Download - Rezumat Teza Doctorat_POPA

U�IVERSITATEA DI� BUCUREŞTI FACULTATEA DE CHIMIE

ŞCOALA DOCTORALĂ Î� CHIMIE

DETERMINAREA UNOR ANTIOXIDANŢI

ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE TOTALE

A UNOR PROBE COMPLEXE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Doctorand,

Claudia-Valentina POPA

Conducător ştiinţific,

Profesor Dr. Andrei Florin DĂNEŢ

Bucureşti -2011-

Cuprins Cuprins

3 4

CUPRI�S

(numerotarea paginilor este cea din teza de doctorat) LISTA DE ABREVIERI 7 I�TRODUCERE 9 OBIECTIVELE TEZEI 11

1. RADICALI LIBERI. A�TIOXIDA�ŢI. CAPACITATE A�TIOXIDA�TĂ TOTALĂ. STRESUL OXIDATIV

13

1.1. Radicali liberi 13 1.2. Antioxidanţi. Capacitate antioxidantă totală 18

1.2.1. Clasificarea antioxidanţilor 21 1.2.2. Antioxidanţi naturali neenzimatici 22

1.2.2.1. Antioxidanţi naturali neenzimatici liposolubili 22 1.2.2.2. Antioxidanţi naturali neenzimatici hidrosolubili 32 1.2.2.3. Compuşi cu structură fenolică 37

1.2.3. Antioxidanţi enzimatici 53 1.2.4. Antioxidanţi anorganici 56

1.3. Stresul oxidativ 57 2. OBŢI�EREA EXTRACTELOR VEGETALE 63

2.1. Principii generale ale extracţiei 63 2.2. Procedee de extracţie 65

3. BIOLUMI�ESCE�ŢĂ. CHEMILUMI�ESCE�ŢĂ 69 4. METODE DE DETERMI�ARE A A�TIOXIDA�ŢILOR ŞI A CAPACITĂŢII

A�TIOXIDA�TE A U�OR PROBE COMPLEXE

73 4.1. Clasificarea metodelor de determinare a antioxidanţilor şi a capacităţii

antioxidante

73 4.2. Metode spectrofotometrice 75 4.3. Metode bazate pe luminescenţă 85

4.3.1. Metode bazate pe fluorescenţă 85 4.3.2. Metode bazate pe chemiluminescenţă, electrochemiluminescenţă

şi fotochemiluminescenţă

88 4.4. Metode electrochimice 98 4.5. Metode cromatografice 99 4.6. Metode de analiză prin injectare în flux 100 4.7. Alte metode de determinare a unor antioxidanţi şi a capacităţii antioxidante

totale

108 5. DETERMI�AREA U�OR A�TIOXIDA�ŢI ŞI A CAPACITĂŢII

A�TIOXIDA�TE TOTALE A U�OR PROBE COMPLEXE

111 5.1. Metodă FIA-CL cu injectarea probei într-un flux de apă oxigenată 112

5.1.1. Principiul metodei 112 5.1.2. Reactivi şi materiale 113

5.1.2.1. Aparatura 113

5.1.3. Mod de lucru 116 5.1.4. Mod de calcul 116 5.1.5. Determinarea acidului L-ascorbic 117 5.1.6. Concluzii 118

5.2. Studiul influenţei complexării cu EDTA a ionilor de Co2+ (catalizator) asupra semnalului de chemiluminescenţă

119

5.2.1. Principiul metodei 120 5.2.2. Echilibre implicate în reacţia de chemiluminescenţă bazată pe oxidarea

luminolului de către radicalii HO. în prezenţa ionilor de Co2+ drept catalizator

120 5.2.3. Reactivi şi materiale 123

5.2.3.1. Analiza apei oxigenate 126 5.2.3.2. Aparatura 126

5.2.4. Mod de lucru 128 5.2.5. Mod de calcul 129 5.2.6. Optimizarea condiţiilor de lucru. Influenţa solvenţilor asupra

semnalului de chemiluminescenţă

133 5.3. Determinarea unor antioxidanţi folosind montajul de analiză prin

injectare într-un flux de tampon borat

137 5.3.1. Mod de lucru 138 5.3.2. Mod de calcul 138 5.3.3. Determinarea unor antioxidanţi 138

5.3.3.1. Determinarea acidului uric 138 5.3.3.2. Determinarea acidului L-ascorbic 144 5.3.3.3. Determinarea acidului cafeic 145 5.3.3.4. Determinarea acidului galic 148 5.3.3.5. Determinarea Trolox 150

5.4. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe reale 151 5.4.1. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe de vin 151 5.4.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor ceaiuri 157

5.4.2.1. Obţinerea infuziilor 157 5.4.2.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 157

5.4.3. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor sucuri de fructe şi a unor băuturi necarbonatate

158

5.4.3.1. Obţinerea probelor de analizat 158 5.4.3.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 160

5.4.4. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din fructe de Rubus idaeus L. şi Vaccinium myrtillus L.

165

5.4.4.1. Obţinerea extractelor 165 5.4.4.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 166

5.4.5. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din plante

169

Cuprins Cuprins/cuvinte-cheie

5 6

5.4.5.1. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din plante aparţinând familiei Lamiaceae, obţinute prin macerare

169

5.4.5.1.1. Obţinerea extractelor vegetale 169 5.4.5.1.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 169

5.4.5.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte de Rosmarinus officinalis L. iradiate cu radiaţii γ

171

5.4.5.2.1. Obţinerea extractelor iradiate de rozmarin 172 5.4.5.2.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 172

5.4.5.3. Determinarea capacităţii antioxidante totale şi a conţinutului în polifenoli a unor extracte vegetale obţinute prin extracţie continuă şi extracţie cu ultrasunete

176 5.4.5.3.1. Obţinerea extractelor vegetale 177 5.4.5.3.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale, a conţinutului în

fenoli totali şi flavonoide

177 5.4.5.4. Determinarea capacităţii antioxidante şi a conţinutului în polifenoli a unor

legume

185 5.4.5.4.1. Obţinerea extractelor vegetale 185 5.4.5.4.2. Determinarea capacităţii antioxidante şi a conţinutului în fenoli totali,

flavonoide şi antociani

185 5.4.6. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe de

comprimate de Spirulină 500 mg supliment alimentar

193 5.4.6.1. Obţinerea probelor de analizat 193 5.4.6.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 193

5.4.7. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor produse cosmetice 195 5.4.7.1. Obţinerea probelor de analizat 195 5.4.7.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale 196

5.5. Concluzii 197

6. DETERMI�AREA I�TRACELULARĂ A VARIAŢIILOR CO�CE�TRAŢIILOR IO�ILOR DE Ca2+ CITOSOLIC Î� CO�DIŢII DE STRES OXIDATIV

201

6.1. Calciul intracelular, mesager secundar 201

6.2. Drojdia Saccharomyces cerevisiae şi căile de transport ale ionilor de Ca2+ în celulă

204

6.3. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ la condiţii de stres 206

6.4. Metode de determinare a răspunsului mediat de ionii de Ca2+ la condiţii de stres

208

6.4.1. Aequorina, proteină bioluminescentă 209 6.5. Determinarea răspunsului mediat de ionii de Ca2+ la condiţii de stres

oxidativ printr-o metodă bazată pe bioluminescenţă

210 6.5.1. Principiul metodei 211 6.5.2. Mecanismul emisiei luminii de către aequorină 212

6.2.1. Reactivi şi materiale 214 6.2.1.1. Linii celulare şi condiţii de creştere 215

6.2.2. Mod de lucru 216 6.2.2.1. Studiul creşterii liniilor celulare 216 6.2.2.2. Monitorizarea in vivo a pulsurilor ionilor de Ca2+ induse de stresul oxidativ

216

6.2.3. Mod de calcul 218 6.3. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor supuse stresului oxidativ 218

6.3.1. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la H2O2 218 6.3.2. Mobilizarea ionilor de Ca2+ sub acţiunea stresului oxidativ indus de

H2O2 219

6.3.3. Adaptarea celulelor la stresul oxidativ 222 6.3.4. Mobilizarea ionilor de Ca2+ în celulele expuse la concentraţii letale de

de H2O2 225

6.3.5. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la alchil-hidroperoxizi

226

6.4. Influenţa unor antioxidanţi şi a unor extracte vegetale asupra răspunsului mediat de ionii de Ca2+ în condiţii de stres oxidativ

231 6.4.1. Influenţa vitaminei C asupra răspunsului mediat de ionii de Ca2+

în condiţii de stres oxidativ

231 6.4.2. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ în condiţii de stres oxidativ în

prezenţa unor extracte vegetale

233 6.4.2.1. Obţinerea extractului 233 6.4.2.2. Determinarea conţinutului în fenoli totali şi flavonoide 234 6.4.2.3. Monitorizarea răspunsului mediat de ionii de Ca2+ în condiţii de

stres oxidativ în prezenţa extractului

235 6.5. Discuţii şi concluzii 237 CO�CLUZII GE�ERALE 241 LUCRĂRI PUBLICATE Î� DOME�IUL TEZEI DE DOCTORAT 245 CO�TRACTE DE CERCETARE 247 BIBLIOGRAFIE 249

�umerotarea tabelelor, figurilor şi a indicaţiilor bibliografice este cea din teza de doctorat

Cuvinte-cheie Antioxidanţi, polifenoli, flavonoide, antociani, acid ascorbic, acid uric, acid cafeic, acid galic, Trolox, capacitate antioxidantă totală, activitate antioxidantă, metodă de analiză prin injectare în flux, (chemi)luminescenţă, luminol, ioni de Co(II), metode spectrofotometrice, capacitatea de îndepărtare a radicalului DPPH., extracţie continuă, extracţie cu ultrasunete, stres oxidativ, calciu citosolic, aequorină, Saccharomyces cerevisiae.

Lista de abrevieri Lista de abrevieri

7 8

LISTA DE ABREVIERI AA acid L-ascorbic (vitamina C) AAPH 2,2'-azobis(2-amidinopropan), azo-iniţiator R2N2 ABTS acid 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonic) ADA acid dehidro-L-ascorbic ADNc acid deoxiribonucleic complementar AEQ aequorină AGN/AGS acizi graşi nesaturaţi / acizi graşi saturaţi AH donor(i) de hidrogen AO antioxidant/antioxidanţi AP 3-aminoftalat AU acid uric BAPTA acid 1,2-bis(o-aminofenoxi)etan-N, N, N`, N`-tetracetic) BL bioluminescenţă

B-PE B-ficoeritrina, o proteină fluorescentă roşie, ce are legat covalent de partea proteică cromoforul ficobilină

BR bilirubina c concentraţie CE extracţie continuă CAT catalaza

CD relaxare vibraţională (vibrational relaxation, a collisional deactivation process)

cit citosolic cit c citocrom c CL chemiluminescență CoQ coenzima Q CoQ10 coenzima Q 10 (forma oxidată) CoQ10H2 coenzima Q 10h2 (forma redusă) CP ceruloplasmina Cys cisteină DAD diode array detector DCPIP 2,6-diclorfenolindofenol DO densitate optică (optical density)

DPPH radical 2,2-difenil-1-picril hidrazil sau metoda de analiză bazată pe capacitatea de îndepărtare a acestui radical (2,2-Diphenyl-1-Picryl Hydrazyl Radical Scavenging)

dw extract sau produs vegetal uscat (dry weight)

ECL chemiluminescenţă generată electrochimic, electrochemiluminescenţă

EDTA acid etilen-diaminotetracetic EGTA acid glicol-bis(2-aminoetileter)etan-N, N, N`, N`-tetracetic

ELISA enzyme-linked immuno-sorbent, tehnică de determinare enzimatică a sângelui ce permite detectarea imunoglobulinelor îndreptate împotriva unui agent bacterian sau viral

EMMA Electrophoretically Mediated Microanalysis (microanaliză mediată electroforetic)

ET sau SET transfer de electron (Single Electron Transfer) F fluorescenţă FCM metoda Folin-Ciocâlteu FCR reactiv Folin-Ciocâlteu FIA metodă de analiză prin injectare în flux (flow injection analysis) FNR (sau Fpr) feredoxin-reductaza

FRAP metoda analitică de determinare a capacităţii antioxidante bazată pe reducerea ionului feric (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power)

FRASC

metodă de analiză bazată pe capacitatea de reducere a ionului feric şi pe măsurarea concentraţiei de ascorbat din probe (Total Ferric Reducing (Antioxidant) Activity and Ascorbate Concentration Measurement)

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy fw extract sau produs vegetal proaspăt (fresh weight) GC cromatografia de gaze GPx glutation peroxidaza G-SH / G-S-S-G glutation (forma redusă) / glutation disulfură (forma oxidată) HAT transferul unui atom de hidrogen (Hydrogen Atom Transfer)

HPLC cromatografie de lichide de înaltă performanţă (high performance liquid chromatography)

HPR peroxidaza din hrean IC conversie internă (internal conversion) IOU metoda inhibiţiei reacţiei cu oxigenul (Inhibited Oxygen Uptake) IR infraroşu ISC conversie intersistem (intersystem crossing) L luminescenţă L, LH2 luminol LC cromatografia de lichide

LDL lipoproteine cu densitate mică (low-density lipoprotein, „colesterol rău”)

LH donor de hidrogen (sau antioxidant) în reacţiile ce decurg cu transfer de hidrogen, în etapele de iniţiere şi propagare

