Download - Miroslav Melichar (podle práce Umeshe Adigy)
Nástroj pro segmentaci buněk v obrazu tkáně pořízeném
konfokálním mikroskopem.
Kvantitativní analýza FISH signálů.
Miroslav Melichar
(podle práce Umeshe Adigy)
2
Konfokální mikroskopie• Ostře zaměřený laserový paprsek skenuje
zkoumaný vzorek v určité ohniskové rovině
• Výběr ohniskové roviny a řízení skenování provádí počítač připojený k mikroskopu
• Výsledkem je zásobník 2D obrazů– Hloubka zásobníku je osa Z
4
FISH signály
• Fluorescence in Situ Hybridization
• Biologická metoda umožňující vizualizovat části DNA
• Zkoumané části DNA jsou zobrazeny odlišnou barvou
7
Cíle práce• Poloautomatická segmentace buněk v 3D
obraze• Automatická segmentace FISH signálů• Kvantitativní analýza FISH signálů
– Počet FISH signálů na jednu buňku• Nutné vyšetřit celý (3D) obsah buňky• Visuální počítání v zásobníku 2D obrazů je obtížné
– Obvykle 2 FISH signály na buňku• Pokud chybí(monosomie) nebo přebývají(trisomie),
jde o chybu v genetické výbavě buňky (např. indikuje rakovinotvorný nádor)
8
Předzpracování obrazu
• Úkolem potlačit šum a zvýraznit důležité rysy
• Prahování (odliší pozadí a objekty zájmu)
• Zostření
• (směrové) Vyhlazení - odstraní šum
9
Prahování
• Vhodné pokud jasová složka dostatečně charakterizuje objekt
• Dynamický práh (mění se dle polohy bodu), a hledá se analýzou histogramu– Obvykle v „údolí“ mezi dvěma vrcholy histogr.– Pokud není údolí, hledá se na „rameni“
• Poté se odstraní malé objekty a zalepí malé díry– Objekt: popředí obklopené pozadím– Díra: pozadí obklopené popředím
12
• Zostření obrazu– Přidáním gradientu nebo vysokofrekvenčního
signálu do obrazu
• Směrové vyhlazení (odstraní šum)– Zachovává hrany a odstraňuje rušivé výčnělky
na okraji (na hranách)– Bere maximální hodnotu ze směrového
průměru
14
Detekce vnějších hranic buněk
• Filtrem LoG (Laplacian of Gauss)– Laplacian (druhá derivace) po Gaussovi
(vyhlazení)– Najde vnější hranice– Nenajde hranice dotýkajících se nebo
překrývajících se buněk (je zde malý gradient)
16
Segmentace 3D obrazu s využitím vrstev
• Poloautomatická procedura– Provede se interaktivní (myší) segmentace
jednoho representativního obrazu (vrstvy)
• Informace o segmentaci representativního obrazu je použita pro segmentaci sousedních obrazů– Předpokládá se podobnost sousedících obrazů
18
Segmentace s využitím informace o segmentaci sousední
vrstvy (1)• E1 – množina pixelů z vnějších hran v
aktuálním obraze (získaná LoG)
• E2 – množina pixelů z hran správně segmentovaného sousedního obrazu
• Pokud je v „okolí“ E2 nalezen pixel z E1, je daný pixel z E2 vypuštěn. Množinu zbylých pixelů z E2 nazýváme E3
19
Segmentace s využitím informace o segmentaci sousední
vrstvy (2)• E3 slouží jako základ pro hledání hranice
mezi dotýkajícími se nebo překrývajícími se buňkami.
• V okolí E3 se hledají pixely, které mají vysokou hodnotu lokálního gradientu = hranice mezi buňkami– práh pro gradient je nižší než u LoG
22
Výskyt nových a odstranění nežádoucích buněk
• Výskyt nových buněk při průchodu vrstvami– Pokud je náznak buňky potvrzen výskytem ve
dvou sousedních obrazech, jde o novou buňku
• Odstranění nežádoucích buněk– Buňky na kraji obrazu a v krajních obrazech
zásobníku jsou považovány za ořezané (tj. nežádoucí)
– Odmítnutí buňky možné i interaktivně
23
Označkování (labeling) buněk
1. Vrstvy se prochází postupně, prvnímu neoznačenému voxelu se přiřadí unikátní označení (číslo).
2. Projdou se všechny jeho sousední voxely a dostanou stejnou značku.
3. Poté se pokračuje tam, kde skončil bod 1.
25
Interpolace pro zvýšení axiálního (Z) rozlišení (1)
• Pokud se sousední snímky liší výrazněji, je třeba prohledávat větší region– Výpočetně náročné O(n*m3), n=počet pixelů,
m=velikost regionu
• Zvýšení rozlišení umožní, aby si dva sousední obrazy byli více podobné– Je možno zmenšit velikost prohledávaného
regionu na polovinu => snížení výpočetní složitosti
26
Interpolace pro zvýšení axiálního (Z) rozlišení (2)
• Úloha: máme dva binární obrazy (pozadí a objekty) a chceme vytvořit obraz (vrstvu) mezi nimi.
• Řešení: – Pro vytvoření hranic binárního obrazu se
použije matematická morfologie– Pro vytvoření šedotóní informace v obraze se
použije míchání (tj. průměrování, příp. vážené)
29
Segmentace FISH signálů (1)
• Jednodušší než segmentace buněk– Jsou více lokalizované (malé), vysoký jas– Nezajímají nás FISH signály mimo buňky
• Vyhlazení: Gaussův filtr– Odstraní ostrá ojedinělá maxima způsobené
šumem, ale rozmaže i FISH signál
• Vyhledání FISH sinálů: TopHat filtr– Označí bod jako FISH signál, pokud je rozdíl
maximálních hodnot v jádře a okolí filtrů větší než zadaný práh
31
Segmentace FISH signálů (2)
• Následuje heuristika na velikost a tvar a umístění FISH signálů– Velikost: experimentálně zjištěný počet voxelů
– Tvar: musí zabírat alespoň 2 vrstvy
– Umístění: alespoň z poloviny v buňce
• Pokud je FISH signál příliš veliký, šetří se zda nejde o 2 FISH signály– Musí být přítomny alespoň 2 intenzitní vrcholy s
předdefinovanou minimální vzdáleností
• Posledním krokem je označkování FISH signálů
32
Vyhledávání FISH signálu:
a) Originál
b) po Gaussově vyhlazení
c) Po TopHat filtru
d) Po heuristice na velikost a tvar
33
Kvantitativní analýza FISH signálů
• Pro každou buňku se zjistí počet FISH signálů– Jednoduché, neboť obojí je již označkované
• Výsledky– 6 vzorků tkání, 4-8 buněk na vzorek, 77 FISH sig.– Algoritmus nalezl 73 FISH signálů, tj. 5% chyba– Velmi přijatelný výsledek
• Patologové také nejsou při ručním označovaní jednotní
• Ulehčí únavnou práci patologům