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ECOLOGIA MICROBIANA

- Estudio de los microorganismos en su ambiente natural

-Ambiente es todo aquello que rodea a un organismo vivo.

- Por ejemplo los factores químicos, físicos y biológicos.

- Los microorganismos (MOs) son parte de comunidades organizadas llamadas ecosistemas.

- Los MOs interactúan con el entorno y pueden cambiar en forma marcada las características del mismo. Desempeñan papeles importantes en la síntesis y degradación de distintos compuestos.

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MOs autotróficos: generan materia orgánica a partir de CO2

MOs organotróficos: participan en la biodegradación y reciclado de materia orgánica.

Se puede definir un ciclo biogeoquímico para los elementos clave (C, N, S, Fe) en el cual los mismos sufren distintos estados de óxido reducción a medida que se mueven a través de un ecosistema.

Los MOs participan en las reacciones biogeoquímicas. Para muchos elementos son los únicos capaces de generar los compuestos clave capaces de ser utilizados por otros organismos.

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Ecólogo microbiológico

Actividades metabólicas y como interaccionan

Biodiversidad de los MOs

Conocer aspectos cuali y cuantitativos de la microbiología de un ecosistema

Conocer las actividades de los MOs en su ambiente natural

Da una idea del potencial biogeoquímico en un ecosistema

- La existencia de MOs no implica que los mismos sean activos

-Solo los MOs activos tienen impacto ecológico.

-Medir la existencia de una determinada transformación bioquímica específica implica que un grupo específico de bacterias existe y que es metabólicamente activo.

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Células individuales poblaciones gremios comunidades

Distintas poblaciones relacionadas metabólicamente forman agrupaciones llamadas “guilds” o gremios.

La interacción de los gremios que llevan a cabo procesos fisiológicos complementarios da lugar a la formación de una comunidad bacteriana

Las comunidades microbianas interactúan con comunidades de macroorganismos para definir el ecosistema entero.

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Luz

Compuestos orgánicos Energía Ecosistema

Sustancias inorgánicas

organismos fototróficos, síntesis de materia

orgánica que contiene C, N, S, P, Fe

Muerte de los MOs y liberación de energía

de sus constituyentes químicos orgánicos

Materia orgánica organismos quimioorganotróficos

(usan compuestos orgánicos como fuente de energía)

Sustancias inorgánicas organismos quimiolitotróficos

reducidas (organismos que obtienen energía de la oxidación de

compuestos inorgánicos)

Luz

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Comunidad microbiana en un ecosistema lacustre

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En el lago tenemos tres organismos fototróficos

comunidades microbianas organismos quimioorganotróficos

(aerobios y aerobios facultativos)

organismos anaerobios

La ciencia de la microbiología ecológica tiene 2 objetivos:

1ro) el estudio de la biodiversidad de los MOs en la naturaleza y de cómo los diferentes gremios interactúan en las comunidades microbianas.

2do) medir las actividades de los MOs en la naturaleza y monitorear sus efectos sobre los ecosistemas.

Hay muchos MOs que no se han descubierto aún. La medición de las actividades microbianas en la naturaleza permite conocer el funcionamiento metabólico de las comunidades microbianas aún si conocemos poco acerca de los organismos que las componen

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LOS MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA

- Cualquier hábitat adecuado para el crecimiento de organismos superiores puede también soportar el crecimiento de MOs. La inversa no es válida.

-Los MOs pueden habitar la superficie de animales superiores y en algunos casos pueden vivir dentro de plantas y animales. En tales hábitat alcanzan grandes números y pueden ser beneficiosos para las plantas o animales o ser patógenos de sus respectivos hospedadores.

LOS MICROORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE

El crecimiento de los MOs Los recursos nutricionales

en la naturaleza depende de Las condiciones de crecimiento

- El nicho de un organismo en particular está definido por los recursos nutricionales, la cantidad de los mismos, el pH, la temperatura, la disponibilidad de agua, luz y oxígeno de su hábitat.

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-Cada organismo tiene un nicho primario o principal en el cual dicho organismo es el mas exitoso.

- En la tierra existe un número innumerable de nichos microbianos siendo éstos en parte los responsables de la gran diversidad metabólica y de la biodiversidad de los MOs que tenemos en la actualidad.

- El hábitat de un MO es pequeño (está en relación al tamaño de los MOs), pero pueden existir gradientes químicos y físicos en dicho hábitat que afecten a los MOs.

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MICROAMBIENTE

Es donde el MO vive y metaboliza dentro de un hábitat.

Perfil de las concentraciones de

O2 en una partícula de suelo

En una partícula de suelo de 6 mm pueden existir varios microambientes diferentes, tanto físicos como químicos y pueden coexistir distintos tipos fisiológicos de MOs. Los MOsanaerobios podrían ser activos en el centro de la partícula de tierra, los microaerófilos podrían ser activos mas afuera y los aerobios obligados podrían metabolizar en los 0,2 a 0,3 mmexternos de la partícula

Las condiciones fisicoquímicas en el micro-ambiente pueden cambiar rápidamente en función del tiempo y del espacio. La respiración de los MOs o el incremento de agua en el suelo pueden cambiar drásticamente el gradiente de O2 a través del micro medioambiente.

Conclusiones: Los microambientes son heterogéneos. Las condiciones pueden cambiar drásticamente. Una gran diversidad microbiana puede existir en un área física relativamente pequeña.

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NIVELES DE NUTRICIÓN Y VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

- Los nutrientes entran al ecosistema en forma intermitente. A períodos de gran abundancia le siguen períodos de escasez.

- Los MOs han diseñado mecanismos de defensa que les permiten acumular y almacenar materiales de reserva en forma de polímeros. Por ej. Poli-beta-hidroxibutirato, alcanoatos, polisacáridos (glucógeno), polifosfatos, azufre elemental, etc.

- La velocidad de crecimiento de los MOs en la naturaleza no es la óptima o la velocidad máxima que se da en el laboratorio. Las bacterias del suelo tienen una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1% de la velocidad máxima de crecimiento obtenida en el laboratorio.

Hábitat Tiempo de duplicación

Escherichia coli en el intestino 12 horas

en el laboratorio 20 minutos

La disminución de la velocidad de crecimiento en la naturaleza se debe a:

a) Baja disponibilidad de nutrientes

b) Distribución no uniforme de los nutrientes en el hábitat

c) Efectos competitivos con otros MOs.

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SUSTANCIAS DE RESERVA(a) Estructura química del poli-β-hidroxibutirato

(PHB); (b) Microfotografía electrónica del bacilo fototrófico Rhodospirillum sodomense.

Microfotografía de campo claro del bacilo púrpura del azufre Chromatiumbuderi.

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COMPETENCIA Y COOPERACIÓN MICROBIANA

La competencia por los recursos disponibles en la naturaleza es muy intensa y el resultado depende de:

a) La tasa de incorporación de los nutrientes

b) Las tasas metabólicas inherentes a cada MO

c) La velocidad de crecimiento

- En algunos casos de competencia microbiana, un MO puede inhibir el crecimiento de otros, por ej. con la producción de antibióticos o de productos tóxicos (Ej. el ácido producido por la fermentación de azúcares).