MPC moarte celulară programată (programmed cell death) n număr de determinări NAD+ nicotinadenindinucleotid NADP+ nicotinadenindinucleotid fosfat

ORAC metoda de analiză bazată pe capacitatea de a reacţiona cu oxigenul (Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay) a unor specii radicalice

P fosforescenţă PAD photodiode array detector

Lista de abrevieri Obiectivele tezei

9 10

Pc ficocianina (phycocyanin) PCL fotochemiluminescenţă PMT tub fotomultiplicator (photomultiplier tube) POD peroxidaza

PSC metoda analitică bazată pe capacitatea de îndepărtare a radicalului peroxil (Peroxyl Radical Scavenging Capacity)

r coeficient de corelaţie Pearson R înregistrator RE reticul endoplasmic

RES rezonanţă electronică de spin (Electronic Spin Resonance, ESR)

RL radical(i) liber(i) RLU unităţi relative de luminescenţă RMN Rezonanţă Magnetică Nucleară RNS specii reactive cu azot ROS specii reactive cu oxigen SD deviaţia standard (standard deviation) RSD deviaţia relativă standard (relative standard deviation) S singlet SeCys selenocisteină

SFA metodă de analiză în flux segmentat (Segmented Flow Analyzer)

SIA metodă de analiză prin injectare în flux segmentat (Sequential Injection Analysis)

SOD superoxid dismutaza T triplet TAC capacitate antioxidantă totală tBOOH hidroperoxid de terţ-butil

TEAC metoda de determinare a capacităţii antioxidante ca echivalenţi trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Assay)

TP fenoli totali (total phenols) TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazină

TRAP puterea (parametrul) antioxidant(ă) de a capta radicalul peroxil (Total Peroxyl Radical Trapping Antioxidant Parameter Assay)

UE sau UAE extracţie cu (asistată de) ultrasunete (ultrasonically assisted extraction)

VEAC activitate antioxidantă exprimată în echivalenţi vitamină C

OBIECTIVELE TEZEI Obiectivele urmărite în această teză sunt:

� efectuarea unui studiu de literatură privind tematica tezei; � elaborarea unor noi metode FIA-CL pentru determinarea activităţii antioxidante

a unor AO (substanţe pure) şi a TAC a unor probe reale, complexe, pornind de la datele din literatura de specialitate.

- realizarea unor montaje FIA-CL şi elaborarea unor metode de analiză optimizate pentru determinarea activităţii antioxidante a unor substanţe;

- aplicarea metodelor FIA-CL elaborate la determinarea: � unor AO substanţe pure (acid uric, acid ascorbic, acid cafeic, acid galic,

Trolox); � TAC a unor extracte, obţinute prin mai multe metode (extracţie

continuă, macerare, extracţie cu ultrasunete, centrifugare), folosind solvenţi diferiţi (etanol, acetonă, apă), din plante (condimente, legume, plante medicinale) şi fructe;

� TAC a unor vinuri, infuzii din plante medicinale (ceaiuri), sucuri de fructe, băuturi răcoritoare necarbonatate, precum şi a unor produse suplimente alimentare (comprimate) şi produse cosmetice (creme şi geluri);

- studiul variaţiei TAC a unui extract de rozmarin la iradiere cu doze variate de radiaţii γ;

- efectuarea unor corelaţii între TAC şi conţinutul de polifenoli determinat prin metode spectrofotometrice convenţionale a unor probe analizate;

- efectuarea unor corelaţii între TAC şi capacitatea antioxidantă determinată prin metoda DPPH a unor probe analizate;

- efectuarea unor corelaţii între valorile TAC ale probelor analizate determinate prin metodele FIA-CL studiate şi valori reprezentative ale conţinutului de AO şi ale capacităţii antioxidante raportate de literatură.

� determinarea în dinamică a modificării concentraţiei ionilor de calciu citosolic ([Ca2+]cit) ca răspuns la diferiţi factori de stres oxidativ în absenţa/prezenţa unor AO şi a unor extracte vegetale - stabilirea unui sistem celular pentru determinarea intracelulară a variaţiilor

[Ca2+]cit în celule de Saccharomyces cerevisiae în condiţii de stres oxidativ; - identificarea condiţiilor optime de înregistrare in vivo a semnalului de

luminescenţă care apare în urma fluctuaţiilor [Ca2+]cit; - monitorizarea variaţiei luminescenţei celulei în prezenţa unor inductori ai

răspunsului mediat de Ca2+ (H2O2, hidroperoxizi organici); - studierea influenţei unor AO (vitamina C) şi a unor extracte vegetale asupra

stresului oxidativ indus în celulele drojdiei S. cerevisiae.

Rezumatul tezei Rezumatul tezei

11 12

REZUMAT 5. DETERMI�AREA U�OR A�TIOXIDA�ŢI ŞI A CAPACITĂŢII

A�TIOXIDA�TE TOTALE A U�OR PROBE COMPLEXE

n acest studiu, s-a urmărit elaborarea unei noi metode de analiză prin injectare în flux cu detecţie chemiluminescentă pentru determinarea activităţii antioxidante a unor antioxidanţi (AO) substanţe pure şi a capacităţii antioxidante totale (TAC) a unor probe reale, complexe.

Metodele elaborate se bazează pe sistemul chemiluminescent luminol/H2O2/Co(II). Reacţia de CL are loc între luminol (5-amino-2,3-dihidroftalazin-1,4-diona) şi radicalii HO., proveniţi din apa oxigenată în prezenţa ionilor de Co(II). Ionii de Co(II) catalizează descompunerea H2O2 cu generarea de ROS, în principal radicali HO ., conform reacţiilor Fenton (64) şi Haber-Weiss (65) [316, 366, 465, 476]:

Co2+ + H2O2

-Co3+ + HO + HO. (64)

\

Co2+ + O2

Co3+ + O2

-. (65)

Radicalii HO . generaţi, fiind extrem de reactivi, reacţionează cu luminolul

foarte repede. Luminolul este oxidat în mediu bazic în prezenţa catalizatorului, trecând în final în acid 5-aminoftalic care este în formă excitată. Acesta trece apoi în starea fundamentală generând o emisie de CL, care este măsurată în unităţi relative de CL (RLU). [17, 363, 365, 366, 375, 457, 459, 465]. Datele generate de un chemiluminometru sunt înregistrate cu ajutorul unui calculator cuplat la aparat şi apoi sunt prelucrate corespunzător.

Au fost concepute două montaje FIA-CL. Montajul iniţial a fost prevăzut cu 2 canale. Pe baza aceleaşi variante constructive, au fost concepute două variante de lucru, în care:

- în varianta A, s-a folosit un flux transportor de H2O2 15 µM şi un flux de reactivi luminol 10-4 M/ Co(II) 10-5 M/Na2CO3 0,1 M, pH 10;

- în varianta B, fluxul transportor a fost un amestec de H2O2 15 µM/CoCl2 10-5 M/ acid citric 10-5 M, iar fluxul de reactiv- o soluţie de luminol 10-4 M în Na2CO3 0,1 M, pH 10.

Cele două fluxuri de reactivi se amestecă înainte de intrarea în celula în flux. Reacţia de CL are loc în celula în flux: luminolul este oxidat în mediu bazic conferit de prezenţa carbonatului, de către radicalii HO . proveniţi din H2O2 în prezenţa ionilor de Co(II) drept catalizator, generând o emisie de CL, relativ constantă [17, 366, 459, 465].

Când în fluxul transportor s-a injectat acid ascorbic, acesta a reacţionat (a consumat) apa oxigenată. În consecinţă, H2O2 nu a mai fost disponibilă pentru a genera radicali HO ., care apoi să reacţioneze cu luminolul şi să producă CL. S-au obţinut picuri cu vârful în jos (picuri negative).

În varianta B s-a încercat stabilizarea semnalului prin complexarea ionilor de Co(II) cu acid citric în raport molar de 1:1.

Metoda a fost aplicată la determinarea vitaminei C, dar rezultatele nu au fost suficient de reproductibile.

Din acest motiv, s-a realizat un al II-lea montaj FIA-CL prezentat în figura 31, alcătuit din trei canale, prin care au fost pompate: (a) un flux transportor de borat de sodiu 0,05M, pH 9 în care se injectează proba de analizat; (b) un flux de apă oxigenată şi (c) un flux de luminol/Co(II)/EDTA. Fluxul de apă oxigenată (b) se amestecă cu fluxul (c) în bucla de amestecare (notată „M” în figura 31, cu lungimea de 150 cm). Fluxul oxidant-luminol/catalizator/complexant rezultat se întâlneşte cu fluxul transportor de borat de sodiu 0,05M, pH 9 (a) înainte de intrarea în celula în flux (notată „F” în figura 31), unde are loc reacţia de CL.

Figura 31. Schema montajului FIA-CL cu trei canale, cu injectarea probei într-un flux de tampon borat 0,05 M, pH 9. P: pompă peristaltică; I: valvă de injectare; F: celula în flux; M: buclă de amestecare (L = 150 cm); PMT: tub fotomultiplicator; C: computer; w: rezidii; (a): flux transportor de borat de sodiu 0.05 M, pH 9; (b): flux de H2O2; (c): flux de Co(II)/EDTA/luminol

Sistemul FIA este cuplat cu aparatul de chemiluminescenţă. Montajul FIA-CL utilizat a fost alcătuit din: pompă peristaltică Gilson cu 4 canale; valvă de injectare Rheodyne, model 5051, cu 4 canale şi buclă de injectare; detector de chemiluminescenţă format din tub fotomultiplicator (PMT; tensiunea de alimentare = 1000 V), sistem de amplificare şi ecran de afişare şi celula în flux a chemiluminometrului.

Celula a fost confecţionată în laborator prin spiralarea unui tub de Teflon (diametru intern d.i. = 0,8 mm şi lungimea de 50 cm) în acelaşi plan, obţinându-se

Î

P

I

PMT

S

(a)

(b)

(c)

75 cm

w

w

F

C

M


13 14

astfel opt spire. Celula s-a fixat pe o foiţă reflectorizantă din aluminiu, care reflectă radiaţia luminoasă către fereastra PMT (figura 24A). Această celulă este plasată în faţa ferestrei PMT (figura 24B).

Figura 24. Celula în flux. A. vedere laterală; B. vedere din faţă PMT: tub fotomultiplicator; Al: foiţă de aluminu; S: probă; R: reactiv; w: rezidii

După cum se observă în figura 24B, fluxul de probă (marcat cu culoarea

roşie) şi cel de reactivi (desenat cu culoare albastră) se întâlnesc în faţa celulei în flux, unde are loc reacţia de CL. Radiaţia luminoasă este direcţionată în faţa PMT. Cu negru s-au marcat reziduurile.

Montajul a fost cuplat cu un computer, prevăzut cu un program de achiziţionare şi prelucrare a datelor. În figura 30 este prezentată imaginea ecranului calculatorului la înregistrarea unui semnal de fond. S-a utilizat varianta perfecţionată a programului, care a permis: înregistrarea semnalelor de CL în funcţie de timp la diferite valori ale timpului de achiziţie, prelucrarea datelor înregistrate sub forma unor picuri specifice FIA-CL în timp real, o serie de facilităţi în interpretarea acestor picuri înregistrate, ca de exemplu: posibilitatea măririi, micşorării, lăţirii sau îngustării picurilor, posibilitatea opririi înregistrării şi citirii unei anumite valori de pe pic etc. Astfel, prin apăsarea butonului „PAUZĂ” se întrerupe înregistrarea şi se pot marca anumite valori de pe grafic cu ajutorul reperelor concepute în acest scop. Valorile din înregistrare care se doresc a fi aflate apar în ferestrele care sunt indicate în figura 30 (sunt colorate în albastru şi roz).

Valorile intensităţii CL s-au putut urmări grafic, dar s-au înregistrat numai în formă numerică. Citirile s-au făcut la un interval selectat de 1 s. Fişierele se salvează şi apoi se redeschid prin programul MS-EXCEL. Datele înregistrate de calculator în formă numerică au fost prelucrate ulterior folosind funcţiile disponibile în MS-EXCEL, inclusiv forma grafică.

Metoda FIA-CL propusă se bazează pe reacţia în mediu bazic a luminolului cu radicalii HO. generaţi prin reacţia de tip Fenton (64) proveniţi din H2O2 în prezenţa ionilor de Co(II) (catalizator) complexaţi cu EDTA. Complexarea cu EDTA asigură eliberarea ionilor de Co(II) la o concentraţie foarte mică şi cu o viteză relativ constantă, ceea ce garantează formarea unui flux de RL cu o viteză relativ constantă

şi alimentează sistemul cu o anumită concentraţie constantă de HO. în concentraţie foarte mică şi pentru un timp relativ mare [17].

Figura 30. Imaginea ecranului calculatorului în timpul înregistrării semnalului de fond. RLU: unităţi relative de luminescenţă Folosirea unui exces de complexant contribuie la asigurarea fluxului de RL constant, chiar dacă intensitatea semnalului este mai scăzută. În reacţia de CL a luminolului cu H2O2, apar mai multe echilibre competitive [17, 316, 366, 459, 465, 476].

