efecto de proteínas exógenas en la apoptosis...
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Efecto de proteínas exógenas en la apoptosis inducida con dexametasona en un línea celular de linfocitos B Raji y en células mononucleares de sangre periférica.
RESUMEN Las proteínas de choque térmico (HSP) son macromoléculas altamente conservadas en estructura y función, se expresan constitutivamente en todas las células eucarióntas y procarióntas, se incrementa su síntesis rápidamente en diferentes condiciones de estrés fisiológico y ambiental, lo que ayuda a la célula a resistir el daño causado por estos estímulos. Se ha demostrado que las HSP pueden tener función antiapoptótica que se puede atribuir aunque no siempre a su función como chaperonas. Además, se ha reportado que la GroEL de E. coli protege de la muerte por apoptosis inducida con radiación UV a una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT). Recientemente, nuestro grupo reporto efecto protector de las HSP60 enterobacterianas en la apoptosis inducida con dexametasona (DXM) en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con espondiloartropatías y sujetos sanos. Además, se observó que para que se lleve a cabo el efecto protector de las HSP60 enterobacterianas, se requiere de la interiorización de la proteína por parte de la célula. Por lo tanto, en el presente trabajo extendimos nuestro estudio, para analizar el efecto de las proteínas enterobacterianas de choque térmico de 60 KDa de E. coli y K. pneumoniae en la apoptosis inducida con dexametasona en una línea celular de linfocitos B Raji y en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de sujetos sanos. El análisis del porcentaje de células apoptóticas se realizó por la técnica de pico SubG0 en un clitómetro de flujo. La inducción de apoptosis para ambos cultivos celulares (1X106 células/mL), se realizo con dexametasona (DXM) a una concentración final de 1µM. Para evaluar el efecto de las HSP60 enterobacterianas en la apoptosis inducida con DXM, los cultivos celulares se incubaron con 5µg de cada una de las proteínas 1 hora previo a la inducción de la apoptosis con la DXM. Se incluyeron en cada uno de los ensayos testigos de células sin ningún estímulo y células con cada una de las proteínas. El resultado del valor medio del porcentaje de células apoptóticas obtenidas con DXM fue de 26.23% para linfocitos B y de 22.82% para las CMSP. Porcentaje que no disminuyo significativamente en los linfocitos B Raji, cuando se incubaron con las HSP60 de E. coli y K. pneumoniae (25.47% y 24.38% respectivamente), contrario a lo observado con las CMSP, donde la disminución fue significativa (p≤0.01) para ambas proteínas (15.13% y 15.79% respectivamente). Las proteínas probadas no mostraron efecto inductor de apoptosis para ninguno de los cultivos celulares. El efecto protector de las proteínas enterobacterianas en la apoptosis inducida con DXM sólo se observo en las CMSP y no en los linfocitos B Raji, estos datos sugieren que el efecto protector que pueden ejercer las proteínas enterobacterianas va a depender del tipo celular.
INTRODUCCION Proteínas de choque térmico (HSPs) y la respuesta inmune. La respuesta al
estrés o choque térmico es una de las más específicas y altamente conservada
en la naturaleza. En los organismos unicelulares, la respuesta al estrés les
confiere tolerancia a una variedad de condiciones de estrés, incluyendo a la
hipertermia, hiperoxia y otras alteraciones que modifican la síntesis de proteínas.
Este fenómeno de tolerancia es importante en los organismos multicelulares, no
sólo en la tolerancia térmica, sino también en la resistencia al estrés del organismo
completo cuando sufre daño provocado por isquemia, enfermedades infecciosas,
exposición a agentes físicos y químicos etc. El papel central de las HSP en la transferencia de péptidos a través de la célula,
puede ser el responsable de la importancia de estas proteínas en la modulación
del sistema inmune (Feder y Hofmann, 1999). Estudios realizados en mamíferos
sobre la respuesta inmune humoral y celular hacia agentes infecciosos, mostraron
que miembros de las HSP60 y HSP70 son altamente inmunodominantes, dada su
elevada homología estructural, esto fue sorprendente, debido al riesgo aparente
de desencadenar autoinmunidad y enfermedad autoinmune durante la defensa del
organismo contra agentes infecciosos. Sin embargo, estudios realizados sobre la
respuesta inmune a las HSPs en modelos animales de enfermedades
autoinmunes, cambió el punto de vista, de que la autoinmunidad necesariamente
conduce a enfermedad autoinmune. Se ha encontrado que la modulación de
autoinmunidad de las HSPs es una forma de prevenir enfermedades autoinmunes.
Por lo menos en algunos casos el tratamiento de enfermedades autoinmunes por
inmunización con HSP parece viable (Feige y van Eden, 1996).
La importancia de las HSPs en la regulación de la respuesta inmune es mejor
entendida usando la teoría de peligro propuesta por Matzinger en 1994. Esta
sugiere que el modelo de sistema inmune basado en la diferenciación entre “lo
propio y lo no propio”, no podría explicar fácilmente los cambios que ocurren en el
organismo cuando este crece y se desarrolla. Por ejemplo, un organismo no se
autodestruye cuando el sistema inmune encuentra un gran número de nuevos
péptidos generados en la pubertad; en su lugar dicha teoría propone un modelo de
la función inmune basado en la capacidad para detectar y señalar el peligro
(Matzinger y Fuchs, 1996). La teoría del peligro establece que la función básica de
todas las células del organismo es de duración limitada, es decir, que las células
mueren de “causas naturales” por apoptosis, la cual no genera señales de estrés.
Si la célula sufre daño por un agente infeccioso o su muerte se debe a necrosis o
isquemia la célula sufre de estrés y al lisarse libera complejos HSP-péptido al
ambiente extracelular. Las HSP no sólo funcionan como señal de peligro para
alertar el sistema inmune de la muerte de células bajo estrés, sino que su papel
como proteínas acarreadoras permite que las células inmunes efectoras
reconozcan los péptidos liberados por estas células estresadas y se activen contra
péptidos nuevos o extraños acarreados por las proteínas de estrés (Moseley,
2000).
Apoptosis y proteínas de choque térmico (HSP). La muerte por apoptosis
puede ser desencadenada por diferentes señales intra o extracelulares. Las
señales intracelulares son originadas en muchos casos por estrés biológico, lo
cual trae como consecuencia la liberación de citocromo c de la mitocondria,
conocida como vía intrínseca, mientras que algunas señales extracelulares
desencadenan el proceso apoptótico al unirse a su ligando presente en la
membrana plasmática de la célula blanco, la cual se conoce como vía extrínseca
(Sánchez y col, 2003). La naturaleza de los inductores puede ser fisiológica
(hormonas, citocinas), biológica (bacterias, virus, parásitos), química (drogas
quimioterapéuticas) y físicas (radiaciones UV, radiaciones γ) (Baumann y col,
2002). La célula que ha recibido una señal que induce apoptosis, pierde contacto,
o se separa de sus células colindantes y se exhibe una condensación
característica de la cromatina y el citoplasma. El ADN se divide en fragmentos de
180 y 200 pares de bases, además de múltiplos de estos. La apoptosis esta
acompañada por encogimiento celular, la desestabilización de la membrana
plasmática, la exposición de fosfatidilserina en la misma, la formación de
protuberancias vesiculares, que conllevan al surgimiento de cuerpos apoptóticos,
los cuales se caracterizan por el contenido de organelos celulares condensados y
fragmentos de cromatina (Baumann y col, 2002).
A nivel bioquímico, un inductor de apoptosis, llega a su célula blanco gracias a
intermediarios que dirigen dicha señal, hacia la maquinaria enzimática
responsable de los cambios celulares durante la apoptosis, estos intermediarios
son conocidos como caspasas, estas son sintetizadas como proenzimas
(zimógenos), las cuales son activadas por su rompimiento proteolítico. La enzima
activa es un complejo heterotetramérico de dos subunidades grandes, que
contienen el sitio activo y dos subunidades pequeñas (Baumann y col, 2002).