- En algunos casos los MOs colaboran para llevar a cabo una transformación determinada que ninguno de ellos puede llevar a cabo por si solos. Esto se llama sintrofía. Los organismos que participan deben convivir en un mismo microambiente ya que el producto del metabolismo de uno de ellos debe ser de fácil acceso para el otro. Estas interacciones son cruciales para el éxito competitivo de algunas bacterias anaeróbicas.

Otro ejemplo de relaciones cooperativas son por ej. el metabolismo complementario entre las bacterias nitrosificantes y las nitrificantespara oxidar el amoníaco a nitrato. Otro ej. son las bacterias reductoras de sulfato y oxidantes de sulfuro.

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Sintrofía: proceso por el cual dos o mas MOs cooperan en la degradación de una sustancia que no pueden degradar por sí solos.

En la mayoría de los casos, en la reacción sintróficainterviene el H2, que es producido por un miembro de la relación sintrófica y consumido por el otro. Por este motivo la sintrofía es conocida también como transferencia interespecífica de H2. El organismo que consume el H2 puede ser por ej. bacterias sulfato reductoras, homoacetógenos, metanógenos, bacterias desnitrificantes, etc. Las reacciones sintróficas son características de transformaciones anaeróbicas y se dan en hábitat anóxicos.

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Fermentación de etanol a metano y acetato por la acción sintrófica de una bacteria que oxida el etanol y una bacteria que consume el H2 producido por la primera.

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SUPERFICIES Y BIOFILMS

-Las superficies absorben nutrientes

-Son hábitats microbianos importantes

-La concentración de los nutrientes es muy superior en las superficies respecto a la del medio que la rodea

-La tasa metabólica y de crecimiento de los MOs aumenta mucho en las superficies

-La concentración de MOs que crecen en las superficies suelen ser mucho mayores que las que se encuentran en el medio líquido

Existen técnicas sencillas de tinción de poblaciones microbianas adheridas a una superficie sólida para medir la velocidad de crecimiento de MOs, por ej. La tinción con naranja de acridina y posterior observación por microfotografía fluorescente

La superficie de adherencia puede ser también un nutriente o materia orgánica o inorgánica que los MOs adheridos catabolizan directamente de la superficie de la partícula

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SUPERFICIES Y BIOFILMS MOSTRANDO MICROCOLONIAS BACTERIANAS

Microfotografía fluorescente de una comunidad microbiana natural colonizando raíces de plantas en el suelo. Obsérvese el desarrollo de la microcolonia. La preparación se ha teñido con naranja de acridina

Microcolonias bacterianas desarrollándose sobre un portaobjetos inmerso en agua de un arroyo. Las partículas brillantes son materia mineral. Las células cortas de forma bacilar miden unos 3 µm de largo.

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COLONIZACIÓN

-La mayor parte de los MOs crecen sobre superficies adheridos por medio de polisacáridos bacterianos, secretados por las mismas bacterias.

-Los biofilms atrapan nutrientes y en medios fluidos impiden que los MOs se desprendan

-Los biofilms tienen importancia en medicina y en las industrias

-Las bacterias contenidas en biofilms pueden escapar al ataque del sistema inmunitario de los organismos

-Los implantes médicos pueden convertirse en el lugar de desarrollo de biofilms que pueden contener MOs patógenos

-La placa dental es un biofilm típico que contiene bacterias productoras de ácido láctico que es el causante de las caries dentales

-En las industrias los biofilms pueden causar el entorpecimiento del flujo de agua o de petróleo en los oleoductos

-Los biofilms pueden contribuir a la degradación de objetos sumergidos, plataformas petroleras, barcos, instalaciones en la costa, etc.

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LOS DIENTES Y LA PLACA DENTAL

-El diente está compuesto por una matriz de cristales de fosfato de calcio (esmalte) y tejido vivo del diente (dentina y pulpa)

-El diente influye en la naturaleza de la flora microbiana (microbiota)

-En el 1er año de vida predominan en la boca las bacterias anaeróbicas aerotolerantes así como estreptococos y lactobacilos.

-Al aparecer los dientes hay un cambio marcado de la microflora hacia los MOs anaeróbicos. Aparecen bacterias adaptadas específicamente al crecimiento sobre las superficies y hendiduras de los dientes

Colonización bacteriana

1-Formación de una película fina de glicoproteínas ácidas de la saliva sobre el diente

2-Anclaje firme de células bacterianas. La colonización de ésta película por crecimiento en forma de microcolonias es muy específica y se llama placa dental.

Caries dentales

Es el resultado del aumento de la placa dental y de la formación de productos ácidos, como el ácido láctico producido por la fermentación de los azúcares, que provoca la descalcificación del diente.

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Una vez que ha comenzado la rotura del tejido duro, tiene lugar la proteólisis de la matriz del esmalte dentario bajo la acción de las enzimas proteolíticas liberadas por las bacterias.

El flúor en la matriz del cristal de fosfato de calcio hace que la matriz sea mas resistente a la descalcificación por el ácido.

Se han implicado dos MOs en las caries dentales. Streptococus sobrinus y Streptococus mutants. Ambas bacteria son productoras de ácido láctico.

S. sobrinus tiene una gran afinidad específica por las glicoproteínas de la saliva y se adhiere firmemente a las superficies lisas del diente colonizándolo.

S. mutants se encuentra principalmente en la hendiduras y fisuras pequeñas y su capacidad para fijarse a ambas superficies es el resultado de la producción de un polisacárido de dextrano que es extraordinariamente adhesivo. S mutantsproduce dextrano únicamente cuando existe sacarosa, mediante la enzima dextransacaridasa.

n sacarosa (glucosa)n + n fructosa

dextrano

Distribución de la placa dentaria utilizando un agente de revelado en un diente cepillado (arriba) y sin cepillar (abajo). Los números expresan el área total de la placa dentaria al día 1 (1436 mm2) y al día 10 (22522 mm2).

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Microcolonias bacterianas que crecen sobre una superficie dentaria artificial insertada en una boca durante (a) 6 hs ; (b) a mayor aumento la misma preparación que se muestra en (a).

Obsérvese la diferencia morfológica de los organismos presentes y el material viscoso, indicado con flechas, que “sujetan” a los microorganismos.

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METODOS EN ECOLOGIA MICROBIANA

Interesan dos aspectos en la ecología microbiana1) La biodiversidad, es decir qué MOs y en qué número se encuentran en un determinado hábitat.2) La actividad microbiológica, o sea como afecta la presencia de un determinado MO al ecosistema.Esto se puede llevar a cabo realizando las siguientes actividades: •Análisis de las comunidades microbianas dependientes de cultivos.•Análisis molecular de las comunidades microbianas.•Medición de las actividades microbianas en la naturaleza.

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Análisis dependientes de cultivos: enriquecimiento y aislamiento.

- En la naturaleza los microbios existen en cultivos mezclados llamados comunidades microbianas.

- Para aislar y estudiar un organismo particular los microbiólogos utilizan técnicas de enriquecimiento.

- Se usan medios y condiciones de incubación que seleccionan a un organismo particular y contra-seleccionan a los organismos no deseados.