A B


15 16

În mediul bazic, ionul HO–, un nucleofil foarte puternic, atacă protonul din grupa –OH fenolică din luminol (5-amino-2,3-dihidroftalazin-1,4-diona), cu formare de ion enolat (LH–). Luminolul monodisociat (LH–) în mediul bazic reacţionează cu radicalul HO. (generat din H2O2) şi se formează diazaminochinona LH. –. În prezenţă de oxigen molecular şi apă, anionul radical LH. – se oxidează la luminol (L LH2). Pe de altă parte, LH. – reacţionează cu O2

. – la anionul hidroperoxid (LOO–). Acesta din urmă se află în echilibru cu forma sa tautomeră de endoperoxid, stare de tranziţie instabilă, care se descompune spontan la 3-aminoftalat în stare excitată de triplet (AP*) şi N2. AP* se relaxează ulterior la starea fundamentală (AP–) cu emitere de radiaţie luminoasă (λ = 430 nm) [17, 366, 367, 375, 459, 465, 476].

Folosind montajul şi programul îmbunătăţit menţionate s-au înregistrat semnale cu aspectul celor prezentate în figura 32. Astfel, în absenţa unui AO, se înregistrează un semnal de CL nu foarte mare, dar care rămâne stabil şi constant în timp. Valoare intensităţii acestui semnal este notat cu ICL în figura 32. La injectarea unei probe cu AO, antioxidantul va neutraliza a o parte din radicalii HO., generaţi din reacţia ionilor de Co2+ cu H2O2, ceea ce conduce la scăderea semnalului de CL (pic negativ). Valoarea corespunzătoare scăderii semnalului de CL de fond în prezenţa unui AO a fost notată cu I∆CL (figura 32). Scăderea intensităţii I∆CL este corelată cu activitatea şi concentraţia antioxidantului.

Figura 32. Forma tipică a unui semnal de chemiluminescenţă. ICL: semnalul CL de fond; I∆CL: scăderea semnalui de CL în prezenţa unei probe de AO injectate; RLU: unităţi arbitrare de luminescenţă

După trecerea probei cu AO, semnalul revine la valoarea iniţială. S-a măsurat valoarea semnalului de CL, I∆CL, pentru soluţiile standard şi

pentru probele de analizat. Din valoarea I∆CL s-a scăzut în toate cazurile atât pentru etaloane cât şi pentru probele de analizat, valoarea I∆CL măsurată pentru o probă de comparaţie (o probă care nu conţine un AO) obţinându-se astfel I’∆CL.

Datele obţinute pot fi prelucrate în mai multe moduri. Astfel, se poate reprezenta grafic: I`∆CL (RLU); (ICL/ICL - I∆CL); (I`∆CL/ICL) × 100 în funcţie de logaritmul concentraţiei AO (µM). În teză sunt date exemple de astfel de curbe obţinute la determinarea acidului uric. Cele mai bune rezultate s-au obţinut reprezentând grafic (I`∆CL/ICL) × 100 în funcţie de concentraţia AO (µM). În acest ultim caz s-a calculat pentru ICL media semnalelor corespunzătoare „platoului” înainte şi după injectarea probei. Pentru determinarea I`∆CL al probelor (standard sau probe reale) s-au efectuat cel puţin două injectări şi s-a efectuat media acestora.

5.2.6. Optimizarea condiţiilor de lucru. Influenţa solvenţilor asupra semnalului

de chemiluminescenţă S-au studiat şi optimizat parametrii sistemului care au valorile optime

indicate în paranteze: pH (valoare optimă 9), debitul total pe toate cele 3 canale (Qtot. = 0,45 mL/min.), concentraţiile ionilor de Co(II) şi EDTA şi raportul molar Co(II)/EDTA, concentraţia luminolului (2,3 × 10-4 M), concentraţia H2O2 (6 x 10-4 M preparată într-o soluţie apoasă de EDTA 2 x 10-4 M), volumul de injectare (Vinj = 70 µL). Semnalele de CL au fost mai mici la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA = 10-3 M) comparativ cu cele înregistrate la raport molar Co(II)/EDTA = 0,9 (c Co(II) = 0,804 × 10-3 M; cEDTA = 0,894 × 10-3 M). Totuşi, în majoritatea determinărilor a fost preferat raportul molar Co(II)/EDTA = 0,8 deoarece un mic exces de EDTA asigură producerea unui flux constant de radical hidroxil, în conformitate cu principiul metodei şi echilibrele implicate în reacţia de CL.

Determinarea capacităţii antioxidante a multor probe reale (extracte (hidro)alcoolice de plante, vinuri ş.a.) implică prezenţa alcooliilor sau a acetonei. Din acest motiv, s-a studiat influenţa a trei dintre cei mai utilizaţi solvenţi (etanol, acetonă, metanol) asupra semnalului de CL. S-a demonstrat că prezenţa acetonei chiar şi în concentraţii mari (70 – 90%, v/v) a dus la o creştere cu cel mult 10% a semnalului analitic. Din acest motiv s-a preferat să se lucreze cu extracte prelucrate în acetonă. S-a constat că până la concentraţii de cca. 20%, etanolul conţinut în probele de analizat nu influenţează semnalul de CL. Folosind un flux transportor de tampon borat preparat în etanol 7% (v/v) atunci când s-au analizat soluţii etanolice s-a reuşit diminuarea semnificativă a semnalului dat de soluţiile etanolice. Au fost selectate soluţii de etanol 80% (v/v) şi acetonă 70% (v/v) la prepararea probelor/extractelor de analizat deoarece au cele mai mici concentraţii etanolice respectiv acetonice la care extractele vegetale nu au precipitat. Pentru a înlătura posibilitatea interferenţelor unor ioni metalici aflaţi în urme, care ar putea acţiona ca şi catalizatori competitori faţă de Co(II), soluţiile etanolice, acetonice şi de H2O2 s-au preparat în EDTA 2 x 10-4 M [483].


17 18

5.3. Determinarea unor antioxidanţi folosind montajul de analiză prin injectare într-un flux de tampon borat

etoda FIA-CL dezvoltată a fost aplicată pentru determinarea a cinci antioxidanţi (substanţe pure), şi anume: acid uric (0,6 – 100 µM),

acid ascorbic (0,8 – 300 µM), acid cafeic (1 – 1000 µM), acid galic (2,5 – 300 µM) şi Trolox (2,5 – 500 µM). Domeniile de concentraţie au fost indicate în paranteze. Determinările au fost efectuate la volumul de injectare optim de 70 µL. În cazul determinării acidului uric s-a arătat că sensibilitatea metodei creşte de 10 ori (0,1 – 10 µM) lucrând cu un volum de injectare de 270 µL. S-au trasat mai multe tipuri de drepte de calibrare (menţionate anterior), în diferite condiţii experimentale (raport molar Co(II)/EDTA, solvenţi diferiţi). În continuare se prezintă câteva drepte de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia AO (µM), reprezentative.

De exemplu, în figura 39 se prezintă curbele de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia acidului uric.

Figura 39. Curbe de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia acidului uric. Curbe de calibrare. B. Domeniu de liniaritate. Curba (1): Raport molar Co(II)/EDTA = 0,9 [cCo(II) = 0,804 × 10-3 M; cEDTA= 0,894 × 10-3 M]; cluminol = 2,26 × 10-4 M; cH2O2 = 2 x 10-4 M (soluţie în apă). Vinj = 70 µL; Qtot. = 0,36 mL/min. Curba (2): Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; c H2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). Vinj . = 70 µL. Qtot. = 0,45 mL/min. În ambele situaţii experimentale fluxul transportor a fost o soluţie de tampon borat 0,05M, pH 9, iar proba de comparaţie a fost apa. Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite. Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare determinare. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezintă ± SD

Pentru dreapta de calibrare (1) prezentată în figura 39B (domeniul de linearitate = 4 - 15 µM), s-au calculat ecuaţia dreptei şi coeficientul de corelare următori:

I’∆CL/ICL × 100 = 2,57 x concentraţia acidului uric (µM) + 11,2 (77) r2/n = 0,9968/6

Pentru dreapta de calibrare (2) din figura 39B (domeniul de linearitate = 6 - 35 µM), s-au obţinut:

I’∆CL/ICL × 100 = 0,655 x concentraţia acidului uric (µM) + 37,5 (78) r2/n = 0,9851/6

La concentraţii mai mari de 50 µM curbele de calibrare se aplatizează

(figura 39A). Alura dreptelor obţinute la cele două valori ale raportului molar

Co(II)/EDTA este asemănătoare, semnale ceva mai mari înregistrându-se la raport 0,8. Din acest motiv, în continuare se vor prezenta numai drepte obţinute la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8. Se dă câte un exemplu de curbă de calibrare I’∆CL/ICL × 100 în funcţie de concentraţia (µM) acidului ascorbic dizolvat în apă (din figura 43), acidului cafeic dizolvat în acetonă : apă = 70% (v/v) (din figura 45), acidului galic dizolvat în etanol : EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v) (din figura 46) şi troloxului dizolvat în etanol : apă = 80% (v/v) (figura 47). Condiţiile experimentale în care au fost obţinute datele înregistrate sunt specificate în legendele figurilor., ale căror titluri sunt cele din teză.

Figura 43. Curbe de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia acidului ascorbic. A. Curbe de calibrare. B. Domeniu de liniaritate Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 µL. Flux transportor: soluţie de tampon borat 0,05 M, pH 9 (soluţie în apă). Proba de comparaţie: apa. Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite. Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare determinare. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezintă ± SD

M


19 20

Figura 45. Curbe de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia acidului cafeic obţinute la raport molar Co(II)/EDTA = 0,8. A. Curbe de calibrare. B. Domeniile de liniaritate aferente. cEDTA= 10-3 M; cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). , Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 µL. Probele de solvenţi au fost supuse ultrasonării (∼1 min.) înaintea determinărilor, pentru o mai bună omogenizare şi pentru îndepărtarea aerului. Flux transportor: soluţie de tampon borat 0,05M, pH 9 (soluţie în apă). Proba de comparaţie: soluţie de acetonă 70% (v/v). Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite. Este prezentat un spectru tipic. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezintă ± SD

Figura 46. Curbe de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia acidului galic. A. Curbe de calibrare. B. Domeniile de liniaritate aferente. Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 µL. Probele de solvenţi au fost supuse ultrasonării (∼1 min.) înaintea determinărilor, pentru îndepărtarea aerului. Flux transportor: soluţie de tampon borat 0,05M, pH 9, preparată în soluţie de etanol 7% (v/v). Proba de comparaţie: amestec de etanol: soluţie EDTA 2 x 10-4 M =7% (v/v). Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite. Este prezentat un spectru tipic. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezintă ± SD

Figura 47. Curba de calibrare (I`∆CL/ICL x 100) în funcţie de concentraţia Troloxului. În medalion este prezentat domeniu de liniaritate. Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 8 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 µL. Flux transportor: soluţie tampon borat 0,05M, pH 9, preparată în soluţie de etanol 7% (v/v). Proba de comparaţie: soluţie de etanol 7% (v/v). Determinarea a fost efectuată de două ori, în zile diferite. Este prezentată una dintre curbe. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4. Barele de eroare reprezintă ± SD

Ecuaţiile dreptelor de calibrare prezentate anterior sunt următoarele:

Pentru dreapta de calibrare prezentată în figura 43B (domeniu liniar = 6 - 30 µM) I’∆CL/ICL × 100 = 1,39 x concentraţia acidului ascorbic (µM) + 11,5 (89)

r2/n = 0,9866/5 Pentru dreapta de calibrare prezentată în figura 45B (domeniu liniar = 4 - 50 µM)

I’∆CL/ICL x 100 = 0,661 x concentraţia acidului cafeic (µM) + 10,5 (93) r2/n = 0,9988/6

Pentru dreapta de calibrare prezentată în figura 46B (domeniu liniar = 6 - 75 µM) I’∆CL/ICL x 100 = 0,580 x concentraţia acidului galic (µM) + 7,52 (96)

r2/n = 0,9963/5 Pentru dreapta de calibrare prezentată în figura 47 medalion (domeniu liniar = 6 - 200 µM, cu excepţia celor trei puncte marcate cu cerculeţe roşii)

I’∆CL/ICL × 100 = 0,269 x concentraţia Trolox (µM) + 4,84 (98) r2/n= 0,9931/6

Au fost calculate următoarele RSD pentru diferite valori ale concentraţiilor

AO studiaţi (indicate între paranteze) şi pentru 10 determinări/probă: 2,41% (cacid galic

= 35 µM); 2,98 % (cacid ascorbic = 20 µM) şi 1,0% (cacid uric = 8 µM).


21 22

5.4. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe reale etoda FIA-CL studiată a fost aplicată la determinarea TAC dintr-o multitudine de probe reale: vinuri, ceaiuri (infuzii), sucuri de fructe,

băuturi răcoritoare necarbonatate, extracte vegetale, suplimente alimentare (comprimate) şi produse cosmetice. De asemenea, s-a studiat variaţia TAC a unui extract de Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) la iradiere cu radiaţii γ. Datele experimentale au fost comparate cu date din literatură. Pentru o serie de determinări rezultatele obţinute prin metoda FIA-CL elaborată au fost comparate cu rezultatele obţinute la determinarea prin metode spectrofotometrice a conţinutului în fenoli totali (TP), flavonoide, antociani şi a activităţii antioxidante prin metoda DPPH.