Las caspasas pueden dividirse en tres subfamilias funcionales: Caspasas no
apoptóticas (caspasas -1, -4 y –5), iniciadores de caspasas, las cuales están
involucradas en la regulación de los eventos durante la apoptosis (caspasas -8,-9,-
2 y-10) y efectores de caspasas, las cuales son directamente responsables de los
cambios celulares, además de ser sustratos de los iniciadores de caspasas
(caspasa -3,-6 y –7) (Baumann y col, 2002).
Se han descrito de manera general dos cascadas o vías de inducción de
apoptosis, las cuales pueden unirse en un componente común, que es la caspasa
–3.
Vía extrínseca. Un receptor importante de señales de muerte, es una proteína de
superficie llamada Fas (CD95). Muchas células expresan Fas cuando se
encuentran propensas al suicidio, ya que Fas posibilita su destrucción por otras
células que expresan una proteína de superficie denominada ligando de Fas
(FasL), cuando se posibilita la unión de Fas y FasL, se desencadena la
trimerización de Fas (Sánchez y col, 2003 y 2). La unión provoca el reclutamiento
de DISC (death inducing signaling complex) al dominio citoplásmico de Fas. DISC
contiene proteínas adaptadoras que permiten la unión de procaspasa-8,
favoreciendo su activación; la caspasa-8 puede activar las caspasas efectoras –3,-
6 y –7. Además de lo antes citado, la caspasa-8 puede activar a Bid (miembro
proapoptótico de la familia de Bcl-2) y esta inducir la liberación de citocromo c y
Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) de la mitocondria para formar el
apoptosoma y activar también la vía intrínseca. En algunos casos, las células bajo
estrés expresan tanto Fas como FasL en sus superficies y de esta manera,
desencadenar su propia muerte (Sánchez y col, 2003).
Vía intrínseca. También conocida como vía mitocondrial, se activa por estrés y
otras señales, que provocan la traslocación a la mitocondria de miembros
proapoptoticos de la familia Bcl-2, como Bax, lo que provoca la liberación de
citocromo c, que es un componente de la cadena de transporte de electrones, que
al entrar en el citoplasma, activa con gran potencia, la cascada de las caspasas. El
citocromo c produce este efecto al unirse con una proteína citosólica, formando un
complejo que activa a la caspasa-9, la cual puede activar a su vez a las caspasas-
3,-6 y –7. Una segunda proteína liberada, llamada factor inductor de apoptosis
(AIF; del ingles apoptosis-inducing factor), es capaz de inducir colapso nuclear,
desintegración cromosómica y otros signos de apoptosis. El AIF también causa
que la fosfatidilserina, normalmente presente en la cara interna de la membrana
plasmática, quede expuesta en la superficie celular; esta modificación de la
organización de lípidos en la superficie, promueve el retiro de la célula agonizante
y representa uno de los signos tempranos de apoptosis. Algunas células
apoptóticas, también muestran evidencia de daño, causadas por especies
reactivas del oxigeno, los cuales son productos tóxicos intermediarios del
metabolismo aeróbico mitocondrial (Sánchez y col, 2003).
Aunque la muerte celular ocurre de manera constante en el organismo, las células
que están muriendo por apoptosis, son rara vez vistas in situ, debido a que son
rápidamente removidas por fagocitos. Este hecho diferencia a la apoptosis de la
necrosis, ya que en esta ultima hay liberación de contenido citoplásmico, lo que
desencadena un proceso inflamatorio. Un requerimiento esencial para que las
células apoptóticas sean reconocidas y fagocitadas es la expresión de un ligando
adecuado en su superficie celular y de su contraparte en el fagocito. Entre las
moléculas de superficie, se pueden citar algunas lectinas, integrinas, receptores
“scavenger”, ABC transportadores, CD14 y receptores del complemento. Uno de
los mecanismos de reconocimiento mas ampliamente estudiado y que al parecer
es una señal que siempre esta presente en linfocitos apoptóticos, es la perdida de
la asimetría de la membrana celular, la cual tiene como consecuencia la
exposición de la membrana externa de moléculas de fosfatidilserina (FS), que de
manera normal están restringidas a la parte interna. Se ha propuesto que la
exposición de la FS es una señal suficiente para inducir la fagocitosis de las
células que la expresan (Sánchez y col, 2003).
Se ha reportado que las HSP intracelulares pueden tener función antiapoptótica
que puede ser atribuida a su actividad como chaperonas (Beere y Green, 2001;
Parcellier y col, 2003). El papel de regulación de las HSP parece depender de su
propiedad para interactuar con proteínas o sustratos polipeptídicos (Georgopoulos
y Welch, 1993). Numerosos estudios han atribuido los efectos promotores de
supervivencia de las HSP a su actividad para suprimir compromisos de apoptosis
en respuesta a varios estímulos incluyendo el calor, daño al DNA y ligando a
receptor de muerte. Estas observaciones se enfocan en la inhibición de la
maduración proteolítica y/o actividad de caspasas. Por lo tanto, la inhibición de
activación de caspasas por las HSP podría indicar la regulación negativa de uno o
más puntos sin la señalización múltiple en la cascada apoptótica (Mao y col, 2003;
Beere y col, 2000; Garrido y col, 1999; Mosser y col, 2000).
Las HSP en la vía intrínseca. El papel que juegan las HSP en el crecimiento
celular y la apoptosis ha sido de gran interés. Las HSP90 y su cochaperona
HSP27 pueden prevenir la translocación de Bid a la mitocondria , lo cual ha sido
relacionado a su capacidad para estabilizar el citoesqueleto, así como también se
ha observado que ambas pueden mantener la fosforilación de Akt para que este a
su vez lleve acabo la fosforilación Bad y esta pueda ser reconocida y
secuestrada por las proteínas 14-3-3, lo que previene su heterodimerización con
Bcl-2 y con Bclx L , fosforilación e inactivación de factores de transcripción, que
tienen como blanco los genes de FasL activación de la vía NF-κB, el cual se
trasloca al núcleo, donde promueve la y Bim. Por otro lado promueven la
fosforlación de IκB lo que permite la trascripción de genes anti-apoptótico como; c-
IAP1, c-IAP2. La unión directa de la HSP27 con el citocromo c también impide la
unión de este con Apaf-1, inhibiendo así la formación del apoptosoma y la unión
de la proteína también con Smac/DIABLO favorece que la proteína anti-apoptótica
XIAP ejerza su efecto inhibidor de apoptosis sobre la caspasa 3. Se ha observado
también que la HSP90 puede evitar la oligomerización del apoptosoma y la HSP70
inhibe la translocación de la procaspasa 9 hacia el apoptosoma evitando así su
activación (Beere, 2005)
La HSP70 y su cochaperona HSP40 previene la translocación de Bax (molécula
proapoptotica) hacia la membrana mitocondrial (Li y col, 2004; Beere, 2005). AIF
(apoptosis inducing factor), normalmente reside en el espacio intermembranal de
la mitocondria, pero cuando la célula recibe el estímulo apoptótico se transloca
hacia el citosol y al núcleo donde participa en la muerte independiente de la
actividad de caspasas, sin embargo esto es inhibido cuando la HSP70 se une
directamente a AIF, lo cual ha sido atribuido a su capacidad para mantener la
integridad de la membrana lisosomal y de esta manera prevenir la liberación de
catepsina hacia el citosol (Ravagnan y col, 2001).
Las HSP en la vía extrínseca. La vía extrínseca de la apoptosis puede ser
iniciada por uno de varios receptores de muerte en la superficie celular cuando se
unen a su ligando apropiado. Se ha demostrado que las HSP como chaperonas
pueden modular eventos de señales de transducción apóptotica vía Fas, TNF
(tumor necrosis factor), JNK, de caspasas y TRAIL (TNF-related apoptosis-
inducing ligand). La inducción de apoptosis mediada por Fas es regulada por
varias HSP incluyendo la HSP27 y la HSP70 , estas proteínas parecen suprimir la
apoptosis por unión e inhibición de DAXX y ASK-1 (apoptosis-signal-regulated
kinase), respectivamente, impidiendo la fosforilación de JNK y esta a su vez la no
fosforilación de proteínas proapoptóticas como Bax, Bad, Bim entre otras y de esta
manera evitar su translocación hacia la membrana mitocondrial e impide la
formación de poros y por lo tanto la salida de citocromo c (Charette y col, 2000;
Park y col, 2002).