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Ejemplo: el método de Beijerinck Martinus(microbiólogo holandés) a quien se deben las

primeras técnicas de cultivo de enriquecimiento para aislar la bacteria fijadora de nitrógeno

Azotobacter.

Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del aire, los medios de enriquecimiento carentes de amoníaco u otras formas de nitrógeno fijado son muy selectivos para este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrógeno o las bacterias fijadoras de nitrógeno anaeróbicas son contra-seleccionadas con este método.

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Aislamiento de Azotobacter

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ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO.La columna de Winogradsky:. Se usa para aislar y enriquecer en bacterias fototróficaspúrpuras y verdes, bacterias reductoras de sulfato, y muchos otros anaeróbios.. Es un sistema anóxico en miniatura.. Se prepara llenando aproximadamente por la mitad un cilindro de vidrio grande con un lodo rico en materia orgánica.. El lodo es cubierto con agua de un lago, embalse o acequia y se tapa.. Se coloca cerca de una ventana donde recibe luz solar atenuada y se deja varias semanas.

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Columna de Winogradsky

Agua de pozo o lago

Lodo suplementado con nutrientes orgánicos y sulfato de calcio y carbonato de calcio

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Se desarrolla una mezcla de organismos - Cianobacterias y algas en el tope (zona oxigénica).

- Proceso de descomposición en el lodo o sedimento produce productos adecuados como ácidos orgánicos, alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias reductoras de sulfato.

- El sulfuro producido a partir del sulfato gatilla el desarrollo de las bacterias verdes o púrpuras del azufre. Se toman muestras de la columna a profundidad para obtener muestras de cultivos anaeróbicos.

- La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Una vez que se ha establecido un enriquecimiento, se puede intentar obtener cultivos axénicos.

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SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO

En el laboratorio, el organismo que está mejor adaptado a las condiciones in vivo podría crecer mas rápido y convertirse en el organismo dominante. Típicamente, el organismo más apto in vivo es solo un componente minoritario del ecosistema.La solución es la dilución del inóculo. Se cree que la dilución elimina aquellas poblaciones minoritarias, pero de crecimiento rápido dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad que tienen tiempos de duplicación mayores. La dilución del inóculo es una práctica común en el cultivo de enriquecimiento en la microbiología actual.

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AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS O AXÉNICOS.

Los cultivos axénicos se pueden obtener a partir de cultivos de enriquecimiento de varias maneras; los métodos más frecuentes son:a) la siembra por estría en superficie (caja de Petri), b) la siembra en profundidad (agar shake) y

c) la dilución en líquido.

-Siembra por estría en superficie.Para aquellos MOs que crecen bien en medio sólido, este es el métodode elección. A partir de una población mixta se obtienen al estriarla

en superficie de agar colonias aisladas. Repitiendo con cada una de las colonias aisladas este procedimiento se consigue un cultivo axénico quepuede ser transferido a un medio líquido.

-Siembra en profundidad o agar-shakeLa dilución de un cultivo mixto en agar fundido da lugar a colonias embebidas en el agar. Este método es útil para purificar anaeróbios.Se hacen diluciones sucesivas seriadas para obtener cultivos puros.

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Métodos de cultivo axénico

Jarra anóxica. Una reacción química producida por el contenido del sobre en el interior de la jarra genera H2 + CO2. El H2 reacciona con el O2presente en la jarra sobre la superficie de un catalizador de paladio para formar H2O2. La atmósfera final contiene N2, H2 y CO2.

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AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS. El número más probable.

- Dilución serial de un inóculo en medio líquido hasta que el tubo final en la serie no muestre crecimiento.- Conocida como la técnica del número más probable (NMP). -Se usa para estimar el número de microorganismos en alimentos, aguas residuales y otro tipo de muestras donde el número necesita ser asignado en forma rutinaria.

Utilizando diluciones seriadas de 10 en 10, el último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 células o menos. Si se repite este proceso varias veces se obtiene cultivos puros. Se pueden usan medios altamente selectivos y condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo de organismos, como por ej. un determinado patógeno, o medios complejos para obtener una estimación del número total de células.

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Procedimiento de enriquecimiento por dilución de extinción o análisis del número mas probable NMP

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- El último tubo que muestra crecimiento (en el ej. Es la dilución 10-5) debe haberse desarrollado a partir de 10 células o menos.

- Para obtener cultivos axénicos se utiliza como inóculo la mayor dilución que muestra crecimiento y se repite el procedimiento.

- Para una estimación del número de un tipo determinado de bacteria en una muestra, el NMP se define como la dilución más elevada que muestra crecimiento. Si el medio utilizado fuera muy selectivo, por ejemplo para bacterias reductoras de sulfato, se podría concluir que para el caso mostrado en la figura hay entre 105 y 106 células recuperables de ese organismo por gramo de muestra. Se hacen réplicas para mayor exactitud y un blanco de dilución.

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CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA:Las pinzas láser

- Las pinzas de láser consisten de un microscopio óptico invertido equipado con un láser infrarrojo enfocado con precisión y un instrumento de micromanipulación.

- Una célula individual del campo de visión es atrapada por el haz de rayos láser y separada del resto de los microorganismos contaminantes.

- Es un método útil para aislar bacterias de crecimiento lento que pueden ser superadas por el crecimiento rápido de otras poblaciones en los cultivos de enriquecimiento típicos o para organismos presentes en bajo número.

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Pinzas de láser para el aislamiento de bacterias.

(a) Principio de las pinzas ópticas.Un haz de rayos láser fuertemente enfocado sobre un objeto tan pequeño como una célula bacteriana, crea fuerzas de radiación descendentes (Fa, Fb) sobre la célula, que permiten su desplazamiento en cualquier dirección mientras esté sometida a la fuerza del haz de rayos láser. (b) Aislamiento. El haz de rayos láser puede enfocarse sobre una célula individual presente en la mezcla de un tubo capilar, atraparla óptimamente y separarla. Una vez separada lo suficiente de las otras, el capilar se corta, se desconecta el láser y la célula se coloca en un medio de cultivo estéril.

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ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS.

Viabilidad y cuantificación mediante técnicas de tinción.

- El colorante fluorescente DAPI (4´,6-diamido-2-fenilindol) se usa con frecuencia para teñir microorganismos en hábitat opacos.- Células teñidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fáciles de ver y contar. - Tinción con DAPI es ampliamente usada para la enumeración de microorganismos en el ambiente, en alimentos y en muestras clínicas.- Para muestras acuáticas las células pueden ser teñidas sobre la superficie de un filtro, después que la muestra líquida ha sido pasada a través del mismo.

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Células de Escherichia coli después de haber sido teñidas con DAPI(4´,6-diamido-2-fenilindol)

DAPI es un colorante fluorescente inespecífico que tiñe ácidos nucleicos y no suele reaccionar con la materia inerte. DAPI es una forma razonable de estimar el número de células presentes en una muestra.

Ventaja: es una técnica sencilla, no es específica (tiñe todos los MOs de una muestra.

Desventaja: No diferencia entre células vivas y muertas, ni permite el rastreo de organismos específicos en el ambiente.