5.4.1. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe de vin S-au analizat patru probe de vin produse în România, două roşii („Cabernet”

şi „Sânge de taur”) şi două albe (Fetească” şi „Sauvignon Blanc”). Valorile TAC determinate au fost cuprinse între 0,19 şi 0,55 g echivalenţi acid galic/L vin şi între 0,44 şi 1,78 g echivalenţi acid cafeic/L vin. Vinurile roşii au prezentat o TAC de cca. 2 ori mai mare decât cele albe. Datele sunt în concordanţă cu cele raportate de literatură [156, 165, 166, 458, 489, 490].

Pentru verificarea acurateţii rezultatelor, s-a aplicat metoda adiţiilor standard cu aducere la acelaşi volum. Pentru aceasta, la o probă de vin roşu „Cabernet” (diluată 1/200 cu soluţie apoasă de EDTA 2 x 10-4 M) s-au adăugat volume cunoscute dintr-o soluţie standard de acid galic 10-3 M (preparată în soluţie apoasă de EDTA 2 x 10-4 M). Concentraţiile de acid galic adăugate în probă au fost de: 0, 10, 20, 30, 40 şi 50 µmoli/L. Probele au fost analizate cu ajutorul metodei studiate. În figura 48 se prezintă rezultatele obţinute.

Figura 48. Rezultatele experimentale obţinute la aplicarea metodei adiţiilor standard. Determinările au fost efectuate în următoarele condiţii experimentale: raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M). Qtot. = 0,45 mL/min.; Vinj. = 70 µL. Flux transportor: tampon borat 0,05 M, pH 9 ( soluţie în apă). Proba de comparaţie: apa.

În proba de vin analizată s-a determinat o concentraţie care diferă de valoarea determinată prin metoda directă cu mai puţin de 3%. Aceasta dovedeşte că în cazul metodei studiate efectele de matrice sunt reduse. De altfel, literatura confirmă faptul că specii ne-fenolice precum glucoză, etanol, acid tartaric şi metabisulfitul de sodiu, împreună sau individual, dau semnale de CL foarte mici şi astfel nu interferă în determinările compuşilor fenolici [146].

5.4.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor ceaiuri S-a determinat TAC a cinci infuzii (1,5 g material vegetal în 100 mL apă distilată clocotită; timp de infuzie cca. 15 minute) din plante medicinale cumpărate din magazine locale. Valorile TAC s-au situat între 37,4 şi 238 mg echivalenţi acid galic/200 mL infuzie. Ceaiul verde şi cel negru au cele mai mari TAC (238, faţă de 129 mg echivalenţi acid galic/200 mL). Rezultatele obţinute sunt în concordanţă cu datele raportate în literatură [156, 489]. TAC a ceaiului negru este mai mică decât a ceaiului verde, deoarece în timpul oxidării mare parte din conţinutul în catechine al ceaiului verde este transformat în produşi de oxidare ca tearubine şi teaflavine, ceea ce duce la scăderea capacităţii antioxidante [489].

5.4.3. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor sucuri de fructe şi a unor băuturi necarbonatate

S-au analizat trei soiuri de măr, un soi de pară cu şi fără exocarp, precum şi banane, kiwi, portocale şi lămâi. Sucurile s-au obţinut cu ajutorul unui blender şi centrifugare. Acestea au fost analizate imediat. De asemenea, s-a determinat TAC a două probe de sucuri obţinute în mod similar din fructele speciilor Vaccinium

oxycoccos L. (merişoare) şi Hippophae rhamnoides L. (cătină). Fructele de pădure au fost păstrate congelate (- 18 °C). Sucurile de merişoare şi cătină au fost analizate imediat după obţinere şi după ce au stat 24 de ore la temperatura camerei, în vase bine închise. Valorile TAC ale sucurilor analizate imediat după obţinere au fost cuprinse între 4,23 şi 37,5 mg echivalenţi acid ascorbic/100 g fructe proaspete. Cea mai mare TAC au avut sucurile din merişoare (16,5 mg echivalenţi acid ascorbic/100 g) şi cătină (21 mg echivalenţi acid ascorbic/100 g), urmate de sucurile de citrice. Fructele prelucrate cu coajă au avut o TAC mai mare decât cele fără coajă, aspect semnalat şi de literatură [115]. TAC a sucurilor analizate după 24 ore a scăzut cu cca. 40%, ceea ce justifică alegerea modului de preparare a sucurilor şi este în conformitate cu datele din literatură [113, 115].

De asemenea, s-au determinat valorile TAC pentru şapte băuturi răcoritoare necarbonatate comercializate pe piaţa românească, şi anume: Nestea de Piersici, Lipton Ice Tea de Piersici, Prigat Nectar de Pere, Prigat Nectar de Piersici, Prigat de Kiwi, Granini de Banane, şi suc de mere Tymbark.

M


23 24

Valorile TAC ale băuturilor răcoritoare necarbonatate analizate au variat de la 5,46 la 66,9 mg echivalenţi acid ascorbic/100 mL suc şi între 3,20 şi 104 mg echivalenţi acid uric/100 mL suc. Dintre probele analizate, sucul de mere Tymbark a prezentat cea mai mare TAC. Rezultatele obţinute prin metoda dezvoltată sunt în concordanţă cu cele raportate în literatură [113, 399, 408, 412, 489].

Faţă de cantitatea de acid ascorbic declarată de unii producători, valorile determinate prin metoda FIA-CL dezvoltată au fost mai mari, pentru că în probele analizate sunt prezenţi şi alţi AO.

5.4.4. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din fructe de Rubus idaeus L. şi Vaccinium myrtillus L.

Au fost analizate şapte extracte obţinute în acetonă 70% (v/v) cu un blender şi centrifugare din fructe ale unor soiuri ameliorate aparţinând speciilor Rubus idaeus L. (zmeur, Rosaceae) şi Vaccinium myrtillus L. (afin, Ericaceae). Aceste fructe au fost furnizate de către Institutul de Cercetare – Dezvoltare pentru Pomicultură Piteşti – Mărăcineni. S-a determinat TAC atât pentru extractele proaspete, cât şi după 90 zile, timp în care soluţiile acetonice au fost păstrate în frigider (+ 4°C), în sticle brune, bine închise.

Valorile TAC determinate (mg echivalenţi acid cafeic/100 g fruct) s-au situat între 135 şi 192 pentru zmeură şi între 146 şi 223 pentru afine. Aceste date sunt în concordanţă cu cele din literatură [193-196]. Totodată, TAC a scăzut cu ∼50% faţă de valoarea iniţială (excepţie făcând o singură probă), după trei luni de păstrare în frigider. Această comportare este semnalată şi de literatură [265, 266].

5.4.5. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din plante 5.4.5.1. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte din plante

aparţinând familiei Lamiaceae, obţinute prin macerare S-au analizat 10 extracte din plante din familia Lamiaceaae: Satureja

hortensis L., (cimbru) Leonorus cardiaca L. (talpa-gâştei), Lavandula officinalis Chaix et Vill (levănţică), Ocinum basilicum L. (busuioc), Mentha langifolia L. (mentă), Melissa

officinalis L. (roiniţă), Hyssopus officinalis L. (isop), Thymus serpyllum L. (cimbrişor), Origanum majorana L. (măghiran), Origanum vulgare L. (oregan) obţinute prin macerare (raport material vegetal: solvent de extracţie = 1: 10, m/v; 5 zile) în etanol 96% (probe realizate de un colectiv al INCDIE ICPE SA, Bucureşti). Acestea au fost apoi redizolvate 1:1 (m/v) în etanol: apă = 80% (v/v) şi s-au analizat. TAC a extractelor vegetale analizate s-a situat între 0,90 şi 125 echivalenţi mg acid cafeic/g extract.

Dintre probele analizate, extractele de oregan şi măghiran au cele mai mari valori ale TAC. Cimbrişorul a avut o valoare TAC mult mai mare decât cimbrul (53,4 faţă de 0,90 mg acid cafeic/g). Valorile TAC obţinute prin FIA-CL dezvoltată au fost comparate cu date din literatură [499-505].

5.4.5.2. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor extracte de Rosmarinus officinalis L. iradiate cu radiaţii γγγγ

S-a studiat variaţia TAC cu creşterea dozei de iradiere a unui extract de R. officinalis L. (rozmarin, Lamiaceae). Extractul uscat, obţinut prin extracţie continuă cu Soxhlet în etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracţie = 1: 10, m/v; 10 ore), a fost iradiat cu doze cuprinse între 2,5 şi 320 kGy (probe realizate de un colectiv al INCDIE ICPE SA, Bucureşti) [12]. S-au analizat extractul neiradiat şi cele iradiate, dizolvate (10 mg/10 mL) în acetonă : EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v) şi etanol : EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v). Soluţiile extractului neiradiat au fost diluate 1:30 înaintea analizelor. În aceleaşi condiţii, soluţiile acetonice s-au diluat 1:40. iar soluţiile etanolice 1:20. S-a lucrat în aceleaşi condiţii experimentale în ambele situaţii experimentale, cu două excepţii: fluxul transportor de tampon borat 0,05M, pH 9 (care a fost preparat în apă pentru analiza soluţiilor acetonice, respectiv în etanol 7%, v/v pentru analiza soluţiilor etanolice) şi proba de comparaţie (apă pentru analiza soluţiilor acetonice şi etanol: EDTA 2 x 10-4 M =7%, v/v pentru analiza soluţiilor etanolice). Nu s-au constatat variaţii semnificative ale valorilor TAC determinate în cele două situaţii experimentale. În figura 50 se prezintă TAC determinată prin FIA-CL a probelor preparate în acetonă: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v).

Figura 50. Capacitatea antioxidantă totală (TAC) depinde de doza de iradiere cu radiaţii γ a extractului de rozmarin. Raport molar Co(II)/EDTA = 0,8 (cEDTA= 10-3 M); cluminol = 2,3 × 10-4 M; cH2O2 = 6 x 10-4 M (soluţie în EDTA 2 x 10-4 M); Vinj. = 70 µL; Qtot =

0,45 mL/min. Probele, preparate în amestec acetonă: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v) au fost supuse ultrasonării (∼30 s) înaintea determinărilor, pentru îndepărtarea aerului conţinut. Flux transportor: tampon borat 0,05M, pH 9, preparat în apă. Proba de comparaţie: apa. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 5.2.4.

După cum se poate vedea în figura 50, cu creşterea dozei de iradiere valorile TAC au crescut, apoi au scăzut, astfel încât extractul iradiat la 40 kGy a prezentat aproximativ aceeaşi TAC cu a extractului neiradiat.


25 26

Creşterea TAC din extractul de rozmarin iradiat cu doze ≤ 5 kGy ar putea fi consecinţa unor scindări ale unor structuri chimice, cu apariţia unor intermediari activi, care contribuie la îmbunătăţirea capacităţii protectoare în raport cu extractul neiradiat [12]. Se pare că în timpul iradierii, în matricea vegetală au loc reacţii în cascadă, în urma cărora se formează intermediari precum carnosolul, cu activitate antioxidantă (figura 51). Carnosolul poate bloca RL, trecând în rosmanol [12] care, la rândul său, poate reacţiona cu un alt RL, continuând lanţul de reacţii. Prezenţa unor astfel de compuşi în extractele de rozmarin ar putea explica intensificarea activităţii antioxidante a extractului de rozmarin, care a fost observată după expunerea la radiaţii γ mai mici de 40 kGy.

Figura 51. Mecanismul oxidării în cascadă a acidului carnosinic [12]

5.4.5.3. Determinarea capacităţii antioxidante totale şi a conţinutului în polifenoli a unor extracte vegetale obţinute prin extracţie continuă

şi extracţie cu ultrasunete S-au analizat şase extracte din plante aromate şi medicinale aparţinând familiei Apiaceae (Anethum graveolens L. mărar; Levisticum officinale L. Koch., leuştean; Petroselinum sativum Hoffm., pătrunjel), Lamiaceae (R. officinalis L., rozmarin; Salvia officinalis L., salvie) şi Theaceae (Camellia sinensis (L.) Kuntze, ceai verde).

Extractele au fost obţinute în etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracţie = 1: 10, m/v) prin extracţie continuă (6 ore) cu extractorul de tip Soxhlet şi

UAE (60 minute) (probe obţinute de către un colectiv de cercetători de la Institutul de Chimie Organică „C.D. Neniţescu”, Bucureşti) [161]. Pentru determinarea TAC, extractele au fost apoi redizolvate (10 mg/10 mL) în acetonă: EDTA 2 × 10-4 M = 70% (v/v).

Valorile TAC ale extractelor vegetale studiate au variat între 28,6 şi 7049 mg echivalenţi acid galic/100 g dw şi între 63,4 şi 6061 mg echivalenţi acid cafeic/100 g dw. TAC determinată pentru extractele obţinute prin extracţie continuă au fost mai mari decât cele obţinute prin extracţie cu ultrasunete, cu excepţia extractului de A. graveolens. În general, extractele de C. sinensis, R. officinalis şi S.

officinalis au avut o TAC mai mare decât P. sativum, A. graveolens şi L. officinale. Extractele au fost analizate şi prin metode spectrofotometrice convenţionale

[161], determinându-se: - conţinutul în TP, care a variat de la 60,0 la 3455 mg echivalenţi acid

galic/100 g dw, de la 21,0 la 2739 mg echivalenţi acid cafeic/100 g dw şi de la 103 la 4581 mg echivalenţi acid ferulic/100 g dw.

