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1
大葉大學 分子生物科技學系
黃尉東 助理教授
基因轉殖與複製動物之研究與利用基因轉殖與複製動物之研究與利用
The Studies and Applications of The Studies and Applications of Transgenic and Cloned AnimalsTransgenic and Cloned Animals
2
Nature (2003) 422:835-847
遺傳學及基因體學上之重要發現遺傳學及基因體學上之重要發現
3
James Watson 與 Francis Crick 於1953年提出DNA之雙螺旋(double helix)模型,並於1962年獲得諾貝爾生理醫學獎
Watson and Crick 基因組/體Genome
Gene 基因
Chromosome染色體
+
=
4
The future of genomics rests on the foundation of the Human Genomic Project
Nature (2003) 422:835-847
人類基因組計畫人類基因組計畫
生物生物
健康健康
社會社會
資資源源
科科技技發發展展
生生物物資資訊訊
訓訓練練
教教育育
道道德德、、立立法法
5
DNA DNA 序列分析序列分析
6
7
核小體
染色質
染色體
DNA雙股螺旋
染色體之組成
8
• 基因轉殖動物 (transgenic animal) –
帶有外源遺傳基因或特定之基因組(genome) DNA序列被以人為方式刪除、插入或更改之動物
• 產製基因轉殖動物之方法:
1. 顯微注射法 (microinjection)
2. 反轉錄病毒感染法 (retroviral vector infection)
3. 精子載體法 (sperm vector)
4. 胚幹細胞載體法 (embryonic stem cell)
5. 體細胞核移置法 (nuclear transplantation)
9
基因轉殖家畜之應用
• 提高農業生產效率 -改善家畜生產性能及產品品質、增強對疾病之抵抗力;提高纖維之利用率及品質
• 可為生產醫藥蛋白之生物工廠 -人血液之替代品;治療人類疾病之醫藥蛋白等
• 家畜之器官捐贈予人類之可行性研究
• 體型、壽命及生理上與人較接近,適合作為研究人類遺傳疾病之理想模式
• 改變家畜乳汁之成分一增加α-及β-酪蛋白之產量及提高乳汁之熱安定性等 (吳,1999)
10
轉殖技術之進展
Jaenisch et al., PNAS 72, 4008注射反轉錄病毒到胚胎中產生轉殖動物1975
Gordon et al., PNAS 77, 7380經由原核注射使得老鼠胚胎轉型1980
Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685
分離出乳漿中的乳酸蛋白1984
Palmiter et al., Nature 300, 611帶有豬生長激素之轉殖老鼠可增快生長1982
Gordon et al., Science 214,1244 Brinster et al., Cell 27, 223
原核注射產生之轉殖老鼠可遺傳給後代1981
Jaenisch et al., Cold Spring Harb. Symp. 39, 375
注射病毒 DNA 進入培育的胚株細胞以產生轉殖鼠
1974
Brackett et al, PNAS 68, 353外來基因經由顯微注射送入受精卵1971
Gardner et al., Nature 220, 596利用囊胚注射胚胎細胞產生嵌合鼠1968
參 考 文 獻進 展年份
11
Wilmut et al., Nature 385, 810
Schnieke et al., Science 278, 2130
Paleyanda et al., Nat. Biotechnol. 15, 971
Stromqvist et al., Transgenic Res. 6,271
Petters et al., Nat. Biotechnol. 15, 965
從胎兒及成羊之體細胞中取出之核
轉移至無核之卵產生綿羊
經被轉型之細胞中取出核轉移至無核之卵產生轉殖羊
在豬乳中製造出人類第八因子
在兔乳中表現出人類細胞外之 superoxidedimutase
利用轉殖鼠作出人類視網膜炎色素瘤模型
在山羊中產生之抗凝血因子3進入第一期測試
1997
Campbell et al., Nature 380, 64 Thomson et al., Biol. Reprod.
55, 254
經由核轉移到培養的胚株細胞中
產生複製羊
建立非人類之靈長類 ES 細胞株
1996
Drews et al., PNAS 92, 10462 Schellander et al., Nat.