La HSP70 parece participar suprimiendo la activación de JNK mediante su
defosforilación, sugiriendo un mecanismo independiente de su actividad como
chaperona (Mosser y col, 2000). La HSP90 también tiene un papel en la
modulación de la señalización por el receptor TNF cuando se une a su ligando
TNFR-1, el receptor recluta a la proteína RIP (receptor interacting protein) y
promueve la activación de NF-κB y JNK. La HSP90 interactúa con RIP, resultando
en su estabilización para evitar su degradación y aumentar la señal para inducir la
actividad de NF-κB vía TNF e incrementar la sobrevivencia de la célula. Otra ruta
por la cual actúa la HSP90 y su cochaperona Cdc37 es a nivel de su unión con el
complejo IKK (multisubunit IkB Kinase (IKK) complex) donde una vez unido a el,
IκB puede ser fosforilado para su ubiquitinación y de esta manera NFκB ser
liberado y translocarse al núcleo para llevarse a cabo la inducción de transcripción
de genes que codifican para proteínas antiapoptóticas. La HSP90 y su
cochaperona la HSP27 pueden evitar la desfosforilación de Akt y así ayudar a
mantener su estabilidad y actividad, lo que lleva mejorar la supervivencia celular
vía NFκB (Lewis y col, 2000).
Las proteínas de choque térmico, se encuentran entre las proteínas mas
conservadas en la historia evolutiva de los organismos eucariontes y procariontes.
El aumento de los niveles basales de las proteínas de choque térmico se puede
deber a la existencia de tres tipos de factores ambientales: (1) Factores físicos,
como lo es la exposición a altas temperaturas, radiación ultravioleta; (2) factores
químicos, como la exposición a compuestos derivados de las industrias, citando
como ejemplos el monóxido de carbono, metales pesados y polvo; y factores
biológicos, que comprenden las infecciones provocadas por virus, bacterias,
parásitos y hongos. La exposición a este tipo de estrés, no solo contribuye en la
inducción de las proteínas de choque térmico, sino que también contribuye al
aumento de los niveles de anticuerpos contra las HSP. Muchos factores pueden
contribuir a la producción de anticuerpos contra las proteínas de choque térmico:
factores genéticos, infecciones, la desnaturalización y liberación de las HSP como
resultado de la demanda celular por necrosis, y la presencia de antígenos
específicos, con relación a las condiciones ambientales de estrés. La producción
de anticuerpos contra las proteínas de choque térmico, están asociados con
cambios corporales y con algunas enfermedades reumáticas (Wu y col, 2006).
Las proteínas son moléculas gigantes compuestas por aminoácidos enlazados
que se pliegan para formar una estructura tridimensional, llamada conformación
terciaria, que esta relacionada con su función especifica. El estrés genera cambios
en la conformación terciaria de la proteína, desplegándola, exponiendo al agua a
los aminoácidos hidrofóbicos, causando la perdida de su función. Este proceso, es
llamado desnaturalización de la proteína. Entre proteínas desnaturalizadas
ocurren interacciones hidrofóbicas que hacen que se atraigan entre si y se
agreguen. Las HSP parecen ayudar a la célula con las proteínas desnaturalizadas,
ya sea uniéndose a ellas para evitar su agregación, marcándolas para luego
degradarlas, o manteniéndolas desplegadas en un estado competente, para que
una ves terminado el estrés puedan volver a plegarse y recuperar su función
normal. En el estado competente la proteína no puede llevar a cabo su función, ya
que no se encuentra plegada en su forma tridimensional; pero todos los
aminoácidos que la componen siguen unidos en su estructura primaria, listos para
ser plegados de nuevo (Rodríguez y col).
Se ha visto que muchas HSP están siempre presentes, aunque cuando hay estrés
sus niveles suben. Se cree que su función principal es asistir al plegamiento de
algunas proteínas recién sintetizadas, por lo que se les denomina chaperonas
moleculares. Estas proteínas no forman parte de la estructura final de la proteína
funcional, solo se une a ella para asistir su plegamiento, ensamblaje y traslocación
a otra parte de la célula donde la proteína cumple su función. Hay dos hechos que
evidencian que las chaperonas asisten el plegamiento de las proteínas: primero,
ciertas proteínas recién sintetizadas están transitoriamente asociadas a moléculas
chaperonas, y segundo, se ha observado a las chaperonas asistir en el
plegamiento de las proteínas in Vitro (Rodríguez y col).
Se cree también, que los distintos grupos de HSP, por ejemplo, una proteína como
la rodanasa, cuando se desnaturaliza, se une a la HSP70 y esta previene su
agregación manteniéndola en estado competente hasta que se una a la HSP60
que es la que media el paso del estado competente a la estructura plegada
funcional. Los cambios de una proteína pueden comprometer a varias chaperonas,
dependiendo de su propia estructura y de la disponibilidad de las chaperonas
(Rodríguez y col).
Cuando el factor estresante es eliminado, las células continúan normalmente su
metabolismo. Si por el contrario el estrés continúa aumentando, la función
protectora de las HSP se ve diezmada y el organismo detiene su producción y
activa el programa de muerte autoinducida (Rodríguez y col).
Las proteínas de choque térmico, juegan un papel muy importante en la auto
inmunidad, ya que diversos estudios, han comprobado que las HSP, facilitan la
respuesta inmune para péptidos y proteínas, hecho que ha sido documentado in
vivo e in Vitro. Recientes evidencias que se han encontrado en estudios con
modelos animales y en pacientes con enfermedades auto inmunes, se ha
observado claramente que las HSP están involucradas en la patogénesis y la
inmunoregulación de estas enfermedades, esto tal vez tenga importantes
aplicaciones terapéuticas, para el tratamiento de enfermedades auto inmunes (Wu
y col, 2006).
Como ya se menciono anteriormente, existe un tipo de agresión ambiental, para
aumentar los niveles basales de proteínas de choque térmico, que son los factores
biológicos (virus, bacterias, parásitos y hongos), por lo que el sistema inmune
tiene como función el reconocimiento de los antígenos microbianos para proteger
al hospedero de la infección, pero muchos datos sugieren la importancia de la
primera línea de defensa que involucra a las proteínas de choque térmico,
especialmente algunas que se encuentran altamente conservadas, las HSP60. El
estimulo biológico provoca la aparición de un alto grado de secuencias homologas
mediadas por las HSP, desencadenando la producción de anticuerpos contra las
HSP que por un lado ayudan a la protección del hospedero a la infección, pero de
manera contraria la presencia de estos anticuerpos contribuyen directamente a la
reactividad cruzada mediada por las HSP, lo cual provoca el reconocimiento de
epítopos en tejidos específicos, por lo que no se conoce a ciencia cierta si las
proteínas de choque térmico son benéficas o dañinas. La producción de estos
anticuerpos están involucrados en el desarrollo de muchas enfermedades auto
inmunes y/o enfermedades inflamatorias, como lupus eritematoso sistémico,
artritis reumatoide, esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto, glomerulonefritis,
enfermedad de Addison, hepatitis activa crónica, cirrosis primaria y arteriosclerosis
(Wu y col, 2006).