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TINCIÓN DE VIABLES- Hay métodos de tinción fluorescentes que permiten distinguir entre células vivas y muertas.- Basadas sobre la integridad de la membrana citoplasmática (MC). A la muestra se añaden dos colorantes (verde y rojo). - El colorante verde penetra todas las células.- El colorante rojo penetra en las células donde la MC no está intacta (por ejemplo células muertas).- Método no adecuado para examinar microscópicamente muestras naturales debido al teñido inespecífico de los materiales inertes. Se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio (muestras clínicas, del ambiente y de alimentos).

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Tinción de células viables

Células vivas (verdes) y células muertas (rojas) de Micrococcus luteus(cocos) y Bacillus cereus (bacilos) teñidas por el método de tinción Live/Dead (vivas/muertas) Bac Light TM de viabilidad bacteriana. El colorante verde penetra en todas las células, viables o no, mientras que el rojo, penetra solo en aquellas células cuya membrana esté dañada (células muertas). Este método da una evaluación instantánea de la viabilidad. Se utiliza en cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el examen de muestras naturales debido a problemas de tinción inespecífica con los materiales inertes

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ANTICUERPOS FLUORESCENTES- Explota la especificidad de anticuerpos contra los constituyentes de superficie de un organismo particular.- Se usa para la identificación o seguimiento de organismos en hábitat complejos con muchos microorganismos, tales como suelos o muestras clínicas que contengan una mezcla de muchos organismos.- Requiere de la preparación de anticuerpos específicos contra el microorganismo de interés lo cual es largo y laborioso.- Anticuerpos relevantes clínicamente son disponibles comercialmente.

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Anticuerpos fluorescentes.

Mediante la técnica de anticuerpos fluorescentes se observan microcoloniasbacterianas (las células aparecen como puntos verde-amarillentos) y la arquea hipertermófilaSulfolobus acidocaldariusen la superficie de partículas del suelo de una solfatara. Las células miden alrededor de 1µmde diámetro.

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Métodos de utilización de anticuerpos florescentes para detectar antígenos de la superficie microbiana

(a) Preparación de anticuerpo fluorescente por acoplamiento del colorante fluorescente, el isotiocianato de fluoresceína, con una molécula de anticuerpo (Ac).

(b) Reacciones con anticuerpos fluorescentes. Células de Clostridiumsepticum con un Ac conjugado con isotiocianato de fluoresceína que da fluorescencia amarilla verdosa y células de Clostridium chauvei teñidas con Acconjugado con rodamina B, que da fluorescencia roja.

© Parte superior del panel: Método de tinción directa

Parte inferior del panel: Método de tinción indirecta

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Proteína fluorescente verde para el etiquetado celularLas células bacterianas pueden ser alteradas mediante técnicas de ingeniería genética para volverlas fluorescentes. Se puede insertar en su genoma el gen que codifica por la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein). Al expresarse, las células que contienen la GFP aparecen color verde cuando se observan con un microscopio de luz ultravioleta. Las células etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las raíces de las plantas, y seguir con el microscopio la célula etiquetada. Aunque éste método no resulta útil para medir poblaciones naturales, las células etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las raíces de las plantas. Con éste método, los ecólogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida, o evaluar el efecto de la perturbación en el ambiente. La GFP también se puede utilizar como un gen indicador “reporter” fusionado a un operón para estudiar la regulación de la transcripción de distintos promotores por medición de la fluorescencia.

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Células modificadas por ingeniería genética que expresan la GFP (green fluorescent protein).

Células de Pseudomonas fluorescensmodificadas por ingeniería genética con la GFP observadas por microscopía láser confocal. Las células están adheridas a raíces de cebada y presentan fluorescencia de color verde. Las células teñidas de azul son parte de la biota normal de las raíces de cebada y se han teñido con el colorante inespecífico DAPI.

El uso de GFP permite rastrear las células introducidas en el ambiente.

Este método no es un método de tinción sino que es un método de etiquetado molecular.

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Limitaciones de la microscopía

• La microscopía es una técnica importante para la enumeración e identificación de MOs en muestras naturales pero no es suficiente para el estudio de los mismos.

• Procariotas pequeños pasan inadvertidos si la muestra natural contiene mucha materia orgánica o elevados números de células grandes.

• Es difícil diferenciar entre células vivas y muertas y la materia inerte.• Imposibilidad de evaluar la diversidad genética de los MOs en un hábitat

natural.• Células muy similares morfológicamente pueden ser genéticamente muy

distintas y por lo tanto desempeñar funciones diferentes en un ecosistema.• Los estudios de microscopía en el área de la ecología microbiana deben

complementarse con métodos de cultivo o moleculares, preferiblemente de ambos si se quiere entender bien la ecologia de un ecosistema microbiano.

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Morfología y diversidad genética

Dos fotos de un mismo campo de células. a) microscopía de contraste de fases. b) tinción filogenética. Aunque las células ovaladas grandes tienen una morfología y tamaño poco corrientes en procariotas (2,25 um de diámetro), y parecen similares por microscopía de contraste de fases, la tinción filogética revela que son dos tipos distintos genéticamente.

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TINCIONES GENÉTICAS

- La sonda de ácido nucleico es un oligonucleótido de DNA o RNA complementario a un gen diana.-Las sondas de ácidos nucleicos son un instrumento poderoso para identificar y cuantificar microorganismos en la naturaleza.-La técnica de hibridización florescente in situ (FISH, fluorescent in situ hybridization) usa sondas de DNA o RNA fluorescentes para identificar organismos que contienen una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a la sonda.- La técnica de FISH es una herramienta muy común en ecología microbiana y permite la identificación rápida de organismos patógenos específicos en la industria alimenticia y en el diagnóstico clínico.

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Tinción filogenética con FISH- Los colorantes filogenéticos son oligonucleótidosfluorescentes complementarios en la secuencia de bases a las secuencias “signatura” en el rRNA 16S (en procariotas) o 18S (en eucariotas).-Los colorantes filogenéticos penetran en la célula, donde hibridan con el RNA ribosómico directamente en los ribosomas.-Se han identificado sondas filogenéticas signatura para especies microbianas individuales, así como para dominios enteros de organismos.-El grado de especificidad de un colorante filogenético puede controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada al colorante. FISH permite identificar o rastrear un organismo particular , o un grupo de organismos relacionados, dependiendo de la especificidad de la sonda.

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Identificación de microorganismos en ambientes naturales por métodos de sonda de ácidos nucleicos

(a) Microfotografías de células hibridizadas con sondas complementarias a secuencias específicas en el 16S rRNA de Bacteria (izquierda) y de el 18S rRNA de Eukarya(derecha)

(b) Sondas de RNA ribosomal marcadas fluorescentemente. Izquierda: microfotografía de contraste de fases de B. megaterium y la levadura Saccharomyces cerevisiae (no hay probes presentes. Centro: el mismo campo, células teñidas con la probe de rRNA universal. Derecha: el mismo campo, células teñidas con la sonda para eukarya (sólo las células de S. cereviciae reaccionan).

(c) Diferenciación de bacterias Gram-negativas estrechamente relacionadas. Izquierda: microfotografía de una mezcla de Proteusvulgaris y de una bacteria relacionada aislada de avispas. Centro: el mismo campo con una sonda bacterial. Derecha: probe específica para las bacterias aisladas de avispa.

