivas de dez aminas
quaternárias. (B) Representação gráfica da dependência da resposta analítica pela
quantidade de carbono da molécula.
Durante as análises das aminas quaternárias, observou-se uma clara
influência do número total de carbono do composto na resposta analítica de
cada analito. As zonas eletroforéticas dos analitos com menor quantidade de
carbono (TMAB, TEAOH, HTAB e TOMB) possuem condutividade maior do
que o eletrólito por isso apresentam picos positivos. As outras aminas formam
0 50 100 150 200
(A)
9
32
4
56 8710
Sin
al C
4D
Tempo (s)
4 mV1
0 10 20 30 40 50
-4
-2
0
2
4
6
8
(B)
Sin
al
C4D
nº total de carbono
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
108
zonas eletroforéticas com condutividade menor que o eletrólito, desta maneira
os picos são negativos.
O gráfico apresentado na Figura 66B mostra que a intensidade dos picos
decaí exponencialmente com o número de carbonos, de acordo com a equação
y = A1*e(-x/t1) + y0.
Conclusões e
Perspectivas
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
110
5 Conclusões e Perspectivas
Analisando o conjunto de dados apresentado no desenvolvimento deste
trabalho, pode-se afirmar que os objetivos do projeto foram alcançados com
êxito, tanto na parte da avaliação do controle eletrocinético para introdução da
amostra em microdispositivos, quanto na parte relacionada à análise de aminas
quaternárias utilizando eletroforese não aquosa.
Avaliação dos modos de injeção
Com a instrumentação de MSE-C4D disponível é possível a
automatização do processo eletroforético, o que abre a possibilidade de
realizar múltiplas injeções consecutivas em ambos os modos de injeção, com
elevada frequência analítica.
Ambos os modos de injeção apresentaram resultados satisfatórios, com
boa repetitividade. O modo gated, por apresentar um melhor controle
eletrocinético da amostra, apresentou resultados ligeiramente melhores do que
o modo floating.
Para a resposta do C4D, o modo gated, por proporcionar um melhor
controle do volume de amostra injetado, forneceu resultados bem superiores
quando comparados com o modo floating, sendo possível a detecção de íons
inorgânicos com concentração na ordem de 1 µmol/L.
Os excelentes resultados obtidos com modo de injeção gated cria a
possibilidade de futuros estudos, que visam a detecção de íons inorgânicos em
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
111
concentrações na ordem de nmol/L o que proporcionaria LDs muito inferiores
aos reportados na literatura utilizando C4D.
Separação das AQs utilizando eletroforese não aquosa
A NAME se mostrou uma ótima alternativa para contornar os problemas
encontrados na eletroforese convencional para as análises das AQs. Uma vez
que a utilização de solventes aquosos acarretou precipitações no interior dos
microcanais de vidro, devido à alta afinidade das AQs com o vidro, e pobre
solubilidade em meio aquoso.
A utilização de eletrólitos preparados com solvente orgânicos, também
proporcionou separação com ótimas eficiências e resoluções, uma vez que foi
possível a aplicação de campos elétricos elevados sem que ocorresse o
aquecimento no interior do microcanal pelo efeito Joule.
A metodologia para a análise das AQs apresentou uma elevada
frequência analítica, uma vez que foi possível separações de dez AQs com
tempo inferior a 150 s em microchips com comprimento efetivo de 7 cm.
Apesar dos ótimos resultados alcançados com a eletroforese em meio
não aquoso, devemos ressaltar os problemas causados pela incompatibilidade
da cola utilizada para fixação dos cabos na plataforma e os solventes orgânicos
utilizados no preparo das soluções. A construção da parte avariada com
algumas modificações foi a saída encontrada.
No que diz respeito à análise das AQs na matriz enviada pelo Centro de
Pesquisas da Petrobras, foram alcançados resultados bem interessantes, com
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
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112
a construção de uma curva analítica com adição de padrão, a qual resultou em
correlações lineares satisfatórias para todos os analitos estudados.
A alta salinidade da amostra foi um problema, então estudos futuros
serão necessários para a redução da salinidade sem afetar os níveis de
detectabilidade.
