esercitazioni di biochimica applicata
DESCRIPTION
Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in un campione biologico; - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/1.jpg)
Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine
1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in un campione biologico;
2. Proteine cellulari - tecniche di omogeneizzazione e centrifugazione: arricchimento della/le proteina/e studiate in frazioni sub-cellulari ottenute da omogenato d’organo, tessuto, linee cellulari;
3. Saggio analitico nella frazione subcellulare (saggio enzimatico);
4. Cinetica enzimatica;
5. Procedure di separazione delle proteine in studio (elettroforesi su gel)
Analisi di proteine specifiche o totali nei diversi tessuti e distretti anatomici, in liquidi biologici e colture cellulari: tecniche separative più risolutive, metodi di identificazione e purificazione.
In particolare: Western blot, elettroforesi bidimensionale, proteomica, tecniche cromatografiche, purificazione all’omogeneità, sequenziamento.
Tecniche mirate
![Page 2: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/2.jpg)
•per conoscere quante proteine sono presenti in un determinato preparato biologico, prima di procedere verso ulteriori analisi relative ad una o più proteine; esempi:
•per calcolare l’attività specifica durante i saggi funzionali (es. per vel. enzimatica);
• per calcolare la densità specifica di un recettore nei saggi di legame (binding) dei recettori proteici;
•come indice di purezza/resa della proteina studiata durante le fasi progressive di purificazione;
•prima di una separazione cromatografica o elettroforetica (SDS-PAGE, Western blot, proteomica).
Il dosaggio quantitativo delle proteine viene applicato:
![Page 3: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/3.jpg)
Dosaggio della concentrazione di proteine totali in un campione biologico
Metodi chimici:Metodo Kjeldahl (N totale)
Metodi spettrofotometrici: -metodo in assorbanza UVa 280 nm (amminoacidi aromatici) - Metodi colorimetrici:Metodo del biureto;Metodo di Lowry;Metodo BCA (acido bicinconinico);Metodo di Bradford;
Metodi turbidimetrici: precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi turbidimetrica del precipitato.
![Page 4: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/4.jpg)
Metodo di Kjeldahl
Determinazione dell’N proteico trasformato in gr proteine mediante un fattore di conversione- Per incrementarne l’accuratezza: precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio per centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva:
1) Digestione: il campione con le proteine viene portato ad alta temperatura in presenza di H2SO4 concentrato + catalizzatore (ex. Cu2SO4) + ossidanti (ex. permanganato o H2O2); tutto l’N organico si trasforma in NH4
+, ossidazione di C e S a CO2 e SO2; 2) Distillazione: (NH4)2SO4 formato + 2NaOH = 2NH3 (raccolta x distillazione) + Na2SO4 + 2 H2O;
3) Titolazione: NH3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl) a titolo noto.Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in un campione
1 mol HCl = 1 mol NH3= 14 gr N
Quantità di N nel campione in gr:ml HCl x M HCl x 14/1000
Quantità di proteine nel campione ingr: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16
se si considera che il contenuto medio di N proteico è 16%.
![Page 5: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/5.jpg)
Metodi spettrofotometrici - colorimetrici
![Page 6: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/6.jpg)
I 20 L-amminoacidi che formano le proteine
Legame peptidico Legame peptidico
da: www.vialattea.netda: www.vialattea.net
Metodi spettrofotometricibasati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico
o i gruppi –R di alcuni AA
Metodi spettrofotometricibasati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico
o i gruppi –R di alcuni AA
Dosaggio proteine
![Page 7: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/7.jpg)
Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico; Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione;
Interferenze: queste possono alterare sia accuratezza che specificità del metodo: es.: assorbimento alla analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, ex. sali del tampone, con la formazione di complessi colorati (metodi colorimetrici);
Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno: metodo relativo, metodo assoluto; importante durante procedura di purificazione.
Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi;
Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati.
PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE
Metodi spettrofotometriciMetodi spettrofotometrici
![Page 8: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/8.jpg)
ASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINEASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINE
Caratteristiche:
Sensibile: 10-20 g
Integrità del campione: si
Stabilità: si
Interferenza con:basi azotate acidi nucleici(si corregge a 260 e 280 nm)
Metodo relativo: può variare in base al tipo di proteine presenti.
![Page 9: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/9.jpg)
•Scarsa sensibilità
Reattivo di Benedict: solfato di rame CuSO4
in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K+ o Na+
Metodi colorimetriciMetodi colorimetrici
Metodo «capostipite» di altre tecniche colorimetriche,quali i metodi del Lowry e del BCA.
Metodo «capostipite» di altre tecniche colorimetriche,quali i metodi del Lowry e del BCA.
Caratteristiche:•Integrità campione: no•Metodo ritenuto assoluto, più costante di UV .
![Page 10: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/10.jpg)
Integrità campione: no
Stabilità e tempistica: stabile entro limiti di tempo, lettura
dopo 30 min. Procedura relativamente lunga.
Metodo ritenuto piùcostante specifico e sensibile rispetto a UV, Folin classico e
biureto.
Caratteristiche:
Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (specialmente tirosina) , sono ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin.
Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (specialmente tirosina) , sono ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin.
![Page 11: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/11.jpg)
Quota di ioni rameici ioni rameosi dalle proteine in ambiente alcalino. L’acido BCA chela ioni rameosi formando un complesso colorato molto stabile.
Integrità campione: no
Stabilità: buona.Tempistica: procedura lunga.
Interferenze: lipidi, detergenti, EGTA;DTT (ditiotreitolo >1mM).
Migliore del Lowry perdetergenti, sali etc..
rid
![Page 12: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/12.jpg)
Integrità campione: no
Stabilità: più stabile deglialtri metodi; rapidità di esecu-zione – non richiedeincubazione dopo aggiunta reagente.
Metodo relativo- Sensibilità comparabile a Lowry Interferenze con
detergentiInterferenze con detergenti
Residui di arginina, triptofano, tirosina e fenilalaninaResidui di arginina, triptofano, tirosina e fenilalanina
![Page 13: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/13.jpg)
Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1-1 mg
Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1-1 mg
Retta a 330 nm
![Page 14: Esercitazioni di Biochimica Applicata](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061423/5681351d550346895d9c79e8/html5/thumbnails/14.jpg)
Metodo del Bradford: retta di calibrazione – analitica: 595 nm