Biotechnol. 6, 41
在哺乳類動物-老鼠中造成 enzymatic modification
利用精子載體產生轉殖牛
1995
Velander et al., PNAS 89, 12003
在豬體內表現出人類蛋白 C1993
參 考 文 獻進 展年份
Dolly
12
Galli et al., Nature 424, 635
Woods et al., Science 301, 1063
Zhou et al., Science 302, 1179
從培養之體細胞經核轉移產生複製
馬
騾
大鼠
2003
Kono et al. Nature 428:860-864
自剔除銘印基因之卵經核轉移產生複製
小鼠 (孤雌生殖)2004
Shin et al., Nature 418, 732Chesne et al., Nat. Biotechnol. 20, 366
從培養之體細胞經核轉移產生複製貓及兔2002
Lee et al. Nature Biotechnol. 20:795-799
自培養之胚細胞經核轉移產生複製斑馬魚
Loi et al., Nat. Biotechnol. 19, 962
Wakamatsu et al., PNAS 98, 1071
從死亡野山羊之卵巢細胞產生複製羊
自培養之胚細胞經核轉移產生複製稻田魚
2001
參 考 文 獻進 展年份
13
脊椎動物胚之發育Development of Vertebrate Embryos
1 天 1 天
60 天 90 天21 天 50 天
4 天 10 天
14
有性繁殖週期有性繁殖週期
精子
卵子
合子
減數分裂
受精
15
1st Polar body
1st Polar body
Meiotic spindle
第一極體
第一極體
紡錘體
受精卵
成熟之卵母細胞
四細胞期之胚
應用於基因
轉殖及複製
動物所用之
卵母細胞及
胚
16
立體顯微鏡
Stereo microscope
•倍率: 1~100X•應用於:1. 物體之觀察2. 胚之收集3. 胚之顯微操作(兩棲、爬蟲或魚類之胚)
17
•動物之飼養照顧, 外科手術、無菌細胞培養及顯微操作等之知識
•轉殖基因(transgene)之準備 :構築DNA →啟動子(promoter), polyadenylation site,
complete coding region, at least one intron,Linearizaton of the cloned DNA, The removal of plasmid vector sequences
•準備供胚受胚之母畜-發情同期化•胚之收集•基因顯微注射 - 0.5 µL of DNA (1 to 5 µg/mL)•胚移置•基因轉殖動物(transgenic animal)之檢驗– PCR, Southern blot,
Western blot, Immunohistochemistry…….
產製基因轉殖動物之基本條件
18
•基因轉殖哺乳動物產製之效率 (出生動物/基因轉殖動物):
牛- 4.9%;山羊- 6.9%;綿羊- 8.39%;豬- 9.2%;小鼠- 10-20%
•影響基因轉殖效率之因子:
DNA之形式及濃度、製備基因所使用之緩衝液成分、動物之種別及品系、顯微操作之熟練度、注射位置、
胚之期別、顯微鏡之光源強度、注射微管之品質、供胚
動物之年齡、顯微注射之時機等
(吳,1999)
19
兩棲、爬蟲或魚類胚之
顯微操作
20
倒立式螢光
顯微鏡及顯
微操作設備
•倍率: 40~1,000 X•應用於:1. 細胞及胚之觀察2. 細胞及胚之顯微操作
21
Female pronucleus Male pronucleus
外源性基因之導入Foreign Gene Microinjection
雌原核 雄原核
正常小鼠 基因轉殖小鼠
Palmiter et al. (1982) / Science 385:810-813
22
拉針器 (Puller)磨針器 (Grinder)
鍛燒器 (Microforge) 注射器 (Injector)
23
顯微注射針
(injection pipette)
頭髮
(hair)
24
顯微注射針
白金絲
顯微注射針
磨石
25
直立式螢光顯微鏡
•倍率: 40~1,000 X•應用於:
1. 細胞及胚之觀察2.細胞及胚之顯微操作
26
Wheeler & Walters (2001) Theriogenology 56:1345-1369
卵母細胞或胚於培養液中與病毒顆粒共同培養,病毒顆粒經由隙縫進入卵黃膜間隙
病毒顆粒經由顯微注射法進入卵母細胞或胚之卵黃膜間隙
反轉錄病毒感染法(retroviral vector infection)
27
Holding Pipette
細胞質內單一精子注射Intracytoplasmic sperm
injection (ICSI)
Injection
精子載體法精子載體法 (sperm vector)(sperm vector)
28
胚幹細胞載體法(embryonic stem cell)
Donovan and Gearhart (2001)Nature 414, 92 - 97
29
將轉殖基因與
受精卵混合,
利用外加電場
讓帶負電荷之
DNA往電場正極瞬間泳動進
入受精卵
優點:可一次處理大量受精卵
缺點:對受精卵傷害較大
電破法 /電穿孔法 (electroporation)
(陸,2004)
Before During After
Electron micrographs of cells before and after brief electric pulses confirm that electroporation causes pores to open and close.