A utilização da NAME foi uma novidade para o nosso grupo de pesquisa,
o que abriu diversas possibilidades de estudos, uma vez diversos compostos
com pouca ou nenhuma solubilidade em água poderão ser detectados
utilizando essa metodologia.
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CURRICULUM VITAE
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
129
CURRICULUM VITAE
Informações Pessoais
Nome Completo: Roger Cardoso Moreira
Endereço eletrônico: [email protected]
Naturalidade: Dores do Indaiá – MG Data de Nascimento: 15/10/1987
Filiação: Geralda Maria Moreira e Adílson Cardoso Moreira
Formação Acadêmica
Bacharel em Química Tecnológica
Universidade Federal de Goiás
Goiânia – Goiás
2009-2012
Atividades
Principais trabalhos apresentados em reuniões científicas
MOREIRA, R. C., LOPES, M. S., MEDEIROS JUNIOR, I., COLTRO, W. K. T..
Adaptação de um Sistema de Eletroforese Comercial para Separação de
Aminas Quaternárias em Microchips. V Workshop de Microfluídica, 2015,
Campinas/SP, Brasil.
MOREIRA, R. C., LOPES, M. S., MEDEIROS JUNIOR, I., COLTRO, W. K. T..
Determinação de quaternários de amônio usando eletroforese não aquosa em
microchips com detecção condutométrica sem contato. 38ª Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2015, Águas de Lindóia/SP, Brasil.
MOREIRA, R. C., ALMEIDA, A. D., COLTRO, W. K. T.. Desenvolvimento de
metodologia analítica para determinação de tensoativos utilizando microchips
CURRICULUM VITAE
Roger Cardoso Moreira Grupo de Métodos Eletroforéticos – IQ-UFG
130
de eletroforese com detecção condutométrica sem contato, 2014. IV Workshop
em Microfluídica,2014, Campinas/SP, Brasil.
MOREIRA, R. C., DUARTE JUNIOR, G. F., COLTRO, W. K. T.. Avaliação da
repetibilidade analítica do processo de injeção eletrocinética no modo gated em
microssistemas eletroforéticos. III Workshop em Microfluídica, 2013. IV
Workshop em Microfluídica,2014, Campinas/SP, Brasil.
MOREIRA, R. C., DUARTE JUNIOR, G. F., COLTRO, W. K. T. Efeito da
injeção gated na resposta do detector condutométrico sem contato acoplado
em microssistemas. 17º Encontro Nacional de Química Analítica, 2013, Belo
Horizonte/MG, Brasil.
MOREIRA, R. C., ARRUDA, A. F.. Avaliação da presença de metais tóxicos e
sua disponibilidade físico-química em lodo da estação de tratamento de esgoto
de Goiânia-GO. 35ª Reunião Anual da Sociedade de Química, 2012, Águas de
Lindóia/SP, Brasil.
Prêmios
Analytical Methods Poster Prize, Royal Society of Chemistry. WorkShop de
Microfluídica, 2013, Campinas/SP, Brasil.
Artigos publicados FREITAS, C. B., MOREIRA, R. C., TAVARES, M. G. de O., MARIA GIZELDA,
COLTRO, W. K. T. Monitoring of nitrite, nitrate, chloride and sulfate in
environmental samples using electrophoresis microchips coupled with
contactless conductivity detection. Talanta, v.147, p.335 - 341, 2016.
CURRICULUM VITAE
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131
Artigos em preparação
MOREIRA, R.C; LOPES, M. S., MEDEIROS JUNIOR, I., COLTRO, W. K. T..
Nonaqueous michochip electrophoresis coupled with contactless conductivity
detection for determination of quaternary ammonium in residual waters.
Journal Chromatography A, in preparation.
CHAGAS C. L. S., De SOUZA F. R., CARDOSO, T. M. G., MOREIRA, R.C.,
COLTRO W. K. T.. Paper microchip electrophoresis with integrated contactless
conductivity detection for separation of creatinine and bovine serum albumin
Analytical Chemistry, in preparation.