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Estudio de muestras naturales mediante sondas filogenéticas multiples por FISH

a) Bacterias nitrificantes en muestra de aguas residuales. En rojo bacterias oxidadoras de amoníaco, en verde bacterias oxidadoras de nitritos. b) Micrografía laser confocal de rastreo de una muestra de fango de aguas residuales. La muestra fue tratada con tres sondas filogenéticas distintas.

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TINCIONES GENÉTICASTécnicas de FISH:

a) Tinción de cromosomas:- Comienza con el marcado fluorescente de una sonda de oligonucleótidos o del gen completo, de un conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido, para obtener sondas pequeñas.- Las sondas se utilizan para averiguar qué organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o los genes presentes en la sonda(s). - La tinción de cromosomas es útil para identificar bacterias que contienen genes específicos, como los que codifican para la nitrogenasa, responsable de la fijación de N2, los componentes del centro de reacción fotosintético, o vías autotróficas específicas.- Los números de células fluorescentes en cada caso darán una estimación de las bacterias fijadoras de N2, fotótrofaso autótrofas, respectivamente, en una muestra natural.

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b) Transcripción inversa in situ (in situ reverse transcription, FISH-ISRT).

- Usada para determinar si un organismo está expresando un gen o genes particulares en la naturaleza, a un tiempo dado.

- Involucra el uso de una sonda que hibridiza con un mRNA.- Permite a los científicos explorar los factores que controlan la expresión del gen en poblaciones naturales.

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Técnicas de fluorescencia que emplean tinción de cromosomas bacterianos y transcripción inversa in situ.

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PCR: relacionando genes específicos con organismos específicos.Muchos estudios en ecología no necesitan aislar los organismos, ni siquiera identificarlos por microscopía con tinciones específicas. A menudo el objetivo del estudio es evaluar la biodiversidad de un hábitat sin emplear técnicas de cultivo, ni observar células. Con este objetivo se han aislado y caracterizado genes específicos como medida de la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes específicos están ligados frecuentemente a organismos específicos, la detección del gen implica la presencia del organismo. Las principales técnicas en este tipo de análisis de comunidades microbianas son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE), la clonación molecular y la secuenciación y el análisis del DNA.

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PCR. La reacción en cadena de la polimerasa llamada “PCR” puede multiplicar moléculas de DNA hasta miles de millones de veces proporcionando grandes cantidades de genes para su clonación, secuenciación o mutagénesis. La técnica de PCR hace uso de la DNA polimerasa. Se requiere que se conozca la secuencia nucleotídica de una región del gen deseado para poder diseñar oligonucleótidosiniciadores cortos o primers, complementarios de secuencias presentes en el gen o genes de interés. Las etapas de amplificación son las siguientes: 1- En un sintetizador de nucleótidos se fabrican los dos oligonucleótidos iniciadores que flanquean al gen diana, y se añaden en un gran exceso al gen diana desnaturalizado por calor. 2- Cuando se ha enfriado la mezcla, el exceso de iniciadores relativos al DNA diana asegura que la mayor parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no entre sí. 3- La DNA polimerasa alarga los iniciadores usando las bandas diana como moldes. 4- Después de un período de incubación adecuado, se calienta de nuevo la mezcla para separar las cadenas. Luego se enfría la mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden con las regiones complementarias del DNA recién sintetizado, y se repite el proceso.

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Análisis de la comunidad microbiana.Para el análisis de comunidades microbianas un gen diana que se amplifica frecuentemente es el que codifica el RNA ribosómico 16S (rRNA 16S). De esta manera, el análisis de la secuencia de genes de rRNA 16S amplificados a partir de una comunidad microbiana puede ofrecer una imagen filogenética de esa comunidad. Alternativamente también se pueden usar como dianas los genes metabólicos que codifican proteínas particulares del metabolismo de un organismo específico (o de un grupo de organismos relacionados). El imprescindible que el diseño de los cebadores tenga una especificidad elevada. Si la fuente de DNA es una muestra natural , el diseño de los cebadores es crítico para que los resultados no sean ambiguos y difíciles de interpretar. Se dispone de reactivos comerciales (kits) para obtener el DNA puro, sin restos de sustancias que pueden interferir con la PCR. El DNA obtenido es una mezcla del DNA genómico de todos los microorganismos presentes originalmente en el hábitat. La tarea de la PCR es “capturar” el o los genes diana que interesan en la mezcla y hacer las copias suficientes para análisis posteriores. El producto de la PCR es corrido en un gel donde se obtienen bandas de los genes diana amplificados

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Pasos en el análisis de una comunidad microbiana mediantesondas filogenéticas.

(a) Se utiliza el DNA total de la comunidad para amplificar los genes del rRNA 16S utilizando cebadores (primers) universales conservados para los microorganismos del dominio Bacteria. Las bandas producidas por la PCR se cortan y los diferentes genes rRNA 16S se separan o por clonación o por DGGE (electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) y se secuencian. A partir de las secuencias obtenidas se construye un árbol filogenético.

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Análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y DGGE (electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) coordinados.

Por la divergencia evolutiva del gen diana elegido en las diferentes especies, la banda obtenida en el gel (a) puede estar compuesta de varios genes diana, los cuales difieren en la secuencia de nucleótidos entre los lugares de unión de los cebadores escogidos. Para el análisis filogenético de las secuencias de los genes amplificados , se necesita un paso extra para distinguir las diferentes formas del gen antes de iniciar la secuenciación. Un método es mediante la clonación molecular y la otra posibilidad es la electroforesis en geldesnaturalizante en gradiente (b). La DGGE es un método de electroforesis que separa los genes del mismo tamaño que difieren en la secuencia de bases. La técnica utiliza un gradiente de urea y formamida que desnaturaliza el DNA. Un fragmento de DNA bicatenario se desplaza por el gel y cuando llega a una determinada concentración “desnaturalizante” las cadenas de DNA se separan y el desplazamiento se interrumpe.

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Las bandas individuales obtenidas por DGGE se pueden cortar y secuenciar. Usando como gen diana el rRNA 16S, el análisis por DGGE proporciona una visión detallada del número de filotipos (genes rRNA 16S distintivos) presentes en el hábitat. Secuenciando estas bandas , es posible determinar las especies presentes en la comunidad por comparación con las secuencias de las especies conocidas disponibles a partir de bases de datos apropiadas. Con otros genes (por ejemplo, genes metabólicos) se obtiene información acerca del número de tipos diferentes de organismos presentes en la comunidad que contiene el gen específico. El análisis por DGGE revela la biocomplejidad de un hábitat con respecto a un gen especifico.

El análisis filogenético por PCR de las comunidades microbianas ha dado resultados sorprendentes. Con el rRNA 16S como diana, se ha comprobado que la mayoría de las comunidades microbianas contienen varios organismos filogenéticamente distintos, cuyas secuencias de RNA ribosómico no se emparejan con ninguno de los cultivos de laboratorio. Hay que señalar que en muchos casos los miembros más abundantes de las comunidades microbianas son especies que hasta ahora no han podido ser cultivadas en el laboratorio. Este problema indica que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir de los cultivos de enriquecimiento es todavía muy incompleto y que el enriquecimiento presenta sesgos, lo cual supone un serio problema para los estudios de biodiversidad.