30
電穿孔/融合之設備
(Equipments for Electroporation/
fusion)
31
基因槍法
(gene/particle gun)
利用氣體加壓,將附著在微粒載體(通常為惰性金屬)上之DNA快速射入目標細胞中
優點:可一次處理大量細胞,較常用於植物細胞轉殖
缺點:對細胞傷害較大
32
胚複製
Cloning of
Embryos
33
34
嵌合羊 -綿羊+山羊
嵌合鼠 -129/SvJ+C57BL/6
35
Zebhund oder Seera Kängaffe oder Girruh
嵌合動物 Chimeras
36
Techniques of nuclear transfer in mammals
Keith et al. (1996) / Reviews of Reproduction 1:40-46
37
去核(Enucleation)
核轉置(Nuclear Transplantation)
PB1
A
B
PB1
C
Donor cell
D
Donor cell
(沈,2004)
38Procedures of nuclear transfer in cattle (沈,2004)
電融合 (Electrofusion)
C D
A B
50μm
39Wilmut et al. (1997) / Nature 385:810-813
複製綿羊Cloning of Sheep
Dolly and her mother
乳腺細胞Mammary cells
核轉置Nuclear transplantation
供核
供卵
電融合
移置至代理孕母
體外培養
1/277
= 0.4%
40
Megan and Morag – first animals cloned from cultured cells
Dolly and her 3 lambs born in April 1998
複製綿羊Cloning of Sheep
41
Procedure of cattle cloning
Culture and passages
Donor cells
Matured oocyte
Enucleation
Nuclear transferElectrofusion and
Activation
Embryo culture
Starvation
Frozen
(沈,2004)
42
複製牛 (Cloning of Transgenic Calves)
ACT3, ACT4, ACT5; 3 weeks of age
PCR amplified segment of the pCMV/βGEO construct of DNA from cell line and calf
Southern blot of genomic DNA
A,B. Transgenic fibroblast C,D. Nontransgenic fibroblast
N C A D Normal
Cibelli et al. (1998)Science 280:1256-1258
5/276 =1.8%
43
複製小鼠 Cloning of Mouse
Wakayama et al., (1998) Nature 394:369-374
31/1385= 2.2%No. Oocyte- 2468
44
複製豬Cloning of Pig
Polejaeva et al. (2000) Nature 407:86-90
Single NT
0/185 = 0% - 3 Recipients
No. oocytes - 283
Double NT
5/401 = 1.3% - 7 Recipients
No. oocytes - 1869
45
CLONING PROCEDURECLONING PROCEDUREBisection of embryos
Production of bisected blastocyst
Blastocyst2-cell embryos
Transfer into recipient
Chimeras with ES cells Nuclear transfer
Cultured cellsBlastomeresES cells
Injected into host embryos
Transferred into recipient
Slection and mating of germ-line chimeras
Cloned pigs
Transferred into enucleated oocyte
Transferred into recipient
(吳,2004)
46
Provide endogenic cells
Therapeutic cloning
Drug screening
Transgenic cloning
Animal models (gene targetting)
Gender and genetic consistent
Clone elite animals
Endangered breed
Xenotransplanation
Research models
Animals as bioreactor
Disease-resistant animals
Improve production performance
Xenotransplanation
Transgenic animal technology Nuclear transfer technology
Transgenic animals Animal cloning Embryonic stem cells
Applications of transgenic and cloning techniques