Línea celular Raji. Durante muchos años se conocieron las limitaciones que
existían en algunas técnicas, para poder observar desordenes en el sistema
retículo-endotelial, un ejemplo es la inclusión en parafina, dicha técnica no
permitía diferenciar cuando se trataba solamente de un proceso inflamatorio, o del
comienzo de una neoplasia, para lo cual se trato de idear una técnica que
permitiera observar las células vivas. Para poder obtener un cultivo integro de
células, fue necesario tomar en cuenta diversas variables, por ejemplo el método
de recolección de las células vivas, la estructura celular, la naturaleza del órgano
del cual se van a extraer, el tiempo que toma la obtención celular, entre otras
variantes. Indudablemente en este tipo de procesos entra también un factor
crucial, que es la experiencia y la aptitud del personal que ejecutara el método. De
esta manera comienza el desarrollo de las técnicas de obtención de cultivos
celulares. En un inicio, el problema no era obtener el cultivo celular primario, sino
que las contrariedades radicaban en el subcultivo de estas células, ya que estas
no podían conservarse viables por largos periodos de tiempo, alrededor de 48
horas (Pulvertaft, 1965). Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, se
emprendieron diversos estudios de neoplasias malignas en niños de Nigeria. Los
primero estudios patológicos presentados, mostraron que se trataba de un tipo de
linfosarcoma, de difícil clasificación. Posteriormente este tipo de neoplasia se
denomino “linfoma de Burkitt” (Pulvertaft, 1965). Posteriormente se desarrollaron
técnicas nuevas para la conservación de la integridad celular, se utilizaron
soportes como agar, colágeno y medio de cultivo celular suplementado con suero
al 10%, lo que ayudo importantemente a la observación de este tipo celular y su
posterior clasificación. La línea celular Raji se obtuvo por el científico Pulvertaft a
partir de la necropsia de un ganglio linfático que provenía de un niño nigeriano con
linfoma de Burkitt, con la ayuda de las nuevas técnicas de cultivo celular, éste
material se estudio, por un grupo de investigadores en la ciudad de Londres. Se
pudieron apreciar diversas particularidades de estas células. Las células eran
grandes a menudo multinucleadas y con nucleolo prominente, el fenómeno de
mitosis se encuentro incrementado y el citoplasma presento granularidad muy
marcada, estas células presentaron gran estabilidad en cultivo, mientras que el
material obtenido de la enfermedad de Hodkin y el reticulosarcoma, presento
rápida autolisis (Pulvertaft, 1965). Para poder preservar a la línea celular, se
realizaron diversos ensayos de conservación, se utilizaron condiciones variadas
de aerobiosis y anaerobiosis, diferentes medios y temperaturas. Posteriormente se
cultivaron utilizando medio de cultivo con agar, se observó que las células se
desprenden fácilmente de esta superficie y en vidrio no presentaban adherencia.
Se probó con colágeno, el cual fue exitoso, ya que las células se adherían
perfectamente a este tipo de superficie. La fijación de las células al colágeno,
permitió apreciar con mayor nitidez la presencia de una alta granularidad en el
citoplasma, siendo esta particularidad, muy útil para el diagnóstico futuro de este
tipo de enfermedad. Los gránulos son usualmente intracelulares, pero pueden
adherirse en el exterior de la célula. La aparición de gránulos, puede estar
acompañada con la presencia de vacuolas, estas estructuras pueden apreciarse
con tinciones especificas, el núcleo tan bien posee una particularidad, ya que la
forma de este puede ser parecida a la de un trébol (Pulvertaft, 1965).
Como se menciono anteriormente, el cultivo celular se conservo, mediante la
utilización de diversas variantes para poder encontrar las mejores condiciones de
cultivo, por lo cual, las células se colocaron en suspensión, y se mantuvieron en
un medio de cultivo suplementado con suero humano al 10% y hasta el 30%, por
lo cual se observo que las células se multiplicaban con mayor velocidad, además
de que tenían la particularidad de formar rosetas en la suspensión. Actualmente la
mejor manera de conservar este tipo de células es en suspensión (Pulvertaft,
1965).
Citofluorometría. Existen varias técnicas para la determinación de apoptosis que
hacen uso de la citofluorometría, las cuales se pueden dividir en tres grupos:
a) Detección de moléculas involucradas en la muerte apoptotica. Muchas de estas
utilizan anticuerpos acoplados a algún fluorocromo, están dirigidos contra una de
las moléculas involucradas en la muerte apoptotica (Fas (CD95), FasL (CD95L),
Bcl-2, p53, etc.). Uno de los eventos tempranos de la apoptosis es la perdida de la
asimetría de la membrana, durante la muerte apoptotica, la fosfatidilserina queda
expuesta hacia el exterior. Bajo ciertas concentraciones de calcio, la molécula de
anexina V, tiene afinidad especifica por este fosfolípido, por lo que se utiliza
acoplada a un fluorocromo como el FITC, a la par se utiliza el ioduro de propidio
(IP) como colorante supravital, lo que permite diferenciar entre las células
apoptóticas, que fijan la anexina V y excluyen al IP y a las células necróticas que
captan el IP. Las células vivas son negativas para ambos fluorocromos.
b) Análisis del ciclo celular. Permite de manera simultánea la cuantificación del
fenómeno apoptótico. Para la determinación se emplea un fluorocromo (IP, DAPI,
naranja de acridina) que se intercala de manera estequiométrica en el DNA, por lo
que es posible determinar el contenido relativo en cada una de las células y por lo
tanto diferenciar la fase del ciclo celular en que se encuentran cada una de ellas.
Así, las células en fase G0 o G1 presentan un contenido de DNA = 2N, cuando
entran en división e inician la síntesis de material genético la cantidad es mayor
(fase S), mientras que las células en mitosis tienen exactamente el doble de DNA
justo antes de separarse en dos células hijas (fase G2 y M), siendo entonces su
contenido igual a 4N; las células apoptóticas, en las que hay degradación de la
cromatina, presentan un contenido menor a 2N permitiendo ser cuantificadas por
la aparición de un pico en la región Sub-G0 (técnica de pico Sub-G0).con esta
técnica es posible apreciar simultáneamente la reducción de tamaño que
presentan las células en apoptosis.
c) Determinación de la actividad de caspasas. Esta técnica es útil cuando se
requiere establecer la ruta de inducción de apoptosis. Se emplea el sustrato de la
caspasa cuya actividad se requiera evidenciar unido a una molécula fluorogénica.
Si la enzima esta activa, actúa sobre su sustrato liberando la molécula
fluorogénica, volviéndose esta fluorescente y detectable en el citofluorómetro.
Sánchez- Diosdado 2003)
JUSTIFICACIÓN
Con base en lo anterior y los datos de nuestro grupo de trabajo, donde se ha
observado efecto protector de las proteínas de choque térmico de 60KDa (HSP60)
de Escherichia coli y de Klebsiella pneumoniae en la apoptosis inducida con
dexametasona (DXM) en células mononucleares de sangre periférica de sujetos
sanos y de pacientes con espondiloartropatías, en este trabajo, nos proponemos
evaluar el efecto de éstas proteínas en la apoptosis inducida con dexametasona
en linfocitos B Raji .
HIPÓTESIS
Las proteínas de choque térmico de Escherichia coli y de Klebsiella pneumoniae,
protegen de la muerte por apoptosis inducida con dexametasona a la línea celular
de linfocitos B Raji.
OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto que causan las proteínas de choque térmico de 60kDa de
Klebsiella pneumoniae y de Escherichia coli en la apoptosis inducida con
dexametasona en linfocitos B Raji y en CMSP.
OBJETIVOS PARTICULARES
Obtener y purificar las proteínas recombinantes de choque térmico de
60Kda de Klebsiella pneumoniae y de Escherichia coli.
Evaluar el efecto inductor de apoptosis de la dexametasona en linfocitos B
Raji y en CMSP.
Analizar el efecto de las proteínas de choque térmico de 60 kDa de
Klebsiella pneumoniae y de Escherichia coli en la apoptosis inducida con
dexametasona en linfocitos B Raji y en CMSP.
MATERIAL Y METODOS
Obtención de las proteínas de choque térmico de 60KDa de K. pneumoniae y E. coli. Las cepas de E. coli XL1-Blue transformada con el plásmido recombinante
que contenía el inserto del gen que codifica para la HSP60 de K. pneumoniae y E.
coli y que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para un residuo de 6
histidinas, se sembró en 5mL de medio liquido LB con ampicilina a una
concentración final de 50μg/mL. Este cultivo se mantuvo en incubación toda la
noche a 37°C y en agitación constante. El cultivo se transfirió a un matraz que
contenía 100mL de medio líquido LB con ampicilina y se mantuvo a 37°C con
agitación constante hasta que alcanzo una densidad óptica de 0.4-0.5 a 600nm.