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Medición de la actividad microbiana en la naturaleza

La actividad microbiana in situ se puede medir mediante la utilización de:

(1) Radioisótopos

(2) Microelectrodos

(3) Isótopos estables

Los análisis usando radioisótopos son:

- Muy sensibles y muy específicos para medir procesos químicos

- Usan tiempos cortos de incubación

- Las mediciones obtenidas son mas representativas de las muestras como existen en la naturaleza

- Hay que hacer control con células muertas para verificar que ocurre un proceso bioquímico y no una transformación química

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Medida de la actividad microbiana en la naturaleza

a) Análisis químico para lactato y H2S durante la reducción de sulfato.

b) Uso de radioisótopos: fotosíntesis medida en un ambiente natural de agua de mar con 14CO2

c) Reducción de sulfato en un lodo medido con 35SO4

2-

d) Producción de 14CO2de 14C-glucosa.

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Esquema de un microelectrodo de oxígeno

MICROELECTRODOS- Electrodos de vidrio muy finos que miden pH, oxígeno, N2O, CO2, H2 o H2S.

- Usado para el estudio de transformaciones químicas y fotosíntesis en tapetes microbianos.

- Los tapetes microbianos son comunidades microbianas estratificadas conteniendo usualmente cianobacteria en las capas superiores, bacterias fototróficas anoxigénicasen las capas subsiguientes y bacterias quemoorganotrofas en las capas inferiores.

- Los tapetes microbianos son encontrados a menudo en las zonas intermareales y junto a fuentes termales.

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Tapetes microbianos y el uso de microelectrodospara su estudio. b) microperfiles de pH, sulfhídrico y oxígeno en un tapete microbiano de una fuente termal.

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ISÓTOPOS ESTABLES

Muchos elementos químicos tienen diferentes isótopos, que difieren en el número de neutrones. Algunos son inestables y se degradan liberando radioactividad y otros son estables.

- Los isótopos estables no son radioactivos y se utilizan para el estudio de diversas transformaciones microbianas en la naturaleza. - Los elementos mas comúnmente usados para estudios con isótopos estables en la ecología microbiana son el carbono y el azufre.- En la naturaleza, el carbono se encuentra principalmente como 12C, y en pequeña cantidad (alrededor del 5%) como 13C. Lo mismo sucede con el azufre, cuya forma principal es el 32S, pero que también se encuentra en menor cantidad como 34S.- Las reacciones bioquímicas tienden a favorecer el isótopo más liviano, los mas pesados son discriminados negativamente.

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ISÓTOPOS ESTABLES-Fraccionamiento isotópico: las molécula producidas bioquímicamente son mas livianas que los compuestos producidos geoquímicamente.- Cuando el CO2 es atrapado por un organismo fototrófico, el carbono celular se enriquece en 12C y se empobrece en 13C. -El sulfuro producido por la reducción bacteriana del sulfato es mas “ligero” que el de origen geoquímico.-Este fenómeno se conoce como fraccionamiento isotópico.

-El fraccionamiento es el resultado de la actividad de algunas enzimas que discriminan la forma más pesada de un elemento cuando se unen a sus sustratos.

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Medición de la actividad microbiana por el uso de isótopos estables

Los isótopos estables pesados 13C, 18O, 34S tienen un número distinto de neutrones que la forma isotópica principal.

Los geoquímicos y los microbiólogos forman equipos para el estudio de las transferencias biogeoquímicas usando isótopos estables.

La mayoría de los procesos bioquímicos favorecen el isótopo mas liviano discriminando el más pesado. Esto es particularmente cierto para las enzimas que fijan CO2 o que metabolizan SO4

=.Los organismos fototróficos utilizan el CO2 de composición isotópica conocida como alimento y las enzimas fijadoras de CO2 lo hacen preferentemente con el isótopo mas ligero (12C). De esta manera , el carbono fijado como carbono celular aumenta la cantidad de 12C y disminuye la de 13C en relación con el sustrato inicial. El grado de disminución de 13C se acumula como un fraccionamiento isotópico. El tamaño de las flechas indican la abundancia relativa de cada isótopo del carbono.

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a) Composición isotópica de carbono de varias sustancias. Los valores están dados en partes por mil y fueron calculados usando la fórmula(13C/12C muestra)-(13C/12C estándar) x 1000

13C/12C estándarEl estándar del C es el belemnite de la formación rocosa PeeDee. Nótese que el C fijado por los organismos autotróficos estáenriquecido en 12C.

b) Resumen de la geoquímica isotópica del azufre con indicación del margen de valores para 34S y 32S en varias sustancias que contienen azufre. Los valores se dan en partes por mil y se calculan mediante la fórmula(34S/32S muestra)-(34S/32S estándar) x 1000

34S/32S estándarEl estándar del S es el SFe procedente del meteorito Canyon Diablo. El sulfuro y azufre de origen biogénico tienden a tener menos 34S.

Fraccionamiento isotópico en ecología microbianaLa composición isotópica de una muestra contiene un registro de su actividad biológica pasada. El análisis isotópico del carbono permite distinguir entre la materia orgánica biogénica de la abiogénica. Se pueden hacer registros evolutivos

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EL USO DEL FRACCIONAMIENTO ISOTÓPICO EN ECOLOGÍA MICROBIANA.

- La composición isotópica de una muestra contiene un record de su actividad biológica pasada.-El análisis del isótopo de carbono en las rocas tiene prevista la existencia de vida sobre la tierra 3.500 millones de años atrás.-El análisis del oxígeno (18O/16O) de rocas se usa para determinar la transición de la Tierra de un ambiente anóxico a un ambiente óxico (fotosíntes oxigénica de las cianobacterias). -El análisis del isótopo de azufre también ha sido usado como evidencia de la carencia de vida sobre la luna.-La composición isotópica de un organismo animal superior tiende a aproximarse a la composición isotópica de su principal alimento. Esto permite rastrear el flujo de C a través de un ecosistema.

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FIN

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ECOSISTEMAS MICROBIANOS

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HÁBITAT MICROBIANOS TERRESTRES Y DE AGUA DULCE

Los suelos y las aguas varían en su estructura física, composición de nutrientes, temperatura y potencial de agua. Todos estos factores se combinan para influir en los tipos y número de microorganismos presentes en cada caso.

Ambientes terrestresmaterial original

Interacción (roca, arena, sedimentos) formación del suelo

compleja topología del terreno

clima

seres vivos

La interacción involucra procesos físicos, químicos y biológicos.

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Formación del suelo. Los suelos pueden clasificarse en dos grandes grupos: suelos minerales y suelos orgánicos según procedan inicialmente de la fragmentación de rocas y otros materiales inorgánicos , o de la sedimentación de turberas y marismas.

roca expuesta a la intemperie

algas líquenes musgo

humedad Se desarrollan MOs fototróficos

Producen materia orgánica que permite el crecimiento de bacterias quimioorganotróficas y hongos

El número de bacterias quimioorganotróficas aumenta en forma proporcional a la extensión de la cubierta vegetal de la roca. El CO2 que producen los organotrofosdurante la respiración se convierte en ácido carbónico, que es un agente importante en la disolución de rocas, especialmente en las que son calizas. Muchos quimioorganotrofos secretan además ácidos orgánicos que disuelven la roca en partículas de menor tamaño.