- conţinutul în flavonoide, care s-a situat între 56,3 şi 345 mg echivalenţi quercetol /100 g dw. Rezultatele acestui studiu sunt în concordanţă cu datele de literatură în ceea

ce priveşte conţinutul în TP şi flavonoide pentru câteva extracte de plante [184, 504, 515-517, 457]. S-a efectuat o corelaţie între valorile TAC determinate prin metoda FIA-CL elaborată şi cele ale conţinutului în TP determinate prin metoda convenţională Folin-Ciocâlteu pentru toate cele şase probe analizate. Cele mai bune corelaţii s-au obţinut pentru extractele obţinute prin metoda cu extractorul Soxhlet când cei doi parametrii urrmăriţi au fost exprimaţi în echivalenţi acid galic (r2 = 0,9821) şi pentru extractele obţinte prin UAE când TAC şi TP au fost raportaţi în echivalenţi acid cafeic (r2 = 0,9648) [161].

5.4.5.4. Determinarea capacităţii antioxidante şi a conţinutului în polifenoli a unor legume

Au fost analizate extracte din Brassica oleracea L. var. capitata f. rubra (Brassicaceae, varza roşie), Allium cepa L. (Alliaceae, ceapa roşie sau purpurie) şi Beta vulgaris L. (Chenopodiaceae, sfecla roşie), obţinute prin extracţie continuă, cu extractorul de tip Soxhlet şi UAE. S-a lucrat cu materiale vegetale în stare proaspătă. S-a folosit etanol 96% (raport material vegetal: solvent de extracţie = 1: 10, m/v; 2 ore) [207]. Extractele au fost obţinute de un colectiv de cercetători de la Institutul de Chimie Organică „C.D. Neniţescu”, Bucureşti [207]. Pentru determinarea TAC, extractele obţinute au fost redizolvate (100 mg/10 mL) în etanol: EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v).


27 28

Valorile TAC ale extractelor vegetale obţinute prin metoda continuă cu extractorul Soxhlet variază între 37,5 şi 379 mg echivalenţi acid galic /100 g plantă proaspătă, iar pentru extractele obţinute prin UAE între 35,5 şi 586 mg/100 g.

Extractele au fost analizate şi prin metode spectrofotometrice [207], determinându-se:

- capacitatea antioxidantă prin metoda DPPH. Evaluarea activităţii antioxidante a celor trei extracte analizate s-a realizat în termeni de „scădere” a absorbanţei DPPH (%), comparativ cu rutinolul şi cianidolul, ca standarde. Extractele analizate reduc absorbanţa DPPH cu 24,4 – 77,4%. Cea mai mare activitate antioxidantă a fost determinată în extractul de varză roşie (77,4% pentru o concentraţie de 0,1 mg/mL) obţinut prin tratare cu ultrasunete, comparativ cu rutinolul (88,7%, concentraţia standardului fiind de 0,1 mg/mL). Comparând activitatea de „îndepărtare” a radicalului de către extracte cu activitatea cianidolului (63%) în concentraţie de 0,1 mg/mL, se poate concluziona că nu numai antocianii sunt responsabili pentru activitatea antioxidantă a extractelor, ci şi alţi polifenoli contribuie la aceasta. Valorile activităţii antioxidante determinate cu metoda DPPH variază în aceeaşi ordine cu valorile TAC determinate prin noua metodă FIA-CL.

- conţinutul în TP. Pentru extractele obţinute cu extractorul de tip Soxhlet conţinutul în TP a variat de la 61,3 la 411 mg echivalenţi acid galic/100 g plantă proaspătă, iar cel al extractelor obţinute prin UAE între 76,9 şi 521 mg echivalenţi acid galic/100 g. Conţinutul în TP al extractelor analizate sunt în concordanţă cu valorile TAC determinate prin FIA-CL, ceea ce demonstrează contribuţia polifenolilor la TAC a plantelor şi care, totodată, demonstrează faptul că FIA-CL este o metodă eficientă pentru determinarea TAC a unor probe reale.

- conţinutul în flavonoide, care s-a situat între 13,4 şi 108 mg echivalenţi rutinol/100 g plantă proaspătă pentru extractele obţinute prin extracţie continuă şi între 7,32 şi 79,4 mg echivalenţi rutinol/100 g pentru extractele obţinute prin UAE.

- conţinutul în antociani, care a variat între 8,05 şi 164 mg echivalenţi cianidol/100 g plantă proaspătă la extractele obţinute cu extractorul Soxhlet şi între 7,29 şi 55,4 mg echivalenţi rutinol/100 g pentru celălat tip de extracte. S-a constatat că extractele de varză roşie sunt bogate în flavonoide şi

antociani. Extractele de sfeclă roşie s-au caracterizat prin valori mici ale cantităţilor de polifenoli şi TAC.

Rezultatele prezentate sunt în concordanţă cu datele din literatură [312, 502, 518, 520 - 522].

5.4.6. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor probe de comprimate de Spirulină 500 mg supliment alimentar

Prin metoda FIA-CL dezvoltată s-a determinat TAC a trei probe de comprimate de Spirulină 500 mg supliment alimentar de la producători diferiţi (Ozone, Walmark şi Hofigal), care au fost centrifugate (0,5 g/14 mL) în soluţii etanolice de concentraţii diferite: 7% (v/v), respectiv 80% (v/v). În cazul probelor preparate în etanol 80% (v/v) valorile TAC au fost de cca. două ori mai mari decât în cazul probelor pentru care s-a folosit etanol 7% (v/v), ceea ce confirmă capacitatea de extracţie mult mai mare a etanolului 80% (v/v). Dintre probele analizate s-a evidenţiat, cu o valoare superioară a TAC, produsul comercializat de Hofigal.

5.4.7. Determinarea capacităţii antioxidante totale a unor produse cosmetice S-au analizat două probe de creme şi una de gel de la doi producători diferiţi:

„Hofigal Activ. Cremă pentru prevenirea şi atenuarea ridurilor” (producător Hofigal); „Cremă pentru mâini” (producător Cosmetic plant) cu extract de gălbenele, vitamina A şi F şi respectiv „Plant Intim gel” (producător Hofigal). Cele trei produse cosmetice au fost supuse extracţiei discontinue cu etanol: EDTA 2 x 10-4 M = 80% (v/v) şi acetonă: EDTA 2 x 10-4 M = 70% (v/v). După centrifugarea extractelor obţinute (3 000 rpm, 7 min.) supernatantele au fost filtrate, ţinute la frigider (+ 4°C) peste noapte, a II-a zi din nou filtrate şi diluate (cu excepţia probei notate P3) 1:10 (v/v) înaintea determinărilor. Valorile TAC au variat între 7,53 şi 405 echivalenţi mg acid galic/100 g produs atunci când solventul folosit la extracţia principiilor active a fost acetona 70% (v/v). Când solventul de extracţie a fost etanolul 80% (v/v), valorile TAC au fost mai mici, situându-se între 24 şi 72,6 echivalenţi mg acid galic/100 g. Produsele Hofigal analizate au avut valori TAC mai mari atunci când extracţiile au fost făcute în acetonă, pentru că o mai mare parte din AO din produsele cosmetice analizate se dizolvă mai bine în acest solvent.


29 30

6. DETERMI�AREA I�TRACELULARĂ A VARIAŢIILOR CO�CE�TRAŢIILOR IO�ILOR DE CA2+ CITOSOLIC Î�

CO�DIŢII DE STRES OXIDATIV -au folosit celule de Saccharomyces cerevisiae cu diferite mutaţii implicate în transportul şi homeostazia calciului. În celulele acestei drojdii se regăsesc

o serie de procese metabolice conservate. Calciul reprezintă unul din mesagerii secundari cu rol major în declanşarea răspunsului celulelor eucariote la diferiţi factori de stres (prin diverse mecanisme de semnalizare mediată de Ca2+) ca de exemplu: stres hiper- şi hipotonic şi stres generat de temperaturi joase [548, 549], stres hiperosmotic şi stresul salin [550], generarea intracelulară de H2O2 de către β-feniletilamină [551], stres alcalin [552].

Scopul acestui studiu a fost acela de a demonstra că ionii de Ca2+ sunt implicaţi în răspunsul celulelor la stresul oxidativ, aspect nesemnalat de literatură.

Determinarea semnalului mediat de Ca2+ este dificilă, deoarece acest semnal se transmite datorită unor modificări bruşte (creşteri) şi de scurtă durată (ms) a [Ca2+]cit. Pentru a evalua influxul de calciu s-a aplicat tehnologia aequorinei recombinante („recombinant aequorin technology”) cu detecţie bioluminescentă [531]. Este o metodă non-invazivă, care permite măsurarea şi compararea fluctuaţiilor de calciu simultan în diferite organite sau compartimente şi, prin urmare, evaluarea contribuţiei lor relative la răspunsul obţinut la stimul [531, 569].

6.4.1. Aequorina, proteină bioluminescentă Aequorina este o proteină Ca2+-dependentă, alcătuită din apoaequorină

(având un singur lanţ polipeptidic, M = 21 kDa) şi cofactorul coelenterazină (M = 400 Da). Substratul oxigen-preactivat, 2-hidroperoxicoelenterazina este legat ferm dar nu covalent, de apoproteină [569, 573-575].

6.5. Determinarea răspunsului mediat de ionii de Ca2+ la condiţii de stres oxidativ printr-o metodă bazată pe bioluminescenţă 6.5.2. Mecanismul emisiei luminii de către aequorină

Coelenterazina este o moleculă hidrofobă. Ea pătrunde în celulă şi, în prezenţa oxigenului molecular şi a ionilor de Ca2+, cele două componente structurale ale aequorinei reconstituie spontan proteina funcţională, capabilă să emită lumină în prezenţa calciului [569]. Când cele trei situsuri de legare a Ca2+ sunt ocupate cu aceşti ioni, aequorina suferă o modificare structurală, se comportă ca o oxigenază care transformă coelenterazina într-o formă excitată, coelenteramida şi se eliberează CO2. Coelenteramida se relaxează la starea fundamentală şi emite lumină albastră (λ = 469 nm). În figura 56 este prezentat mecanismul de acţiune al aequorinei, implicând emiterea luminii [531, 568, 573].

Figura 56. Mecanismul emisiei luminii de către aequorină (după [531]) Prin măsurarea radiaţiei luminoase astfel emise se pot evidenţia variaţiile [Ca2+]cit.

6.5.4.2. Monitorizarea in vivo a pulsurilor ionilor de Ca2+ induse de stresul oxidativ

Monitorizarea calciului citosolic a fost efectuată prin utilizarea sistemului de expresie ADNc pentru apoaequorină [586]. Celulele de drojdie au fost transformate cu plasmidul pYX212-cytAEQ [571]. Acest plasmid conţine în structura sa o secvenţă ADN care codifică apoaequorina şi permite exprimarea exclusiv citosolică a genei aequorinei în celule de S. cerevisiae. Transformarea drojdiei a fost realizată utilizând metoda cu acetat litiu modificată [588].

S-a monitorizat variaţia [Ca2+]cit ca răspuns la stresul oxidativ indus de H2O2 şi de hidroxidul de terţ-butil (tBOOH). Pentru aceasta, s-a urmărit emisia luminii cu un luminometru. S-a înregistrat intensitatea bioluminescenţei (1 citire/s), care a fost raportată în unităţi relative de luminescenţă (RLU). S-a reprezentat grafic variaţia intensităţii bioluminescenţei (RLU) pe 107 celule în timp (s), dar şi răspunsul relativ maxim în funcţie de concentraţia unui oxidant. Răspunsul relativ maxim reprezintă raportul dintre intensitatea luminescenţei înregistrată în prezenţa unui stimul la fiecare secundă şi media intensităţii luminescenţei pentru suspensia celulară (celule neexcitate) monitorizată timp de 1 minut (sau de câte ori a crescut semnalul în prezenţa unui stimul/stresor faţă de linia de bază).

6.6.1. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la H2O2 În figura 59A se prezintă variaţiile intensităţii de luminescenţă înregistrate

pentru celulele liniei parentale („wild-type”, WT) supuse stresului oxidativ indus de H2O2 în concentraţii de 0,5 – 10 mM. Se observă că H2O2 a iniţiat creşteri imediate şi picuri luminescente de scurtă durată, indicând creşteri bruşte de Ca2+ citosolic. Pulsurile de calciu au putut fi înregistrate pentru concentraţii scăzute, de până la 0,5 mM. O creştere abruptă urmată de o scădere rapidă a luminescenţei cauzate de [Ca2+]cit au putut fi observate pentru concentraţii ≥ 2 mM.

S


31 32

Figura 59. Răspunsul celulelor la diferite concentraţii de H2O2. A. Efectul H2O2 asupra intensităţii lumiscenţei celulelor. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 6.5.4. Săgeata indică momentul adăugării H2O2. B. Răspunsul relativ maxim al celulelor supuse şocurilor oxidative cu H2O2. Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite; nu s-au înregistrat variaţii semnificative (P < 0,05). RLU: unităţi relative de luminescenţă.

În figura 59B se prezintă răspunsul relativ maxim al celulelor supuse şocurilor oxidative prin adăugarea în mediul de cultură a H2O2 în concentraţii cuprinse între 0,5 şi 10 mM. Se constată că pentru celulele WT transformate cu plasmidul pYX212-cytAEQ amplitudinea pulsului creşte odată cu creşterea concentraţiei de H2O2. În aceleaşi condiţii, tratamentul cu H2O2 al celulelor transformate cu vectorul nul pYX212 (de control) nu prezintă răspuns luminescent.