Para inducir la síntesis de proteína recombinante se adiciono IPTG (Isopropyl-β-D-
thiogalactopyranoside, Research Organics Inc.) a una concentración final de 0.6
mM y se continuo con agitación durante 4h mas a 37°C.
El análisis de la proteína recombinante se realizo en geles de poliacrilamida al
12% en condiciones reductoras (PAGE-SDS-ME). Una vez que se comprobó la
inducción de la proteína (al observar una banda de mayor grosor con un tamaño
molecular de 60Kda, en el extracto total del cultivo con IPTG, se obtuvo el paquete
celular por centrifugación a 1200Xg durante 10 minutos, se resuspendió en 4 mL
de regulador de lisis (NaH2PO4 50mM, NaCl 300mM, Imidazol 10mM, 2-
mercaptoetanol 5mM, PMSF 1mM, pH 8-8.5) y para romper la bacteria la
suspensión celular se sonicó durante 10 minutos a intervalos de 1 minuto de
reposos y uno de sonicado a 180 Watts (Vibra Cell VC 375, CT USA),
manteniendo el cultivo en baño de hielo. Los detritus celulares se eliminaron por
centrifugación a 3020Xg durante 5 minutos. El sobrenadante rico en proteínas se
mezclo con 1.5mL de resina Ni-NTA agarosa (Qiagen, life technologies). La
proteína recombinante se unió a la resina mediante la interacción de las 6-
histidinas con el níquel. La mezcla se mantuvo en agitación constante a 200Xg a
una temperatura de 4°C durante una hora. La proteína que no interacciono con la
resina se elimino en el efluente al vaciar la mezcla en una columna, donde se
llevaron a cabo lavados con 8-10 mL de regulador de lavado (NaH2PO4 50mM,
NaCl 300mM, Imidazol 20mM, 2-mercaptoetanol 5mM, glicerol 10%, pH 8-8.5),
finalmente se realizo la elusión de la proteína recombinante con 8-10mL de
regulador de elusión (NaH2PO4 50mM, NaCl 300mM, Imidazol 250mM, 2-
mercaptoetanol 5mM, glicerol 10%, pH 8-8.5). Se obtuvieron elusiones de 500μL,
que se analizaron en PAGE-SDS-ME al 12% y las que contenían a la proteína
recombinante se mezclaron y se sometieron a diálisis contra PBS pH 7.4, durante
48 horas a temperatura de 4°C y en agitación constante en membranas de
celulosa (Spectrapor, exclusión 12,000-14,000 Da) para eliminar el exceso de
imidazol. La concentración de la proteína se determino por el método de Bradford
(1976). El análisis de pureza de la HSP60 de K.pneumoniae y E.coli se realizo por
PAGE-SDS-ME.
Mantenimiento y preservación de la línea celular de linfocitos B Raji. Para su
mantenimiento las células de un cultivo a una concentración aproximada de
20X106 células/mL en botellas de 75cm2, se recuperan para su estratificación
sobre Lymphoprep a una proporción de un volumen, por tres volúmenes de cultivo
celular. La purificación celular se realizó por centrifugación a 1600 rpm, durante 20
min a 4°C. Transcurrido este tiempo, se observo la formación de un anillo de
células en la interfase del medio de cultivo y del Lymphoprep. Se obtuvo el anillo
rico en células y se colocaron en tubos cónicos de 15 mL estériles, se realizaron
dos lavados de 5 y 10 mL con medio RPMI-1640 sin suplemento, las células se
centrifugaron a 1600rpm durante 15 min, La viabilidad celular se determino por
exclusión con el colorante azul tripano (azul tripano al 0.1%, en solución salina al
0.85%), se realizo una dilución 1:20 de la suspensión celular, para su recuento en
la cámara de Neubauer. Las células se ajustaron a una concentración de 1X106
células/mL, las cuales se colocaron en las botellas para cultivo celular de 75 cm2
(NUNC), con 20mL de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de
suero fetal bovino descomplementado por calor a 56°C por 30min en un baño
María, 1mM de L-glutamina, 1mM de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
Las células se incubaron en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37°C. El
cambio del medio de cultivo se realizo cada tres días. Para la congelación y
preservación de las células, se utilizaron cultivos con un crecimiento celular de una
semana (15-20 X106 células/mL). Las células se centrifugaron a 1600rpm durante
5min y se les determino la viabilidad celular (Azul tripano). Para cada 5X106
células/mL se utilizo DMSO (Dimetil-sulfoxido) diluido 1:10 con suero fetal bovino,
en un volumen final de 1.5mL y se procedió a la congelación, a una temperatura
de -70°C.
Descongelación de linfocitos B Raji. El procedimiento de descongelación
consiste en la recuperación de un vial preservado a –70°C, se ayuda a la
descongelación con la temperatura de la mano, el vial descongelado, se coloca en
un baño María a 37°C de 3 a 5 minutos. Transcurrido el tiempo se procedió a
colocar el contenido del vial en 10mL de medio RPMI-1640 suplementado, se
mezclo por inversión y se centrifugo a 1200rpm durante 5 minutos, para obtener
las células a las cuales se les realizo cuenta viable con azul tripano. Por ultimo,
las células se colocaron en 20mL de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado
en botellas de cultivo de 75 cm2 (NUNC).
Obtención de células para cultivos de trabajo. Para obtener células de trabajo,
se utilizaron cultivos con un crecimiento celular de una semana, del cual se tomo
una concentración aproximada de 10X106 células/mL, las células se adicionaron a
20 mL de medio RPMI-1640 suplementado y se colocaron en frascos para cultivo
de 75 cm2, el cultivo celular se incubo por tres días en una atmósfera húmeda con
5% de CO2 a 37°C.
Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Las
muestras de sangre periférica heparinizada (Inepar Lab Pisa) de 10 sujetos sanos
se estratificaron sobre Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway) en
proporción de un volumen por dos volúmenes de la muestra. Las muestras se
centrifugaron a 3200 rpm a 4ºC durante 20 minutos. Las CMSP obtenidas por
gradiente de densidad se lavaron dos veces con solución salina estéril a 2200 rpm
durante 10 minutos. La viabilidad celular se determinó por exclusión del colorante
azul tripano (azul tripano al 0.1% en solución salina estéril 0.85%) y se ajustaron a
1 X 106 células/mL, en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal
bovino inactivado por calor, L-glutamina 1mM, penicilina 100U/mL y
estreptomicina 100 μg/mL (Gibco).
Inducción de apoptosis con dexametasona y efecto de las proteínas enterobacterianas en linfocitos B Raji y en CMSP. Se obtuvo un paquete
celular a partir del cultivo de trabajo, las células con tres días de cultivo, se
obtuvieron por centrifugación durante 5 minutos a 1200rpm, la suspensión celular
se ajusto a 1X106 células /mL con medio RPMI-1640 suplementado y se colocaron
en placas de 24 pozos estériles. Para llevar a cabo la inducción de apoptosis, las
células se incubaron con 1μM de dexametasona (DXM) por 24 horas a 37°C en
una atmósfera de 5% de CO2. Para evaluar el efecto de las proteínas de choque
térmico de 60 kDa de Escherichia coli y de Klebsiella pneumoniae, sobre la
apoptosis inducida con DXM, las células se incubaron con 5 μg de cada proteína
durante 1h, previo a la inducción de la apoptosis con DXM. Para todos los
ensayos, se incluyeron testigos de células sin estímulo y con cada una de las
proteínas de choque térmico.
