高速条件付きノックアウト 動物作成法 - jst1 高速条件付きノックアウト...
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1
高速条件付きノックアウト動物作成法
群馬大学 生体調節研究所
生体情報ゲノムリソースセンター
教授 畑田 出穂
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コンディショナルノックアウト動物は創薬研究に不可欠
通常のノックアウト動物×
疾患モデル動物を用いた病態解明、標的妥当性評価に必要
特定の臓器だけ遺伝子破壊
・ほとんどの遺伝子の解析が可能。・薬剤の効果や副作用が起こる臓器
を特定できる。
コンディショナルノックアウト動物
Cre/loxP
Floxマウス
loxP(34bp) loxP(34bp)
標的遺伝子exon
遺伝子が機能
・6割の遺伝子が胎生致死で解析不能・薬剤の効果や副作用が起こる臓器を
特定不可能。
CRISPR/Cas9で作製容易
CRISPR/Cas9で作製困難(ES細胞で年単位で作製)
loxP 左右のloxPがCreによる組換えでexon欠損
組織特異的Creリコンビナーゼ発現マウス
× 交配
loxPの組換えをおこなう
本発明の経緯1
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標的20bp PAM配列
gRNA
Cas9
非相同的末端結合(NHEJ)(挿入・欠失) 相同組換え修復(HDR)
遺伝子ノックアウト 遺伝子ノックイン
ドナーDNAゲノムの特異的切断
遺伝子改変部位
CRISPR/Casゲノム編集法
本発明の経緯2
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Exon
染色体欠失 (Deletion)が起きやすいため、Floxになりにくい
1ステップ法(従来法)
loxP loxP
両方同時に切断してノックイン
CRISPR/Cas法
問題点
2ステップ法は染色体欠失が起きにくい
2ステップ法(新規法)
Exon
染色体欠失 (Deletion)が起きにくいため、Floxになりやすい
loxP
loxP
Exon
Exon
片方ずつ切断してノックイン
受精卵
2細胞胚
CRISPR/Cas法
組換え
組換え
~
相補配列+ loxPオリゴ
本発明の内容1
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Mecp2遺伝子
マイクロインジェクション法では、2-stepはFlox効率は上昇するが、生存率が極めて悪い。
0%
5%
10%
15%
20%
25%
1-step 2-step
Flox効率(Flox数/胚盤胞数)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1-step 2-step
染色体欠失(欠失数/胚盤胞数)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1-step 2-step
生存率(胚盤胞数/受精卵数)
本発明の内容2
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導入法の比較検討
マイクロインジェクション法
1) マイクロマニピュレーターの習熟が必要。2) 処理に時間がかかる(100個/1時間)。3) 設備費が高い(1,000万円程度)。4) 受精卵への物理的ダメージ大きい。5) 受精卵に何でも導入可能。
いろんな装置が必要
エレクトロポレーション法
1) 初心者でも可能!2) 処理時間は一瞬(100個/10分)!3) 設備費が安い(100万円程度)!4) 受精卵への物理的ダメージ少ない。5) 大きな物質は導入できない。
(Kaneko et al., 2014; Takemoto & Hashomoto, 2015)
本発明の内容3
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エレクトロポレーション法はインジェクション法に比べ受精卵へのダメージが少ないため、生存率が高い
生存率(胚盤胞数/受精卵数)
エレクトロポレーション
インジェクション
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1-step 2-step 1-step 2-step
Flox効率(生存率考慮)(1-step インジェクションを x1とす
る))
エレクトロポレーション
インジェクション
0%
20%
40%
60%
80%
100%
1-step 2-step 1-step 2-ste
X 5
X 20
X 10
X 15
X 1
(従来法)
本発明の内容4
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0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
1-step 2-step
染色体欠失
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
1-step 2-step
Flox効率
0%2%4%6%8%
10%12%14%16%
1-step 2-step
Flox効率
2-stepのエレクトロポレーションによりFloxマウスが効率良く産まれた
Mecp2 遺伝子 Tet3 遺伝子
× 0.14× 7.3
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
1-step 2-step
染色体欠失
× 0.27×3.0
組織特異的Creマウスで直接作製でも同様の成績
エレクトロポレーション
本発明の内容5
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野生型♀
×第1ステップ 第2ステップ
左のlox挿入 右のlox挿入
Cre/loxマウス受精卵 2細胞期胚
エクソン
胚移植
Flox
Creマウス♂
特定の臓器で遺伝子破壊
新規法
最短1ヵ月
交配
×
現行のコンディショナルノックアウトマウス作製ES細胞でFlox作製 キメラマウス
×
1~2年
交配 交配
野生型
Flox
Creマウス
Cre/loxマウス
Flox
特定の臓器で遺伝子破壊
Floxマウス
エクソン
先行技術との比較
先行技術との比較して迅速である
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2
新技術の特徴・従来技術との比較
1. 非常に簡便な技術であるため大量生産に適している。
・Cas9タンパク質, gRNA, 合成オリゴDNA(155bp:ドナー)などすべて 購入した素材を用いている。⇔他の方法だと長いplasmidドナー(kb単位) 、1本鎖DNAなどを使用するため作製に熟練と労力が必要。・エレクトロポレーションを用いるので熟練が不要。
2. 迅速である:1ヶ月
3. 安価である:15万円(作製のみの材料実費)
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3
想定される用途
• 本技術の特徴を生かすためには、疾患モデル動物製造に適用することで開発研究の迅速化のメリットが大きいと考えられる。
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4
企業への期待
• 従来作製に時間を要した条件付きノックアウト動物作製については、本技術により克服できると考えている。
• マウス以外の動物や大型動物の技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、製薬会社など疾患モデル動物を多量に作製し創薬開発への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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5
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :条件付きノックアウト動物の製造方法
• 出願番号 :特願2016-254276• 出願人 :群馬大学• 発明者 :畑田出穂、堀居拓郎
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6
産学連携の経歴
• 2001年 (株)DNAチップ研究所とDNAチップを用いたメチル化解析法に関る特許を共同出願
• 2006年 JST A-Step事業に採択• 2006年- (株)DNAチップ研究所にてDNAチップを用
いたメチル化解析法の受託解析を開始
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1
お問い合わせ先
群馬大学 産学連携・知的財産活用センター
〒376-8515 群馬県桐生市天神町1-5-1
TEL 0277-30-1171~1175
FAX 0277-30-1178
e-mail tlo@ml.gunma-u.ac.jp
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