6.6.2. Mobilizarea ionilor de Ca2+ sub acţiunea stresului oxidativ indus de H2O2 În figura 60 se prezintă efectul expunerii la H2O2 a liniei parentale şi a liniilor nul mutante cch1∆, mid1∆ şi yvc1∆, în absenţa şi în prezenţa agentului de complexare (1,2-bis(o-aminofenoxi)etan- N,N,N',N'-tetraacetic acid) (BAPTA).

În absenţa BAPTA, expunerea celulelor liniei sălbatice la H2O2 (concentraţie finală 2 mM, subletală) a dus la obţinerea unor picuri de luminescenţă caracterizate de creştere bruscă şi de scurtă durată. Creşterea intensităţii luminoase este cauzată de creşterea concentraţiei de Ca2+ din citosol (figura 60A). După expunerea la H2O2, comportamentul celulelor liniilor nul mutante cch1∆ şi mid1∆

(cărora le lipsesc genele care codifică componentele canalului de calciu Cch1p/Mid1p din membrana plasmatică) este diferit. Astfel, comparativ cu semnalul dat de celulele liniei WT semnalul corespunzător fluxului de ioni de Ca2+ a scăzut aproape la jumătate în celulele cch1∆ (figura 60B), în timp ce creşterea [Ca2+]cit pentru linia mutantă mid1∆ este mai mare (figura 61C). Aceasta sugerează că Cch1p este parţial responsabil pentru influxul de Ca2+ la aplicarea stresului oxidativ indus de H2O2, acționând probabil independent de Mid1p.

Figura 60. Expunerea la H2O2 a liniilor celulare testate, în absenţa şi în prezenţa agentului de complexare BAPTA. Tulpinile izogene exprimând coelentarazina reconstituită cytAEQ au fost expuse şocului oxidativ indus de H2O2 (concentraţie finală 2 mM). BAPTA (concentraţie finală 5 mM)a fost adăugat cu 1 minut înaintea introducerii H2O2. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 6.5.4. Săgeţile indică momentul adăugării H2O2. Fiecare determinare a fost repetată de cel puţin trei ori în zile diferite, nu s-au înregistrat variaţii semnificative (P <0,05). Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare tulpină testată: (A). WT; (B). Nul mutantă cch1∆; (C) Nul mutantă mid1∆; (D) WT pretratată cu BAPTA; (E). Nul mutantă cch1∆ pretratată cu BAPTA; (F). Nul mutant mid1∆ pretratată cu BAPTA; (G). Nul mutantă yvc1∆; (H). Nul mutant yvc1∆ pretratată cu BAPTA. RLU: unităţi relative de luminescenţă.

Creşterea concentraţiei ionilor de Ca2+ citosolic, ca rezultat la expunerea celulelor la H2O2, a fost atenuată de prezenţa chelatorului ionilor de Ca2+ BAPTA, sugerând astfel că fluxul de Ca2+ provine parţial din exteriorul celulelor.

Se observă că tratamentul cu BAPTA asupra ambelor linii celulare cch1∆ (figura 60E) şi mid1∆ (figura 60F) au atenuat influxul de ioni de Ca2+ la nivele comparabile cu cele detectate în cazul celulelor liniei sălbatice tratate cu BAPTA (figura 60D), indicând astfel că sub influenţa stresului oxidativ indus de H2O2,


33 34

calciul extracelular poate pătrunde în citosol prin intermediul unui transportor care este diferit de canalul Cch1p/Mid1p. Adăugarea de BAPTA nu a suprimat complet creşterea semnalului analitic, sugerând că, după expunerea la H2O2, resursele interne sunt de asemenea mobilizate. Plecând de la această observaţie, a fost monitorizat fluxul de ioni de Ca2+ indus de H2O2 şi în celule cărora le lipseşte Yvc1p, canalul membranar vacuolar responsabil pentru eliberarea Ca2+ din vacuole în citosol. Din figura 60G se observă că amplitudinea pulsului de Ca2+ înregistrat în absenţa complexantului BAPTA este mult mai mică decât a picului celulelor WT. Acest pic rezidual a fost practic eliminat prin adăugare de BAPTA (figura 60H) sugerând că pulsul de calciu de intensitate mică observată în celulele de yvc1∆ a fost rezultatul influxului de Ca2+ din exteriorul celulei.

Având în vedere aceste aspecte şi faptul că semnalul de luminescenţă al celulelor liniei sălbatice a scăzut cu cca. 50% în prezenţă de BAPTA (figura 60 A şi D) se poate concluziona că ionii de Ca2+ pot proveni din exteriorul celulei dar şi prin eliberarea din vacuolă de către Yvc1p [295], printr-un feedback pozitiv [563, 564].

6.6.3 Adaptarea celulelor la stresul oxidativ A fost investigată dezvoltarea celulelor în medii suplimentate cu stresori oxidativi pe linii celulare mutante care au prezentat diferite nivele tranzitorii ale Ca2+ citosolic.

S-a observat că în cazul liniilor celulare cch1∆ şi yvc1∆, toleranţa la H2O2 şi tBOOH a fost mai ridicată decât în cazul celulelor liniei sălbatice, deci nivelul mai scăzut al creşterii Ca2+ citosolic în timpul stresului oxidativ poate fi un efect de protecţie a creşterii celulare. Linia celulară mid1∆ a prezentat cea mai mare şi bruscă eliberare a ionilor de Ca2+ în prezenţa stresorilor. Explicaţia constă în aceea că această linie celulară a fost puţin mai sensibilă faţă de linia sălbatică şi considerabil mai sensibilă decât liniile celulare cch1∆ şi yvc1∆ la stresul oxidativ.

Suplimentarea mediului cu chelatorul de Ca2+ glicol-bis(2-aminoetileter)-2,2,2′,2′-tetraacetic acid (EGTA) a crescut toleranţa celulelor la oxidanţi. Suplimentarea mediului cu Ca2+ a dus la creşterea sensibilităţii faţă de H2O2.

S-a constatat că celulele yvc1∆, au fost cele mai tolerante la H2O2. Aceste observaţii sugerează faptul că şansele de supravieţuire a celulelor

sunt mai mari dacă [Ca2+]cit în timpul şocurilor oxidative sunt mici [295]. 6.6.4. Mobilizarea ionilor de Ca2+ în celule expuse la concentraţii letale

de H2O2 Pentru a determina dacă celulele se comportă diferit atunci când sunt supuse

stresului oxidativ mai intens, celulele liniilor parentală şi yvc1∆ au fost expuse la concentraţii letale de H2O2 (10 mM), în prezenţa şi absenţa complexantului BAPTA. În ambele situaţii experimentale semnalele înregistrate pentru celulele WT au

prezentat aproximativ aceeaşi amplitudine, indicând faptul că în condiţii de stres oxidativ letal, celulele se bazează în principal pe depozitele de Ca2+ intracelular.

Celulele yvc1∆ au prezentat o slabă luminescenţă mediată de Ca2+ sugerând faptul că atunci când celulele se confruntă cu concentraţii letale, de H2O2 celulele utilizează vacuolele ca principală sursă pentru ca ionii de Ca2+ să fie direcţionaţi în citosol [295].

6.6.5. Răspunsul mediat de ionii de Ca2+ al celulelor expuse la alchil-hidroperoxizi

S-a monitorizat răspunsul mediat de ionii de Ca2+ dat de celulele aceloraşi linii (WT şi nul mutante cch1∆, mid1∆ şi cch1∆) la stresul oxidativ indus de tBOOH. Experimentele au fost asemănătoare celor descrise la studierea comportamentului celulelor la expunerea la H2O2, iar rezultatele similare. Totuşi, în cazul expunerii liniilor celulare testate la şocul oxidativ indus de tBOOH, contribuţia vacuolară pare mai scăzută. De asemenea, gradul de mobilizare a calciului vacuolar nu este dependent de concentraţia de tBOOH, spre deosebire de situaţia întâlnită la determinările [Ca2+] în condiţiile stresului oxidativ indus de H2O2 [295].

6.7. Influenţa unor antioxidanţi şi a unor extracte vegetale asupra răspunsului mediat de ionii de Ca2+ în condiţii de stres oxidativ

-a studiat influenţa vitaminei C şi a unui extract alcoolic din sâmburi de struguri albi caracterizat printr-un conţinutul în TP de 29 mg echivalenţi

acid galic/100 g material vegetal uscat şi o cantitate de flavonoide de 13 mg echivalenţi quercetol/100 g). asupra răspunsului mediat de Ca2+ al celulelor liniei parentale supuse stresului oxidativ indus de H2O2. Măsura în care prezenţa AO are sau nu rol protector împrotriva stresului oxidativ indus de H2O2 a fost determinată prin înregistrarea semnalului luminescent mediat de ionii de Ca2+ şi compararea cu semnalul înregistrat în absenţa sa.

6.7.1. Influenţa vitaminei C asupra răspunsului mediat de ionii de Ca2+

în condiţii de stres oxidativ Celulele WT au fost supuse stresului oxidativ indus de concentraţii de H2O2 subletale (2 mM), respectiv letale (10 mM). Peste suspensiile celulare s-a adăugat apoi vitamina C (5 mM, concentraţie finală). Rezultatele sunt prezentate în figura 67.

S


35 36

Figura 67. Efectul vitaminei C asupra răspunsului mediat de ionii de Ca2+ dat de celulele supuse stresului oxidativ indus de H2O2. Concentraţia finală a vitaminei C, adăugată direct în tubul luminometrului, a fost aceeaşi în ambele experimente (5 mM). Este prezentat un spectru pentru fiecare concentraţie de H2O2: (A). 2 mM; (B). 10 mM. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 6.5.4. Săgeţile indică momentul adăugării H2O2 şi a vitaminei C.

În prezenţa H2O2 s-a înregistrat o creştere bruscă şi de scurtă durată a intensităţii luminescenţei (indicând creşteri bruşte ale [Ca2+]cit), urmată de o scădere rapidă a luminescenţei (figura 67A). La adăugarea vitaminei C, s-a înregistrat o scădere bruscă a semnalului de luminescenţă (de cca. 2,5 ori) (figura 67A). În condiţiile expunerii celulelor la şoc oxidativ (figura 67B), scăderea amplitudinii picului a fost nesemnificativă, ceea ce sugerează că efectul protector al vitaminei C este limitat de concentraţia oxidantului.

Pentru a vedea dacă vitamina C are, într-adevăr, efect protector asupra celulelor supuse stresului oxidativ, sau scăderea semnalului înregistrat este o posibilă consecinţă a reacţiei dintre acidul ascorbic şi H2O2, în următoarele experimente celulele liniei parentale s-au tratat cu vitamina C imediat înainte de introducerea stresorului sau s-au pre-incubat 2, respectiv 5 ore cu vitamină C. Apoi celulele au fost expuse la H2O2 şi s-a determinat luminescenţa (figura 68).

După cum se observă din figura 68A adăugarea vitaminei C (2 mM, concentraţie finală) peste suspensia cu celule de tip WT a dus la o scădere bruscă a semnalului de bioluminescenţă cu cca. 70% faţă de semnalul dat de celulele netratate. Mărirea concentraţiei AO la 5 mM (concentraţie finală) a avut drept consecinţă accentuarea pantei descendente a semnalului înregistrat, ceea ce confirmă faptul că prezenţa vitaminei C modifică răspunsul celulelor mediat de Ca2+.

Introducând direct în cuva luminometrului un volum de H2O2 corespunzător unei concentraţii finale de 2 mM (subletală), semnalul a crescut, dar maximul picului a atins puţin mai mult de 1/3 din înălţimea picului înregistrat în situaţia inversă, când s-a adăugat mai întâi stresorul şi apoi vitamina C. Aceeaşi tendinţă s-a înregistrat şi în cazul introducerii oxidantului în concentraţie finală de 5 mM (datele nu sunt prezentate).

Figura 68. Evidenţierea efectului protector al vitaminei C. A. Vitamina C a fost adăugată direct în tubul luminometrului (sunt indicate concentraţiile finale ale acesteia); B. suspensia de celule de tip sălbatic WT a fost incubată 2 ore cu 20 mM vitamină C; C. suspensia de celule de tip sălbatic WT a fost incubată5 ore cu 20 mM vitamină C. H2O2 a fost adăugată direct în tubul luminometrului în concentraţiile finale indicate. Fiecare determinare a fost repetată de trei ori în zile diferite, nu s-au înregistrat variaţii semnificative (P <0,05). Este prezentat un spectru tipic pentru fiecare tip de experiment. S-a lucrat conform modului de lucru descris în capitolul 6.5.4. Săgeţile indică momentul adăugării H2O2 şi a vitaminei C.

Din figura 68B se constată că în cazul pre-incubării celulelor cu AO, semnalele înregistrate s-au diminuat semnificativ faţă de amplitudinea semnalului obţinut în absenţa vitaminei C (figura 67A, primul pic). Mărirea timpului de pre-incubare la 5 ore (figura 68C) nu a condus la modificări semnificative ale rezultatelor experimentale. Totuşi, în acest caz (incubare 5 ore) s-a înregistrat o uşoară creştere a valorii semnalului faţă de semnalul prezentat în figura 68B (timp de incubare 2 ore). Acest aspect poate fi explicat prin aceea că vitamina C e sensibilă la temperatură şi mai puţin stabilă în timp.