(吳,2004)
47
Loi et al. (2002) Nature Biotechnology 19:962-964
Shin et al. (2002) Nature 415:859
Cloned female mouflon with the sheep foster mother
Nuclear source:
Granulosa cells from dead ones
1/22 = 4.5%
a. Nuclear-donor (cumulus cells) cat;b. cloned kitten with its surrogate
mother. 1/87 = 1.2%
48
Chesne et al. (2002)
Nature Biotechnology
20:366-369
6/755 = 0.8% (2 died)
A1 – EGFP protein
Rabbits born from somatic
nuclear transfer
Nuclear source:Cumulus cells
49
Kono et al. (2004)
Nature 428:860-864
2/371= 0.6 % (survived)
No. Oocytes- 457
Mouse created without father
Kaguya
輝夜姬 Parthenogenesis(孤雌生殖)
Imprinted genes(銘印基因)
50
斑馬魚之發育
Bar = 250 µm
0.75 h 1 h 1.25 h
1.5 h 1.75 h 2 h
2.5 h 3.3 h 3.5 h
3.8 h 4.3 h 4.7 h
40 min
10 min
51
24 h 28 h 28 h 3.3 h 3.3 h 36 h 36 h 42 h 42 h
48h 48 h 60 h 60 h 72 h 72 h
120 h
120 h
52
Saga and Takeda (2002)
Nature Reviews Genetics
2:835-845
鼠胚與斑馬魚胚發育之比較
53
斑馬魚
產卵水槽
產卵魚箱
循環殺菌獨
立飼養水槽
種魚養成
飼養水槽
54
產卵之步驟
a b
c
a. 公母魚隔開飼養(前一晚放置)
b. 抽起隔板(追尾,約30分鐘)
c. 將內套移至另一外套中
55
已產卵之斑馬魚
於外套底部可見斑馬魚卵
56
斑馬魚卵之顯微
注射操作手臂
(針筒式注射)
57
1 ACCATGGCTC TCTCACTTTT CACTGTCGGA CAATTGATTT CTTATTTTG 51 GACAATGAGA ATCACTGAAG CCAACCCCGA CCCCGCAGCC AAGCCGTCC
101 CTGCCGCAGC CGCCCCAGAC ACCGCCTCTG ATGCCGCCGC GCAGCCGCC 151 GCCACCGCAG CCACCGCCGC CGCAGCAGCC GCCGCCACCG AGTCACCGC 201 TGCCAAAGCC GCAGCCCTCA CCGCCGCCAA CGCCGCCGCC CCGCAGCAG251 CCACCGCCGC CGCAGCCGCC AGAGGTTAA
The Construction of Expression SystemsThe Construction of Expression Systems
PCR
報導基因
(Reporter gene)
載體
(Vector)
58
DNA之吸取
A
B
59
置卵盤
以 1% agarose製作
將魚卵整齊置於盤之溝中
60
A B
C1 C2
61
EGFPEGFP--N1 N1 質體之表現質體之表現 (Vector alone)(Vector alone)
a1
a2
b1
b2
c1
c2
62
經顯微注經顯微注
射後產生射後產生
之畸形斑之畸形斑
馬仔魚馬仔魚
63
28 h
48 h
144 h
108 h
120 h
168 h
36 h
60 h
72 h
84 h
64
Ju et al. (1999) Devel. Genetics
25:158-167
斑馬魚於發斑馬魚於發
育生物學上育生物學上
之應用之應用
65
斑馬魚於基因失活斑馬魚於基因失活
(gene knockdown)(gene knockdown)研究之應用研究之應用
MorpholinoMorpholinoor or RNAiRNAi
抑制轉譯作用抑制轉譯作用
((translationtranslation))之進行之進行
Nature Genetics (2000) 26:216-220
66
Nuclear Transplantation in Fish
Niwa et al. (1999) / Develop Growth Differ 41:163-172
Medaka
DonorWild type
RecipientOrange red
D R F1 MD FD FR
29/845
= 3.4%
67Lee et al. (2002) / Nature Biotechnol. 20:795-799
複製斑馬魚
Cloned Zebrafish
~ 2%
68
Devlin et al. (2001)
Nature 409, 781 - 782
基因轉殖基因轉殖
vsvs育種育種
69
應用基因轉殖技術之其它考慮因素
• 開發基因轉殖家畜之成本昂貴
• 政府之法規管制
• 食品安全性問題:(a) 利用遺傳學技術無法測到轉殖基因之存在
(b) 測不到轉殖基因表現之產物
(c) 無與轉殖基因相關之特徵
(d) 此等動物於屠宰前之外表及生理狀況正常
• 對環境之影響:破壞生態平衡
70
謝 謝!Thank you!Vielen Dank! Merci!