Heladas y deshielos grietas en las rocas formación del suelo primitivo

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Hendidura de roca formación de suelo primitivo desarrollo de plantas superiores

Las raíces de las plantas van penetrando por las hendiduras y aumentan la fragmentación de la roca y sus excreciones causan el desarrollo de una rizosfera.

Planta muere suelo nutriente para un desarrollo microbiano mas extenso

Los minerales se solubilizan aún más y el agua al filtrarse arrastra los mismos hacia capas mas profundas. A medida que avanza el proceso de meteorización del suelo, éste se hace mas profundo y permite el desarrollo de plantas y árboles de mayor tamaño. Los animales se estabilizan y desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la aireación y mezcla de las capas superiores del suelo. Finalmente, el movimiento de materiales hacia el interior origina la formación de distintas capas y aparece un perfil de suelo típico, cuya velocidad de formación depende del clima, de otros factores. Es un proceso lento que puede llevar cientos de años.

Horizonte O : capa de materia vegetal sin descomponer

Horizonte A: suelo superficial (rico en materia orgánica), alta actividad microbiana.

Horizonte B: subsuelo (se acumulan minerales, humus, etc), pobre en materia orgánica, actividad microbiológica pobre.

Horizonte C: suelo base, actividad microbiana muy baja. Roca sólida

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Ambiente terrestre: formación del suelo

Agregado de suelo

Microscopía electrónica de barrido Microorganismos sobre una partícula de suelo

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EL SUELO COMO HÁBITAT MICROBIANO

-El crecimiento mas importante se da en la rizosfera (suelo que rodea las raíces).

-Un pequeño agregado de suelo contiene microambientes muy diferentes y diferentes tipos de MOs.

Partícula de suelo tinción fluorescente observación de distintos MOs

naranja de acridina microscopio

tinción con anticuerpos MOs específicos

fluorescentes microscopio

de fluorescencia

microscopio electrónico de barrido MOs sobre superficies opacas (suelos)

(morfología, recuento de viables)

-La actividad microbiana depende de la disponibilidad del agua, que es variable y depende de: (a) la composición del suelo, (b) la lluvia, (c) el drenaje, (d) la cubierta vegetal.

- El agua permanece en el suelo : (a) adsorvida sobre superficies, (b) libre formando láminas o películas entre las partículas del suelo.

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Solución del suelo: es el agua del suelo con diversos materiales disueltos

En terrenos bien drenados el aire penetra con facilidad y la concentración de O2 es alta. En suelos encharcados, el O2 disponible es el disuelto en el agua y es pronto consumido por los MOs. Este tipo de suelo se vuelve pronto anóxico, por lo que experimenta profundos cambios en sus actividades biológicas.

El estado nutricional ( los recursos) es otro factor importante que afecta a la actividad microbiana, la mayor parte de la cual se lleva a cabo en las capas superiores ricas en materia orgánica (rizosfera).

El número de MOs del suelo y su actividad dependen del equilibrio entre los nutrientes presentes (orgánicos e inorgánicos).

La disponibilidad de agua es lo que más influye en la actividad microbiológica que tiene lugar en la superficie del suelo, mientras que enel interior del suelo la disponibilidad de nutrientes es el factor principal.

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MICROBIOLOGÍA DE LA SUBSUPERFICIE PROFUNDA

metanógenos

MOs anaerobicos estricto homoacetógenos

Suelos profundos MOs aerobios facultativos bacterias SO4= reductoras

MOs anaerobios facultativos

En muestras tomadas a 300 m se han aislado una gran variedad de microorganismos. Tienen actividades metabólicas bajas, inferiores a las que tienen en sus hábitat naturales

Comparado con los MOs de las capas superiores del suelo, la importancia biogeoquímica de los MOs de ambientes profundos puede ser mínima. No obstante pueden causar la mineralización de compuestos orgánicos y liberar productos a las aguas subterráneas.

El potencial que representan estas bacterias para la Biorremediación in situ de las sustancias tóxicas que alcanzan las aguas subterráneas por lixiviación (por ej. bencenos y productos químicos utilizados en agricultura) tiene un gran interés en la actualidad.

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Vida microbiana en las profundidades de la TierraLos microbiólogos han hallado procariotas viables a varios metros de profundidad bajo la superficie

En algunas formaciones de basalto de hasta 1500 m de profundidad se han encontrado una gran cantidad de bacterias anaeróbicas quemolitotróficas que son sulfato reductores, metanógenos y homoacetógenos. Estos anaerobios estrictos comparten una gran apetencia por el H2. El análisis del isótopo estable del carbono del CH4 presente en las rocas y aguas circundantes indica una gran abundancia del isótopo más ligero (12C), lo que es típico de la metanogénesis biológica demostrando que estos organismos son metabólicamente activos. El H2 del basalto parece originarse de la interacción , estrictamente química, del agua con los minerales de hierro de las rocas y es elque permitiría el crecimiento de las poblaciones de procariotas anaeróbicos encontrados en las profundidades. Estos quimiolitótrofos subterráneos son independientes de la producción primaria fotosintética la cual genera O2 y/o materia orgánica sugiriendo que pueden ser agentes biogeoquímicos importantes en estos ambientes.

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Ambientes de agua dulceLagos Distintos hábitat acuáticos. Difieren en sus propiedades

Estanques fisicoquímicas y consecuentemente en la composición

Ríos de las especies microbianas que viven en ellos, que

Manantiales predominantemente son los organismos fototróficos.

Zona óxica Cianobacterias

algas que flotan (fitoplancton)

que se adhieren al fondo o a los lados (bénticas)

Zona anóxica bacterias fototróficas anoxigénicas

E materia orgánica

Luz organismo fototrófico productor primario

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Los organismos fotótrofos oxigénicos producen nuevo material orgánico y O2. Cuando la actividad quimioorganotrófica es muy elevada, la materia orgánica lleva al agotamiento de O2 y a condiciones anóxicas.

-La actividad biológica de un ecosistema acuático depende de la tasa de producción primaria que llevan a cabo los organismos fototróficos.

-Los recursos y las condiciones ambientales afectan la actividad de los productores primarios. Hay mayores tasas en los ríos y manantiales.

-En los mares abiertos hay baja concentración de nutrientes para el fitoplancton y por lo tanto baja productividad.

-Las zonas mas fértiles son las cercanas a la costa por los aportes de nutrientes de los ríos y de las aguas continentales contaminadas.

-Las zonas costeras tienen alta producción primaria y son los mejores lugares para el crecimiento y recolección de pescados y mariscos.

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Relaciones con el oxígeno en lagos y ríos-Concentración de O2 en el aire 21%, su solubilidad en el agua es limitada

-El intercambio entre el O2 disuelto y el O2 atmosférico en las grandes masas de agua es lento.