Valoarea semnalului de luminescenţă a scăzut în prezenţa vitaminei C sub 10 000 RLU, indiferent dacă celulele liniei sălbatice testate au fost pre-incubate cu vitamina C sau dacă aceasta s-a introdus direct în tubul luminometrului. Aceste rezultate conduc la ideea că este posibil ca vitamina C să ofere protecţie celulelor împotriva stresului oxidativ indus de H2O2. Rezultate similare s-au obţinut şi când s-a testat efectul protector al extractului vegetal.

Concluzii generale Concluzii generale

37 38

CO�CLUZII GE�ERALE S-au realizat două montaje şi s-au elaborat noi metode FIA-CL pentru determinarea unor antioxidanţi şi a capacităţii antioxidante totale a unor probe reale (extracte vegetale, vinuri, băuturi răcoritoare necarbonatate etc.).

Rezultate reproductibile s-au obţinut cu montajul FIA-CL cu 3 canale, prin care au fost pompate: un flux transportor de borat de sodiu, un flux de H2O2 şi un flux de luminol/Co(II)/EDTA. S-a utilizat o celulă în flux confecţionată în laborator. S-a îmbunătăţit programul de achiziţie şi prelucrare a datelor.

S-au studiat şi optimizat parametrii operaţionali ai metodei. S-a studiat influenţa acetonei, etanolului şi metanolului asupra semnalului

de CL. S-a realizat o diminuare semnificativă a semnalului dat de etanolul conţinut în probele de analizat prin pomparea unui flux transportor de borat de sodiu preparat în etanol: apă = 7% (v/v). Pentru a înlătura posibilitatea interferenţelor unor urme de ioni metalici, care ar putea acţiona ca şi catalizatori competitivi faţă de Co(II), soluţiile etanolice, acetonice şi de H2O2 s-au preparat în EDTA 2 x 10-4 M.

S-au trasat mai multe tipuri de curbe de calibrare, reprezentând I`∆CL, I∆CL / ICL, ICL / (ICL - I∆CL) şi I`∆CL / ICL x 100 în funcţie de concentraţia AO (µM) sau I`∆CL / ICL x 100 în funcţie de concentraţia AO la scală logaritmică. Valoarea ICL corespunde semnalului de fond. Valoarea I`∆CL corespunde scăderii semnalului ICL în prezenţa unei probe de AO (I∆CL), din care s-a scăzut semnalul probei de comparaţie. S-au ales curbele de calibrare I’∆CL/ICL × 100 în funcţie de concentraţia antioxidantului (µM), pentru că acestea oglindesc cel mai bine complexitatea determinărilor analitice.

S-au studiat cinci antioxidanţi în stare pură, în domeniile de concentraţii indicate în paranteză: acid uric (0,1 – 100 µM), acid L- ascorbic (0,8 – 300 µM), acid cafeic (1 – 1000 µM), acid galic (2,5 – 300 µM) şi Trolox (2,5 – 500 µM). Domeniile de liniaritate au variat în funcţie de condiţiile de lucru. De exemplu, la raportul molar optim Co(II)/EDTA = 0,8, domeniile liniare au fost: 6 – 40 µM (pentru acidul uric); 6 – 30 µM (pentru acidul ascorbic); 2,5 – 50 µM (pentru acidul cafeic); 4 – 100 µM (pentru acidul galic) şi 6 – 200 µM (pentru Trolox).

S-au calculat RSD pentru diferite valori ale concentraţiilor antioxidanţilor studiaţi (indicate între paranteze) şi pentru 10 determinări/probă. Acestea sunt: 2,41% (cacid galic = 35 µM); 2,98 % (cacid ascorbic = 20 µM) şi 1,0% (cacid uric = 8 µM).

Metoda FIA-CL dezvoltată a fost aplicată pentru determinarea TAC a: patru probe de vin; cinci tipuri de ceaiuri (infuzii) medicinale; sucuri şi extracte de la 10 tipuri de fructe; şapte băuturi răcoritoare necarbonatate; trei suplimente alimentare Spirulină 500 mg (comprimate) de la trei producători diferiţi; precum şi trei tipuri (un gel, două creme) de produse cosmetice. De asemenea, s-a determinat capacitatea antioxidantă totală a extractelor obţinute din 12 specii de Lamiaceae, trei specii de Apiaceae şi câte o specie de Theaceae, Brassicaceae, Alliaceae şi Chenopodiaceae.

Extractele vegetale alcoolice, acetonice sau în apă analizate au fost obţinute prin macerare, extracţie continuă (cu extractorul de tip Soxhlet), extracţie asistată de ultrasunete şi centrifugare. Din produsele cosmetice s-au obţinut extracte acetonice prin metoda discontinuă.

S-a studiat variaţia TAC a unui extract de Rosmarinus officinalis L. (Lamiaceae) la iradiere cu radiaţii γ (doze cuprinse între 2,5 – 320 kGy).

Exactitatea (acurateţea) metodei dezvoltate a fost verificată la analiza unei probe de vin prin metoda adausurilor standard. Diferenţa între concentraţia determinată prin metoda adausurilor şi cea obţinută prin metoda directă a fost mai mică de 3%. Aceasta dovedeşte că în cazul metodei studiate efectele de matrice sunt reduse.

Sensibilitatea metodei FIA-CL dezvoltată pentru determinarea TAC a fost cu 2 - 3 ordine de mărime mai mare decât cele obţinute în cazul metodelor spectrofotometrice utilizate, ceea ce este în conformitate cu datele raportate în literatură. S-au analizat 10 probe/oră. Consumul de reactivi a fost de 3 mL/probă.

S-au stabilit corelaţii bune între rezultatele experimentale obţinute cu metoda FIA-CL dezvoltată şi cele obţinute cu metode spectrofotometrice convenţionale de determinare a conţinutului de fenoli totali, flavonoide, antociani şi a activităţii antioxidante cu metoda DPPH.

Rezultatele obţinute au fost în concordanţă cu date reprezentative raportate în literatură.

S-au determinat variaţiile intracelulare ale concentraţiilor ionilor de citosolic ([Ca2+]cit) în celule de Saccharomyces cerevisiae cu diferite mutaţii implicate în transportul şi homeostazia calciului, ca răspuns la stresul oxidativ indus de H2O2 şi de hidroperoxidul de terţ-butil (tBOOH) în absenţa/prezenţa unor AO (substanţe pure) şi a unor extracte vegetale.

Rezultatele prezentate în acest studiu dovedesc pentru prima dată faptul că stresul oxidativ exogen induce o creştere de scurtă durată a [Ca2+]cit, ionii provenind atât din exteriorul celulei cât şi din vacuole. Atunci când se confruntă cu concentraţii mai mari, letale, de H2O2, celulele utilizează vacuolele ca principală sursă de calciu citosolic.

În partea finală a lucrării s-a studiat influenţa prezenţei vitaminei C şi a unui extract din sâmburi de struguri (caracterizat din punct de vedere al conţinutului în polifenoli) asupra semnalului analitic. Scăderea semnalului luminescent mediat de ionii de Ca2+ în prezenţa acidului L-ascorbic şi a extractului comparativ cu semnalul analitic obţinut în absenţa acestora arată posibilul efect protector al acestora.

Rezultatele încurajatoare privind posibila influenţă benefică a vitaminei C şi a extractului folosit în experimente asupra stresului oxidativ indus în celulele drojdiei S. cerevisiae pot constitui o direcţie de cercetare în viitor.

Bibliografie selectivă Bibliografie selectivă

39 40

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 12. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, A.F. Danet, C.-V. Popa, M. Bumbac, L.M. Gorghiu and A.M. Mariş, The effects of γ-irradiation on the antioxidant activity of rosemary extract. Optoelectron. Adv. Mat.-Rapid Commun., 2009, 3(12), 1315-1320 17. D.L. Giokas, A.G. Vlessidis and N.P. Evmiridis, On-line detection of antioxidants free-radical scavenging activity based on Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence by flow injection analysis. Anal. Chim. Acta, 2007, 589(1), 59-65 113. V. Kabasakalis, D. Siopidou and E. Moshatou, Ascorbic acid content of commercial fruit juices and its rate of loss upon storage. Food Chem., 2000, 70(3), 325-328 115. S.C. Achinewhu, Ascorbic acid content of some Nigerian local fruits and vegetables. Plant Food Hum. 2utr., 1983, 33(4), 261-266 146. C. Proestos, I. S, Boziaris, M. Kapsokefalou and M. Komaitis, Natural antioxidant constituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected pathogenic microorganisms. Food Technol. Biotechnol., 2008, 46(2), 151-156 156. K.W. Lee, Y.J. Kim, H.J Lee and C.Y. Lee, Cocoa has more phenolic phytochemicals and a higher antioxidant capacity than teas and red wine. J. Agric. Food Chem., 2003, 51(25), 7292-7295 161. C.-V. Popa, L. Lungu, M. Savoiu, C. Bradu, V. Dinoiu and A.F. Danet, Total antioxidant activity, phenols and flavonoids content of several plant extracts. Int. J. Food Prop., 2011, DOI 10.1080/10942912.2010.498545 165. P. Stratil, V. Kuban and J. Fojtova, Comparison of the phenolic content and total antioxidant activity in wines as determined by spectrophotometric methods. Czech J. Food

Sci., 2008, 26(4), 242-253 166. O. Doka and D. Bicanic, Determination of Total Polyphenolic Content in Red Wines by Means of the Combined He−Ne Laser Optothermal Window and Folin−Ciocalteu Colorimetry Assay. Anal Chem., 2002, 74(9), 2157-2161 184. M. Hajimahmoodi, M. Hanifeh, M.R. Oveisi, N. Sadeghi and B. Jannat, Determination of total antioxidant capacity of green teas by the ferric reducing/antioxidant power assay. Iran. J.

Environ. Health Sci. Eng., 2008, 5(3), 167-172 193. R.L. Prior, G. Cao, A. Martin, E. Sofic, J. McEwen, C. O`Brien, N. Lischner, M. Ehlenfeldt, W. Kalt, G. Krewer and C.M. Mailand, Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity and variety of Vaccinium species. J. Agric. Food

Chem., 1998, 46(7), 2686-2693 194. G.A. Garzon, C.E. Narvaez, K.M. Riedl and S.J. Schwartz, Chemical composition, anthocyanins, non-anthocyanin phenolics and antioxidant activity of wild bilberry (Vaccinium

meridionale Swartz) from Colombia. Food Chem., 2010, 122(4), 980-986 195. E. Sariburun, S. Şahin, C. Demir, C. Turkben and V. Uylaser, Phenolic content ant antioxidnat activity of raspberry and blackberry cultivars, J. Food Sci., 2010, 75 (4), 328-335 196. D. Burdulis, L. Ivanauskas, V. Dirse, S. Kazlauskas and A. Razukas, Study of diversity of anthocyanin composition in bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits, Medicina (Kaunas), 2007, 43(12), 971-977 207. L. Lungu, C.-V. Popa, M. Savoiu, A.F. Danet and V. Dinoiu, Antioxidant activity of Brassica oleracea L., Allium cepa L. and Beta vulgaris L. extracts, Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(10), 911-914

265. M.B. Hossain, C. Barry.-Ryan, A.B. Martin-Diana and N.P. Brunton, Effect of drying method on the antioxidant capacity of six Lamiaceae herbs. Food Chem., 2010, 123(1), 85-91 266. J.-H. Jeong, H. Jung, S.-R. Lee, H.-J. Lee, K.T. Hwang and T.-Y. Kim, Anti-oxidant, anti-proliferative and anti-inflammatory activities of the extracts from black raspberry fruits and wine. Food Chem., 2010, 123(2), 338-344 295. C.-V. Popa, I. Dumitru, L.L. Ruta, A.F. Danet and I.C. Farcasanu, Exogenous oxidative stress induces Ca2+ release in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS J., 2010, 277(19), 4027-4038 312. P. Stratil, B. Klejdus and V. Kuban, Determination of Total Content of Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Vegetables Evaluation of Spectrophotometric Methods. J. Agric. Food Chem., 2006, 54(3), 607-616 316. I. Parejo, C. Codina, C. Petrakis and P. Kefalas, Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH. (2,2,-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 44(3), 507-512 363. Encyclopedia of Analytical Science, Editor–in-chief Alan Tounshend, Academic Press Limited, Harcourt Brace & Company Publishers, London, p. 1526- 1528, 1557, 3679-3688, 3887-3892, 5395-5400 365. A. Meghea, L. Popa si M. Giurginca, Evaluarea capacităţii de protecţie a antioxidanţilor prin chemiluminescenţă. Rev. Chim. (Bucharest), 2003, 54(5), 455-457 366. M.J. Navas and A.M. Jimenez, Chemiluminescent methods in olive oil analysis. J. Amer.

Oil Chem. Soc., 2007, 84(5), 405-411 367. C. Dodeigne, L. Thunus and R. Lejeune, Chemiluminescence as diagnostic tool. A review. Talanta, 2000, 51(3), 415 – 439 375. A.M. Garcia-Campagna and W.R.G. Baeyens, Chemiluminescence in Analytical

Chemistry, Marcel Dekker, Inc, New York-Basel, 2001, p. 42-50, 227-228, 503-510 399. A.M. Pisoschi, A.F. Danet and S. Kalinowski, Ascorbic acid determination in commercial fruit juice samples by cyclic voltammetry. J. Autom. Methods Manag., 2008, vol.