Análisis de la apoptosis en linfocitos B Raji y en las CMSP por la técnica de pico Sub-G0 en un citómetro de flujo. Transcurrido el tiempo de los ensayos
descritos arriba, se obtuvo el contenido de cada uno de los pozos de la placa en
tubos limpios para clitómetro, los cuales se centrifugaron a 1200rpm durante 5
minutos a una temperatura de 4°C, se elimino el sobrenadante y se coloco 500μL
de etanol frío al 70%, las muestras obtenidas se almacenaron a 4°C durante 1
hora. Transcurrido el tiempo de incubación, se elimino el etanol por medio de la
centrifugación a 1200rpm durante 5 minutos, posteriormente se realizo un lavado
con 2mL de PBS 1X (NaCl, K2HPO4, Na2HPO4.12H2O y KCl) frío a 1200rpm
durante 5 minutos, obtenido el paquete celular, se decanto el sobrenadante. Se
procedió a la adición de 500μL de PBS 1X a temperatura ambiente y 250μL de
regulador de permiabilización (NaH2PO4 0.2M y H3C6H5O7 0.1M) se incubo por 1
minuto y medio, transcurrido el tiempo, se centrifugo a 1200 rpm durante 5
minutos para eliminar el sobrenadante. Las muestras se resuspendieron en
regulador de resuspensión (10mL de PBS 1X, 250μL de Ioduro de propidio de una
solución stock de 1mg/mL y 0.73mg de RNAsa). El análisis de células apoptóticas
se realizo con base al contenido de DNA por la técnica de pico Sub-G0 por
citometría de flujo, se adquirieron 20000 eventos en la región R1. Todas las
muestras se adquirieron y analizaron en el programa Cell quest de un citómetro de
flujo FacsCalibur de tres colores (BD).
Tinción de linfocitos B Raji por el método de WRIGTH. Los linfocitos B a los
cuales se les indujo apoptosis con DXM y linfocitos sin inductor se centrifugaron a
1200rpm durante 5 minutos, se realizo una cuenta viable con el colorante azul-
tripano y se ajusto la suspensión a 5X105 células / mL, se realizaron dos lavados
con 500μL de PBS 1X a 1200rpm durante 5 minutos y por ultimo se resuspendió el
paquete celular en 200μL de PBS 1X. Para obtener la monocapa de células por
citocentrifugación, se utilizaron portaobjetos tratados albúmina y de centrifugaron a
800 rpm/3 minutos. Los portaobjetos se dejaron secar y se realizó la tinción. Los
portaobjetos se cubrieron totalmente con colorante de WRIGTH durante 10
minutos, transcurrido este tiempo, se coloco sobre el colorante el regulador de
fosfatos, soplando ligeramente para mezclar el colorante con el regulador, además
se observo la formación de una película de color verde metálico, esta mezcla se
dejo sobre el portaobjetos durante 10 minutos más, al terminar el tiempo de
tinción, se lavo la preparación por inversión, para evitar la formación de precipitado
del colorante. Las preparaciones, se dejaron secar al aire y se observo al
microscopio óptico (40X).
Resultados
Obtención de las proteínas de choque térmico de 60Kda de K. pneumoniae y E. coli. Para inducir la expresión de las proteínas de choque térmico
recombinantes, se adiciono IPTG a los cultivos de E.coli XL1-Blue transformadas
con el plásmido que codifica para estas proteínas. El análisis de inducción se
realizo en un gel de poliacrilamida a una concentración del 12% (PAGE-SDS-ME).
En la figura 3, se muestra el patrón electroforético del extracto soluble total (EST)
de la bacteria transformada sin IPTG (carril B) y con IPTG de K.pneumoniae y
E.coli respectivamente (carriles C y D), donde se puede observar un incremento
en la síntesis de la proteína con un peso molecular de 60Kda. La purificación de la
proteína se realizo mediante una columna conteniendo resina con níquel (Ni-NTA).
La pureza de la proteína se muestra en el carril D y F. La concentración de la
proteína obtenida, se determino mediante el método de Bradford, además la
proteína fue sometida a un proceso de diálisis con PBS para eliminar el exceso de
imidazol, en total se obtuvo de 700-800μg/mL por cada 100mL de cultivo
bacteriano inducido con IPTG.
Figura 1. Análisis en PAGE-SDS-ME al 12% de la inducción y purificación de la proteínas recombinantes de choque térmico de 60 kDa de K. pneumoniae y
de E. coli. Marcador de peso molecular (A). EST de E. coli XL1-Blue transformada
con el plásmido que codifican para la proteína de K. pneumoniae sin IPTG (B) y
cultivadas con IPTG K. pneumoniae y E. coli respectivamente (C y E), proteína
recombinante de choque térmico de 60 kDa pura (D y F).
A B C D E F
Análisis de células apoptóticas por la técnica pico SubGo. Un resultado
representativo obtenido por la técnica pico SubGo en un clitómetro de flujo, se
muestran en la Figura 2. En las primeras gráficas de puntos (Figura 2, panel A y B)
se muestra la región qué se realiza para seleccionar a las células en las diferentes
fases del ciclo celular, en donde el eje de las X representa la amplitud de la señal
y el eje de las Y el área bajo la curva de la señal amplificada (corresponde a la
integración de la fluorescencia total del evento). De esta región se integra y
analiza en un histograma, el contenido de DNA (intensidad de fluorescencia) para
cada célula (FL2-A) en las diferentes fases del ciclo celular; así las células en fase
G0/G1 presentan un contenido de DNA=2N, cuando entran en división e inician la
síntesis de material genético la cantidad es mayor (fase S), mientras que las
células en mitosis tienen el doble de DNA justo antes de separarse en dos células
hijas (fase G2/M), siendo su contenido de DNA igual a 4N. Las células apoptóticas
en las que hay degradación de la cromatina, presentan un contenido de DNA
menor a 2N permitiendo ser cuantificadas por la aparición de un pico por debajo
de la región Go/G1, llamado pico SubGo. Un resultado representativo de las
células sin ningún estímulo, se muestra en la Figura 5, panel B y C, donde se
puede observar el valor medio del porcentaje de células apoptóticas para linfocitos
B Raji y CMSP (6.17 y 5.14%, respectivamente), localizado en la región del pico
SubG0 en el histograma señalado.
Figurcitómselecchistogde flumono
0
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(C)
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200200200200
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(B)
(D)
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nido de DNAocitos B Ramente).
enido en un donde
el A y B) y lA (intensida
Raji y célul
un se os ad as
.Efecto de las HSP60 bacterianas de K.pneumoniae y E.coli, en la apoptosis
inducida con dexametasona en los linfocitos B Raji y en CMSP. En la figura 3, se
muestran los histogramas obtenidos en un clitómetro de flujo, donde se puede
observar el resultado de un ensayo representativo del efecto de las proteínas
enterobacterianas en la apoptosis inducida con DXM en linfocitos B Raji y CMSP.
Los resultados obtenidos del valor medio en porcentaje de células apoptóticas
inducidas con DXM y el efecto de las HSP60 de K. pneumoniae y de E. coli en
los linfocitos B Raji y en CMSP se muestran en la tabla No.1, donde se puede
observar, el porcentaje de apoptosis de los cultivos celulares sin estímulo a las 0 y
24h (6.17 y 4.81%) para los linfocitos B Raji, para las CMSP de 5.41 y 5.34%
respectivamente. Los testigos para la HSP60 de K. pneumoniae (5.62 y 5.67%) y
para E. coli (6.27 y 6.21%) en cada caso para linfocitos B Raji y CMSP
respectivamente. Cuando a las células se les indujo la muerte con DXM, el
porcentaje de células apoptóticas se incremento significativamente a 26.23% para
los linfocitos B Raji y a 22.82% para las CMSP. A los cultivos de células que se
incubaron con cada una de las proteínas enterobacterianas y después se les
indujo la muerte con DXM, el porcentaje de células apoptóticas que se observó
con el inductor no disminuyó significativamente para ambas proteínas en los
linfocitos B Raji, 24.38% para K. pneumoniae y 25.47% para E. coli (tabla 1,
figura 3, panel A). Sin embargo, para las CMSP si se observó disminución
significativa en el porcentaje de células apoptóticas con el inductor en presencia
de las dos proteínas; 15.79% para K. pneumoniae y 15.13% para E. coli (tabla 1,
figura 3, panel B).
(A)
(B)
(C)
Figurcitómcontede apde un
ra 3. Porcemetro de f
nido de DNpoptosis con sujeto san
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00 600ntenido de DNA
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00 600ntenido de DNA
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00 600ontenido de DNA
Testigo E. coli.
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eto
100010001000
800 1000800 100000
Tabla 1. Porcentaje de células apoptóticas en linfocitos B Raji y CMSP de sujetos sanos, contenido de DNA obtenido por pico SubG0 en un clitómetro de
flujo.