-La producción fotosintética significativa de O2 en mares y lagos se lleva a cabo sólo en las capas superficiales, donde hay luz disponible.

-La materia orgánica que no se consume en estos estratos superiores va a parar al fondo, donde se descompone por la acción de MOs facultativos, que utilizan el O2 disuelto en el agua.

-En los lagos, cuando se ha consumido el O2 disuelto, las capas mas profundas se vuelven anóxicas donde sólo pueden crecer bacterias anaeróbicas y organismos microaerofílicos. Se produce un cambio del metabolismo respiratorio al fermentativo y al metanogénico.

Metanogénesis 4H2 +CO2 CH4 + 2H2O

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Mar capas mas O2 consumida

Lago superficiales luz organismos materia quimioorganotrofos

biosintéticos orgánica

no consumida

excedente al fondo

organismos facultativos

que utilizan el O2 disuelto

En lagos

Cambio del metabolismo capas mas profundas anóxicas

del respiratorio al fermentativo bacterias anaeróbicas y organismos

y al metanogénico microaerofílicos

no plantas superiores ni animales

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Que una masa de agua quede o no desprovista de O2 depende de muchos factores.

Hay O2 en la masa de agua:

(a) si la materia orgánica es escasa (lagos poco productivos o mar abierto)

(b) si no hay suficiente materia orgánica disponible para que los organismo quimioorganotróficos consuman todo el O2,

(c) si la velocidad de intercambio del agua entre las capas profundas y la superficie es alta (corrientes, turbulencias, etc) que mezclan bien y el O2 puede alcanzar las capas profundas.

En muchos lagos de climas templados la masa de agua permanece estratificada durante el verano con capas superficiales menos densas y mayores temperaturas llamadas epilimnion y separadas de capas inferiores mas pesadas y frías llamadas hipolimnion. Cuando se produce la estratificación, normalmente a principios del verano, las capas inferiores se vuelven anóxicas. Al final del otoño o al principio del invierno, las capas superiores se enfrían y se vuelven mas densas que las capas inferiores, produciéndose un intercambio que causa la aireación del fondo. Por ello la mayoría de los lagos de zonas templadas muestran un ciclo anual en el que las capas inferiores pasan de óxicas a anóxicas y de nuevo a óxicas. Estos cambios y especialmente también la temperatura afectan la actividad microbiana.

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Interrrelaciones del oxígeno en lagos y ríos

O2 temperatura

SH2

Epilimnion

Termoclina

Hipolimnion

Desarrollo de condiciones anóxicas en las profundidades de un lago de clima templado, como resultado de la estratificación estival. Las aguas mas frías del fondo son mas densas y contienen SH2 procedente de la reducción del sulfato. La zona que presenta un cambio brusco de la temperatura se denomina termoclina. A medida que las aguas superficiales se enfrían en otoño y en invierno, la densidad de las mismas aumenta y, al hundirse, desplazan a las del fondo, dando lugar a la “mezcla del lago”.

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RíosEl O2 es un factor importante, especialmente en los ríos que reciben mucha materia orgánica procedente de aguas residuales y de contaminación industrial. Si hay mucha materia orgánica, se produce un déficit de O2 debido a la respiración bacteriana. A medida que el agua se aleja del lugar donde se produce la descarga de residuos, la materia orgánica es consumida gradualmente y la concentración de O2 se acerca a la normalidad. En condiciones de anoxia, aunque sean temporales, los animales se mueren y además empiezan a crecer bacterias anaeróbicas que producen compuestos con olor fuerte (SH2, mercaptanos, ac. grasos)

O2 bacterias, C orgánico y DBO (demanda biológica de O2)

algas y cianobacterias

O2

Aporte de aguas NO3- NH4

+ y PO43-

residuales Distancia corriente abajo

Efecto de la incorporación de aguas residuales o de materia orgánica a los ríos

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Demanda biológica de O2 (DBO)

Es la capacidad de consumir O2 que tienen los MOs en una masa de agua determinada.

Muestra de agua se airea bien se coloca en incubación 5 días se mide el O2

botella precintada a 20oC residual

La DBO es una medida indirecta de la cantidad de materia orgánica del agua que puede ser oxidada por los MOs. Cuando un río se recupera de la contaminación producida por compuestos orgánicos, hay una disminución de la DBO que se acompaña con un aumento de la concentración de O2 disuelta en el agua.

En una masa de agua, los ciclos de C y O se encuentran interrelacionados y la concentración de cada uno de los elementos suele ser inversamente proporcional a la del otro. Esto se hace especialmente evidente en los ambientes anóxicos, donde hay abundancia de C.

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Microbiología de las profundidades marinas-Los océanos ocupan ¾ partes de la superficie terrestre de allí la importancia de la microbiología marina.

-Las zonas alejadas a las costas son pobres en nutrientes y la actividad microbiana no es intensa.

-Los MOs marinos son interesantes porque: crecen a concentraciones de nutrientes

crecen a temperaturas

Mar 300 m crecen a presiones

Animales y luz solar zona fótica

MOs quimio- intensa actividad biológica

organotróficos

1000 m

mas abajo zona biológicamente inactiva

profundidades marinas 75% del volumen del agua de mar

La presión atmosférica 1 atm cada 10m de profundidad. A 5000 m tenemos 500 atm.

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Distribución de Archaea/Bacteria en mar abierto

El número de procariotas en mar abierto disminuye con la profundidad. En la superficie el promedio es de 105-106 células/ml. Por debajo de los 1000 metros el número desciende a 103-105 células/ml. Las tinciones filogenéticas han revelado que en general las especies de Bacteriapredominan en las aguas superiores (<1000 metros), mientras que los números son iguales o muestran un ligero predominio de Archeae en las aguas profundas. Extrapolando los datos de la figura se ha estimado que en el conjunto de los océanos de todo el mundo existen 1,3 x 1028

y 3,1 x 1028 células de Archeae y Bacteria, respectivamente. Esto indica que los océanoscontienen la mayor cantidad de biomasamicrobiana que existe en toda la superficie de la Tierra.

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Bacterias barotolerantes y barofílicasBacterias barotolerantes son aquellas que toleran altas presiones.

Bacterias barofílicas son aquellas que necesitan altas presiones para crecer.

La distribución de ambos tipos de bacterias dependen básicamente de la profundidad.

Las bacterias barotolerantes no crecen a presiones superiores a las 500 atm (pero pueden crecer también a 1 atm).

Los organismos aislados a mas de 500 atm son barofílicos, con un crecimiento óptimo a 400 atm. A más de 10.000 m de profundidad se obtienen los barófilos extremos o estrictos (necesitan mas de 400 atm para crecer). En general la temperatura óptima es de aproximadamente 2oC. Por enzima de 10 oC disminuye su viabilidad.

La presión puede afectar la expresión de genes en las bacterias barofílicas. Las proteínas de la pared celular y las estructuras relacionadas con la pared celular, asícomo los transportadores parecen ser los componentes con mayor variabilidad. La presión actúa de manera selectiva para regular la transcripción de genes específicos que codifican las proteínas necesarias para el crecimiento a alta presión.

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Crecimiento de bacterias barotolerantes, barofílicas y barofílicas extremas

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FIN