2008, doi:10.1155/2008/937651, http://www.hindawi.com/journals/jammc 408. A. Nezamzadeh, M.K. Amini and H. Faghihian, Square-wave voltametric determination of ascorbic acid based on its electrocatalytic oxidation at zeolite-modified carbon-paste electrodes. Int. J. Electrochem. Sci., 2007, 2(8), 583-594 412. A.M. Pisoschi, G.-P. Negulescu and A. Pisoschi, Ascorbic Acid Determination by an Amperometric Ascorbate Oxidase-based Biosensor. Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(4), 339-344 457. N. Erdemoglu, N.N. Turan, I. Cakici, B. Sener and A. Aydm, Antioxidant activities of some Lamiaceae plant extracts. Phytother. Res., 2006, 20(1), 9-13 458. C.-V. Popa, A.F. Danet, S. Jipa and T. Zaharescu, Determination of Total Antioxidant Activity of Wines Using a Flow Injection Method with Chemiluminescence Detection. Rev.

Chim. (Bucharest), 2010, 61(1), 11-16 459. M. Sariahmetoglu, R.A. Wheatley, I. Cakici, I. Kanzik and A. Townshend, Flow injection analysis for monitoring antioxidant effects on luminol chemiluminescence of reactive oxygen species. Anal. Lett., 2003, 36(4), 749-765 465. I. Parejo, Ch. Petrakis and P. Kefalas, A transition metal enhanced luminol chemiluminescence in the presence of a chelator. J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 2000, 43(3), 183-190

Bibliografie selectivă Bibliografie selectivă

41 42

476. C. Lu, G. Song and J.-M. Lin, Reactive oxygen species and their chemiluminescence-detection methods. Trends Anal. Chem., 2006, 25(10), 985-995 483. G.R. Buetner and B.A. Jurkiewicz, Catalytic metals, ascorbate, and free radicals: combinations to avoid. Radiat. Res., 1996, 145(5), 532-541 489. N. Pellegrini, M. Serafini, B. Colombi, D. del Rio, S. Salvatore, M. Bianchi and F. Brighenti, total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays. J. 2utr., 2003, 133(9), 2812-2819 490. N. Paixao, R. Perestrelo, J.C. Marques and J.S. Camara, Relationship between ntioxidant capacity and total phenolic content of red, rose and white wines. Food Chem., 2007, 105(1), 204-214 499. M.A.A. Meireles, Extracting bioactive compounds for food products: theory and

application, M.A.A. Meireles ed., CRC Press, Taylor and Francis Group, 2008, p. 186 500. A. Armatu, S. Colceru-Mihul, C. Bubueanu, E. Draghici and L. Pirvu, Evaluation of antioxidant and free scavenging potential of some Lamiaceae species growing in Romania. Rom. Biotech. Lett., 2010, 15(3), 5274-5280 501. G. Ozkan, O. Sagdic, L. Ekici, I. Ozturk and M. Musa Ozcan, Phenolic compounds of Origanum sipyleum L. extract and its antioxidant and antibacterial activities. J. Food Lipids, 2007, 14(2), 157-169 502. M.P. Kahkonen, A.T. Hopia, H.J. Vuorela, J.-P. Rauha, K. Pihlaja, T.S. Kujala and M. Heinonen, Antioxidant activity of plant extracts containinig phenolic compounds. J. Agric.

Food Chem., 1999, 47(10), 3954-3962 503. A. Matkowski, P. Tasarz and E. Szypula, Antioxidant activity of herb extracts from five medicinal plants from Lamiaceae, subfamily Lamioideae. J. Med. Plant Res., 2008, 2(11), 321-330 504. A. Wojdylo, J. Oszmianski and R. Czemerys, Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem., 2007, 105(3), 940-949 505. S. Dragland, H. Senoo, K. Wake, K. Holte and R. Blomhoff, Several culinary and medicinal herbs are important sources of dietary antioxidants. J. 2utr., 2003, 133(5), 1286-1290 515. S. Suteerapataranon and D. Pudta, Flow injection analysis-spectrophotometry for rapid determination of total polyphenols in tea extracts. J. Flow Injection Anal., 2008, 25(1), 61-64 516. C. Anesini, G.E. Ferraro and R. Filip, Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in Argentina. J. Agric. Food Chem., 2008, 56(19), 9225-9229 517. U. Justesen and P. Knuthsen, Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs traditional Danish dishes. Food Chem., 2001, 73(2), 245-250 518. D. Sreeramulu and M. Ragunath, Antioxidant activity and phenolic content of roots, tubers and vegetables commonly consumed in India. Food Res. Int., 2010, 43(4), 1017-1020 520. A.A. Franke, L.J. Custer, C. Arakaki and S.P. Murphy, Vitamin C and flavonoid levels of fruits and vegetables consumed in Hawaii, J. Food Comp. Anal., 2004, 17(1), 1-35 521. P.D. Makris, G. Boskou and K.N. Andrikopoulos, Polyphenolic content and in vitro antioxidant characteristics of wine industry and other agri-food solid waste extracts. J. Food

Comp. Anal., 2007, 20(2), 125-135 522. G. Mazza and E. Miniati, G. Mazza and E. Miniati eds. Introduction in anthocyanins in fruits, vegetables and grains. CRC Press, Boca Raton, 1993

531. A. Mithofer and C. Mazars, Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+- signatures in plant cells. Biol. Proced. Online, 2002, 4(1), 105-118 548. A.F. Batiza, T. Schulz and P.H. Masson, Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem., 1996, 271(38), 23457-23462 549. M. Kanzaki, M. Nagasawa, I. Kojima, C. Sato, K. Naruse, M. Sokabe and H. Iida, Molecular Identification of a Eukaryotic, Stretch-Activated Nonselective Cation Channel. Science, 1999, 285(5429), 882-886 550. T.K. Matsumoto, A.J. Ellsmore, S.G. Cessna, P.S. Low, J.M. Pardo, R.A. Bressan and P.M. Hasegawa, An osmotically induced cytosolic Ca2+ transient activates calcineurin signaling to mediate ion homeostasis and salt tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J Biol

Chem., 2002, 277(36), 33075-33080 551. R. Pinontoan, Krystofova, S. Kawano T., I.C. Mori, F.I. Tsuji, H. Iida and S. Muto, Phenylethylamine Induces an Increase in Cytosolic Ca2+ in Yeast. Biosci, Biotechnol, Biosci., 2002, 66(5), 1069-1074 552. L. Viladevall, R. Serrano, A. Ruiz, G. Domenech, J. Giraldo, A. Barcelo and J. Arino, Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces

cerevisiae. J Biol Chem., 2004, 279(42), 43614-43624 563. E.G. Locke, M. Bonilla, L. Liang, Y. Takita and K.W. Cunningham, A Homolog of Voltage-Gated Ca2+ Channels Stimulated by Depletion of Secretory Ca2+ in Yeast. Mol Cell

Biol., 2000, 20(18), 6686-6694 564. X.L. Zhou, A.F. Batiza, S.H. Loukin, C.P. Palmer, C. Kung and Y. Saimi, The transient receptor potential channel on the yeast vacuole is mechanosensitive. Proc 2atl Acad Sci USA, 2003, 100(12), 7105–7110 568. J.J. Rudd and V.E. Franklin-Tong, Unravelling response-specificity in Ca2+ signalling pathways in plant cells. 2ew Phytol., 2001, 151(1), 7-33 569. M.R. Knight, A.K. Campbell, S.M. Smith and A.J. Trewavas, Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. 2ature, 1991, 352(6335), 524-526 571. K. Tomonori, S. Nobuya, T. Koji, U. Nobuyuki and M. Muto, Salicylic Acid Induces Extracellular Superoxide Generation Followed by an Increase in Cytosolic Calcium Ion in Tobacco Suspension Culture: The Earliest Events in Salicylic Acid Signal Transduction. Plant

Cell Physiol., 1998, 39(7), 721-730 573. A Chiesa., E. Rapizzi, V. Tosello, V. Pinton, M. De Virgilio, K.E. Fogarty, R. Rizzuto, Recombinant aequorin and green fluorescent protein as valuable tools in the study of cell signaling. Biochem. J., 2001, 355(Part I), 1-12 574. D. Prasher, R.O. McCann and M.J. Cormier, Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 126(3), 1259-1268 575. E.S. Vysotski, S.V. Markova, L.A. Frank, Calcium-Regulated Photoproteins of Marine Coelenterates. Mol. Biol. (Mosk.), 2006, 40(3), 404–407 586. J. Nakajima-Shimada, H. Iida, F.I. Tsuji and Y. Anraku, Monitoring of intracellular calcium in Saccharomyces cerevisiae with an apoaequorine cDNA expression system. Proc

2atl Acad Sci USA, 1991, 88(15), 6878-6882 588. R. Schiestl and R.D. Gietz, High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acid as carrier. Curr Genet., 1989, 16(5-6), 339-346

Lista lucrărilor publicate în domeniul tezei Lista lucrărilor publicate în domeniul tezei/Contracte de cercetare

43 44

LUCRĂRI PUBLICATE Î� DOME�IUL TEZEI DE DOCTORAT

ARTICOLE 1. C.-V. Popa, L. Lungu, M. Savoiu, C. Bradu, V. Dinoiu and A.F. Danet, Total antioxidant activity, phenols and flavonoids content of several plant extracts, Int. J. Food Prop., 2011, doi:10.1080/10942912.2010.498545 2. C.-V. Popa, I. Dumitru, L. L. Ruta, A.F. Danet and I. C. Farcasanu, Exogenous oxidative stress induces Ca2+ release in the yeast Saccharomyces cerevisiae, FEBS

J., 2010, 277(19), 4027-4038 (3 citări) 3. C.-V. Popa, A.F. Danet, S. Jipa and T. Zaharescu, Determination of total antioxidant activity of wines using a flow injection method with chemiluminescence detection, Rev. Chim. (Bucharest), 2010, 61(1), 11-17 (3 citări) 4. L. Lungu, C.-V. Popa, M. Savoiu, A.F. Danet and V. Dinoiu, Antioxidant activity of Brassica oleracea L., Allium cepa L. and Beta vulgaris L. extracts, Rev. Chim.

(Bucharest), 2010, 61(10), 911-914 5. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, A.F. Dăneţ, C.-V. Popa, M. Bumbac, L.M. Gorghiu and A.M. Maris, The effects of γ-irradiation on the antioxidant activity of rosemary extract, Optoelectron. Adv. Mat.– Rapid Commun., 2009, 3(12), 1315 -1320 6. L. Lungu, C.-V. Popa, J. Morris and M. Savoiu, Evaluation of phytotoxic activity of Melia azedarach L. extracts on Lactuca sativa L., Rom. Biotech. Lett., 2011, 16(2), 6089-6095

COMU�ICĂRI (SELECŢIE) 1. A.F. Danet and C.-V. Popa, “A new flow injection methods for chemiluminescence determination of total antioxidant activity of plant extracts “

(Oral presentation), International Conference on Ecological Materials and Technologies, September 25-26th, 2008, Bucharest, Romania 2. S. Jipa, T. Zaharescu, W. Kappel, T. Setnescu, M. Lungulescu, A. Mantsch, M. Bumbac, R. Olteanu, I.M. Gorghiu, C. Dumitrescu, A.F. Danet and C.-V. Popa, “Extract of Rosemary (Rosmarinus officinalis) as a radioprotective agent “(Oral presentation), International Conference on Ecological Materials and Technologies, September 25-26th, 2008, Bucharest, Romania 3. A.F. Danet, C.-V. Popa and I. Cristea, “Determination of total antioxidant capacity (TAC) of some fruit extracts and juices using FIA and batch versions of a chemiluminometric method “ (Oral presentation), 17th International Conference on flow injection analysis including related techniques, July 3-8th, 2011, Krakow, Poland

4. A.F. Danet and C.-V. Popa, “Total Antioxidant determination in plant extracts by FI chemiluminescence spectrometry using luminol and Co(II) catalyst in the presence of a chelating agent” (Poster), XIII International Symposium on Luminescence Spectrometry., September 7-11th, 2008, Bologna, Italy 5. A.F. Danet, C.-V. Popa, T. Zaharescu and S Jipa, “Total antioxidant determination of some plant extracts, wines and fruit juices by FI chemiluminescence spectrometry using luminol and Co(II) catalyst in the presence of a chelating agent “ (Poster), FLOW ANALYSIS XI, September 14‐18th, 2009, Pollensa, Mallorca, Spain 6. A.F. Danet and C.-V. Popa, “Flow injection method with chemiluminescence detection for total antioxidant activity determination “ (Poster ), XIIV International Symposium on Luminescence Spectrometry, July 13 – 16th, 2010, Prague, Czech Republic

CO�TRACTE DE CERCETARE 1. PNII 71-079/2007 ECOMAT “Fabricarea de materiale polimerice ecologice multifuncţionale stabilizate cu antioxidanţi polifenolici din plante”; membru

2. PNII 71-098/2007 SENSALIM “Senzori şi aparatură pentru controlul calităţii unor produse alimentare”; membru

3. PN II, IDEI, ID_965.176-/2007 „Mecanisme moleculare implicate în răspunsul celulelor de Saccharomyces cerevisiae la condiţii de stres metalic şi stres oxidativ”, 2007-2010; membru.

……………………………………………………//……………………………………………………

Download - Rezumat Teza Doctorat_POPA

Top Related