Linfocitos B Raji (n=10) CMSP (n=10)
Testigo 0h 6.17+/-2.96 5.14+/-1.28
Testigo 24h 4.81+/-1.16 5.34+/-1.28
DXM 26.23+/-4.02 22.82+/-7.71
Testigo HSP60Kp 5.62+/-1.73 5.67+/-2.13
HSP60Kp + DXM 24.38+/-3.85 15.79+/-6.92
Testigo HSP60Ec 6.27+/-3.29 6.21+/-2.71
HSP60Ec + DXM 25.47+/-3.33 15.13+/-7.10
Los resultados representan el valor de la media + una desviación estándar del porcentaje de células apoptóticas, se consideraron diferencias significativas cuando el valor de p<0.05.
Figura 5. Análisis del porcentaje de células apoptóticas en linfocitos B Raji y CMSP de sujetos sanos. Panel A. Efecto de las HSP60 de K. pneumoniae (Kp)
y de E. coli (Ec) en la apoptosis inducida con DXM en linfocitos B Raji (n=10) y en células mononucleares de sangre periférica (n=10)) de sujetos sanos (Panel B).
Se consideran diferencias significativas con un valor de p ≤ 0.05 (*).
(A)
(B)
0
10
20
30
40
50Testigo 0 h
Testigo 24 h
DXM
HSP60Kp
HSP60Kp+DXM
HSP60Ec
HSP60Ec+DXM
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** *
0
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HSP60EC
HSP60Ec+DXM
% d
e cé
lula
s ap
optó
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Tinción de linfocitos B Raji por el método de Wright. Los cultivos de linfocitos
B Raji sin estímulo y con el inductor de apoptosis DXM, se tiñeron con el colorante
de Wright. En al figura 6, panel A, se muestran las células sin estímulo, donde se
pueden apreciar células de diferente tamaño, con una membrana citoplasmática
homogénea y un núcleo con tinción intensa. Las células con el inductor de
apoptosis (DXM), se observan más pálidas en su coloración, su membrana
citoplasmática aunque esta integra, muestra pequeñas protuberancias que
indican cambios importantes en la célula y no se observan los núcleos.
Figurlinfoci
memb
puede
cuales
celula
obser
célula
(
(B
ra 6. Linfoitos B Ra
brana celul
en observa
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ar presenta
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(A)
B)
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ndujo apop
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Raji, tincióimulo, mo
énea (flecha
éolo (flecha
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DISCUSIÓN
La apoptosis juega un papel vital, en una gran variedad de procesos fisiológicos
en el sistema inmune y en el sistema nervioso central como los cambios
morfogenéticos durante el desarrollo embrionario, la homeostasis en los tejidos y
la eliminación de células dañinas, por lo que esta ampliamente involucrada en la
patogénesis de diversos desordenes humanos como el cáncer, las enfermedades
del sistema inmune, padecimientos cardiovasculares y muchas enfermedades
neurodegenerativas incluyendo el Alzheimer y el Parkinson, por lo que el estudio
de la misma es importante no solo para el entendimiento de sus procesos de
regulación en condiciones fisiológicas normales, sino también para definir la
fisiopatología de muchas de las enfermedades ya antes mencionadas y por lo
tanto ayudar a su tratamiento y control (Ssang-Goo y col 2002).
En los últimos años las proteínas de choque térmico (HSP) o proteínas de estrés
representan un paradigma emergente para la coordinación de los múltiples pasos
de regulación en la apoptosis, las cuales ayudan a la recuperación celular después
de la exposición a diversos estímulos apoptóticos. Las HSP constituyen un gran
grupo de proteínas altamente conservadas, las cuales se expresan
constitutivamente, mientras que algunas de ellas son sintetizadas rápidamente en
respuesta a una variedad de estímulos químicos, ambientales y de estrés
fisiológico. Actualmente se ha reportado que la subfamilia de HSP27, HSP70 y
HSP90, están directamente implicadas en la protección contra la muerte por
apoptosis inducida por una gran cantidad de estímulos incluyendo radiaciones
UV, choque térmico, falta de nutrientes, estrés químico, etc. En muchos de estos
casos se ha observado supresión a nivel de la activación de casapasas y
consecuentemente la inhibición a nivel de sustrato (Beere H. 2005).
Nuestro grupo de investigación ha reportado la participación de las proteínas de
choque térmico de 60 kDa enterobacterianas en la respuesta inmune celular y
humoral de sujetos sanos y de pacientes con espondiloartropatías (SpA)
(Domínguez-López y col, 2000 y 2002). Los resultados de proliferación celular en
CMSP en presencia de las HSP60 enterobacterianas, en ambos grupos de estudio,
nos permitió evaluar, la función que tienen estas proteínas a nivel de muerte celular
por apoptosis. Observamos que las HSP de 60 kDa enterobacterianas disminuyen
significativamente el porcentaje de células apoptóticas inducidas con DXM en
CMSP de sujetos sanos y de pacientes con SpA. Estos resultados sugieren, efecto
protector de las proteínas sobre la apoptosis inducida con DXM en éstas células
(Trujillo, 2005). Recientemente, observamos que el efecto protector de las HSP60
enterobacterianas en la apoptosis inducida con DXM en CMSP de sujetos sanos, se
da por igual en linfocitos T CD4+ y CD8+ y que tal efecto requiere de la
interiorización de las proteínas, es decir, para que se observe la protección es
necesaria la integridad funcional del citoesqueleto de la célula (Ortega-Ortega,
2007).
Con base a los antecedente mencionados, en este trabajo analizamos el efecto
de las HSP60 de K. pneumoniae y E. coli en la apoptosis inducida con DXM en
linfocitos B Raji y en CMSP de sujetos sanos. El análisis de la apoptosis se
realizo por citometría de flujo, la cual es una técnica que ofrece diversas ventajas
en la cuantificación del fenómeno apoptótico, ya que permite apreciar
simultáneamente los cambios que presentan las células durante la apoptosis,
además de su cuantificación, otra ventaja es la utilización de un solo fluorocromo
siendo una técnica más económica. La técnica de pico SubG0 utilizada en
nuestros ensayos de apoptosis (etapa tardía), permite la cuantificación del
contenido de DNA en un citómetro de flujo, empleando el fluorocromo ioduro de
propidio (IP) que se intercala estequiométricamente en el DNA, lo que permite
emitir fluorescencia que es proporcional a la cantidad de DNA unido y de esta
manera, diferenciar en que fase del ciclo celular se encuentra cada célula.
La inducción de apoptosis puede llevarse acabo mediante diversos estímulos, uno
de los cuales, es el efecto causado por los glucocorticoides sintéticos como la
dexametasona (DXM), dichos compuestos son una clase de hormonas
estereoideas lipofílicas que se absorben rápidamente por piel y mucosas,
generalmente circulan en sangre unidos a proteínas, mientras que la fracción libre
se difunde a las células ejerciendo su acción. El efecto apoptótico de los
glucocorticoides es dependiente de la unión de los mismos con los receptores
hormonales de glucocorticoides (GRs) en el citosol, formándose un complejo entre
el receptor y el glucocorticoide, el cual actúa directamente en el núcleo celular
provocando la inducción de un grupo especifico de genes, conocidos como “genes
de muerte”, responsables de el desencadenamiento de la muerte celular por
apoptosis (Iwata M. Y col 2006).
Si bien el mecanismo de difusión simple a través de la bicapa lipídica de la
membrana es el más aceptado, hay evidencias de que su ingreso a la célula esta
regulado a través de receptores de membrana distintos al receptor esteroideo (GR).
Utilizarían como señales proteínas G y este mecanismo sería responsable de las
acciones rápidas de estas hormonas (Iwasaki y col, 1997).
En el citoplasma el receptor GR esta formado por un complejo multiproteíco con
proteínas de choque térmico (HSP90 y HSP40), inmunofilinas, calreticulinas y otras,
que impiden su traslocación al núcleo. Cuando el receptor se une al glucocorticoide
sufre cambios conformacionales y se fosforila, el receptor activado y dimerizado
unido a la hormona se transloca al núcleo donde se une a secuencias específicas
de bases denominadas elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE), actuando
sobre el gen promotor e induciendo la síntesis del mRNA que sale al citoplasma y
es traducido en los ribosomas formándose proteínas que secretadas o
permaneciendo dentro de la misma célula, constituyen el efecto de la respuesta de
inducción, por ejemplo, la activación de genes aún no determinados que activan a la
procaspasa 9 (Marcel y col, 2003; Jares y Pignataro, 2002; Marchetti y col, 2003).
Los resultados obtenidos de la inducción de apoptosis con DXM en linfocitos B
Raji y en CMSP mostraron para ambas poblaciones celulares un incremento
significativo del porcentaje de células apoptóticas con respecto a los testigos sin
estimulo (Tabla 1). Este resultado es importante, ya que ambas poblaciones
celulares respondieron de forma similar a la DXM. Se ha reportado que el efecto
apoptótico de los glucocorticoides (GC), depende mucho del tipo celular, es decir,
pueden favorecer o bien evitar la apoptosis en distintos tipos celulares. Además,
se ha observado que en la regulación positiva o negativa del mismo producto
génico por estos GC puede ocurrir regulación entre varios co-activadores y co-
represores nucleares. Por ejemplo, se ha documentado que la sobrexpresión de
Bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por los GC en células linfoides (Cron-Leslie,
1994). Por otro lado, se ha sugerido que la mayoría de los efectos de los GC en la
apoptosis de diversos tipos celulares es mediado por los GR (Evans-Storms y col.,
1995. Regulation of apoptosis by steroid homones. J Steroid Biochem Mol Biol. 53:
1-8).
El análisis del posible efecto protector de las HSP60 enterobacterianas de E. coli
y K. pneumoniae, en la apoptosis inducida con DXM en linfocitos B Raji y en
CMSP mostró los siguientes datos; no se observo para ninguna de las dos
poblaciones celulares efecto inductor de apoptosis de ninguna de las proteínas
probadas, los valores del porcentaje de células apoptóticas en estos ensayos
fueron muy similares a los obtenidos de los testigos sin inductor (Tabla 1). El
porcentaje de células apoptóticas obtenido con la DXM en la línea celular de
linfocitos B Raji, no disminuyó significativamente cuando las células se incubaron
previamente con las HSP60 enterobacterianas (Figura 5, panel A). Para las
CMSP, se observo lo previamente reportado por nosotros, disminución
significativa en el porcentaje de células apoptóticas obtenidas con la DXM al
incubar 1 h previa a la inducción con las HSP60 enterobacterianas.
Estos datos apoyan el efecto protector de las HSP60 bacterianas en la apoptosis
inducida con DXM en CMSP, efecto que no se observo en la línea celular B Raji.
Para las proteínas exógenas existen varias ideas en las que se sugiere su
participación en la apoptosis de una forma similar; a lo que puede suceder con las
HSPs de la misma célula. Se ha demostrado que las HSP pueden inhibir la
apoptosis por diversos mecanismos; al reducir la actividad de proteínas pro-
apoptóticas como Bcl-2, ya que cambian la permeabilidad celular y regulan la
liberación de factores apoptogénicos, que pueden ser inducidos por estrés
químico, lumínico, calórico, genómico, etc. Las HSP pueden participar en la
disrupción del apoptosoma ya que inactivan a las pro-caspasas y reducen la unión
a sustratos específicos de las caspasas activas, lo que implica una regulación
negativa de uno o más puntos de la apoptosis. Este fenómeno se ha reportado
para la HSP70. Además, se ha documentado que la HSP70 se une al citocromo c
para frenar la ruta intrínseca de apoptosis. La HSP27 regula la supresión de la
proteína pro-apoptótica Bid, cuya traslocación en la mitocondria se relaciona con
la liberación del citocromo c. Las HSP40 y HSP70 actúan como co-chaperonas
para inhibir a la proteína Bax cuando es inducida por óxido nítrico. La HSP90
previene la oligomerización del factor 1 de la proteasa activada de apoptosis
(Apaf-1) lo que impide la formación del apoptosoma. Las HSP se pueden unir
directamente a las caspasas maduras; este fenómeno sugiere una función
análoga a las proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs). La HSP70 favorece el
ataque inmunológico de las células cancerosas, estas proteínas se acumulan en la
membrana de la célula y se unen con la granzima B, el complejo formado favorece
la apoptosis desencadenada por Bid o por la caspasa 3. En la ruta extrínseca, las
HSP modulan la señalización de los receptores de muerte celular (TNF-α) a través
de la inhibición de la fosfolipasa A2. Las HSP facilitan el incremento de los niveles
de glutatión, del calcio intracelular y de las fosfatasas. Estos procesos se
relacionan con disminución de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Las HSP
inhiben la fosforilación de los factores apoptóticos o se ligan directamente a ellos.
La HSP70 interrumpe la señalización de la proteína cinasa activada por mitogeno,
al c-Jun N-terminal cinasa (JNK), que está implicada en la liberación del complejo
SMAC/DIABLO (SMAC, del inglés “second mitochondria-derived activator of
caspases” DIABLO: “direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low
isoelectric point”). La HSP90 y su co-chaperona, la proteína p37 (CdC37)
permiten la fosforilación de las rutas de supervivencia celular como son los
factores de crecimiento, las citocinas, etc. El papel regulador de las HSP depende
de la capacidad para interactuar con las proteínas o polipéptidos. Los eventos
clave involucrados en la exclusión y regulación de las cascadas apoptóticas
incluyen alteraciones de la conformación proteica, multimerización de las
proteínas, cambios en su localización celular y cambios de su estructura (Zugel y
Kaufmann, 1999).
Lo anterior podría explicar en parte lo observado con las CMSP, que son cultivos
primarios de células obtenidos de sangre periférica total heparinizada a diferencia
de las células B Raji que son células que provienen de un linfoma de Burkitt.
Estas células presentan alteraciones a diferentes niveles moleculares. Un aspecto
importante en las líneas celulares de origen tumoral, es la alteración a nivel de la
apoptosis, donde se observa una alta resistencia a morir por este mecanismo. La
inducción de apoptosis con DXM en los linfocitos B Raji fue muy similar y
ligeramente mayor (Tabla 1) a la observada para las CMSP, estos datos sugieren
que el mecanismo de inducción de la apoptosis a través de los receptores para
glucocorticoides (GR) en la línea de linfocitos B se lleva acabo de forma similar a
los cultivos primarios. Estos datos se ven apoyados por los antecedentes donde
se ha reportado que la DXM es un fármaco capaz de inducir apoptosis tanto in
vivo como in vitro (Distelhorst, 2002) y que además es el modelo de inducción de
apoptosis más recomendable por su fácil manejo al comparar con otros métodos
alternativos como son las radiaciones gama, UV, la exposición a agentes
oxidantes como el peróxido de hidrógeno o el arsenito de sodio (NaAsO2) ( Gault y
col, 2005; Reagan-Shaw y col, 2006). Antes de descartar que las HSP60
enterobacterianas no tiene efecto protector sobre la apoptosis inducida con DXM
en linfocitos B Raji, es recomendable probar diferentes concentraciones de las
proteínas de choque térmico y diferentes tiempos de incubación a los probados en
este trabajo, para de esta forma poder descartar estas variantes, sin excluir la
posibilidad de que el efecto protector observado en las CMSP, señala un efecto
modulador, que podría ser muy característico del tipo de célula con la que se este
trabajando y que las características intrínsecas de la población celular dan la
pauta para que la proteína tenga o no el efecto modulador sobre la apoptosis.
CONCLUSIONES
La dexametasona induce apoptosis a la línea celular de linfocitos B Raji y a
células mononucleares de sangre periférica de sujetos sanos.
Las proteínas de choque térmico de E. coli y K. pneumoniae no mostraron
un efecto protector en la apoptosis inducida con DXM en los linfocitos B
Raji.
Las proteínas de choque térmico de E. coli y K. pneumoniae mostraron
efecto protector significativo en la apoptosis inducida con DXM en las
células mononucleares de sangre periférica de sujetos sanos.
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